Reglarea proceselor metabolice

celulare – structuri de reglare si

modele cinetice
Notiuni introductive

• Fiecare celula desfasoara mii pana la zecii de mii reactii chimice

pentru a-si mentine functionarea corespunzatoare.

• Aceste reactiile nu decurg izolat ci sunt organizate in secvente

multiple formand calea metabolica, in care produsul unei reactii
serveste ca substrat pentru reactia urmatoare.

• Astfel diferite cai se intersecteaza formand o retea de reactii

biochimice integrate = metabolism.

METABOLISMUL = un set de reactii biochimice

• Caile metabolice pot fi clasificate in:
– cai catabolice (cai degradative)
– cai anabolice (sintetice)
Reactiile catabolice degradeaza molecule complexe ca proteine,
poliglucide si lipide, la cateva molecule simple ca CO2, NH3 si apa
Reactiile anabolice formeaza produsi finali complecsi din precursori
simpli
Cele doua categorii de reactii sunt strans interconectate, in sensul ca
numerosi intermediari ai reactiilor de catabolism sunt utilizati in
reactiile de anabolism
• Metabolismul celular constituie un sistem dinamic complex.
• Elucidarea, intelegerea si eventual predictia comportamentului
metabolismului celular constituie una din principalele provocari ale
erei postgenomice.
• Marea majoritatea a produselor comerciale importante sunt compusi
rezultati ai metabolismului celular.
• Ingineria metabolica poate fi aplicata pentru a imbunatati procesele
de obtinere a acestor metaboliti celulari.
• Avantajul ingineriei metabolice se datoreaza si cresterii considerabile a
numarului de genomuri microbiene secventate. Astfel inca din 2001 erau
complet secventiate peste 50 de genomuri.
• In ultimi ani au fost depuse eforturi substantiale pentru dezvoltarea si
investigarea de modele pentru procesele de metabolism celular.
• Modelarea matematica a metabolismului celular
• Odata stabilit un model matematic acesta poate servi mai multor scopuri:
1. Poate fi privit ca un “laborator virtual” care permite construirea si
caracterizarea unui sistem.
2. Permite o privire asupra principiilor fundamentale ale functiilor celulare
(cum ar fi adaptabilitatea, robustetea, principiul optimalitati).
3. Serveste ca baza pentru investigarea unor mecanisme majore (modificari
ale activitati enzimatice pentru a imbunatati o proprietate a sistemului)
• Desi exista progrese majore in analiza structurala a proceselor
metabolice, lipsesc modele dinamice ale metabolismului celular
care sa incorporeze o realitate complexa a functiilor celulare.
CONSTRUIREA UNOR ASTFEL DE MODELE INTAMPINA
O SERIE DE DIFICULTATI:
• Se bazeaza pe cunoastere precisa a tuturor ecuatiilor enzimatice
implicate in procesele metabolice.
• Chiar daca aceste ecuatii sunt furnizate de literatura, parametrii de
functionare a enzimelor depinde de multi factori (cum ar fi tipul de
tesut sau conditiile experimentale ).
• Desi majoritata ecuatiilor enzimatice au fost determinate in vitro de
multe ori acestea se desfasoara diferit in vivo.
• In studiile traditionale ale proceselor biotehnologice sunt masurate:
concentratia biomasei si metabolitii extracelulari.
• Modelel care pot fi formulate pornind de la astfel de masuratori sunt
nestructurate, nepermitand interpretarea fiziologiei celulare si predictiei
comportamentului celular in diferite conditii de cultivare.
• Masurarea concentratiei de metaboliti intracelulari si a activitatii
enzimatice intracelulare permit formularea de modele structurate.
• Astfel modelele obtinute permit cresterea posibilitatii de predictie a
fiziologiei celulare.
• Dezvoltarea capacitatii de lucru a procesoarelor (din dotarea PC-urilor)
a permis deasemenea devoltarea acestor modele prin prisma posibilitatii
introducerii mai multor parametri in ecuatia modelului matematic.
• Aceste modele au la baza studiul metabolismului celor mai simple
organisme (bacteriile) (metabolismul bacterian).
• Din aceasta categorie fac parte E. Coli si Saccharomyces cerevisiae.
• Astfel E. Coli poseda peste 4400 de gene, aproximativ 2500 de proteine
active si enzime, intre 50 – 70 proteine senzor inserate im membrana
plasmatica, si un numar semnificativ de cai metabolice.
PARTICULARITATI ALE METABOLISMULUI BACTERIAN
• Metabolismul bacterian se distinge de cel al celulei eucariote prin cateva
trasaturi particulare:
1. Intensitate neobisnuita – metabolismul bacterian este de sute si chiar mii
de ori mai intens decat cel am organismelor superiore, raportat la
unitatea de greutate (gramul). Ex.: Micrococcus ureae poate sa
metabolizeze pana la 1200 g uree/ora.
- aceasta particularitate deriva din valoarea inalta a raportului
suprafata/volum (la bacterii suprafata este foarte mare in raport cu
volumul = usureaza schimburile intre celula si mediu).
2. Natura substratului – bacteriile pot cataboliza substraturi foarte diferite.
Ele metabolizeaza substante inaccesibile pentru alte organisme. Ex.:
bacterii ale genului Pseudomonas pot metaboliza pana la 200 substante
diferite.
3. Plasticitatea metabolismului – bacteriile au o capacitate fara echivalent in
lumea vie: pot utiliza alternativ diferite surse de carbon si energie.
- ceasta versatilitatea metabolica are caracter adaptativ si are o semnificatie
majora, deoarece, cel putin in conditii naturale, microorganismele trebuie
sa isi adapteze tipul de metabolism in raport cu substratul disponibil.
4. Potentialul de sinteza – este corelat direct cu intensitatea
metabolismului. Aceasta particularitate este consecinta faptului ca
transcrierea este simultana cu traducerea informatiei genetice.
- O celula de E. coli sintetizeaza circa 1000 molecule de
proteina/secunda, circa 4000 molecule de lipide si 4 molecule de ARN.
- Trebuie insa mentionat ca acest urias potential de sinteza este numai
teoretic si ar putea deveni real numai in conditii optime de mediu. In
conditii obisnuite de mediu acest potential de sinteza se manifesta o
perioada scurta de timp.
5. Diversitatea cailor metabolice – diversitatea prin care un compus chimi
poate si degrada: calea glicolizei, suntul hexozo-monofosfatilor, calea
Entner-Doudoroff.
• Toate substantele nutritive utilizate in metabolsim, trebuie sa strabata
invelisurile celulare: peretele si membrana citoplasmatica.
 Reglarea procesului metabolic
• Bacteriile prezinta mecanisme sofisticate pentru reglarea atata a cailor
catabolice ca si a celor anabolice.
• In mod general bacteriile nu sintetizeaza enzime degradative
(catabolice) decat daca substratul este prezent in mediu de crestere (ex.:
sinteza de enzime care sa degradeze lactoza ar fi inutile daca din mediu
de crestere ar lipsi lactoza).
• Caile metabolice sunt inchise in conditiile in care produsul final al caii
metabolice nu este necesar, sau este obtinut direct prin prelucrarea
acestuia din mediul de cultura.
• Concentratia unei enzime depinde de prezenta substratului. Enzimele
constitutive sunt mereu prezente in celula, indiferent de compozitia
mediului in care aceasta se dezvolta. Enzimele care opereaza pe calea
glicolitica si ciclul Krebs sunt in general enzime constitutive (sunt
prezente in aproximativ aceleasi concentratii in celula tot timpul).
• Enzimele inductive sunt produse atunci cand celula raspunde la un
substrat particular = sunt produse doar atunci cand este nevoie.
• In procesul de inductie, substratul (sau un compus similar cu substratul)
induce sinteza enzimei = inductor
• Enzima represata = enzima a carei sinteza este indusa de prezenta (de
exemplu) a produsului final a caii metabolice la care participa in mod
normal.
• Reactiile enzimatice pot fi reglate prin 2 mecanisme:
- reglarea activitatii enzimatice (inhibitie tip feedback,inhibitie de produs
final) care opereaza pentru a regla caile de biosinteza.
- reglarea sintezei enzimatice (represia de produs final, inductia enzimatica
si represia catabolica ) – functioneaza in reglarea cailor de biosinteza;
inductia enzimatica si represia catabolica .
• Procesul de inhibitie de feedback, regleaza activitatea unor enzime
preexistente.
• Mecanismele de represia de produs final, inductia enzimatica si represie
catabolica sunt implicate in controlul si sinteza enzimelor.
• Procesul care controleaza sinteza enzimelor poate fi ori un control
pozitiv ori control negativ.
• Represia de produs final si inductia enzimatica sunt mecanisme de
control negativ pentru ca conduc la diminuara ratei de transcriptie a
proteinelor.
• Marea majoritate a punctelor de reglare a metabolismului se realizeaza la
nivel transcriptional, modificantdu-se astfel activitatea proteinelor pre-
existente.
• Aceste puncte de reglare sunt controlate de proteine cu proprietati
alosterice = proteine alosterice.
• Proteina alosterica prezinta un situs activ (catalitic) si un situs alosteric
(efector).
• Moleculele care stimulează activitatea proteinei se numesc activatori
alosterici, iar moleculele care inhibă activitatea proteinei se numesc
inhibitori alosterici
Exemplu de enzima alosterica:
cand molecula efectoare se
cupleaza la situsul alosteric,
este inactivata activitatea
enzimei cat si capacitatea ei de
legare la substrat; cand
efectorul se detaseaza de la
situsul alosteric enzima este
activa.
• In reglarea alosterica sunt implicate atata enzime cat si proteine.
• In conditiile in care este o proteina aceasta poseda deasemena un
situs alosteric si un situs catalitic.
• Situsul activ este un situs de cuplare la ADN, care atunci cand este
activ se cupleaza la o secventa specifica de ADN.

REGLAREA CELULARA ESTE SUPUSA UNOR REGULI GENERALE:

1. Moleculele care sunt necesare numai ocazitional, se sintetizeaza numai

cand prezenta lor este esentiala.
2. O activitate enzimatica ce consuma inutil energie, sau consuma o molecula
care este substratul unei alte enzime, este de obicei inhibata.
3. Daca celula are mai multe cai metabolice disponibile, ea va alege calea
care produce o cantitate mai mare de energie pe unitatea de timp.
• Activitatea mecanismelor reglatoare se poate desfasura la 4 niveluri
• La nivleul transcrierii genetice
1. Prin controlul la nivelul traducerii genetice
2. Prin modificare directa a activitatii enzimelor existente in celula
3. Prin modificarea ratei degradarii proteinelor.

Modele matematice

• Modelele matematice pentru descrierea metabolismului celular:

1. Modele stoechiometrice
2. Modele cinetice

Modelele stoechiometrice se bazeaza pe un sistem liniar invariant

in timp caracteristic retelei metabolice
Modelel cinetice se bazeaza atat pe stoechiometrie cat si pe
cinetica microbina sau enzimatica
Modele cinetice
Cand exista informatii suficiente despre cinetica unor procese
specifice celulare (reactii catalitice-enzimatice, interactii
proteina-proteina, sau legaturi proteina-ADN) este posibila
descrierea dinamica a acestor procese prin combinarea
cineticii cu stoechiometria cailor metabolice
• Aceasta metodologie a fost aplicata de exemplu la modelarea glicolizei
la Saccharomyces cerevisiae.
• Modelul include reactii ale caii Embden–Meyerhof–Parnas (EMP) ,
ciclul acizilor tricarboxilici (TCA), ciclul glioxilatului si lantul
respirator.
• In acest model au fost incluse 22 de reactii de bilant masic referitoare la
metaboliti si 23 de ecuatii pentru enzime.

• Modelul isi propune:

1. Simularea fiziologiei celulare pentru intelegerea proceselor de reglare in
conditii dinamice.
2. Analiza controlului metabolic pentru amplificarea si/sau redirectionarea
fluxului metabolic.
3. Investigarea situatiilor in care conditiile de mediu afecteaza
metabolismul.
 Reprezentarea
schematica a
gicolizei, ciclul
glioxilatului,
lantul respirator,
si EMP
 Structura
modelului
metabolic pentru
simularea
dinamici pe
termen scurt a
efectului glucozei
la Saccharomyces
cerevisiae
Nomenclatorul modelului
Nomenclatorul modelului
Nomenclatorul
modelului
• Modelul a fost aplicat cu succes pentru a prezice nivelul intracelular si
extracelular de metaboliti dupa introducerea glucozei in cultura
continuna de Saccharomyces cerevisiae.
• Aceiasi strategie a fost aplicata pentru investigarea cai pentozo-fosfatului
Saccharomyces cerevisiae.
• In acest caz a fost exprimata concentratia unor metabolici intracelulari
cum ar fi glucoza – 6 – fosfat si 6-fosfogluconat ca si coenzima NADPH.
Predictia acestora a fost in concordanta cu rezultatele experientale.

• Exemple de alte modele cinetice structurate:

1. Investigarea cailor de biosinteza a PHB la A. eutrophus.

2. Eliberarea biologica a fosforului de catre Acinetobacter sp.
3. Fermentatia acidului hialuronic de catre S. zooepidemicus.
4. Producerea de celulaza de catre T. reesei.
 Concluzii
Modelarea metabolismului permite in esenta :
1. Predictia comportamentului celular sub diferite conditii de mediu, dat
fiind un fond genetic fix.
2. Predictia comportamentului celular sub conditii genetice diferite, dat
fiind conditii de mediu fixe.
In ambele cazuri output-ul este fenotipul, care poate fi descris ca fluxuri
metabolice ale concentratiilor transcriptilor, proteinelor sau
metabolitilor intermediari.
Bibliografie

1. G. Mihaescu, Microbiologie generala si virusologie, Edit. Universitatii Bucuresti,

2000.

2. Manfred R., Michael B., Uwe T., Matthias R., In Vivo Analysis of Metabolic
Dynamics in Saccharomyces cerevisiae:II. Mathematical Model, Biotechnology
And Bioengineering, Vol. 55, No. 4, August 20, 1997.

3. Uwe T., Werner M., Michael B., Manfred R.,Matthias R., In Vivo Analysis of
Metabolic Dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental Observations,
Biotechnology And Bioengineering, Vol. 55, No. 2, July 20, 1997

4. Ralf S., Thilo G., Joachim S., and Bernd B., Structural kinetic modeling of
metabolic networks, PNAS August 8, 2006 vol. 103 no. 32

5. http://www.textbookofbacteriology.net/regulation.html