Sunteți pe pagina 1din 40

PRINCIPII DE CONSTRUIRE ALE MODELELOR

CINETICE ENZIMATICE, TIPURILE DE MODELE


SI UTILIZAREA ACESTORA IN PROCESE
ENZIMATICE SI FLUXURILE METABOLICE
 Celula este elementul constitutiv fundamental al organismelor vii,
alcătuit din membrană, citoplasmă și nucleu, reprezentând cea mai
simplă unitate anatomică.

 O celula este caracterizata de:


 număr foarte mare de reacţii biochimice:
• de sinteză;

• de reglare;

• de semnalare;

• procese de transport.

 condiţii de reacţie extrem de bine conturate.

 Datorită complexităţii deosebite a unui sistem biologic, nu


poate fi realizata modelarea în detaliu pe durata unui ciclu
de viaţă, ci doar a unor paşi de reacţie metabolică cu ajutorul
modelelor cinetice.
 Modele cinetice definesc:
 procesele de dezvoltare/diviziune la nivel celular;
 dezvoltarea şi înmulţirea populaţiilor de celule.

 Complexitatea atat de mare a proceselor ce au loc intr-o


celula a determinat, pentru creearea modelelor celulare,
adoptarea un compromis între simplitatea modelului,
complexitatea procesului şi capacitatea de predicţie (gradul
de simplicfiare).

 Procesele fundamentale care au loc in celula sunt:


• creşterea (dezvoltarea) ;
• reproducţia / diviziunea ;
• intreţinerea;
• moartea ;
• liza;
• mobilitatea;
• modificări morfologice .
 Organismele vii necesita un aport continuu de energie si
nutrienti. Totalitatea proceselor complexe de sinteză, de asimilare
(cu înmagazinare de energie), de degradare și de dezasimilare
(însoțită de eliberare de energie), pe care le suferă substanțele dintr-
un organism viu poarta denumirea de metabolism.

 Toate procesele metabolice au citeva trasaturi comune:


• Catalizate de enzime;
• Universale – toate organismele au cai metabolice
similare;
• Tipurile de reactii implicate sunt relativ putine;
• Sunt controlate, adesea cu ajutorul unor enzime de
reglare de baza;
• Necesita prezenta coenzimelor (al doilea substrat in
diferite procese);
• Caile anabolice sunt diferite de cele catabolice –
controlul lor poate fi facut separat.
 Enzima (ferment-din fr. enzyme) = compus organic de
natură proteică, prezent în celule vii, care dirijează
procesele de sinteză şi de degradare din organismele
animalelor, plantelor şi microorganismelor, producând şi
păstrând energie.

 Enzimele:
• determina traiectoria transormarilor biochimice;
• mediaza transformarea intre compusii energetici;
• specificitate mare la substraturi;
• viteze mari de reactie;

 Cataliza se produce cu ajutorul centrilor activi


(situsuri active).

 Situs activ – centru activ - regiune specializata din


proteina prin care enzima interactioneaza cu substratul
 De regula, centrul activ al enzimei apare ca un buzunar
sau o crevasa, specializat in recunoasterea unui substrat
specific si cataliza unei transformari biochimice. Situsul
activ are structura tridimensionala, fiind format dintr-o
serie de aminoacizi diferiti care pot fi sau nu adiacenti
secventei primare.

 Interactiile dintre centrul activ si substrat au loc prin forte


care stabilizeaza structural proteina: hidrofobe,
electrostatice , legaturi de hodrogen sau Van del Waals.
 Centrii activi nu au doar rolul de a se cupla la substrat; ei
poseda grupuri catalitice care faciliteaza procesul biochimic
prin furnizarea unei forte de interactie suficiente astfel
incit complexul activat in starea de tranzitie sa fie
stabilizat.

 Specificitatea enzimelor fata de un anume substrat este


dublata de promovarea fie a unei transformari catalitice
unice, fie a unui set de transformari foarte apropiate.

 Reactiile secundare generatoare de pierderi materiale sau


energetice sunt foarte rare.
 Specificitatea enzimelor
(A) Tripsina rupe legaturile dintre situsul carboxil al
Argininei si Lizinei
(B) Trombina desface legaturile Arg-Gly doar pentru anumite
sencvente
 Enzimele accelereaza reactiile facilitind
formarea starii de tranzitie. Ele micsoreaza
diferenta de energie libera dintre substrat
si starea de tranzitie, accelerind obtinerea
acesteia.

 Starea de tranzitie – aranjamentul


atomilor avind cea mai mare stare
energetica in timpul unei transformari
biochimice

 In timpul unei reactii chimice, structura


unui (unor) reactant(i) se schimba in cea a
unui (unor) produs(i). Intre cele doua,
exista niste legaturi care se rup si altele
care se formeaza, fie si partial, generind un
aranjament al atomilor avind cea mai mare
stare energetica.
 Variatia energiei libere de reactie (ΔG) indica daca reactia se
poate desfasura spontan:
 ΔG<0→procesul se poate desfasura spontan (reactie
exergonica);
 ΔG=0→procesul este la echilibru;
 ΔG>0→procesul nu se poate desfasura spontan-trebuie
aport extern de energie libera (reactie endergonica);

 Energia libera fiind o marime de stare, ca si entalpia, variatia


sa nu depinde de traiectoria urmata de procesul biochimic, ci
numai de starile finala si initiala.

 O valoare negativa pentru variatia de energie libera de reactie


este numai o indicatie ca aceasta se poate desfasura spontan,
dar nu contine nici o informatie privind cinetica particulara
dupa care procesul poate avea loc.
 Starea de tranzitie este data de
aranjamentul cel mai putin stabil al
atomilor, deci avind o energie
maxima.

 Viteza transformarii depinde de


energia libera de activare (diferenta
intre nivelele energetice ale
substratului si starii de tranzitie).
Cu cit aceasta este mai mare, cu
atit viteza de reactie va fi mai mica
si procesul mai lent.

 Pentru a explica mecanismele


enzimatice, trebuie considerata si
calea biochimica urmata de proces,
nu doar starile lui finala si initiala.
Functionarea unei enzime virtuale complementara substratului (b)
sau starii de tranzitie (c)
 Enzima se leaga la substrat (si la cofactor/coenzima, daca
acesta exista) prin centrii activi, care contin resturi de
aminoacizi (grupe catalitice) care participa la formarea si
ruperea legaturilor intermediare.

 Interactiunea dintre enzima si substrat la centrul activ


favorizeaza formarea starii de tranzitie.

 Centrul activ este regiunea care produce nemijlocit


micsorarea variatiei de energie libera, determinind
crestearea specifica a vitezei de reactie.

 Chiar daca enzimele difera substantial prin: structura,


specificitate si mod de actiune catalitica, centrii activi
prezinta citeva caracteristici cu caracter general:
1. Centrul activ are o conformatie geometrica tridimensionala
data de grupuri care provin din diferite parti ale secventelor
de aminoacizi; grupe reziduale situate departe in secventa
pot interactiona mai puternic decit resturi adiacente de
aminoacizi.

2. Centrul activ ocupa doar o mica portiune a structura spatiala


a enzimei. Majoritatea resturilor de aminoacizi nu sunt in
contact cu substratul, ceea ce nu justifica marimea enzimelor.
Resturile suplimentare de aminoacizi servesc pentru a crea
suportul structurii tridimensionale a situsului activ din grupe
functionale situate departe una de alta in structura primara.
Aminoacizii apropiati sunt constrinsi steric sa adopte anumite
pozitii care sa permita aparitia centrului activ.
3. Centrul activ este o adincitura/crevasa/vale. In toate
structurile enzimatice cunoscute, substratul se leaga de o
adincitura. Apa este exclusa, daca nu este reactant.
Caracterul ne-polar al adinciturii faciliteaza atit prinderea
substratului cit si cataliza. Cu toate acestea, crevasa poate
sa contina resturi polare, care confera anumite proprietati
speciale, strict necesare legarii substratului sau activitatii
catalitice, in mediul ne-polar. Pozitia acestor resturi polare
in interiorul adinciturii este cruciala pentru a fi ferite de
actiunea apei.

4. Substratul se leaga de enzima prin interactiuni reversibile


slabe. Interactiunile slabe (ne-covalente) din complexul
energetic sunt mult mai slabe decit legaturile covalente.
Legaturile van der Waals devin semnificative doar daca
mai multi atomi de substrat se afla la mica distanta de
atomii de enzima simultan. De aceea enzima trebuie sa
aiba o geometrie complementara. Caracterul directional al
legaturilor de hidrogen dintre enzima si substrat
determina gradul mare de specificitate.
 5. Stereospecificitatea depinde decisiv de aranjamentul
atomilor in centrul activ.Deoarece substratul si enzima
interactioneaza prin intermediul legaturilor cu raza scurta
de actiune, care necesita un contact apropiat, substratul
trebuie sa aiba o matrita corespunzatoare in enzima.

Aceasta proprietate este explicata prin cateva teorii:


• cheie-lacat, care si-a dovedit limitele in timp;
• geometrie indusa – matrita enzimatica se formeaza
abia in urma interactiunii cu un anume substrat;
• legare neproductiva.
 Mecanismul cheie-lacat
Situsul activ al enzimei este
ca o matrita in care intra
numai substratul specific.

 Modelul geometrie indusa


Situsul activ isi schimba
forma in interactie cu
substratul pina cind devine
complementar acestuia.
 Modelul geometriei induse
postuleaza ca substratul
specific este acela care
determina acele modificari
conformationale ale enzi-
mei care sa aduca grupele
functionale si catalitice in
pozitia corecta pentru ca
procesul de transormare sa
se produca.
Celelalte substraturi nu
reusesc aceasta stereo-
izomerizare, lasand enzima
intr-o structura conforma-
tionala inactiva.
 Modelul legarii nepro-
ductive sugereaza ca
numai substratul spe-
cific se poate lega la
centrul activ in mod
corect, restul legindu-se
la mai putine gru-puri
catalitice (active),
reactia neputind avea
loc.
 Activitatea catalitica a multor anzime depinde de prezenta
unor molecule mici, numite cofactori – rolul lor exact este
dependent de enzima si de proces.
Tandemul enzima-cofactor poarta numele de holo-enzima,
in tip ce enzima singura se numeste apo-enzima.

 Cofactorii pot fi divzati in doua subgrupe: metale si


molecule organice mici.

 Cofactorii care sunt molecule organice mici sunt denumiti


coenzime, derivate cel mai adesea din vitamine – acestea
sunt mai puternic sau mai slab legati de enzime.

 Daca legatura este puternica, coenzimele poarta numele de


grupe prostetice.
 In cazul celalalt, ceonzimele sunt, mai degraba, co-substrat,
deoarece actiunea lor (legarea si detasarea de enzima) este
asemanatoare cu a substratului. Cu toate acestea,
utilizarea coenzimelor de catre diferite enzime, precum si
provenienta lor din vitamine, le deosebesc pe acestea de
substraturile ordinare.

 Enzimele care utilizeaza aceleasi coenzime functioneaza


dupa acelasi mecanism de reactie.

 Enzimele pot transforma energia dintr-o forma in alta

 Mecanismele care guverneaza astfel de transformari sunt


remarcabil de precise, formate din cicluri unidirectionale
desfasurate cu ajutorul unor pasi discreti de cuplare-
decuplare.
 Majoritatea enzimelor au nume uzuale, care nu spun nimic legat
de tipul de reactii pe care le catalizeaza.

 In 1964 Uniunea Internationala a Biochimistilor stabileste


Comisia Enzimelor, cu scopul de a da o nomenclatura clara si
definitiva a acestora. Astfel, enzimele au fost grupate in sase
categorii (numerotate de la 1 la 6), dupa tipologia reactiilor
catalizate. Acestea au fost subdivizate, la rindul lor, astfel incit s-
a creat un indicativ din patru cifre precedate de literele EC, care
permit identificarea precisa si univoca a enzimelor.
 Cinetica enzimatica reprezinta studiul factorilor ce
actioneaza asupra enzimelor, modificand viteza de reactie
(denumita activitate enzimatica).
 Functia fundamentala a unei enzime este sa
imbunatateasca viteza de reactie, astfel incit aceasta sa
satisfaca nevoile organismelor. Pentru a intelege modul in
care functioneaza enzimele, este nevoie de o descriere
cantitativa (cinetica) a activitatii lor.

 In cinetica enzimatica exista urmatorul formalism:


enzima E converteste substratul S la produsul P,
accelerand viteza de reactie.

 In cinetica enzimatica se opereaza cu marimi intensive si


mai putin cu marimi extensive.O marime extensiva
(cantitativa) depinde de cantitatea initiala(ex. masa,
volumul, lungimea )
O marime intensiva nu depinde de cantitatea initiala. (ex.
concentratia, densitatea, fractia molara )
 O unitate de enzima este cantitatea de enzima care catalizeaza
formarea unui mol de produs pe minut in conditii specificate.
Unitatile enzimatice pot fi convertite in miligrame de enzima daca
se cunoaste activitatea specifica (factor de conversie).

 Activitatea specifica este cantitatea de activitate enzimatica pe


miligram de proteina (μmoli de produs format pe mg de proteina
sau unitati pe mg).

 Pentru o enzima pura aflata intr-un mediu experimental bine


definit, activitatea specifica este o constanta, diferita pentru
fiecare enzima.

 Activitatea specifica este utilizata, adesea, drept un prim criteriu


de puritate. Cu cit enzima este mai pura, prin separare, cu
atit activitatea acesteia creste, pina la un palier –
momentul in care nu mai exista decit enzima in mediul de
reactie,
 Modelul cinetic cel mai uitilizat pentru caracterizarea
proceselor enzimatice este descris de ecualia Michaelis-
Menten:

Vmax[ S ]
V0 =
[S] + KM
 Elementul esential in determinarea unei expresii cinetice
este ipoteza pseudo-stationaritatii complexului activat,
intermediarul catalitic avind energia cea mai mare. Se
pleaca de la stoechiometria elementara:
k k
1 2 +
E + S E S E P
k
-1
 Enzima E reactioneaza cu substratul S pentru a forma
complexul activat ES, cu constanta de viteza k1.
Complexul ES are doua posibilitati. Fie disociaza inapoi, in
reactanti, cu constanta k-1, fie se transforma in produsul P,
cu constanta k2. Se considera ca procesul de transformare a
complexului enzimatic in produs este ireversibil (ipoteza
adevarata la inceputul reactiei).

 Conform cu observatiile experimentale, consideram ca


obtinerea produsului este un proces de ordinul unu

 In conditii de pseudo-stationaritate
 Dupa rearanjare

 KM este o caracteristica importanta a interactiei enzima-


substrat, fiind independenta de concentratiile ambilor
parteneri de reactiei. Constanta KM se numeste constanta
de afinitate. Concentratia complexului activ poate fi
calculata din conditia de pseudostationaritate:
Viteza specifica maxima, Vmax, este atinsa cind centrii activi ai enzimei sunt
saturati cu substrat:
 La concentratii mici de substrat, cand [S] este mult mai
mica decit KM, V0 = (Vmax/KM)[S]; adica, viteza de reactie
este proportionala cu concentratia de substrat,
caracteristica a proceselor liniare.

 La concentratii mari de substrat, cand [S] este mult mai


mare decit KM, V0= Vmax; adica, procesul se desfasoara la
viteza maxima, indiferent de concentratia substratului,
carcateristica a proceselor de ordinul zero.

 Cand [S] = KM, atunci V0 = Vmax/2. Deci, KM reprezinta


concentratia de substrat la care viteza de reactie este
jumatate din viteza maxima. KM este o marime importanta
a reactiilor catalizate enzimatic, fiind semnificativa pentru
procesele biologice.
 Constanta de afinitate, KM, furnizeaza o masura a
concentratiei de substrat la care jumatate din centrii activi
sunt ocupati – moment de la care cataliza devine
semnificativa ca viteza de proces.
De fapt, concentratia de substrat corespunzatoare lui KM
este cea in vivo.

 Dar, KM este, de asemenea, legat de constantele pasilor


elementari din reactia catalitica fundamentala, KM = (k-1 +
k2)/k1.
Considerand cazul limita in care k-1 este mult mai mare
decat k2, se observa ca ES disociaza in E si S mult mai
repede decat se formeaza produsul P.
 O grupa importanta de enzime
care nu se supun cineticii
Michaelis-Menten sunt cele
alosterice. Aceste enzime poseda
centrii activi multipli si au viteze
de reactie sigmoidale functie de
concentratia substratului (V0
functie de [S]), si nu profilul
hiperbolic, caracteristic pentru
ecuatia Michaelis-Menten.

 In cazul enzimelor alosterice,


legarea unui substrat la enzima
poate afecta proprietatile altor
centri activi ai aceleasi enzime.
 Inhibitia enzimatica
 Activitatea multor enzime poate fi inhibata de legarea
unor molecule mici sau ioni – mecanism de control al
proceselor metabolice. Pe linga enzimele alosterice, si
alte enzime pot fi inhibate de agenti toxici sau
medicamente, ceea ce poate constitui o modalitate de a
descifra mecanismele dupa care functioneaza o enzima –
inhibitori specifici pot fi utilizati pentru a identifica
grupe reziduale critice pentru cataliza.
 Inhibitia poate fi:
 Competitiva: efect asupra raportului dintre viteza
specifica maxima si constanta de afinitate(inhibitorul
se substituie gruparii active a enzimei )
 Incompetitiva: efect asupra constantei de afinitate

 Necompetitiva: dublu efect, atit asupra asupra


raportului cit si a constantei(are loc o reactie directa
intre inhibitor si enzima)
Inhibitia competitiva este reversibila in timp ce inhibitia de
tip necompetitiv este in general ireversibila.
 Cinetica inhibitiei
competitive
 La concentratii scazute de substrat
([S] < KM), enzima se afla
preponderent libera. Inhibitorul
competitiv se poate cupla cu enzima,
deci prezenta inhibitorului descreste
viteza de reactie.

 Pe masura ce concentratia de
inhibitor competitiv creste, sunt
necesare concentratii de substrat
mereu mai mari pentru o aceeasi
viteza a procesului.

 Calea metabolica (de reactie) poate


sugera care este acea valoare a
concentratiei de substrat care
elimina complet inhibitia
competitiva.
 Cinetica inhibitiei incompetitive

 Daca inhibitorul se combina doar cu ES


(dar nu si cu enzima E), inhibitorul
exercita influenta doar la concentratii
mari de substrat, la care complexul
activat exista in concentratii mari.
 Asta inseamna ca modificarea
concentratiei de substrat nu
influenteaza inhibitia, cum substratul
si inhibitorul se leaga (ataseaza) de
doua centre active diferite (centrul
activ liber al enzimei, in cazul E, si
complexul activ ES, in cazul I).
 Cinetica inhibitiei
incompetitive

 La concentratii de substrat
foarte mici ([S] se apropie de
zero), enzima este libera in cea
mai mare parte. Cum inhibitia
acompetitiva se manifesta
numai asupra complexului ES,
inhibitorul nu afecteaza viteza
specifica maxima, deci raportul
Vmax/KM.
 Acest tip de inhibitie este
intilnit la enzime care
catalizeaza reactia dintre doua
substraturi.
 Cinetica inhibitiei
necompetitive

 Calea de reactie arata ca


inhibitorul se leaga la enzima
libera si la complexul
enzimatic. In consecinta, Vmax
nu poate fi atins, chiar si la
concentratii mari de substrat.
o Influenta factorilor de mediu asupra cineticii
enzimatice:

 Temperatura
La creşterea temperaturii
creşte şi activitatea
enzimatică. La temperaturi
însă prea mari, enzimele
încep să se descompună şi
activitatea enzimatică se
micşorează.

 Concentratia substratului
La crestea concentratiei
substratului si activitatea
enimatica creste.
o Influenta factorilor de mediu asupra cineticii enzimatice:

 pH-ul
Activitatea enzimatică
este în strânsă legătură
cu pH-ul mediului în care
se află. De exemplu,
pepsină, o enzimă
digestivă, este în condiţii
optime la pH cuprins între
1,5 - 2.
 Fluxul metabolic este un determinant fundamental in
fiziologia celulara si cel mai important parametru al unei
cai metabolice.
 Fluxul caii metabolice este viteza cu care metabolitii de
intrare sunt procesati in vederea producerii metabolitilor
de iesire.
 Fluxul metabolic este o abordare globală a celulei, unde se
ia în calcul reţeaua completă a reacţiilor intracelulare,
unde sunt cuantificate fluxurile, prin ramurile individuale
ale reţelei.
 Un domeniu în care folosirea fluxului metabolic si a
cineticii enzimatice poate fi imbinata este îmbunătăţirea
productivităţii, de exemplu in cazul în care substratul A
este convertit în produsul B, cu formarea produsului C.
Substratul A poate fi glucoza, produsul B poate fi etanolul
şi produsul C poate fi glicerolul.(http://ebooks.unibuc.ro/biologie/drojdii/2.htm )
Căile biochimice ce conduc la glicerol şi etanol din glucoza.