UNIVERSITATEA „LUCIAN BLAGA” SIBIU

FACULTATEA DE ȘTIINȚE
MASTER BIOLOGIE APLICATĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

EFECTUL ANTIBACTERIAN AL MOSCULUI ȘI ULEIURILOR ESENȚIALE

DE CIMBRU, OREGANO ȘI SCORȚIȘOARĂ ASUPRA STAFILOCOCULUI
AURIU

ÎNDRUMĂTOR MASTERAND
Sef lucrări dr. ing. LENGYEL Ecaterina COMANICIU L.R. David Lucian

Sibiu, 2018

1
 NOTĂ
Prezentul material reprezintă tema pentru disertația susţinută
la încheierea programului educaţional de formare a specialiştilor
în domeniul Biologie, cu promovarea celor doi ani de studiu în
cadrul programului de masterat Biologie Aplicat ă din cadrul
Facultăţii de Științe, Universitatea „Lucian Blaga” din Sibiu.
Aduc mulţumiri pentru îndrumare şi suport Coordonatorului
meu ştiinţific, Doamna Dr. Ing. LENGYEL Ecaterina, alături de
întreaga apreciere pentru colectivul de cadre didactice universitare
care mi-au îndrumat paşii de-a lungul anilor de studiu.
De asemenea, țin să mulțumesc personalului Laboratorului de
Analize Medicale din cadrul Spitalului Clinic de Pediatrie din Sibiu și
personalului Natural Ingredients R&D S.R.L. pentru suportul și
susținerea oferite.

AUTORUL
Masterand COMANICIU L.R. David Lucian

”Sănătatea este darul cel mai frumos și mai bogat pe care natura știe să-l facă.”
Michel de Montaigne

2
 CUPRINS

INTRODUCERE 4

1. MATERIALE ȘI METODE 5

1.1. Descrierea materialelor 5

1.1.1. Microorganismul 5

1.1.2. Uleiurile esențiale și modalitățile de extracție 8

1.1.3. Substanțele, ustensilele și aparatura folosite 21

1.2. Descrierea metodei. Antibiograma 21

1.3. Descrierea modului de lucru 25

2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 29

3. CONCLUZII 35

BIBLIOGRAFIE 36

3
 INTRODUCERE
Lucrarea de față își propune să evidențieze activitatea antibacteriană a moscului și a uleiurilor
esențiale provenite din plante de cimbru (Thymus vulgaris), oregano (Oreganum vulgare) și scorțișoară
(Cinnamomum sp.) asupra stafilococului auriu (Staphylococcus aureus), izolat din secreția nazală a
unui pacient anonim, utilizând metoda difuziei discurilor (Kirby-Bauer).
Vom prezenta atât aspecte teoretice, dar și practice care țin de proprietățiile medicinale ale
uleiurilor esențiale, mai cu seamă ne vom îndrepta atenția asupra proprietățiilor antibacteriene ale
uleiurilor esențiale provenite de la speciile vegetale mai sus menționate asupra stafilococului auriu.
Motivul alegerii acestei teme derivă din dorința de-a face cunoscute calitățile de adjuvanți în
tratamentele de bază ale infecțiilor provocate de stafilococul auriu și, totodată, din considerarea
problemelor globale generate de consumul de antibiotice. Pe de altă parte, s-a luat în considerare și
frecvența crescută a cazurilor de infecții cu stafilococ auriu, mai ales în probele colectate din secrețiile
nazale. Ne-am îndreptat atenția spre prezența acestui microorganism în exudatele nazale, deoarece
dorim să studiem eficacitatea acestor substanțe, ușor de administrat la nivelul nazo-faringelui
împotriva stafilococului auriu.
În acest context, se precizează că stafilococii sunt unii dintre cei mai importanți patogeni
prezenți în infecțiile nosocomiale. De asemenea, ei sunt identificați des în probele de secreție nazală.
Conform procedurii medicale de laborator, în urma identificării stafilococului auriu în astfel de probe,
se face o antibiogramă pentru a afla la ce antibiotice este rezistent, respectiv la care este sensibil,
pentru a identifica cu claritate antibioticul care urmează a-i fi administrat pacientului pentru tratarea
eficientă.
În prezent, după cum am menționat și mai sus, pentru tratarea infecțiilor generate de
stafilococul auriu sunt administrate antibioticele. Este bine cunoscută problema globală cu care ne
confruntăm în prezent cu privire la rezistența microorganismelor la antibiotice, printre cauzele care
înlesnesc această adaptabilitate a microorganismelor, în speță a stafilococului auriu, la antibiotice fiind
consumul de antibiotice des și uneori nefondat sau cu nerespectarea perioadei recomandate de medic,
precum și transcenderea acestor substanțe dincolo de procesarea metabolică, în mediul înconjurător.
Aceste comportamente defectuoase în privința administrării de antibiotice duc la dezvoltarea graduală,
în timp, de către microorgaanisme a unei rezistențe la anumite tipuri de antibiotice. În acest sens, în
cazul stafilococului auriu, există și tulpini meticilino-rezistente, tulpini care sunt rezistente la
antibiotice foarte bine cunoscute, cum sunt Penicilina, Oxacilina, Amoxicilina și Meticilina. Această
formă poate cauza infecții grave și chiar decesul, în lipsa tratării eficiente. În prezent, în urma
efectuării antibiogramei, se pot identifica antibioticele la care microorganismele sunt sensibile și se
începe cu celeritate tratamentul cu aceste antibiotice.
În scopul evitării acestei probleme, dar și a acelor probleme conexe sau secundare care pot să
apară în urma administrării de antibiotice, la pacienți și în ecosistem, prin intermediul acestui studiu se

4
propune o atenție sporită asupra uleiurilor esențiale provenite din plante care au efecte puternice
antibacteriene. În speță uleiurile esențiale de cimbru (Thymus vulgaris), oregano (Oreganum vulgare),
scorțișoara (Cinnamomum zeylandicum) asupra stafilococului auriu (Staphylococcus aureus),
recomandând totodată utilizarea acestora conform rezultatelor acestui studiu. Efectul antimicrobian al
acestor uleiuri esențiale este analizat prin comparație cu cel al produselor de sinteză din clasa
antibioticelor și a unui ulei bazat pe un compus sintetic (uleiul de mosc), tocmai având în vedere
inteeresul utilizării unor soluții alternative la tratamentele medicamentoase, bazate pe produse naturale
în locul celor sintetice.
Lucrarea se structurează pe trei capitole principale, cuprinzând referiri legate de speciile
vegetale de la care provin uleiurile esențiale testate, componența în compuși activi și raportul acestor
compuși, uleiurile esențiale extrase din cele trei specii vegetale, modalitatea de extracție a uleiurilor
esențiale, ustensilele și aparatura utilizate în cadrul acestei lucrări, metoda de studiu aplicată, discuții și
studii anterioare concludente, rezultatele obținute, concluziile acestui studiu, sugestii.

Cuvinte cheie: uleiuri esențiale, mosc, efect antibacterian, stafilococ auriu, antibiogramă, Kirby-Bauer,
cimbru, oregano, scorțișoară.

CAPITOLUL 1. MATERIALE ȘI METODE

1.1. Descrierea materialelor

Dezvoltarea spectaculoasă a științelor medicale din ultimele decenii, progresele inregistrate

industria farmaceutică pe planul sintezei de compuși chimici noi cu activitate antimicrobiană, a dus la
introducerea în arsenalul terapeutic actual a unui număr mare de antibiotice. La acestea se adaugă și
folosirea de multe ori irațională a acestor medicamente, atat direct de către pacienți care recurg de
multe ori la automedicație, cât și din partea medicilor, care sub presiunea unor eventuale acuzații de
malpraxis, prescriu antibiotice uneori fără a ține seama de ghidurile internaționale de antibioterapie.
Toate acestea duc la apariția unor tulpini de microorganisme tot mai rezistente la medicamentele
uzuale, așa numitele microorganisme ”multi drug resistant”. Stafiloculul auriu este un agent patogen
foarte larg întâlnit în patologia umană, responsabil de un număr mare de infecții cu localizări din cele
mai diverse: tract respirator superior și inferior, tegumente, os și țesuturi moi, glob ocular, ureche, etc.
Poate pătrunde în torentul sangvin – septicemie - și determină un răspuns inflamator sistemic mediat
de citokinele proinflamatorii, care poate evolua până la șoc urmat de multe ori de decesul pacientului.
Din aceste motive ne-am focalizat asupra acestui germen patogen în prezentul studiu.

5
1.1.1. Microorganismul
Microorganismul aupra căruia s-a testat efectul antibiotic al uleiurilor esențiale extrase din
speciile floristice ante-menționate este stafilococul auriu, izolat dintr-o probă de secreție nazală de la
un pacient anonim.
Stafilococul este un coc gram-pozitiv, catalazo-pozitiv, coagulazo-pozitiv, facultativ anaerob
(subsp. anaerobius). Stafilococul auriu face parte dintre principalele bacterii cauzatoare de patologii în
cazul omului, cum sunt infecțiile de la nivelul tegumentului și de la nivelul țesuturilor moi. (Causes
and Symptoms of Staphylococcus aureus, 2010) Denumirea genului sugerează o serie de particularități
de natură morfologică, cum este faptul că acest microorganism, la microscop, este reprezentat de coci
dispuși în formă de ciorchine, pe când denumirea speciei în speță, „aureus”, indică faptul că produce
un pigment auriu (citrin). Din punct de vedere nutritiv, aceștia nu sunt pretențioși, fiind ușor de
cultivat pe majoritatea mediilor de cultură uzuale, tolerând concentrații de NaCl între 5% și până la
15% (în cazul speciilor halofile). (Figura 1) (Buiuc, 2008)

Figura 1. Staphylococcus Aureus. Gram (+) ( x 900) (După www.myhealth.gov.)

Coloniile specifice de stafilococ auriu sunt mari, având un diametru cuprins între 1-3 mm, cu
aspect S, cremoase, de formă rotundă, bombate și lucioase, în majoritatea cazurilor hemolizând
sângele din compoziția mediului de cultură, astfel formându-se un halou semi-transparent/complet
transparent în jurul coloniei. Pe mediul de cultură îmbogățit cu 5%-8% sânge de berbec, produce
hemoliză, în urma hemolizării sângelui din mediu. De asemenea, produce acid din glucoză (anaerob),
lactoză, sucroză, manitol (anaerob) și glicerol. (Figura 2) (Rayner, 2005)

6
 Figura 2. Colonii Staphylococcus Aureus. Gram (+) pe agar sânge. (După www.myhealth.gov.)

În anumite circumstanțe, stafilococul auriu poate produce atât enterotoxine, care pot fi letale,
cât și exotoxine, în cazul contaminărilor alimentare. Temperatura optimă de creștere a acestuia este de
37°C, însă acesta se poate dezvolta între un minim de 10°C și o temperatură maximă de 45°C. De
asemenea, tolerează foarte bine sarea (NaCl). (Robert S. Breed, 1957)
Stafilococul auriu se dezvoltă pe membrana mucoasă a vestibulelor nazale, dar și pe epidermă,
la foliculele firelor de păr. De asemenea, el colonizează și mucoasa organelor cavitare care comunică
cu exteriorul, cum sunt colonul și vaginul. (Robert S. Breed, 1957). Transmiterea acestuia poate avea
loc fie prin contact direct, cum se întâmplă în majoritatea cazurilor, fie prin alte modalități, mult mai
rare, în cazul unor anumite tipuri de infecții pe care nu le vom discuta în această lucrare. Dacă însă
bacteria ajunge în fluxul sanguin sau pe suprafața unor țesuturi interne ea poate cauza infecții cu
urmări deosebit de grave. (Tracey A. Taylor, 2017)
Examinarea microbiologică a probelor provenite din exudate nazale (Figura 3) sunt indicate
printre altele și pentru depistarea portajului cu stafilococul auriu, solicitată de către epidemiolog. Acest
microorganism are o rată a portajului de 30 % în cazul indivizilor sănătoși și poate ajunge și până la
70% în cazul persoanelor care lucrează în laborator și la personalul din spital. (Buiuc, 2008).

7
 Figura 3. Habitatul Staphylococcus aureus la nivelul cavității nazale (După https://bacteriologynotes.com)

Exudatul nazal se face astfel: după prelevarea probei din secreția nazală a pacientului cu
ajutorul unui tampon nazal, tamponul nazal se descarcă prin însămânțarea microorganismelor colectate
pe acesta, pe un mediu de cultură agar-sânge (berbec 5%). Mediul de cultură este incubat 24 ore la o
temperatură de 37°C. A doua zi, se citește placa Petri cu mediul însămânțat, fiind vizate coloniile
specifice.
Dacă însă coloniile apărute nu sunt foarte concludente, fie se poate prelungi perioada de
incubație în aceleași condiții amintite mai sus, fie se poate confirma identificarea acestora prin
efectuarea testului catalazei care indică faptul că avem de-a face cu un microorganism din genul
Staphylococcus sp., respectiv testul coagulazei care, dacă iese pozitiv, indică faptul că avem de-a face
cu stafilococul auriu și/sau prin efectuarea unei colorații Gram pe frotiu și observarea coloniilor de pe
acesta, la microscop. În urma identificării stafilococului auriu, se efectuează o antibiogramă
difuzimetrică, prin metoda Kirby-Bauer, care are rolul de-a indica rezistența, respectiv sensibilitatea la
o serie de antibiotice, în scopul de-a identifica eventualele tulpini care prezintă rezistență la
antibioticele convenționale și de-a identifica antibioticele la care prezintă sensibilitate, pentru a le
folosi pe cele din urmă în scopul tratării eficiente a acestuia.
Printre antibioticele la care tulpinile rezistente nu reacționează sunt: penicilina (majoritatea
tulpinilor), cefalosporinele, clindamicina și, uneori, vancomicina. Printre antibioticele la care prezintă
sensiblitate, fiind: flucoxacilin, dicloxacilin, teicoplanin, cotrimexazol, linezolid, quinupristin și altele.
(Rayner, 2005).

8
1.1.2. Uleiurile esențiale și modalitățile de extracție

Uleiurile esențiale folosite au fost extrase de la următoarele specii floristice: cimbru (Thymus
vulgaris), oregano (Oreganum vulgare), scorțișoară (Cinnamomum sp.), precum și uleiul gras de mosc
care are proveniență sintetică, în acest caz. Plantele provin din culturi de la ferme specializate.
Uleiurile esențiale folosite în cadrul acestui studiu au fost obținute prin utilizarea procedeului de
antrenare cu vapori.
În cadrul procedurilor de extracție posibile, materia primă vegetală, recepţionată conform
cerinţelor de calitate, se supune extracției de ulei volatil fie prin procedeul hidrodistilării, fie printr-o
variantă îmbunătățită - antrenarea cu vapori de apă. Hidrodistilarea este unul dintre cele mai vechi
procedee care se utilizează şi în prezent.
Fenomenul fizic care stă la baza acestui procedeu este legea aditivităţii presiunilor de vapori ale
componenţilor unui amestec, conform căruia amestecul fierbe la temperatura la care suma presiunilor
parţiale ale componenţilor ajunge să fie egală cu presiunea atmosferică. Toate substanţele componente
ale unui ulei volatil au puncte de fierbere superioare celui al apei, dar au o volatilitate ridicată la
temperaturi inferioare temperaturii de fierbere, fapt care face ca ele să fie antrenate uşor de vaporii de
apă la temperatura de fierbere a acesteia. Insolubilitatea în apă şi densitatea diferită față de aceasta
facilitează separarea lor în fază lichidă.
Antrenarea uleiului volatil este precedată de difuzia acestuia din celulele vegetale în care se
găseşte. În funcţie de natura materiei prime, acest proces durează mai mult sau mai puţin, influenţând
durata finală a operaţiei de antrenare. În vederea uşurării acestui proces, materia primă vegetală este
măcinată în prealabil.
Timpul necesar antrenării uleiului depinde şi de debitul de vapori de apă, fiind invers
proporţional cu acesta. Astfel, cu cât debitul de vapori de apă este mai mare, cu atât timpul necesar
antrenării uleiurilor esențiale se reduce.
Există mai multe variante de antrenare cu vapori de apă:
a. Antrenarea la foc direct (hidrodistilare)
b. Antrenarea în curent de vapori (directă sau indirectă)
c. Antrenarea cu abur sub presiune
d. Antrenarea la presiune redusă
Compoziţia uleiului volatil obţinut din acelaşi material vegetal poate fi diferită, în funcţie de
procedeul de extracție utilizat. În timpul antrenării au loc procese chimice care modifică compoziţia
uleiului.

9
1.1.2.a. Hidrodistilarea
Este cel mai vechi procedeu de obţinere a uleiurilor volatile, care se mai foloseşte şi în zilele
noastre, concomitent cu procedeele moderne.
Factorii care afectează calitatea uleiului sunt:
 durata distilării
 pH–ul soluţiei
 gradul de mărunţire al materiei prime
 temperatura, etc.
Timpul de antrenare este determinat și de locul unde sunt situate celulele care stochează uleiul
volatil.
Ordinea de antrenare a componentelor uleiului volatil depinde, în primul rând, de polaritatea
acestora şi mai puţin de volatilitatea acestora. Astfel, primele componente antrenate sunt compuşii
terpenici oxigenaţi, componenţii hidrocarbonaţi – deşi au puncte de fierbere mai joase, sunt antrenaţi
ulterior.
În timpul antrenării, datorită faptului că materialul vegetal conţine acizi organici, pH-ul
mediului scade la valori slab acide sau puternic acide. Acest lucru favorizează fenomene de hidroliză,
racemizare, eliminare, ciclizare. Pentru a reduce durata operațiunii de antrenare este importantă
mărunţirea materialului supus antrenării, durata redusă ducând implicit la eliminarea reacţiilor
nedorite.
Instalaţia de antrenare a uleiurilor volatile se compune din (Figura 4) :
1. Antrenor - vasul în care se încarcă materialul supus antrenării;
2. Gât de lebădă - care reprezintă o conductă de evacuare a vaporilor cu o secţiune din ce
în ce mai mică pe măsură ce se îndepărtează de capacul antrenorului;
3. Condensator - este o serpentină răcită la exterior cu apă;
4. Vas florentin - este vasul de colectare a condensului unde are loc separarea fazelor. În
cazul uleiurilor volatile cu densitate mai mică decât a apei, acestea se recoltează pe la partea superioară
a vasului. În cazul uleiurilor cu densitate mai mare decât a apei acestea se recoltează pe la partea
inferioară a vasului florentin.

10
 Figura 4. Instalaţie de hidrodistilare (Gh Rădoiaș, 2013)
1 – antrenor, 2 – gât de lebădă, 3 – condensator, 4 – vas florentin
Avantajul hidrodistilării este acela că instalaţia se poate monta acolo unde se găseşte materialul
vegetal, încălzirea realizându-se cu lemne sau chiar cu materialul vegetal deja antrenat, dar uscat în
prealabil (Gh Rădoiaș, 2013).

1.1.2.b. Antrenarea în curent de abur sau vapori

În general, uleiurile volatile care sunt standardizate şi pentru care există normative de calitate
sunt obţinute prin acest procedeu (Figura 5). Aceasta presupune tratarea materialului vegetal cu abur
saturant, generat într-un cazan de abur separat. În acest fel, se asigură încălzirea uniformă a materiei
prime, evitându-se contactul acesteia cu peretele supraîncălzit al antrenorului, aşa cum se întâmplă în
cazul hidrodistilării. Degradarea uleiului esențial obținut prin acest procedeu este, practic, absentă.
Instalația industrială se compune din următoarele elemente constructive:
 Antrenorul - este un recipient metalic de formă cilindrică de mare capacitate, cu fund și
capac elipsoidal. Materialul vegetal se încarcă în coșuri metalice perforate sau direct pe un grătar
metalic montat la fundul antrenorului. În cazul fructelor, seminţelor sau radăcinilor măcinate, se va
avea în vedere folosirea unui material textil, pentru a împiedica trecerea particolelor mărunţite prin
perforaţiile coșului metalic.
Încălzirea se poate face direct prin injectarea aburului la partea inferioară a antrenorului sau
indirect, printr-o manta de încălzire conectată la o sursă de abur primar.
 Condensatorul - este de tip tubular, răcit cu apă. În acesta are loc condensarea amestecului
azeotrop abur - ulei, rezultând o fază lichidă care se va colecta în vasul colector.
 Vasul de colectorare are și rol separator, aici obținându-se faza organică (uleiul esențial).

11
 Apa rezultată se recirculă în antrenor pentru a se reduce pierderile generate de solubilitatea
parțială a uleiului volatil în apa de antrenare (cohobație).

Figura 5. Instalaţie de antrenare în curent de vapori (Gh Rădoiaș, 2013)

1 – antrenor, 2 – condensator, 3 – coş metalic cu material vegetal, 4 – serpentină perforată, 6 – manta de
încălzire, 7 – recirculare fază apoasă (cohobaţie)

Diferenţa dintre hidrodistilare şi această metodă de antrenare este faptul că ordinea de antrenare
a componenţilor din uleiul volatil este în funcţie de volatilitatea lor. Astfel, întâi se antrenează
componentele cu volatilitate mai mare (hidrocarburi monoterpenice), iar ultimele cele mai puţin
volatile (V. Eliu Ceaușescu, 1988).
Acest procedeu, în diverse variante, este cel utilizat pentru obţinerea celor mai multe uleiuri
volatile, inclusiv a celor abordate în prezenta lucrare: cimbru, oregano și scorțișoară.
Procesul de antrenare durează de obicei destul de mult pentru scorțișoară (circa 12 de ore), iar
pentru uleiul esențial oregano și cimbru, durata de antrenare este de aproximativ 8 ore.
Uleiurile esențiale de cimbru și scorțișoară utilizate în prezenta lucrare s-au obținut cu ajutorul
unei instalații de laborator la scară micropilot prin procedeul antrenării cu vapori de apă, după
principiul dispozitivului Clevenger. [ (Constantin F. Pavlov, 1981), (Pode, 2001), (Lazăr Gabor,
Timișoara)]. Uleiul esențial de oregano, a fost de asemenea obținut prin procedeul de antrenare cu
vapori.
Schema instalației și ansamblul acesteia sunt prezentate în Figura 6.
12
 Figura 6. Instalația micropilot de obținere a uleiurilor volatile prin antrenare cu vapori de apă
– imagine de ansamblu și schema de principiu (Natural Ingredients R&D S.R.L.)

Descrierea instalației
Instalația este prevăzută cu un blaz (2) din oțel inoxidabil pentru industrie alimentară, cu
capacitatea totală de 9 l și volumul util de umplere Vutil = 7 l. Blazul este izolat termic (6) cu vată
minerală și comunică cu atmosfera prin intermediul unui robinet (4) care se închide după ce instalația a
fost alimentată. Blazul este încălzit cu ajutorul unei rezistențe electrice (1) cu puterea de 1000 W.
Aburul generat în interior este condus către schimbătorul de căldură tip ”țeavă în țeavă” (7) printr-o
conductă de cupru izolată termic cu vată minerală (5), având secțiunea interioară de Ø15 mm. La
nivelul schimbătorului de căldură are loc condensarea vaporilor de apă care au antrenat și uleiul
volatil. Răcirea condensatorului se face cu apă de la rețeaua de apă a laboratorului. Uleiul antrenat se
acumulează în vasul de colectare (11), realizat tot din cupru, cu volumul de 300 ml și se separă de
condens pe baza nemiscibilității fazei organice cu faza apoasă.
Condensul apos se reintroduce în blaz prin intermediul traseului (12) prevăzut cu un robinet –
în cazul uleiurilor care au densitatea mai mică decât cea a apei; respectiv prin intermediul traseului
(13), de asemenea prevazut cu un robinet – în cazul uleiurilor care au densitatea mai mare decât cea a
apei. După încheierea procesului de antrenare cu vapori de apă, conținutul vasului (11) (ulei volatil

13
antrenat și condens în exces), se golește într-un recipient de colectare (16) prin intermediul ștuțului de
golire (15) prevăzut cu robinet.
Funcționarea instalației
Așa cum s-a menționat la descrierea instalației, acesta poate fi folosită atât pentru obținerea
uleiurilor volatile cu densitate mai mică decât cea a apei (majoritatea situațiilor practice – uleiurile
abordate în lucrare) cât și pentru obținerea uleiurilor volatile cu densitate mai mare decât cea a apei (de
ex benzaldehida sau aldehida cinamică).
1) Alimentarea instalației
Se demontează capacul blazului prin destrângerea flanșelor aferente. Se introduc 6,3 - 6,4 l apă
de robinet si 600 - 700 g material vegetal fin mărunțit. Se montează la loc capacul blazului și se
deschide robinetul de aerisire cu care acesta este prevăzut. Din datele de literatură se obține densitatea
față de apă a uleiu care urmează să fie antrenat. Se inchide robinetul ștuțului de golire, si unul din
robineții corespunzatori traseului (12) sau (13) funcție de densitatea uleiului, așa cum este descris în
paragrafele următoare. Prin portul de umplere (10) se introduc 600 mL apă pentru umplerea vasului
(11) si a traseului selectat. Se inchide robinetul de aerisire de pe capacul blazului si se pornește sursa
de încălzire electrică. Se stabilește timpul de antrenare și se supraveghează instalația pe toată durata
funcționării.
A – densitatea uleiului volatil obținut este mai mică decât densitatea apei.
Această situație este aplicabilă pentru obținerea uleiurilor volatile de cimbru și oregano. În
acest caz, se inchide robinetul corespunzător traseului (13), robinetul ștuțului de golire (15) și se
deschide robinetul corespunzător traseului (12). În figura 7 se poate observa reprezentarea schematică
a circulației condensului și dispunerea stratului de ulei față de condens in vasul de colectare (11).

Figura 7. Poziționarea robineților pentru uleiuri esențiale mai ușoare decât apa

14
B – densitatea uleiului volatil obținut este mai mare decât densitatea apei.
Această situație este aplicabilă pentru obținerea uleiului de scorțișoară din surse naturale. În
acest caz, se inchide robinetul corespunzător traseului (12), robinetul ștuțului de golire (15) și se
deschide robinetul corespunzător traseului (13). În figura 8 se poate observa reprezentarea schematică
a circulației condensului și dispunerea stratului de ulei față de condens in vasul de colectare (11).

Figura 8. Poziționarea robineților pentru uleiuri esențiale mai grele decât apa

2) Colectarea uleiului volatil

După atingerea duratei stabilite de antrenare se oprește încălzirea electrică și se menține racirea
cu apă a schimbătorului de căldură. După aproximativ o oră, timp în care temperatura conținutului din
blaz scade suficient astfel încât să nu se mai genereze abur, se deschide robinetul corespunzător
ștuțului de golire (15) și masa de produs brut din vasul de colectare (11) este transferată în recipient
(16). Se colectează aproximativ 300 ml lichid (amestec) care contine atât uleiul volatil antrenat (faza
organică), cât și un rest de condens (faza apoasă). Această cantitate este transvazată într-o pâlnie de
separare de 500 ml. Se lasă în repaus până la o separare cât mai netă a fazelor. Se separă uleiul volatil
brut, se cântărește și se calculează randamentul de antrenare.
3) Golirea și spălarea instalației
După ce temperatura blazului ajunge la valoarea temperaturii ambiante, se desfac flanșele și
conținutul blazului (resturi vegetale cu o cantitate de apă) se aruncă. Blazul este clătit cu apă de la
robinet pentru a înlătura urmele de material vegetal de pe pereți. Se introduc 4 l apă, se montează
instalația în mod identic ca pentru o antrenare obișnuită, dar robineții corespunzători traseelor (12),
(13) și ștuțului de golire (15) vor rămâne deschiși. Nu este necesară adăugarea de apă prin portul de
alimentare (10). Se închide doar robinetul de aerisire (14). Se pornește încalzirea electrică, se lasă
15
pornită apa de răcire prin schimbătorul termic și se lasă să funcționeze instalația până se colectează în
recipientul (16) aproximativ 3 L de condens. Prin acestă manevră se înlătură în totalitate urmele de ulei
volatil care pot rămâne în instalație, evitându-se astfel contaminarea următorului produs antrenat.

Obținerea uleiului esential de cimbru

Thymus vulgaris este principala specie din care se obține uleiul esențial de cimbru. Se folosește
partea aeriană a plantei care se recoltează în perioada înfloririi. Antrenarea cu vapori de apă durează în
medie 8 ore și se obține 0.3 – 0,7 % ulei volatil. Din punct de vedere al compoziției chimice, uleiul de
cimbru prezintă o variabilitate foarte mare. Varietatea luată în lucru este uleiul volatile din cimbru de
cultură (Thymus vulgaris), ai căror parametrii fizico-chimici sunt cuprinși în Tabelul 1.
Tabelul 1

Parametrii fizico-chimici Valori admise

Aspect Lichid limpede, fără depuneri și suspensii

Culoare Slab gălbui la maro deschis

Miros Aromat, caracteristic de cimbru

Densitate relativă la 20°C 0,890-0,930

Indice de refracţie la 20°C 1,4950-1,5050

Putere rotatorie la 20°C -50 la 00

Principalii componenți ai uleiului de cimbru, determinați prin cromatogafia de gaze, sunt

cuprinși în Tabelul 2.
Tabelul 2

Component Minum % Maxim %

α -Tuien 0,2 1,5

α- Pinen 0,5 2,5

Mircen 1,0 2,8

γ-Terpinen 4,0 11,0

Limonen 0,6 2,2

p-Cimen 14,0 28,0

Linalool 3,0 8,5

Terpinen-4-ol 0,1 2,5

Timol 37,0 47,5

16
 Carvacrol 0,5 5,5

β -Cariofilen 0,5 2,0

Cel mai important din punct de vedere comercial este chemotipul ”timol”, acesta fiind și
compusul activ principal. Se găsește în ulei într-un procent de aproximativ 40 – 50% și este compusul
responsabil de acțiunea antimicrobiană a acestui ulei esential. Timolul este un compus fenolic
monoterpenic, izomer cu carvacrolul. Structura chimică este prezentată în figura 8 [ (Prasanth Reddy,
2014), (Maher Ali Ahmed Al. Maqtari, 2011), (Höferl M., 2009)].

Figura. 9 Timol. Structura chimică.

Obținerea uleiului esențial de oregano

Specia Origanum vulgare este o plantă ierboasă care crește în zonele montane ale multor țări
europene. Uleiul volatil se obține din vârfurile florale, prin antrenare cu vapori de apă după uscare, cu
randamente de până la 1%. Durata antrenării este de aproximativ 8 ore. Pentru aplicații farmaceutice
este necesară rectificarea uleiului obținut. Uleiul are o culoare gălbuie – roșiatică, cu un miros intens
fenolic, ierbaceu foarte proaspăt.
Caracteristicile fizico-chimice ale uleiului de oregano sunt cuprinse în Tabelul 3.
Tabelul 3

Parametrii fizico-chimici Valori admise

Aspect Lichid limpede, fără depuneri

Culoare Galben deschis la roșiatic

Miros Condimentat, ierbos, caracteristic de oregano

Densitate relativă la 20°C 0,930-0,960

Indice de refracţie la 20°C 1,4900-1,5150

Putere rotatorie la 20°C -50 la +50

Compoziția uleiului de oregano este redată în Tabelul 4.

17
 Tabelul 4

Component Minum % Maxim %

α- Pinen 0,1 0,5

Camfen 0,1 0,8

β-Pinen 0,6 1,5

Mircen 0,1 0,5

Limonen 0,5 1,2

1,8-Cineol 1,0 2,0

γ-Terpinen 2,5 5,5

p-Cimen 3,0 5,0

Camfor 0,6 2,0

Linalool 2,0 6,0

β -Cariofilen 3,0 5,5

α -Terpineol 0,8 2,5

Timol 2,0 3,0

Carvacrol 70,0 80,0

Carvacrolul este compusul chimic activ principal și se găsește în proporție de 70 – 80 %, fiind

responsabil pentru efectul antimicrobian al uleiului esențial de oregano. Din punct de vedere chimic,
carvacrolul este tot un derivat fenolic monoterpenic ca și timolul cu care este izomer. În figura 9 este
prezentată structura chimică a carvacrolului.

Figura. 9. Carvacrol. Structura chimică.

La ora actuală, se consideră că acest compus are o acțiune antimicrobiană foarte intensă, dar si
acțiune antivirală și antifungică. Este de asemenea activ față de mulți paraziți ai omului. Uleiul de
oregano cu un conținut bogat în carvacrol se poate administra atât intern (3 – 5 picături/zi), cât și în

18
aplicații externe sau în aerosoli pentru infecții ale căilor respiratorii superioare și ale sinusurilor feței [
(Bodea, 1982), (Burt, 2004), (EFSA, 2010)].

Obținerea uleiului esențial de scorțișoară

Pentru scopuri medicale și parfumeristice se folosește specia Cinnamonum cassia cunoscută și
sub numele de scorțișoară chinezească. Distilarea trebuie condusă atent pentru a recupera în măsură cât
mai mare compușii greu antrenabili – uneori se folosește distilarea extractivă în locul hidrodistilării
simple. Durata antrenării trebuie sa fie de minim 12 ore. Randamentul în ulei esential este cuprins între
0,5 – 1,5 %. Uleiul brut se supune rectificării și se obține un lichid gălbui cu miros cald, balsamic și
ușor picant.
Parametri fizico-chimici ai uleiului de scorțișoară sunt cuprinși în Tabelul 5.
Tabelul 5

Parametrii fizico-chimici Valori admise

Aspect Lichid limpede, fără depuneri

Culoare Galben la orange

Miros Dulceag, balsamic, caracteristic de scorțișoară

Densitate relativă la 20°C 1,050-1,060

Indice de refracţie la 20°C 1,6000-1,6250

Putere rotatorie la 20°C -20 la +20

Principalii componenți ai uleiului de scorțișoară sunt prezentați în Tabelul 6.

Tabelul 6

Component Minum % Maxim %

Benzaldehida 0,5 1,5

β -Cariofilen 0,2 0,8

Aldehida cinamică 75,0 90,0

Acetat de cinamil 3,5 5,0

Eugenol 0,2 0,5

Alcool cinamic 0,3 1,0

Cumarină 1,0 2,5

19
 Compusul principal este aldehida cinamică prezentă în cantitate mare – peste 75%. Aldehida
cinamică este cunoscută în aplicații medicale pentru acțiunea sa antibacteriană, antifungică și
antivirală. De asemenea, are efect antiinflamator și antitrombotic. Uleiul de scorțisoară și-a dovedit
eficiența atât în infecțiile cu agenți patogeni gram pozitivi, cât și cu agenți patogeni gram negativi,
precum și în infestațiile parazitare cu Giardia sp. și unii dermatofiți [ (Filoche, Soma, & Sissons,
2005), (Rao & Gan, 2014), (Tung, Chua, Wang, & Chang, 2008)]. Din punct de vedere structural,
aldehida cinamică este un derivat aromatic (Figura 10) [20]:

Figura. 10 Aldehida cinamică. Structură chimică.

Așa cum am prezentat succint mai sus, activitatea antimicrobiană a uleiurilor selectate pentru
experimentări în prezenta lucrare se bazează pe terpenoidele oxigenate care se găsesc în componența
lor (timol, carvacrol, aldehida cinamică). Totuși, numeroase studii au arătat că și componenții
hidrocarburi din aceste uleiuri prezintă, de asemenea, efecte antimicrobiene, interacțiunile lor putând
duce atât la efecte antagonice, cât și sinergice. Unele studii au arătat faptul că uleiurile esențiale
complete au activitatea antimicrobiană mai mare decât principalele componente ale lor, acest fapt fiind
dovada potențării reciproce a componenților din uleiul essential.
În afară de uleiurile volatile și extractele vegetale, o altă categorie de odorante cu potențială
activitate microbiologică este reprezentată de extractele de origine animală. Din acestă ultimă
categorie face parte și moscul, care a fost utilizat încă din antichitate. Structura chimică a acestui tip de
odorant este foarte complexă.
Moscul este un feromon secretat de niște glande situate în abdomen, anterior organelor genitale
ale masculului mosc. Glandele au forma unui sac cu lungimea de aproximativ 6 – 7 cm și diametrul de
2 – 5 cm. Moscul este o secreție de consistența mierii puternic odorantă, folosită de animal pentru
marcarea teritoriului și pentru atragerea femelelor. În perioadele de reproducere, la nivelul acestor
glande se găsesc aproximativ 30 – 40 g de secreție. Secreția se prelevează fie prin sacrificarea
animalelor, fie prin recoltare o singură dată pe an în cazul animalelor din captivitate. Se folosește în
medicina tradițională chineză, ayurvedică și într-o mică măsură în medicina homeopată europeană.
Desigur, utilizarea sa în parfumeristică este bine cunoscută. În general, tincturile sunt cele mai
utilizate, se folosește pentru extracție alcoolul etilic în raport de 1:10. Din punct de vedere
organoleptic, tinctura de mosc este un lichid de culoare ușor brună, cu un miros tipic de mosc, cald,
animalic, cu tonuri fin lemnoase. Compusul odorant principal este (-) muscona. Se mai găsește

20
normusconă și multi compuși fără proprietăți odorante: grăsimi, ceruri, parafine, hemoglobină, uree și
săruri minerale [ (Pengfei Liu, 2014)].

1.1.3. Substanțele, ustensilele și aparatura folosite

Ustensile: Plăci Petri, tampon steril de unică folosință cu vârf de bumbac, eprubetă, microcomprimate
standardizate cu antibiotice pentru testare, discuri difuzimetrice de 6 mm din hârtie de filtru, riglă
gradată, 4 vârfuri pentru pipetă de 10 µl, pensă curbată.
Aparatura: DensiCHECK Plus [ (Kit Densicheck Plus Instrument, 2018)], termostat, pipetă automată
de 10-100 µl, bec Bunsen
Substanțe: 3 ml ser fiziologic (clorură de sodiu 0.9%), inocul de 0,5 McFarland (etalon), mediu de
cultură Muller-Hinton Agar, uleiuri esențiale (cimbru, oregano, scorțișoară) și tinctură de mosc.
Toate experimentele s-au realizat într-un laborator de microbiologie având dotările necesare
pentru manipularea agenților patogeni obișnuiți. În figura 11 este prezentată masa de laborator cu
ustensilele necesare efectuării experimentului.

Figura 11. Masa de laborator. Ustensilele necesare efectuării experimentului.

1.2. Descrierea metodei. Antibiograma.

Antibiograma prin metoda difuzimetrică Kirby-Bauer este o metodă semicantitativă (simplă și
cu costuri reduse) larg utilizată în activitatea laboratoarelor de microbiologie clinică pentru
determinarea in vitro a sensibilității/rezistenței la antibiotice a unui microorganism care poate fi
cultivat pe un mediu de cultură adecvat, de regulă fiind cultivat pe mediul de cultură Muller-Hinton
Agar. [ (Antibiotic Sensitivity Testing Presentation, 2008), (P.N., 2018)].

21
 Metoda se bazează pe difuzia antibioticului în mediul de cultură cu realizarea unei concentrații
de antibiotic progresiv descrescânde pe măsură ce ne îndepartăm de microcomprimatul cu antibioticul
respectiv. Astfel se va atinge o concentrație minimă inhibitorie care se apreciază semicantitativ prin
măsurarea diametrului ariei de inhibiție a creșterii microorganismelor, din jurul microcomprimatului.
Practic, într-o placă Petri se toarnă un strat de aproximativ 4 mm mediu de cultură steril, de
regulă Muller-Hinton Agar, iar după răcire se însămânțează întreaga suprafață a plăcii cu o cultura
pură dintr-un inocul care conține microorganismul de interes, cultură astfel preparată încât să
corespundă la o concentrație de germeni de 0,5 unități McFarland.
Standardizarea McFarland este larg utilizată în microbiologie pentru aprecierea semicantitativă
a numărului de germeni existenți în 1 ml de suspensie bacteriană (exprimarea standardizată este
”densitate bacteriană” – Nr. UFC / ml). Aprecierea acestei densități se face cel mai corect nefelometric
– turbidimetric, dar pentru uzul curent al laboratoarelor clince este suficientă o cuantificare simplă
fotometrică la lungimea de undă λ = 600 nm. Etalonarea fotometrului se face cu o suspensie de sulfat
de bariu (BaSO4) preparat in situ prin precipitarea sulfatului de bariu în urma reacției clorurii de bariu
cu acidul sulfuric, conform reacției:
BaCl2 + H2SO4 → BaSO4 + 2 HCl
Determinarea fotometrică s-a facut cu dispozitivul: DensiCHECK Plus.
In tabelul 7 este prezentată scara McFarland și modul de preparare a suspensiei de sulfat de
bariu, respectiv corespondența cu densitatea bacteriană corespunzare.
Tabel 7
Standard McFarland
0,5 1 2 3 4
(unități)
Soluție 1% BaCl2 (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
Soluție 1% H2SO4 (ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6
Densitate bacteriană (Nr.
UFC/ml = 1 x 108 celule 1,5 3 6 9 12
bacteriene/ml)
Absorbanța la
0,09 0,257 0,451 0,582 0,669
λ = 600 nm
Transmitanța (%) 74,3 55,6 35,6 26,4 215

Însămânțarea se face cu un tampon steril cu vârf de bumbac, înmuiat în suspensia bacteriană

care se trece apoi peste toată suprafața plăcii Petri.
Ulterior, se dispun microcomprimatele cu antibioticele de testat la o distanță de 30 mm între ele
și de 15 mm fată de marginea plăcii, astfel încat să se evite interferența dintre acestea și să se poată
aprecia corect diametrul zonei de inhibiție. Dispunerea microcomprimatelor se poate face fie manual
22
cu ajutorul unei pensete sterile, fie cu dispensere automate care au avantajul rapidității muncii și un
control mai strict al sterilității (Figura 12).

Figura 12. Aplicarea microcomprimatelor cu dispenserul (După www.flickr.com)

Microcomprimatele utilizate pentru efectuarea antibiogramei sunt niște discuri de hârtie cu

adiametrul de 6,5 mm impregnate cu o cantitate riguros determinată de agent antimicrobian.
Identificarea discurilor se face printr-un sistem de codare internațional valabil format din 1 – 3 litere
imprimate pe ambele fețe ale discului. Sunt ambalate în tuburi din plastic cu 50 de microcomprimate.
Tuburile sunt prevăzute cu un agent de deshidratare – silicagel pentru a limita efectul negativ al
umidității atmosferice. În tabelul 8 sunt prezentate câteva microcomprimate de antibiotice uzuale cu
caracteristicile lor:
Tabel 8
Concentrația de antibiotic / Simbol (codificare
Antibioticul
microdisc internațională)
Amikacin 30 µg AN
Amoxicilină 25 µg AMX
Amoxicilin + Acid clavulanic 20 µg + 10 µg AMC
Ampicilină 2 µg sau 10 µg AMN2 sau AM
Cefaclor 30 µg CEC 30
Cefalexin 30 µg CN
Cefoperazonă 75 µg sau 30 µg CFP75 sau CFP 30
Clindamicină 2 µg CM
Gentamicină 10 µg sau 30 µg GM sau GME30
23
 Linezolid 10 µg sau 30 µg LZD10 sau LZD30
Metronidazol 4 µg MTR
Norfloxacină 10 µg sau 5 µg NOR10 sau NOR5
Oxacilină 1 µg sau 5 µg OX1 sau OX
Penicilină 6 µg respectiv 10 UI P
Rifampicină 5 µg sau 30 µg RA5 sau RA30
Streptomicină 10 µg S
Tetraciclină 30 µg TE
Tobramicină 10 µg sau 30 µg TM sau TOB30
Trimetroprim - Sulfametoxazol 1,25 µg + 23,75 µg SXT
Vancomicină 5 µg sau 30 µg VA5 sau VA

Plăcile astfel pregatite se incubează la termostat pentru 24 ore la 370C. După incubare, cu
ajutorul unei rigle gradate în mm se măsoară diametrul zonei de inhibiție a creșterii microbiene,
această inhibiție fiind direct proporțională cu sensibilitatea/rezistența in vitro a microorganismului
respectiv la antibioticele testate – concentrația minimă inhibitorie (Figura 13).
Valorile obținute în urma măsurătorilor se raportează întotdeauna la valorile de referință pentru
fiecare antibiotic testat. Astfel se poate încadra microorganismul respectiv în una din cele trei categorii
clinice de sensibilitate:
- Rezistent
- Intermediar sensibil
- Sensibil
În practica clinică curentă se va utiliza atunci cind este posibil un antibiotic la care germenul
respectiv este sensibil, de preferință antibioticul la care sensibilitatea este maximă. Antibioticele din
categoria ”intermediar sensibil” se vor utiliza doar atunci când există contraindicații ferme de
administrare a unui antibiotic din categoria ”sensibil”.
Întotdeauna interpretarea rezultatelor unei antibiograme se va face utilizând ghidurile
internaționale referitoare la testele de susceptibilitate a microorganismelor la antibiotice:
1.World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1992. Technical
report series 822. W.H.O., Geneva.
2. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Approved standard M2-A10.
Performance standards for antimicrobial susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa.
3. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST QC
Tables V1.2. 2010.
Trebuie precizat faptul că există situații clinice în care sensibilitatea unui anumit
microorganism in vitro poate fi diferită de cea in vivo, fapt care duce la dificultăți serioase în
24
elaborarea planului terapeutic [ (Brown & Kothari, 1975), (Bonev, Hooper, & Parisot, 2008), (Bauer,
Kirby, Sherris, & Turck, 1966)].

Figura 13. Principiul antibiogramei (adaptare după www. Disk_diffusion_test.org)

Controlul calității acestor microcomprimate, respectiv stabilirea limitelor de control se face utilizând
tulpini microbiene standardizate (standarde interne CLSI):
- Gentamicină 120 µg – E. faecalis ATCC 29212 (16 – 23 mm)
- Streptomicină 300 µg – E. faecalis ATCC 29212 (14 – 20 mm)
- Gentamicină 500 µg – S. aureus ATCC 25923 (30 – 34 mm) și E. faecalis ATCC 29212 (18 – 28
mm)
- Kanamicină 1 mg - S. aureus ATCC 25923 (minim 14 mm) și E. faecalis ATCC 29212 (minim 10
mm)
- Streptomicină 500 µg - S. aureus ATCC 25923 (24 - 28 mm) și E. faecalis ATCC 29212 (14 – 25
mm)
- Cefoperazonă + Sulbactam 75µg + 30 µg – E Coli ATCC 35218 (24 – 30 mm)

1.3. Descrierea modului de lucru

Experimentul s-a desfășurat în două etape:
- O primă etapă a constat studiul sensibilității microorganismului la antibioticele uzuale folosite în
mod obișnuit pentru tratarea infecțiilor stafilococice la om
- O a doua etapă care a constat în studiul efectului antimicrobian al uleiurilor volatile de cimbru,
oregano și scorțișoară, respectiv a tincturii de mosc.
Tehnica de lucru este identică în ambele etape ale studiului.
În prealabil au fost făcute discurile difuzimetrice din hârtie de filtru, cu ajutorul perforatorului,
ulterior fiind sterilizate de două ori.

25
 Sterilizarea s-a facut prin autoclavare la temperatura de 1210 C timp de 30 minute după care
materialul a fost lăsat să se răcească în mediu controlat pentru a evita umectarea acestuia. (Figura 14)

Figura 14. Autoclav (După http://www.den-team.ro)

De asemenea, a fost izolată o colonie de stafilococ auriu dintr-o probă de secreție nazală, pre-
însămânțată pe o placă Petri cu mediu de cultură Geloză Sânge berbec 5%, care a fost pusă apoi la
termostat timp de 24h la o temperatură de 37°C, pentru a se dezvolta o monocultură pură. A doua zi,
din respectiva monocultură, s-au însămânțat două plăci Petri, una cu mediu de cultură Geloză Sânge
berbec 5% iar cealaltă cu mediu de cultură cromogen UTI (Urinary Tract Infection), plăcile fiind puse
apoi în termostat timp de 24h la 37°C pentru a se dezvolta microorganismul. (Figura 15)

Figura 15. Aspectul culturii de Staphylococus aureus pe Geloză Sânge si Muller Hinton Agar (original)

A doua zi, s-a făcut un inocul de 0,5 McFarland, astfel: Într-o eprubetă s-au pus 3 ml de soluție
salină în care s-au omogenizat două unități formatoare de colonii (UFC), din monocultura de stafilococ

26
auriu, de pe placa cu Geloză Sânge, cu ajutorul unui tampon steril de unică folosință cu vârful de
bumbac. Ulterior, cu ajutorul aceluiași tampon steril de unică folosință cu vârful din bumbac, s-au
însămânțat 4 plăci Petri cu mediu de cultură Muller-Hinton Agar (Figura 16).

Figura 16. Plăcile Petri pentru testarea uleiurilor esențiale și a tincturii de mosc. Se observă fotometrul de
apreciere a densității culturii bacteriene McFarland (original)

Cu ajutorul unei pense, a unei pipete automate 10-100 µl și a 4 vârfuri de 10 µl s-au prelevat,
pe rând, câte 10 µl din fiecare ulei pentru fiecare din cele 3 discuri alocate fiecărui ulei, în parte,
îmbibându-se fiecare disc cu 10 µl ulei.
Discurile, cu ajutorul pensei, au fost așezate pe suprafața mediilor ante-însămânțate, astfel:
Câte 3 discuri îmbibate cu același ulei, pe aceeași placă Petri cu mediu Muller-Hinton Agar ante-
însămânțată cu stafilococ auriu. S-a procedat în acest fel, pentru a se putea calcula o medie a
diametrelor zonelor de inhibiție. Ulterior, plăcile au fost puse în termostat timp de 24h la o temperatură
de 37°C. Trebuie precizat că pensa a fost sterilizată la flacără după fiecare utilizare.
După 24h, plăcile au fost scoase din termostat iar diametrele zonelor de inhibiție care s-au
format, au fost măsurate și a fost calculată media diametrelor zonelor de inhibiție, pentru fiecare ulei în
parte. Procedura s-a repetat și după 48h.
Antibiograma clasică (figura 17) s-a facut cu urmatoarele antibiotice: penicilină, cefoxitin,
eritromicină, clindamicină, gentamicină, norfloxacin, biseptol (trimetoprim – sulfametoxazol) și
cloramfenicol.

27
 Figura 17. Staphylococus aureus. Cultură pură. Antibiogramă convențională.

Plăcile Petri folosite pentru antibiogramă, au conținut mediu de cultură Muller Hinton Agar.
Rezultatele s-au citit după 24 ore de incubare la termostat la 370C.
În toate cazurile s-au utilizat doar plăci Petri din material plastic de unică folosință care după
încheierea experimentului au fost inactivate prin autoclavare alături de celelalte materiale consumabile
contaminate / posibil contaminate biologic. Ulterior acestea se transportă în condiții adecvate spre a fi
incinerate. Fotometrul DensiCHECK Plus, este decontaminat folosind procedurile și soluțiile
recomandate de producător.
Se respectă precauțiile universale de lucru cu germeni patogeni obișnuiți, purtarea de mănuși și
halat de laborator.
Am utilizat normativul de biosiguranță publicat de Ministerul Sănătății din România, pentru
activitatea de microbiologie ce se desfășoară în laboratoarele clinice de analize medicale. Lucrarea este
înregistrată sub ISBN 973-99-893-7-3, fiind publicată în anul 2005.
Masa de lucru este dezinfectată obligatoriu la încheierea activității sau ori de cite ori s-a produs o
contaminare accidentală.
În figura 18 se observă modul de lucru în laborator.

28
 Figura 18. Modul de lucru în laboratorul de microbiologie.

CAPITOLUL 2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Prelucrarea datelor experimentale din cele două etape ale experimentului au arătat următoarele:

Etapa 1. Antibiograma convențională [ (Joshi, 2010)].

In tabelul 8 sunt prezentate rezultatele testării sensibilității tulpinii de stafilococ auriu utilizată
în acest studiu, la următoarele antibiotice: penicilină, cefoxitin, eritromicină, clindamicină,
gentamicină, norfloxacin, biseptol (trimetoprim – sulfametoxazol) și cloramfenicol.
Tabelul 8
Diametrul zonei
Sensibil Rezistent
Antibiotic de inhibiție Sensibilitate
<(mm) <(mm)
(mm)
Penicilină 12 26 26 Rezistent
29
 Cefoxitin 32 22 22 Sensibil

Eritromicină 22 21 21 Sensibil

Clindamicină 24 22 22 Sensibil

Gentamicină 22 18 18 Sensibil

Norfloxacin 24 17 17 Sensibil

Biseptol (sulfametoxazol – 28 17 17 Sensibil

trimetoprim)
Cloramfenicol 24 18 18 Sensibil

Dacă se reprezintă grafic diametrele zonelor de inhibiție pentru fiecare antibiotic în parte ținând
cont de valorile de definire a sensibilității, respectiv rezistenței pentru fiecare antibiotic (se face
corecția matematică a rezultatelor), putem stabili care este antibioticul cel mai potrivit pentru
eradicarea tulpinii de stafilococ auriu luată în lucru. În figura 19 se observă acestă sensibilitate
corectată, cu evidențierea biseptolului ca fiind cel mai potrivit agent antimicrobian clasic în respectiva
infecție.
Desigur că, în situații clinice particulare se poate lua in considerare și administrarea cefoxitin
sau norfloxacină la un pacient cu acestă infecție, data fiind incomoditatea de administrare a
biseptolului ( 2 x 2 comprimate / zi) și faptului că acesta este greu accesibil în forma injectabilă.
Cu toate acestea biseptolul administrat oral, azuri în care nu avem o infecție sistemică
amenintătoare de viată (septicemie), oferă cea mai bună alternativă deoarece este un antibiotic relativ
rar prescris în ultimii ani, deci și eventualitatea unei rezistențe microbiene in vivo este mai redusă. La
pacientul nostru infecția fiind strict localizată la nivelul foselor nazale și fără simptomatologie clinică
zgomotoasă, se va administra acest antibiotic.

30
 Figura 19. Tulpina de Staphylococcus aureus studiată. Antibiograma interpretată.

Etapa 2. Studiul efectului antimicrobian pentru uleiurile esențiale de cimbru, oregano,

scorțișoară și pentru tinctura de mosc.
În figura 20 se observă aspectul plăcilor de cultura cu zonele de inhibiție produse de
substanțele naturale testate. Practic putem afirma că s-a realizat o ”antibiogramă naturală” pentru
respectiva tulpină de stafilococ auriu utilizată în cadrul acestui studiu. Diametrele zonelor de inhibiție
se măsoară exact după aceleași principii ca și în cazul antibiogramei clasice. Trebuie remarcat faptul că
pentru aceste produse nu există o standardizare a sensibilității, respectiv rezistenței ca si în cazul
antibiogramei convenționale, deci valorile diametrelor zonelor de inhibiție trebuie luate ca atare fără a
li se aplica vreo corecție. Această interpetare poate genera discuții în ceea ce privește standararea
metodei, dar este acceptabilă în acestă etapă a studiului.

31
 Figura 20. Cultura de Staphylococcus aureus. Zonele de inhibiție pentru produsele naturale testate.
”Antibiograma naturală”

În acestă situație incubarea la 370 C s-a facut timp de 48 ore cu citirea diametrelor zonelor de
inhibiție atât la 24 ore cât și la 48 ore. Fiecare experiment s-a efectual în triplicat. În tabelul 9 sunt
prezentate rezultatele obținute (valori medii).
Tabelul 9
Diametrul zonei de inhibiție Diametrul zonei de inhibiție
Produs natural la 24 ore (mm) la 48 ore (mm)
Valori medii Valori medii
Tinctură de mosc 9 7,66

Ulei esențial de scorțișoară 12,66 12,33

Ulei esențial de oregano 34,66 33,33

Ulei esențial de cimbru 36,33 34,66

Din analiza rezultatelor experimentale observăm ca efectul antibacterian cel mai puternic este
deținut de uleiurile esențiale de cimbru și oregano (diferențele între ele fiind nesemnificative). Tinctura
de mosc a dovedit un efect antibacterian minim, în cazul de față. Se observă că la 48 ore diametrele de
inhibiție au valori mai mici (fără a fi însă scăderi semnificative), fapt care poate fi explicat prin
volatilitatea compușilor bioactivi din aceste produse la temperatura de 370 C, cu slăbirea discretă a
concentrației la periferia zonei de inhibiție, probabil sub concentrația minimă inhibitorie, ceea ce
permite dezvoltarea microorganismelor în acestă zonă periferică la 48 ore.
Analiza comparativă a datelor obținute în urma efectuării antibiogramei convenționale și a celei
”naturale” se poate face strict prin comparația diametrelor zonelor de inhibiție din motivele menționate

32
anterior. În figura 21 este prezentată o situație comparativă a rezultatelor obținute în cele două etape
ale prezentului studiu (sunt prezentate rezultatele la 24 ore).

S. aureus. Antibiograma convențională versus

antibiograma ”naturală”
Situație comparativă
Diametrul zonei de inhibiție (mm)

40 36.33
34.66
35 32
30 28
24 24 24
25 22 22
20
15 12 12.66
9
10
5
0

Produsul (antibioticul) testat

Figura 21. Staphylococcus aureus. Antibiograma convențională versus ”antibiograma

naturală”. Situație comparativă.

Se observă ca efectul antimicrobian asupra tulpinii de stafilococ auriu, al uleiului esențial de

oregano și cimbru este comparabil, cel puțin ca arie de inhibiție a cresterii bacteriene in vitro, cu
antibioticele consacrate: cefoxitin, biseptol, norfloxacin, cloramfenicol.
Reprezentarea grafică a eficienței uleiului esențial de oregano și de cimbru asupra tulpinii de S
aureus luată în lucru, raportat la biseptol pe care il considerăm etalon (activitate bactericidă = 100%)
în acestă situație, este prezentată în figura 21.
Se observă că eficiența antibacteriană a acestor uleiuri este superioară biseptolului considerat
ca etalon, dar acest rezultat trebuie interpretat cu prudență, in condițiile lipsei de standardizate pentru
compușii naturali din amestecuri complexe cum sunt aceste uleiuri esențiale.

33
 Figura 22. Eficiența uleiurilor esențiale de oregano și cimbru comparativ cu biseptolul

Se observă ca uleiul esențial de cimbru are cel mai bun efect antimicrobian comparativ cu
celelalte produse naturale testate. În figura 23 se observă eficiența antimicrobiană (exprimată
procentual) a produselor analizate comparativ cu uleiul volatil de cimbru care este considerat etalon în
acestă situație.

Figura 33. Eficiența antimicrobiană a moscului, uleiului esențial de scorțișoară și oregano

comparativ cu uleiul esențial de cimbru

34
 CAPITOLUL 3. CONCLUZII

Microbiologia modernă și industria farmaceutică sunt deopotrivă puse în fața unei reale
probleme: rezistența crescândă a microorganismelor la agenții terapeutici disponibili.
Microorganismele posedă o extraordinară capacitate de a se adapta la condițiile de mediu, deci și la
antibiotice. Pe măsură ce acestă rezistență devine tot mai exprimată, se fac eforturi pentru sinteza a noi
clase de agenți cu actiune antimicrobiană. Fenomenul de rezistență la antibiotice a devenit evident la
scurt timp după ce s-a introdus penicilina în terapeutică pe scară largă. Este practic ”prețul” pe care
omenirea trebuie să il plătească în lupta continuă cu microorganismele.
În urma analizei rezultatelor experimentale obținute, se pot desprinde câteva concluzii:
1. Tema propusă a fost abordată interdisciplinar, facându-se apel la cunoștințe de
microbiologie, botanică, chimie, biochimie, respectiv la noțiuni de statistică și prelucrare a datelor.
2. Modelul experimental propus are un design care satisface cerințele studiului, fiind astfel
validat.
3. Rezistența la antibiotice a tulpinilor de stafilococ auriu este o realitate, sensibilitatea cea
mai mare fiind atinsa doar de biseptol și cefoxitin.
4. Uleiurile esențiale de cimbru și oregano au un potențial antimicrobian considerabil,
capacitatea lor de inhibiție a creșterii microbiene fiind comparabilă cu antibioticele folosite
actualmente în terapeutică. Activitatea antimicrobiană față de stafilococul auriu a celor două uleiuri
este comparabilă, fapt ce dovedește că poziția grupării hidroxil din ciclul fenolic nu afectează mult
efectul antimocrobian al lor.
Astfel, ținând cont de toate aceste rezultate, se propune luarea în considerare a respectivelor
uleiuri esențiale care au oferit cele mai puternice rezultate, ca tratament adjuvant complementar în
infectiile stafilococice de căi respiratorii superioare, putând fi în acest scop aplicate local (aerosoli),
sau administrate sistemic pe cale orală.
Pentru administrare sistemică în special, dar si pentru administrarea în aerosoli, produsele
trebuiesc supuse unui control de calitate extrem de riguros în concordanță cu cerințele impuse de
Farmacopeea Română Ed. X și a reglementărilor forurilor naționale competente.

35
 BIBLIOGRAFIE

Antibiotic Sensitivity Testing Presentation. (2008, Oct 28). Retrieved july 4, 2018, from slideshare.net:
https://www.slideshare.net/doctorrao/antibiotic-sensitivity-testing-presentation
Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., & Turck, M. (1966). Antibiotic susceptibility testing by a
standardized single disk method. Technical bulletin of the Registry of Medical Technologists,
36 (3): 49-52.
Bodea, C. (1982). Tratat de biochimie vegetală, Partea II, Compoziția chimică a principalelor plante de
cultură (Vol. IV). București: Editura Academiei Republicii Socialiste România.
Bonev, B., Hooper, J., & Parisot, J. (2008). Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics
using agar diffusion method. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 61(6):1295-301.
Brown, D., & Kothari, D. (1975). Comparison of antibiotics discs from different sources. J. Clin.
Pathol., 28:779-83.
Buiuc, M. N. (2008). Tratat de Microbiologie Clinică (Vol. II). București, România: Editura Medicală.
Retrieved iulie 3, 2018
Burt, S. (2004). Essential oils: Their antibacterial properties and potential applications in food-a
review. International Journal of Food Microbiology, 94, 223-253.
Causes and Symptoms of Staphylococcus aureus. (2010, February). (M. D. Health, Producer)
Retrieved 07 03, 2018, from health.state.mn.us:
http://www.health.state.mn.us/divs/idepc/diseases/staph/basics.html
Constantin F. Pavlov, c. (1981). Procese și aparate în ingineria chimică. București: Editura Tehnică.
EFSA. (2010). EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sorces added to Food (ANS). EFSA, (pp.
8,1514).
Filoche, S., Soma, K., & Sissons, C. (2005). Antimicrobial effects of essential oils in combination with
chlorhexidine digluconate. Oral Microbiol. Immunol., 20, 221-225.
Gh Rădoiaș, A. B. (2013). Odorante naturale în parfumeria Modernă. Cluj-Napoca: Casa cărții de
știință.
Höferl M., B. G. (2009). Correlation of antimicrobial activities of various oils and their main aromatic
volatile constituents. Journal od Essential Oil Research, 21:459-463.
Joshi, S. (2010). Hospital antibiogram; a necessity. Indian J Med Microbiol, 28 (4): 277-280.
Kit Densicheck Plus Instrument. (2018, july). (biomerieux) Retrieved july 5, 2018, from
biomerieuxdirect.com: https://biomerieuxdirect.com/industry/Bacteriology/ID-AST-
Auto/Automated-%3A-VITEK-system/Vitek2-Equipment/VITEK-2-Instrument-Sales-
New/Kit-Densicheck-Plus-Instrument/p/21250
Lazăr Gabor, D. G. (Timișoara). Transfer termic în ingineria chimică. 2002: Editura Politehnica.

36
Maher Ali Ahmed Al. Maqtari, S. M. (2011). Chemical composition and antimicrobial activity of
essential oil of Thymus vulgaris from Yemen. Turk J Biochem, 36:342-349.
P.N., S. R. (2018, july 7). Antimicrobial resistance. Retrieved from microrao.com:
https://www.microrao.com/micronotes/pg/antimicrobial_resistance.pdf
Pengfei Liu, Y. F. (2014). Administration of BMSCs with Muscone in Rats with Gentamicin-Induced
AKI Improves Their Therapeutic Efficacy. PLoS One, 9(5):e97123.
Pode, V. (2001). Procese hidrodinamice. Timișoara: Editura Politehnică .
Prasanth Reddy, R. V. (2014). Review on Thymus vulgaris Traditional Uses and Pharmacological
Properties. Med Aromat Plants, 3:3.
Rao, P., & Gan, S. (2014). Cinnamon: A Multifaceted Medicinal Plant. Evid. Based Complement.
Alternat. Med., 642942.
Rayner, W. M. (2005, Dec). Antibiotics currently used in the treatment of infections caused by
Staphylococcus aureus. Internal Medicina Journal. Retrieved 07 03, 2018, from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16271060
Robert S. Breed, E. M. (1957). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: The
Williams and Wilkins Company. Retrieved 7 3, 2018, from
https://archive.org/stream/bergeysmanualofd1957amer#page/n5/mode/2up
Tracey A. Taylor, C. G. (2017). Staphylococcus Aureus. Statpearls.com. Retrieved 07 03, 2018, from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK441868/
Tung, Y., Chua, M.-T., Wang, S.-Y., & Chang, S. -T. (2008). Anti-inflammation activities of essential
oil and its constituents from indigenous cinnamon. Bioresour. Technol., 99, 3908-3913.
V. Eliu Ceaușescu, G. R. (1988). Odorante și Aromatizante, Chimie, Tehnologie. Aplicații. București:
Editura Tehnică.

37