FORMALIZAREA REACTIILOR SI MASURI ALE

TRANSFORMARII BIOCHIMICE:
MATRICE STOECHIOMETRICA, GRADUL
MOLAR DE AVANSARE, CONVERSIA,
RANDAMENTUL, SELECTIVITATEA  
- MODUL DE DETERMINARE DIN DATE
EXPERIMENTALE
Se poate considera in mod simplificat ca reactiile celulare constau in
conversia substratului in energie libera si produsi metabolici
(metaboliti primari), si produsi complecsi (metaboliti secundari,
proteine extracelulare, proteine celulare, ADN, ARN, lipide). Pentru a
analiza acest numar mare de reactii se va specifica stoechiometria de
reactie sise va generaliza un algoritm de formalizare. Pentru aceasta
este important sa definim notiuni precum substrat, produsi
metabolici, metaboliti intracelulari si contituentii biomasei

•Substratul – reprezinta un compus prezent in mediul steril care

urmeaza sa fie metabolizat sau direct incorporat in celule; in multe
cazuri numai C, N si sursele de energie sunt luate in consideratie.
(Tip substrat: g;lucoza, amoniac, oxigen)
•Produsul metabolic – reprezinta un compus produs de celule si
secretat in mediul extracelular (mediu de cultura). De exemplu:
CO2, etanol, acetati, lactati, metaboliti secundari sau proteine
•Constituentii biomasei sunt macromoleculele ce formeaza
biomasa. Acest grup include aglomerari macromoleculare de ARN,
AND, proteine, lipde, carbohidrati, precum si macromolecule ce se
acumuleaza in interiorul celulei precum polizaharide, biopolimeri
etc.
•Metabolitii intracelulari sunt intermediari in transformarile celulare,
precum intermdiarii glicolitici, intermediari tip aminoacizi utilizati
pentru sinteza unor proteinleor, etc.
Astfel un prim caz ar fi asimilarea glucozei prin intermediul
sistemului fosfotransferaza (PTS) activ in majoritatea bacteriilor, unde
in mecanismul de transport sunt implicate un numar mare de enzime,
proces ce poate fi sumarizat prin reactia (3.1) iar al doilea studiu de
caz ar fi asimilarea amoniacului prin NADPH prin intermediul glutamat-
dehidrogenazei, pentru care se poate scrie reactia (3.2)
In reactia (3.1) coeficientii stoechimetrici sunt scrisi dupa cum
uemeaza: compusul utilizat in urmatoare areactie (ca reactant) are un
coeficient stoechimetric negativ, iar compusul format in urmatoarea
reactie are un coeficient stoechimetric pozitiv. Pe baza semnului
coeficientului stoechiometric, reactia 3.1 furnizeaza urmatoarele
informatii: 1 mol PEP este utilizat la asimilarea si fosforilarea unui
mol de glucoza, in timp ce se formeaza 1 mol de piruvat. Se noteaza:

= coeficientii stoechimetrici ai substratului (coeficienti negativi in

general),
=coeficientii stoechiometrici pentru produsii metabolici (coeficienti
pozitivi in general)
g = coeficientii stoechiometrici ai metabolitilor intracelulari (coeficieti
ce pot fi pozitivi sau negativi)
=coeficientul stoechiomatric al biomasei (contituenti
macromoleculari ai biomasei); ecuatiile 3.1 si 3.2 nu include
formarea de biomasa
De obicei, glucoza si amoniacul fuctioneaza ca substrat; cu exceptia
protonului si apei, toti ceilalti compusi sunt metaboliti intracelulari.
Astfel, avem:
glc= -1 (in reactia 3.1)
PEP = -1 (in reactia 3.1)
g glut = 1 (in reactia 3.2)
Protonul si apa sunt considerati produsi metabolici si nu se includ in
reactiile stoechiometrice datorita preponderentei lor in alti
constituenti celulari (se considera ca sunt in exces)
Pentru a formula stoechiometria unei reactii celulare, consideram un
sistem in care N substraturi sunt transformate in M produsi
metabolici si Q constituenti de biomasa.
Transformarea se desfasoara dupa J reactii in care K metaboliti
intracelulari participa ca intermediari. Doi indecsi stoechiometrici
vor indica numarul reactiei si compusul; astfel (I,j) reprezinta
coeficientul stoechiometric al substratului I in reactia j.
In stoechiometria generalizata, se introduc coeficienti
stoechiometrici pentru toti compusii utilizati ca substrat, pentru toti
produsii metabolici, pentru toti metabolitii intracelulari si pentru toti
constituentii biomasei in fecare dintre reactii. Multi dintre coeficientii
stoechiometrici devin zero, ceea ce inseamna ca respectivul compus
nu participa la o anumita reactie (in reactia 3.2 coeficientul
stoechiometric al glucozei este zero).
S(i) reprezinta susbtratul (I), P(i) produsii metabolici, Xmacro(I),
reprezinta constituentii biomasei. Caile intermediare K sunt notate
cu X met(I)
Cu acestea, stoechiometria pentru reactia celulara j se poate scrie in
foma :

Este convenabil sa scriem stoechiometria toturor celor j reactiiilor

celulare intr-o forma compacta, utilizand notarea matriciala:

Unde maricile A, B, G si G sunt matrici soechiometrice ce contin

coeficientii stoechiometrici in j reactii pentru subtraturi, produsi
metabolici, constitenti de biomasa, intermediari de proces; in
aceste matrici randurile reprezinta reactiile (reactantii) iar coloanele
metabolitii
Studiu de caz: fermentatia E.colli cu amestec de acizi
Substratul (glucoza) si sase produsi metabolici sunt recirculati.
Metabolitii intraqcelulari si cofactorii inclusi in modelul metabolic
sunt marcati cu litere ingrosate. Reactia de transaminare unde
aspartatul se formeaza din oxaloacetat este prezentata ca aminare
directa; glutamatul si 2-ketoglutaratul nu sunt prezentate (pentru
simplificitate)
Produsii din fermentatia unui amestec de acizi de catre E.colli
Reactiile specifice
Conversia glucozei la fosfenolpiruvat (PEP)

Conversia PEP la succinat

Conversia PEP la piruvat si transformarea acestuia in lactat,

format si acetil-CoA

Hidroliza formatului la dioxid de carbon si hidrogen

 Formarea acetatului si etanolului

Ecuatiile 1-8 pot fi grupate in matrice, conform ec. 3.4. Glucoza este
substrat iar succinatul, CO2, formatul, H2, acetatul si etanolul sunt
produsi metabolici, iar fosfenopiruvatul (PEP), piruvatul, acetil-
CoA, ATP si NADH sunt metaboliti intracelulari. In model nu s-au
inclus constituenti de biomasa. Cu aceste precizari, pe baza
coeficientilor stoechimetrici corespunzatori reactiilor 1- 8, se
obtine:
Pentru a calcula toata productia sau tot consumul unui compus va trebui sa
insumam contributiile diferselor reactii. Astfel se considera reactia de
foarmare a dioxidului de carbon in fermentarea mixta E.colli cu amestec de
acizi, unde CO2 se formeaza intr-o singura reactie (decarboxilarea formatului)
si este utilizat in alta reactie (carboxilarea PEP). Viteza de formare a CO2 este
evident determinata din vitezele relative ale celor doua recatii. De aceea
putem scrie viteza de asimilarea specifica neta pentru substratul I ca suma a
vitezelor sale de consumare in toate cele J reactii (relatia 3.5) si respectiv
viteza specifica neta de formare a produsului metabolic I (relatia 3.6); similar
cu aceste ecuatii pentru constituentii biomasei si metabolitii intracelulari
putem scrie ecuatiile 3.7 si 3.8:
 Insumand reactiile 3.5 si 3.8 obtinem vectorii 3.9-3.12, in care: rs
reprezinta vectorul vitesei specifice ce contine N tipuri de
subtrate specificeasimilate, iar rp reprezinta viteza specifica de
formare a produsului specific M
Determinarea vitezei specifice in fermentare E.colli cu amestec de acizi

Specificam vitezele celor 8 reactii considerate in slide-urile 13-14 ca

fiind n1-n8; pe baza acestora putem scrie ca viteza specifica de
asimilare a glucozei este:

utilizand ecuatia (3.9) gasim:

Viteza specifica de formare a produsilor metabolici se va scrie
similar; astfel pentru dioxidul de carbon avem:

Deoarece viteza specifica de formare a hidrogenului trebuie sa fie egala cu n6

iar viteza specifica de fermare a succinatului trebuie sa fie egala cu n2, viteza
de formare a CO2 trebuie sa fie egala cu diferenta dintre cele doua viteze, iar
aceasta constrangere se utilizeaza pentru a verifica consistenta datelor
experimentale. Pentru ceilalti 5 metaboliti intracelulari considerati, gasim:
Modelul ‘’black box’’

In acest model, biomasa celulara se considera ca si o “cutie neagra”, in care

se produc procese ce nu se cunosc in detaliu, iar schimbul de materiale
aparent se realizeaza cnf. figurii 4.1, reactiile cellulare fiinf directionate in
scopul cresterii celulare.

Figura 4.1 Reprezantarea modelului’’black box’’ . Fluxurile de substrat in

interiorul celulei sunt elemente ale vectorului rs; fluxurile de produsi
metabolici ce ies din celula sunt elemente ale vectorului rp. Biomasa prezenta
in ‘’black box’’ initial si substratul, determina acumularea prin formarea unei
noi biomase, cu viteza specifica n
Fluxurile de intrare si de iesire din ‘’black box’’ sunt caracterizate de viteze
specifice (in grame sau moli de compus per grame sau moli de biomasa si
unitate de timp). Aici se definesc vitezele specifice de asimilare a substratului
(rs) vitezele specifice de formare a produsilor (rp). In plus, acumularea de
biomasa este reprezentata ca un flux cu viteza specifica n. Deoarece toate
reactiile celulare sunt incluse intr-o reactie generala, coeficientii stoechiometrici
sunt dati de coeficientii de crestere Y (coeficientul stoechiometric al biomasei
este 1 in acest caz).

Introducand coeficientii de productivitate (4.1) si un set de viteze specifice, se

formeaza vectorul viteza r, dat de relatia 4.2:
Exemplul 1.

Se considera ultivarea aeroba a drojdiei Saccharomyces cerevisiae pe

un mediu definit minimal, respectiv glucoza (ca sursa de carbon si
sursa de energie) si o sare de amoniu (ca sursa de azot). In timpul
cresterii aerobe, drojdia oxideaza glucoza complet la CO2.
Un flux glicolitic ridicat “restrictioneaza” oxidarea ac. Piruvic (Engl.
‘Piruvate’) determinand formarea de etanol. Astfel, atat etanolul cat si
dioxidul de carbon trebuiesc considerati ca produsi metabolici. In
final, se formeaza si apa, inclusa in reactie. Astfel, modelul “black box”
al acestui sistem este:
Sistemul (1) poate fi reprezentat de vectorul specific de crestere (2):

Adesea, coeficientii stoechiometrici (sau productivitatea) ec. (1) nu

sunt constanti; astfel Yxp este zero la o viteza specifica de crestere
mica (corespunzatoare unui flux glicolitic scazut) si mai mare dacat
zero pentru viteze specifice de crestere mari

Bilantul elementelor este:

M+N+1 variabile
M coeficienti de crestere pentru produsii metabolici
N coeficienti de crestere pentru substrat
gradul de avansare al reactiei n
M+N+1 viteze specifice

Bilantul carbonului in proces se scrie:

hs,I si hp,I reprezinta continutul de carbon (moli C/mol) in substratul I si in
produsul metabolic i.
Compozitia elementala este normalizata dupa formula CHaObNc, asfel incat
datele ce urmeaza sa se obtina sa fie in acord cu cele prezentate in tabelul 4.1.
Cu exceptia catorva situatii extreme, este rezonabil sa se utilizeze formula
generala CH1,8O0,5N0,2, atunci cand compozitia elementara a biomasei nu este
cunoscuta in mod exact.
Bilantul carbonului (ec.4.3) poate fi formulat in termeni de viteze specifice.
Astfel dupa inmultirea ec.(4.3) cu n si aplicarea definitiei privind coeficientii de
crestere se obtine ec. 4.4:

Compozitia elementala a substratului si produsilor metabolici se scrie tinand

cont de continutul lor in C; astfel ecuatia 4.3. este apoi scrisa functie de
continutul pe 1 mol de C sub forma 4.5:
Tabel 4.1 Compozitia elementala a biomasei unor
microorganisme
Bilantul carbonului in modelul ‘’black box’’

Rescriem ecuatia de conversie (1) utilizand compozitia elementara a

substratului si sprodusilor metabolici. Pentru biomasa se utilizeaza
fomula CH1,3O0,56N0,17

Pot apare dificultati la identificarea CH3O0,5 ca etanol, dar aici intervine

avantajul utilizarii bilantului de carbon (ec.2) de unde rezulta :
 Cu datele privind compozitia elementala a biomasei obtinuta anterior se
poate scrie matricea compozitiei elementale E

Unde:
- pe randuri se indica continutul de carbon, hidrogen, oxigen si azot;
- pe coloane se indica compozitia elementala a biomasei, etanolului, CO2,
apei, glucozei, oxigenului si respectiv al amoniacului.

Utilizand ec. ( 4.6) si inlocuind r cu vectorul specific coeficientilor de

crestere se obtine:
Selectivitatea proceselor biochimice
Se poate explica cel mai bine prin intermediul reactiilor enzimatice. Astfel,
activitatea enzimatica este explicata pe baza mai multor mecanisme, ce
include specificitatea si viteza de reactie.
De regula, cetrul activ al enzimei apare ca un “buzunar” (situs) sau crevasa,
specializat in recunoasterea unui substrat specific si cataliza unei
transformari biochimice. “Situl activ” are o structura tridimensionala, fiind
format dintr-o colectie de aminoacizi diferiti care pot fi sau nu adiacenti in
secventa (structura) primara.
Interactiile dintre centrul activ si substrat au loc prin aceleasi forte care
stabilizeaza structural proteina: hidrofobe, electrostatice (sarcina-sarcina),
legaturi de hidrogen sau van del Waals.

Centrii activi nu au doar rolul de a se cupla la substrat; ei poseda grupuri

catalitice care faciliteaza procesul biochimic prin furnizarea unor forte de
interactie suficiente astfel incit complexul activat din starea de tranzitie sa
fie stabilizat.
Specificitatea enzimelor fata de un anume substrat este dublata de
promovarea fie a unei transformari catalitice unice, fie a unui set de
transformari foarte apropiate.
Enzimele micsoreaza diferenta de energie libera dintre substrat si starea de
tranzitie, accelerind obtinerea acesteia.
Pentru a explica mecanismele enzimatice, trebuie considerata si calea
biochimica a procesului, nu doar starea initiala si finala
Enzima se leaga la substrat (si la cofactor/coenzima, daca acesta exista) prin
centrii activi, care contin reziduuri de aminoacizi (grupe catalitice) care
participa la formarea si ruperea legaturilor intermediare. Interactiunea dintre
enzima si substrat la centrul activ promoveaza formarea starii de tranzitie.
Centrul activ este reginea care produce nemijlocit micsorarea variatiei de
energie libera, determinind crestearea specifica a vitezei de reactie.
Chiar daca enzimele difera substantial prin: structura, specificitate si mod de
actiune cataliztica, centrii activi prezinta citeva caracteristici cu caracter
general:

1. Centrul activ are o conformatie geometrica tridimensionala data de grupuri

care provin din diferite parti ale secventelor de aminoacizi; grupe reziduale
situate departe in secventa pot interactiona mai puternic decit reziduuri
adiacente de aminoacizi. In lizozima (enzima care degradeaza peretele celular
bacterian) grupurile care formeaza centrul activ provin de la reziduurile cu
numerele 35, 52, 62, 63, 101 si108 din secventa de 129 de aminoacizi.
2. Centrul activ ocupa doar o mica portiune a structura spatiala a enzimei.
Majoritatea rezuduurilor de aminoacizi nu sunt in contact cu substratul, ceea
ce nu justifica marimea enzimelor. Majoritatea enzimelor sunt formate din
mai mult de 100 de reziduuri de aminoacizi, si au o masa de peste 10 kDa si
un diametru mai mare de 25 Å. Resturile suplimentare de aminoacizi servesc
pentru a crea suportul structurii tridimensionale a sitului activ din grupe
functionale situate departe una de alta in structura primara. Aminoacizii
apropiati sunt constrinsi steric sa adopte anumite pozitii care sa permita
aparitia centrului activ.

3. Centrul activ este o adincitura/crevasa/vale. In toate structurile enzimatice

cunoacute, substratul se leaga pe o adincitura. Apa este exclusa, daca nu
este reactant. Caracterul ne-polar al adinciturii faciliteaza atit prinderea
substratului cit si cataliza. Cu toate acestea, crevasa poate sa contina
reziduuri polare, care improma anumite proprietati speciale, strict necesare
legarii substratului sau activitatii catalitice, in mediul ne-polar. Pozitia
acestor reziduuri polare in inatriorul adinciturii este cruciala pentru a fi ferite
de acti
Mecanismul cheie-lacat

Situl activ al enzimei este ca o

matrita in care intra numai
substratul specific.

Modelul geometrie indusa

Situl activ isi schimba forma in

interactie cu substratul pina cind
devine complementar acestuia.
4. Substratul se leaga de enzima prin interactiuni reversibile slabe (intre -13
si -50 kJ/mol). Interactiunile slabe (ne-covalente) din complexul energetic
sunt mult mai slabe decit legaturile covalente (intre -210 si -460 kJ/mol).
Legaturile van der Waals devin semnificative doar daca mai multi atomi de
substrat se afla la mica distanta de atomii de enzima simultan. De aceea
enzima trebuie sa aiba o geometrie complementara. Caracterul directional al
legaturilor de hidrogen dintre enzima si substrat determina gradul mare de
specificitate (ribonucleaza, care degradeaza specific ARN).

5. Stereospecificitatea depinde decisiv de aranjamentul atomilor in centrul

activ.

Deoarece substratul si enzima interactioneaza prin intermediul legaturilor cu

raza scurta de actiune, care necesita un contact apropiat, substratul trebuie
sa aiba o matrita corespunzatoare in enzima. Citeva teorii incearca sa
explice aceasta proprietate
• cheie-lacat, care si-a dovedit limitele in timp;
• geometrie indusa – matrita enzimatica se formeaza abia in urma
interactiunii cu un anume substrat
MODUL DE DETERMINARE DIN DATE EXPERIMENTALE A
VARIABILELOR PE BAZA CARORA SE CALCULEAZA GRADUL
MOLAR DE AVANSARE, CONVERSIA si RANDAMENTUL  
Intr-un proces biochimic principalii parametri de cultivare sunt

• temperatura (T): se mentine constanta în timpul unui bioproces,

dar poate varia (pentru diferite tipuri de cultivari) în domeniul 20 ° C
- 40 ° C;
•  presiunea (p): este de asemenea mentinuta constanta în timpul
avansarii procesului; domeniul general de variatie se situeaza în
domeniul 0 - 0.5 atm. (o atmosfera în cazuri speciale);
•  agitarea (n) (utilizata numai în cazul bioreactoarelor cu agitare
mecanica) si aeratia (Q): variaza în cazul oricarui proces aerob,
conform unei curbe optimale;
•  pH : variaza în timpul unui bioproces conform unei curbe
caracteristice; în general celulele vii suporta pH-uri în domeniul 3-10;
•  nivelul oxigenului dizolvat (pO2 ) : reprezinta un parametru de baza
pentru bioprocesele aerobe (se masoara % concentratie de saturatie
mg O2 /L mediu sau ppm) si evolueaza în cadrul fiecarui bioproces
conform unei curbe optime prestabilite;
•  rH : potentialul redox al culturii fiind utilizat mai ales în cultivarile
microbiene sau cu celule animale; acest parametru variaza de
asemenea conform unor curbe caracteristice si se masoara în mV;

•  cantitatea de caldura consumata/ eliminata în unitatea de timp;

•  nivelul spumei : este masurat prin metode diferite, stabilindu-se un

nivel maxim admisibil al acesteia; în functie de tipul reactorului,
combaterea spumarii poate fi facuta pe cale chimica sau mecanica;

Evolutia bioprocesului poate fi caracterizata de asemenea printr-o

serie de marimi specifice

•  concentratia substratului principal - sursa de carbon si energie a

cultivarii, S: se masoara în g/L sau %;
•  concentratia celulara (biomasa) - X: se masoara în g/L;
•  concentratia produsului de biosinteza - P: se masoara în unitati de
concentratie specifice tipului de produs avut în vedere.
• Concentratia substratului, S, poate fi determinata prin metode
analitice specifice substantelor respective, fie on-line (mai rar, datorita
specificitatii senzorilor), fie off-line (prin probe de mediu supuse
analizei chimice la intervale regulate de timp). Exista si cazuri în care
informatiile calitative asupra evolutiei substratului sunt obtinute din
variatia caracteristica a unor parametri de cultivare (d.e. epuizarea
substratului corespunde anularii efectului exoterm al cultivarii sau
micsorarii consumului oxigenului dizolvat).
• Concentratia celulara, X se determina fie prin numarare de celule,
fie prin calcularea substantei umede sau a substantei uscate (masa
solida cântarita dupa centrifugarea unui volum determinat de mediu
pentru substanta umeda; aceeasi masa solida este uscata la 110 ° C si
cântarita, obtinându-se substanta uscata). Aceste determinari sunt
realizate off-line, dar citirea densitatii optice (DO) la un
spectrofotometru ca masura a cresterii celulare se poate face si on-
line prin intermediul turbidimetrelor de bioproces.

• Concentratia produsului final, P, este determinata în general off-

line prin tehnici analitice specifice, în afara de cazul când
produsul urmarit este însasi biomasa X, a carei concentratie se
stabileste conform metodei prezentate anterior.
CĂI DE ANALIZĂ EXPERIMENTALA PENTRU FLUXUL METABOLIC

Analiza fluxului metabolic (MFA) şi analiza controlului metabolic

(MCA) sunt doua cai de analiza esentiale ale metabolismului celular in
regim cvasi-stationar (homeostaza).

MFA= determina fluxurile (vitezele de reactie) in regim stationar

(crestere echilibrata celula).
MCA= determina coeficientii de senzitivitate ai starilor stationare
(concentratii, fluxuri) in raport cu variabile/parametrii din mediul
extern.

MFA considera o abordare globală a celulei, unde se ia în calcul

reţeaua completă a reacţiilor intracelulare, si sunt cuantificate
fluxurile prin toate ramurile individuale ale reţelei. Fluxurile
metabolice pot fi estimate din balanţurilele şi măsurătorile de
metaboliţi ale câtorva căi metabolice, prin introducerea substraturilor
marcate cu C13, urmate de măsurătorile distribuţiei acestora în
metaboliţii intracelulari.
- În acest caz spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară sau GC-MS
poate fi folosită pentru a măsura tiparul metaboliţilor precursori marcaţi.
- Aplicarea de substraturi marcate permite determinări de flux ale reacţiilor
reversibile şi cuantificarea rapoartelor relative ale fluxurilor între căile
biosintetice ce duc la acelaşi metabolit.
- Compararea distribuţiilor fluxului obţinute în diferite condiţii fiziologice
poate da informaţii privind interacţiile dintre diferite căi metabolice sau
poate ajuta la identificarea unor posibile reacţii biochimice, care nu au fost
descoperite în prealabil într-un anumit microorganism.

MFA poate fi folosit în caracterizarea metabolismului unui microorganism,

dar poate fi folosita si ca instrument pentru caracterizarea fiziologică a unei
tulpini, ce a fost manipulată genetic în vederea introducerii unei propietăţi
noi sau modificate (proiectare de organisme modificate genetic).

Un domeniu în care MFA este interesat este îmbunătăţirea productivităţii

unui bioproces industrial. Cantitatea de produs obtinuta din substrat este
determinată de raportul fluxurilor JB şi JA, unde productivitatea este dată de
fluxul JB. Intermediarul I nu se poate acumula în interiorul celulei, fluxul
acestui metabolit va fi egal cu fluxul ce iese din polul (nodul) acelui
metabolit din schema de reactii metabolice.
BIBLIOGRAFIE