Ingineria metabolica

•Reprezinta imbinarea metodelor analitice de

cuantificare a fluxurilor si controlul acestora cu
ajutorul tehnicilor de biologie moleculara, in
vederea implementarii unor modificari genetice

•Poate pune la dispozitie metode de imbunatatire

sistematica a propietatilor celulare in situatii si
aplicatii foarte variate.

•Fluxul este un determinant fundamental in

fiziologia celulara si cel mai important parametru al
unei cai metabolice.
Cale metabolica = orice succesiune a unor etape de
reactii biochimice posibile si observabile care fac legatura
intre un anumit grup de metaboliti de intrare si de iesire.
Fluxul caii metabolice = viteza cu care metabolitii de
intrare sunt procesati in vederea producerii metabolitilor
de iesire.
Pe parcursul unei cai:
vitezele individuale de reactie nu sunt egale
Fluxul variaza si este greu de definit
Fluxul se determina dupa variatia consumarii
substratului sau formarea produsului.
In procesul de elucidare a factorilor si mecanismelor
responsabile de controlul fluxului metabolic exista 3 etape:
I - dezvoltarea mijloacelor de observare a cat mai multor cai cu
putinta si masurarea fluxurilor acestora.
II - introducerea unor perturbari bine definite in reteaua
bioreactorului si determinarea fluxurilor metabolice dupa
relaxarea sistemului la o stare de echilibru. Aceste perturbari
pot fi: modificari ale activitatii unei enzime, adaugarea de
substrat sau schimbarea sursei de carbon.
III - analiza rezultatelor perturbarii fluxului.

- Intelegerea controlului fluxului metabolic este un obiectiv

cheie al ingineriei metabolice.
- Un ajutor important este reprezentat de cadrul analizei
controlului metabolic (MCA), dezvoltat in anii 1970 pentru
reprezentarea cantitativa a gradului de control a fluxului
exercitat de catre activitatile enzimatice, metabolitii, efectorii
si alti parametrii specifici caii metabolice.
- Analiza fluxului metabolic arata gradul de implicare al caii
metabolice in procesul metabolic per ansamblu.
- Elucidarea controlului fluxului pune la dispozitie o baza
mecanica pentru rationalizarea fluxurilor si distributiei acestora
in puncte cheie de ramificare metabolica.

- Avand in vedere ca aceste fluxuri sunt determinate in conditii in

vivo, analiza fluxului metabolic permite de asemenea comparatii
intre regimul enzimatic in vivo si in vitro.

- Fluxurile metabolice conduc la obtinerea unei baze generice de

comparare intre diferite tulpini. Desi caracteristicile
fermentatiilor la asemenea tulpini difera, aceste diferente pot fi
nesemnificative daca distributia fluxurilor in jurul punctelor de
ramificare cheie nu a fost modificata.
- Ingineria metabolica permite de asemenea optimizarea
fluxurilor metabolice in ceea ce priveste cinetica, transportul si
termodinamica reactiilor in retelele metabolice.
- Formarea produsilor metabolici de reactie poate fi determinata
experimental prin masurarea concentratiilor substraturilor si
produsilor metabolici.
- Pentru aceasta trebuie luata in considerare dinamica
bioreactorului in care se fac masuratorile.
In bioreactorul continuu volumul este constant.

Cel mai intalnit tip de operare in sistem continuu este chemostatul,

in care alimentarea cu mediu de reactie este realizata in asa fel in
cat sa existe un singur substrat limitativ al vitezei de reactie, fapt ce
permite o variatie controlata a vitezei specifice de crestere a
biomasei.

Avantaj - posibilitatea obtinerii unei stari de echilibru, care

permite determinari experimentale exacte ale vitezelor specifice in
conditii de mediu bine definite.

Aceste conditii pot fi variate prin schimbarea vitezei de alimentare,

permitand obtinerea de informatii privind influenta conditiilor de
mediu asupra fiziologiei celulare.

Dezavantaje - dificultatea operarii - mari cantitati de mediu

proaspat si steril trebuie sa fie pregatite si este nevoie de perioade
mari de timp pentru atingerea starii de echilibru.
Un alt exemplu de bioreactor cu operare semi-continua este
turbidistatul, in care alimentarea este ajustata in vederea mentinerii
concentratiei de biomasa la un nivel constant.

Ecuatia de bilant pentru substrat in bioreactor este:

Acumularea substratului = - viteza de consum a substratului + viteza

de alimentare a substratului - viteza de indepartare a substratului

Cuantificarea exacta a magnitudinii fluxurilor cailor metabolice

in vivo este un scop important in producerea de metaboliti
(transformarea unei cantitati cat mai mari de substrat in produsi
utili).

Metodologia de determinare a fluxurilor cailor metabolice este

analiza fluxului metabolic (MFA), in cadrul careia fluxurile
intracelulare sunt calculate folosind un model stoechiometric
pentru reactiile intracelulare majore si prin aplicarea
bilanturilor de masa pentru metabolitii intracelulari.
Un set de fluxuri extracelulare determinate este folosit ca baza de
calcul pentru, vitezele de asimilare a substraturilor si vitezele de
secretie a metabolitilor.

Rezultatul final al calcularii fluxului este harta fluxurilor

metabolice ce prezinta o diagrama a reactiilor biochimice incluse in
calcule impreuna cu o estimare a starii de echilibru in care fiecare
reactie din diagrama are loc.

Astfel de harti contin informatii utile despre contributia diferitelor

cai metabolice la procesul metabolic al utilizarii substratului si
formarii produsilor per ansamblu si permit determinarea
diferentelor de flux care se observa la compararea hartilor obtinute
cu diferite tulpini sau in conditii diferite.
Fig.1. Fluxurile in diferite cai
metabolice ale
Saccharomyces cerevisiae pe
parcursul cresterii
anaerobe. Fluxurile au fost
calculate cu modelul
stoechiometric Nissen et. al.
(1997) si masuratori ale
vitezelor de asimilare
pentru: glucoza si amoniac,
viteze de producere pentru
CO2, acetat, etanol, glicerol,
pirvat si succinat si vitezele
de sinteza a compusilor
macromoleculari cheie (de
ex. ADN, ARN, proteine,
lipide si carbohidrati).
Punctul de plecare in analiza fluxului metabolic este reteaua de reactii
stoechiometrice ce descriu felul in care substraturile sunt convertite in
produsi metabolici si constituenti biomasici (sau compusi
macromoleculari).

Consideram J reactii intracelulare prin intermediul a K metaboliti,

pentru care bilanturile masice sunt date de ecuatia:

dcmet ,i
 rmet ,i  Dcmet ,i
r dt
= viteza de formare a constituentului i din biomasa [moli (g DW h) ]
met, i
-1

D = viteza de crestere a substratului [h-1]

cmet, i = concentratia metabolitului intracelular i [molL -1]
 sau vectorial:
dX met
= rmet - D Xmet
dt
unde :

Xmet= vectorul concentratie pentru metaboliti intracelulari

(intermediari ai caii metabolice)

rmet= vectorul ce contine vitezele nete de formare ale

metabolitilor intracelulari in J reactii

Concentratiile diferitelor amestecuri de metaboliti se

adapteaza rapid la noi nivele, chiar si dupa perturbari mari in
mediu. Deci, se poate presupune ca metabolitii caii se afla
intr-o stare de echilibru.
 Aceasta sugereza ca nu exista acumulare de metabolit, sau:
rmet - D Xmet = 0
Primul termen exprima viteza neta de sinteza a intermediarilor
caii in J reactii, de ex. suma fluxurilor de intrare si iesire ale unui
metabolit.
Al doilea descrie dilutia amestecului de metaboliti datorita
cresterii biomasei celulare.
Considerand efectul dilutiei o reactie artificiala de consum,
fluxurile de intrare si iesire ale metabolitilor sunt comparabile.
Nivelul intracelular al celor mai multi metaboliti este foarte
scazut, efectul dilutiei fiind mic, mai ales comparativ cu
celelalte fluxuri care actioneaza asupra aceluiasi metabolit.
Drept urmare ce de-al doilea termen poate fi neglijat:
rmet = 0
Fig.2. Reteaua metabolica pentru
biosinteza lizinei prezentand
vitezele de consum si producere
ale metabolitilor intermediari si
utili.
 Figura 2 ilustreaza vitezele la care au loc diferite reactii intracelulare, incepand
cu 1 mol de glucoza consumat la 1 g de substanta uscata in unitatea de timp.

Urmatoarea stoechiometrie generala a fost folosita pentru calea

pentozofosfatului si, respectiv, ciclul CAT:

3Glc6P + 3H20 + 6NADP  3CO 2 + 6NADPH + 2Fru6P + GAP

Pyr + 3NAD + NADP + FAD + ADP  3CO 2 + NADPH + 3NADH + FADH + ATP

 
Fluxul glicolitic este pozitiv in directia 3Glc6P  Fru6P.
Produsii sunt trehaloza (cu viteza rT), produsi glicolitici (lactat,
alanina, valina grupate cu viteza rG), CO2 (rCO2) si lizina (rL), in
timp ce biosinteza foloseste glucoza (la o viteza de 1 mol in
unitatea de timp), amoniac si O2.
Transportul glucozei se face prin sistemul PTS:
 Glc + PEP  Glc6P + Pyr
Reactii separate au fost incluse pentru carboxilarea piruvatului (flux v6) si PEP
(flux v3) si decarboxilarea OAA (flux v4).

Datorita faptului ca aceste 3 reactii nu pot fi observate independent fata de

masuratorile metabolitilor precedenti, fluxurile v3, v4, v6 sunt grupate ca :

v 8 = v 3 – v 4 + v6

Igorand cantitatile de metaboliti consumate pentru biosinteza se pot

scrie urmatoarele bilanturi pentru a determina cele 2 rapoarte de
separare a fluxului necunoscute v1 si v2:
Trehaloza r T = 1 - v l - v2
Lizina r L = v8 = v3-v4 + x6
Produsi glicolitici r G = v
NADPH 0 = 2v1- 4v8 + z
z= fluxul ciclului CAT din fig.2.
Amoniac ram = 2 v8
Evolutia CO2 rCO2 = v1 + 3z
Consumul O2 rO2 = (½)rNADH = (½)(5v1/3 + 2v2+4z)
 Ecuatiile precedente pot fi rezolvate astfel incat sa se ajunga la :

v1 = (3/5)(rG – 2 + 6rL + 2 rT)

V2 = 1-r T-(3/5) {r G-2+ 6r L+ 2 rT}

V8=rL

V5=rG

In timp ce masuratorile aditionale, desi nu pot sa delimiteze fluxurile

carboxilarii, pun la dispozitie urmatoarele constrangeri ale datelor
experimentale:

rCO2 + 6rL + 3rG + 6rT = 6

2rO2 + 14r L + 5r G + 12r T = 12

ram = 2r L
- Ecuatia rmet = 0 reprezinta baza pentru analiza fluxului metabolic, de exemplu,
determinarea fluxurilor necunoscute in vectorul viteza intracelular v.

- Ecuatia vector reprezinta K bilanturi algebrice lineare pentru K metaboliti cu J

necunoscute (fluxurile cailor metabolice).

- Numarul de reactii (J) este intotdeauna mai mare decat numarul metabolitilor
(K) => un anumit numar de grade de libertate in setul de ecuatii algebrice date de
relatia F=J-K.

-Unele elemente din v trebuie deci sa fie masurate pentru a permite determinarea
celor ramase.

- Un exemplu clasic de viteza de reactie care poate fi masurata este conversia

glucozei la glucozo-6-fosfat care poate fi considerata egala cu viteza de consum a
glucozei.
- Daca exact F fluxuri (viteze de reactie) din v sunt masurate, sistemul devine
determinat si solutia este unica si relativ simplu de obtinut.
- Daca se masoara mai mult de F fluxuri, sistemul este supradeterminat, fapt
care inseamna ca exista mai multe ecuatii care pot fi folosite pentru testarea
consistentei bilanturilor generale, acuatetea masuratorilor fluxului, validitatea
presupunerii starii de echilibru si calculul unor valori mai precise pentru
fluxurile intracelulare necunoscute.
- Daca se masoara mai putin decat F fluxuri sistemul este subdeterminat si
fluxurile necunoscute pot fi deteminate numai daca se introduc constrangeri
suplimentare si un crieriu general de optimizare este impus bilanturilor
metabolice.
- Intr-un sistem determinat fluxurile care raman pot fi calculate prin
rezolvarea sistemului linear de ecuatii rmet = 0.
- Este foarte convenabil sa introducem o matrice algebrica pentru
descrierea diferitelor etape.
- In acest scop solutia ecuatiei este gasita prin colectarea vitezelor
masurate intr-un nou vector vm, si elementele ramase ale vectorului v
(care sunt vitezele ce trebuie calculate) intr-un alt vector vc.
In mod asemanator coeficientii stoechiometrici in
matricea G sunt distribuiti prin colectarea coeficientilor
reactiilor masurate in Gm si celor ramasi in matricea Gc.
Ecuatia poate fi apoi rescrisa astfel:
0 = GTv = GTm vm + GTm vc

Datorita faptului ca se masoara exact F = J - K fluxuri, Gc

este o matrice patratica (de dimensiuni K x K) si daca
aceasta matrice poate fi inversata elementele lui vc pot fi
determinate din:
Vc = -(GTc)-1 GTmvm
Principalele date necesare pentru determinarea fluxurilor
intracelulare sunt fluxurile metabolitilor extracelulari, si anume
vitezele de asimilare a substratului si de secretie a produsilor.
Acestea se obtin cel mai bine din experimentele in chemostat in
stare de echilibru, concentratiile tuturor metabolitilor fiind
masurate in starea de echilibru.
Vitezele corespunzatoare de asimilare/secretie sunt apoi
calculate prin inmultirea acestor concentratii cu rata de dilutie
din chemostat.
Masuratorile concentratiilor pun la dispozitie informatii
referitoare la distributia fluxului de carbon intr-un numar mic de
puncte de ramificare ale retelei metabolice.
De asemenea, masuratorile extracelulare prezinta un
potential limitat in elucidarea aspectelor retelelor
metabolice, cum ar fi:
distributia fluxului in punctele de separare care
converg in alt punct al retelei;
ciclurile metabolice;
clarificarea structurii retelei cu o rezolvare
biochimica mai buna.
Aceste puncte sunt prezentate schematic in fig.3 care
prezinta separarea unui compus primar A intre 2 cai
competitive cu vitezele v1 si v2.
Fig. 3. Reprezentarea schematica a separarii fluxului
intr-o retea metabolica care este numai partial
descompus de catre metabolitul extracelular.

Masurarea vitezei de consum a lui A si vitezele de

secretie pentru F si G sunt suficiente pentru
determinarea distributiei fluxurilor in punctele de
ramificare D si H si calculul independent al unui alt
metabolit secretat, K.
Cu toate acestea, raportul de separare a fluxului pentru
metabolitul A intre cele 2 cai 1 si 2 sau, echivalent, fluxul prin
ciclul A  B  C  A, nu poate fi determinat.
In mod similar, daca mai multe reactii sunt implicate in
conversia lui C in 2 D, trebuie ca toate sa fie grupate intr-o
singura reactie.
Daca sunt necesare mai multe informatii despre raportul de
separare intre caile 1 si 2 sau o rezolvare biochimica mai buna
a pasilor descrisi trebuie aplicate alte metode.
O astfel de metoda este utilizarea compusilor marcati cu 13C
sau 14C.
Astfel, caile care introduc asimetrii in distributia atomilor de C ai
metabolitilor intermediari se pot distinge unele de celelalte, desi duc la
formarea aceluiasi produs final.

Asimetria duce la modele fundamental diferite de marcare la unul sau

mai multi metaboliti, a caror masurare duce la determinarea vitezelor
reactiilor competitive.

Compusii marcati 13C sau 14C sunt folositi in legatura cu masurarea

imbogatirii prin marcare la metabolitii extacelulari si intracelulari.

Tipul informatiei obtinute din aplicarea acestor metode depinde in mare

masura de substratul marcat utilizat, atomii de carbon care sunt marcati
si de metabolitul (intracelular sau extracelular) al carui grad de
imbogatire este masurat.
Aceasta clasa de metode se bazaza pe masurarea
intensitatii (sau gradul de imbogatire) a unei marcari la un
metabolit atent selectionat pentru determinarea directa a
fluxurilor metabolice.

Fig. 4. Reprezentarea schematica a determinarii

raportului de separare a fluxului in cai metabolice
divergente prin compusi marcati radioactiv
- Daca metabolitul A este un compus cu 6 atomi de carbon al
carui prim atom de carbon este marcat, atunci presupunand ca
reactia care duce la metabolitul B este o reactie de
decarboxilare ce indeparteaza carbonul marcat, calea prin
metabolitul B va produce o molecula nemarcata din
metabolitul C, in timp ce molecula de C produsa pe calea
directa (cu viteza v2) va retine atomul de carbon in pozitia 1
dupa cum se vede in figura. Imbogatirea metabolitului C in
molecule marcate va fi direct proportionala cu viteza de reactie
2 raportata la viteza totala de consum a metabolitului A.

- Acest fapt este valabil si pentru metabolitul D si in mod special

pentru metabolitul secretat F, care poate fi masurat prin analiza
mediului extracelular.
- Gradul de imbogatire cu 13C in prima pozitie a metabolitului F poate
oferi astfel informatii despre viteza relativa de reactie 2, care poate fi
folosita alaturi de masuratorile fluxului total pentru a diferentia
vitezele v1 si v2.
- In cadrul acestor determinari trebuie tinut cont de faptul ca
aceasta abordare este valabila numai la stari de echilibru
(stationare) ale metabolitilor si izotopilor.
- O stare stationara a metabolitilor este starea in care
concentratiile tuturor metabolitilor intracelulari ce participa in
reteaua metabolica sunt constanti.
- Intr-o stare de echilibru a izotopilor, populatiile de
izotopomeri metabolici sunt de asemenea constante.
- Daca aceasta stare nu este atinsa, determinarea fluxului
intracelular necesita multe informatii cinetice in vivo.
- Cum aceste informatii nu sunt disponibile este imperios
necesar ca experimentele sa fie modelate astfel incat sa
asigure atingerea starii de echilibru.
- Cel mai bun sistem de conducere a acestor experimente este
chemostatul in stare stationara.
- Exista totusi constrangeri in ceea ce priveste introducerea
substratului marcat in sistem.
- Aceasta se poate realiza printr-un puls finit (limitat),a carui
concentratie sa nu modifice concentratia substratului si a carui
durata sa fie indeajuns de mare pentru a permite atingerea unei
stari de echilibru izotopic.
 Fig. 5. Model pentru
marcarea lizinei din
piruvat si oxaloacetat prin
2 cai diferite.
Calea succinilazei in 4
etape a fluxului (1-y)vlizina
contine secventa
ezimatica N-succinil-2,6-
ketopimelat sintaza, N-
succinilaminoketopimelat:
glutamat
aminotransferaza, N-succinildiaminopimelat desuccinilaza, si
diaminopimelat epimeraza. Intr-o singura etapa (a fluxului yvlizina)
implica actiunea mezo-DAP dehidrogenaza. Notatiile de sub O si P
indica pozitiile initiale ale atomilor de carbon.
- Acest exemplu demonstreaza utilizarea piruvatului
marcat pentru diferentierea intre 2 cai competitive in
punctul de ramificare finala al caii de producere a lizinei.
- Dupa cum se vede in figura pasii finali din biosinteza
lizinei presupun transformarea tetrahidrodipicolinatului
(H4D) in mezo-α,ε-diaminopimelat (mezo-DAP), care poate
urma fie o cale in 4 etape fie o reactie intr-o singura etapa
catalizata de mezo-DAP dehidrogenaza (DDH).
- Lizina se formeaza din mezo-DAP urmand o reactie de
decarboxilare.
Numai viteza de producere a lizinei nu face diferenta intre aceste 2 cai,
ale caror fluxuri combinate sunt egale cu viteza totala de secretie a
lizinei.
Folosind piruvatul marcat se pot obtine estimari ale fractiunii de flux
care este convertita la lizina pe fiecare din cele 2 cai.
H4D este format din oxaloacetat (OAA) si piruvat (Pyr) printr-o reactie
de condensare.
In conversia H4D la lizina prin calea dintr-o singura etapa (ramura
stanga a figurii 5), aranjarea atomilor e carbon ramane neschimbata.
Pe de alta parte ultima reactie din calea in 4 etape este o reactie a unei
epimeraze care duce la formarea a 2 tipuri de mezo-DAP, si prin extensie
lizina, molecule care sunt imagini in oglinda una a celeilalte si pot fi
diferentiate prin utilizarea atomilor de carbon marcati.
Aceasta ultima etapa este cea care introduce asimetria in transformarea
H4D la lizina si in acest fel ofera baza pentru diferentierea intre calea de
formare a lizinei in 4 etape sau intr-o singura etapa (bypass).
- Utilizarea piruvatului marcat in pozitia 3 ([3-13 C]piruvat) ca
sursa de carbon va duce la obtinerea de molecule de OAA care
sunt de asemenea marcate cu 13C.
- In aceasta analiza, atentia este indrepata spre atomii carbon
marcati 3 si 5 din compusii ce apar in fig.5. si [% OAA3] si [%
Pyr3] reprezinta fractiile de OAA si Pyr care sunt macate la
atomul de carbon din pozitia 3.
- Aceste fractii pot sa includa molecule de OAA si Pyr care
sunt marcate si la atomi de carbon din alte pozitii dar au
marcare 13C la carbonul 3.
- Intr-o stare metabolica de echlibru (stationara) nu exista
acumulare de metaboliti intracelulari fapt care conduce la
obtinerea ecuatiei de flux:
vcondensare = vo etapa + v4 etape = vlizina
 abrevierile pentru ecuatiile diferitilor izotopmeri ai H4D:
- izotopomerul marcat numai la carbonul 3 : H4D3, numai
- izotopomerul marcat numai la carbonul 5 : H4D5, numai
- izotopomerul marcat la carbonul 3 si 5 : H4D35
- amestecul total de izotopomeri marcati la carbonul 3 (H4D3=
H4D3, numai + H4D35)
- amestecul total de izotopomeri marcati la carbonul 5 (H4D5=
H4D5, numai + H4D35)
Bilantul pentru amestecul unui singur izotopomer, de exemplu
H4D3 poate fi scris: 
dc H 4 D 3
dt = vcondensare [%OAA3](1-[%Pyr3]) + vcondensare [%OAA3][%Pyr3] -

– (vo etapa + v4 etape)[%H4D3] = vlizina [%OAA3] - vlizina [%H4D3]

dc H 4 D 3
= vcondensare [%OAA3](1-[%Pyr3]) + vcondensare [%OAA3][%Pyr3] -
dt
– (vo etapa + v4 etape)[%H4D3] = vlizina [%OAA3] - vlizina [%H4D3]

Primii 2 termeni ai ecuatiei reprezinta viteza de sinteza a

izotopomerilor H4D3, numai si H4D35 si cel de al doilea termen este
viteza de depletie a H4D3 de catre cele 2 cai din fig.5.

Intr-o stare de echilibru izotopic derivata ecuatiei precedente este

zero ducand la obtinerea unei expresii pentru amestecul de H4D3 :
  
[%H4D3] = [%OAA3]
Amestecul izotopomerilor ramasi de H4D pot fi obtinuti in mod
similar si sunt dati de urmatoarele ecuatii:
[%H4D5] = [%Pyr3]
[%H4D35 ] = [%OAA3][%Pyr3]
[%H4D3,numai ] = [%OA_A3](1 -[%Pyr3] )
[%H4D5,numai ] = [%Pyr3](1 -[%OAA3] )
[%H4Dnemarcat] = (1 --[%Pyr3])(1 - [%OAA3] )
Izotopomerii H4D precedenti vor genera izotopomeri ai lizinei
marcati la atomii de carbon 3 si/sau 5. Presupunand ca fractia din
fluxul lizinei sintetizata intr-o singura etapa este y de exemplu
vo etapa = yvlizina
 Vitezele la care diferitii izotopomeri sunt formati din precursori sunt:
L35 de la H4D35 : vlizina [%OAA3][%Pyr3]
L3,numai de la H4D3,numai : vo etapa [%H4D3,numai ] + (v4 etape/2) [%H4D3,numai ] =
vlizina [(1+y)/2] [%OAA3](1-[%Pyr3])
L3,numai de la H4D5,numai: : (v4 etape /2)[%H4D5,numai] = vlizina [(1-y)/2]
[%Pyr3](1-[%OAA3])
L5,numai de la H4D3,numai: : (v4 etape /2)[%H4D3,numai] = vlizina [(1-y)/2]
[%OAA3](1-[%Pyr3])
L5,numai de la H4D5,numai : vo etapa [%H4D5,numai ] + (v4 etape/2) [%H4D5,numai ] =
vlizina [(1+y)/2] [%Pyr3](1-[%OAA3])
Utilizand aceste ecuatii un bilant pentru suma izotopomerilor lizinei ce au
13 C in pozitia 3, L3 poate fi scrisa pentru un chemostat in stare
stationara:
vlizina {[%OAA3][%Pyr3] + [(1+y)/2] [%OAA3](1-[%Pyr3]) + [(1-y)/2]
[%Pyr3](1-[%OAA3])} – DcL,3 = 0
 Si in mod asemanator pentru suma tuturor izotopomerilor
lizinei ce au 13C in pozitia 5, L5
vlizina {[%OAA3][%Pyr3] + [(1-y)/2][%OAA3](1-[%Pyr3]) +
[(1+y)/2] [%Pyr3](1-[%OAA3])} – DcL,5 = 0
Unde D este dilutia in sistem chemostat. Ultimile 2 reactii pot
fi combinate cu bilantul in stare de echilibru pentru lizina
totala.
vlizina – DcL= 0
Pentru a elimina dificultatea de masurare a fractiei de
imbogatire a OAA ([%OAA3]) si a rezolva raportul de
separare a fluxului y ca randament:
y = {[CL, 5 - CL,3]/CL}/{2[%Pyr3]- [CL, 3 + CL,5]/CL}
- Aceasta ecuatie arata felul in care raportul de separare a
fluxului pentru cele 2 cai producatoare de lizina poate fi
determinat din imbogatirea lizinei in pozitiile 3 si 5 ca urmare
administrarii de piruvat marcat la carbonul din poztia 3.
- Calculul necesita imbogatirea piruvatului intracelular care se
determina cel mai bine prin masurare directa.
- O abordare alternativa se poate baza pe masurarea
imbogatirii prin marcare a valinei si/sau alaninei secretate, 2
aminoacizi sintetizati direct din piruvat.
- Nu este recomandat ca [%Pyr3] sa fie egal cu imbogatirea
piruvatului extracelular datorita posibilei dilutii a amestecului
de piruvat intracelular, a carui cantitate nu este de obicei
cunoscuta.
- Metoda descrisa este valabila numai in stare de echilibru
metabolic si izotopic si poate fi aplicata numai unor retele
relativ simple care nu presupun cicluri metabolice.
- Retele mai complicate in special cele cu cicluri sunt greu de
determinat cu astfel de metode. In aceste cazuri trebuie sa se
ia in considerare aparitia tuturor izortopomerilor metabolici
posibili si sa se determine, prin ei, gradul prevazut de
imbogatire prin marcare in diferite pozitii ale atomilor de
carbon.
 Bibliografie

Heinrich, R. & Rapoport, T. A. (1974). A linear steady-state treatment of

enzymatic chains.European Journal Biochemistry. 42, 89-95.
Kacser, H. & Burns, J. A. (1973). The control of flux. Symposium Society of
Experimental Biology 27, 65-104.
Nielsen, J. (1997). Physiological Engineering Aspects of Penicillium
chrysogenum. Singapore:World Scientific.
Gregory Stephanopoulos (1999). Metabolic Fluxes and Metabolic
Engineering. metabolic engineering 1, 111
R. Michael Raab · Keith Tyo · Gregory Stephanopoulos. (2005). Metabolic
Engineering, Adv Biochem Engin/Biotechnol 100: 1–17
Wouter A. van Winden,Walter M. van Gulik et al (2003) Metabolic Flux and
Metabolic Network Analysis of Penicillium chrysogenum Using 2D [13C, 1H]
COSY NMR Measurements and Cum, Biotechnology And Bioengineering, Vol.
83, No. 1, July 5.
Stephanopoulos N. Gregory, Aristidou A. Aristos, Nielsen Jens. Metabolic
Engineering: Principles and Methodologies, Academic Press, 1998