Modele cinetice ale proceselor enzimatice

= procesele metabolice sunt extrem de complexe O (104) componen i

i Oº(105-106) reac ii;

= procesele care au loc sunt de: – sinteză;

– degradare (apoptoză);
– între iner
– e;
liză;
– mobilitate;
– etc.;
= procesele enzimatice sunt catalizate de o enzimă i pot avea un
activator (A) i un inhibitor (I) al activită ii acesteia;
= controlul lor este deci complex;
= enzimele au un situs (centru) activ iar legăturile cu substratul sunt de
tip Van der Waals, de hidrogen, electrostatice;
= reac ia E + S trece printr-un complex
activat; 83
= reac ia este foarte E +S → (ES ) → (ES )*activat → P
specifică: Enzimă
Substrat (S) Produs (P)
(E)
in-vivo (în celula vie) ducând la modificări
= enzimele ac ionează fiziologice (reglabile);
in-vitro (cu enzime imobilizate pe un
suport);
= ca orice catalizator, enzimele măresc viteza de reac ie, scad
energia de activare dar nu deplasează (modifică) echilibrul biochimic;
= reac iile biochimice pot în acest fel să aibă loc la temperatura i
pH-ul dorite, strict controlate (de către organismul viu);
= enzimele ac ionează cu o mare specificitate, de regulă pentru o
singură reac ie;
= enzimele ac ionează prin ”recunoa terea” fiecărui substrat pe care
îl leagă formând un complex activat;
= procesele cu enzime imobilizate ridică probleme suplimentare de
transfer/transport de masă (cu influen ă asupra cineticii aparente)
de i enzima este mai stabilă; 84
 fără inhibi ie;
= procesele enzimatice prin substrat (S);
cu prin produs (P);
inhibi ie
printr-o substan ă străină
(I);
complexă.

cu co-enzimă (co-reactant);
= procesele enzimatice cu promotor/activator;
fără co-enzimă;

temperatură;
= activitatea enzimei este foarte sensibilă la pH;
inhibitor;

= fiecare enzimă prezintă un domeniu optim de temperatură i pH la

care activitatea sa este maximă.
85
 Modele cinetice enzimatice

Pentru a determina viteza de reacție trebuie generată o curbă ce
ilustrează variația concentrației substratului sau a produsului în funcție
de timp.

În cazul conversiei unui substrat S într-un produs P, forma generală a
curbei va fi dată de:
• descrețterea exponențială de ordin
I a concentrației de substrat:
[ ]
CS - CSmin = CS0 - CSmin e − kt

• sau de crețterea exponențială de

ordin I a concentrației de produs:
[ ](
CP - CP0 = CPmax - CP0 1 - e -kt ) Varia ia concentra iilor
substratului i produsului în timp

În care: CS0 = concentra ia ini ială a substratului

(S);
Csmin = concentra ia minimă de substrat la timpul t →
∞;
CS = concentra ia de substrat la timpul t;
CP0 = concentra ia ini ială de produs la timpul t = 0;
Cpmax = concentra ia minimă de substrat la timpul t →
CP
∞; = concentra ia de produs la timpul t. 86

Viteza reacției este dată de panta corespunzătoare curbei obținute, ți
anume:
dS dP
v =- = =k
dt dt

Viteza de reacție scade în timp datorită următoarelor cauze:

• enzima devine instabilă pe parcursul desfățurării reacției;
• gradul de inhibiție al enzimei descrețte cu descrețterea substratului;
• reacția reversibilă devine determinantă pe măsură ce se acumulează
produsul;
• produsul reacției inhibă enzima;
• orice combinație a factorilor enumerați mai sus.

Curba obținută pentru reacțiile enzimatice nu poate fi comparată cu

modelele standard ale reacțiilor chimice omogene. Prin urmare a fost
necesară o altă abordare, a fost introdus ca termen de măsurare a vitezei
de reacție viteza ini ială.

87

La începutul unei reac ii enzimatice:

• gradul de conversieS → P este destul de mic i astfel

concentra ia substratului poate fi considerată constantă i egală cu
cea ini ială:
C ≈ C
St ≈ S0

• cantitatea de produs acumulată este foarte mică:

CPt ≈ 0

• se poate considera că reacția inversă este neglijabilă;

• posibilele efecte inhibitoare ale produsului sau cele determinate de
activitatea enzimatică sunt nesemnificative;

• se poate consideră că enzima rămâne stabilă în stadiile incipiente

ale reacției;

Pentru a obține vitezele inițiale se trasează o tangentă la curba

obținută anterior care să fie cât mai aproape de origine (vezi figura
următoare). Panta acestei drepte trasate (adică viteza inițială) se
obține prin regresie liniară:
88
 Determinarea vitezei ini iale a unei reac ii enzimatice

De cele mai multe ori, forma curbei variază în funcție de: pH,
temperatură, tărie ionică, polaritate, tipul substratului, concentrațiile
enzimei ți a coenzimei, etc.

Pentru a determina viteza unei reacții, cercetătorii se bazează de prea
multe ori pe măsurătorile obținute, măsurători care nu caracterizează
întotdeauna procesul pentru toate condițiile studiate. Din acest motiv,
pentru a obține o analiză cinetică corectă, este esențial ca vitezele de
reacție să fie determinate din regiunea inițială a curbei.

În caz contrar există riscul ca, prin alegerea unui moment de timp nepotrivit
pentru derivare, să nu se obțină o relație liniară între viteză ți
concentrația enzimei (aceasta fiind o cerință necesară în analiza cinetică
enzimatică). 89

Pentru ca reacția să fie cinetic controlată de către enzimă, viteza reacției
trebuie să fie direct proporțională cu concentrația acesteia:

Dependen a vitezei ini iale a

reac iei de concentra ia enzimei din
amestecul de reac ie

În concluzie, pentru a colecta date valide din punct de vedere cinetic,

trebuie să se țină cont de următoarele aspecte:
• enzima trebuie să fie stabilă pe durata măsurătorilor utilizate în
calculul vitezelor inițiale;
• vitezele inițiale sunt utilizate ca viteze de reacție;
• viteza de reacție trebuie să fie proporțională cu concentrația
enzimei.
90
 Cinetică enzimatică cu inhibiție de substrat
(modelul Michaelis-Menten)

Cea mai simplă ți mai veche descriere cantitativă cinetică a procesului

enzimatic este modelul Michaelis-Menten (M-M):
k1 k2
S+E (ES) P+E
k-1

(S = substrat, E = enzima, P = produs, ES = complex activat)

Pentru a deduce expresia cinetică M-M a reacției enzimatice se aplică

teoria stării staţionare care consideră că, în orice moment, vitezele de
formare şi de scindare ale complexului ES sunt egale, astfel încât:
• pentru o perioadă scurtă de timp, concentraţia complexului poate fi
d(ES)
considerată ca fiind constantă: = 0;
dt 91
• pentru perioade mai mari de timp, concentraţia complexului ES se
modifică deoarece reacţia progresează şi concentraţia substratului
scade, dar viteza modificării concentrației ES va fi întotdeauna mult mai
mică decât viteza reacţiei enzimatice;

• în acest fel, postulându-se că specia ES se află la cvasi-

staționaritate,
d(ES)
=0
dt , ți obținerea produsului (P) este etapa determinantă de viteză
E0 = Et = E + ( ES )
se obține:
dS
= − k1 ⋅ S ⋅ E + k −1 ⋅ ( ES ) So
dt
P
d(ES)
= 0 = k1 ⋅ S ⋅ E − ( k −1 + k 2 ) ⋅ ( ES )
dt

⇓ Eo
(ES)
k ⋅S ⋅E
(ES) = 1
k −1 + k 2
S = S0 0 Timp
t =0
( ES )0 = 0 92
 dS
= − k1 ⋅ S ⋅ E + k −1 ⋅ ( ES )
dt
k ⋅ S ⋅ E E0 ⋅ k −1 + E0 ⋅ k 2 − k1 ⋅ S ⋅ E
E = E0 − ( ES ) = E0 − 1 =
k −1 + k 2 k −1 + k 2

E ⋅ k −1 + E ⋅ k 2 = E0 ⋅ k −1 + E 0 ⋅ k 2 − k1 ⋅ S ⋅ E

⇓
k −1 + k 2
E = E0
k −1 + k 2 + k1 ⋅ S

Substituind în dS ipoteza de cvasi-staționaritate rezultă:

dt
dS
− = k1 ⋅ S ⋅ E − k −1 ⋅ ( ES ) = k 2 ( ES )
dt
dS k ⋅ k ⋅ E ⋅ S k1 ⋅ k 2 ⋅ S k −1 + k 2
− = k 2 ( ES ) = 1 2 = ⋅ E0 =
dt k −1 + k 2 k −1 + k 2 k −1 + k 2 + k1 ⋅ S
dS k1 ⋅ k 2 ⋅ S ⋅ E0 k 2 ⋅ S ⋅ E0
=− =−
dt ( k −1 + k 2 ) + k1 ⋅ S k −1 + k 2
+S
k1 93
 dS V max⋅S
rS = − =
dt K M + S

Vmax = k 2 ⋅ E0 ; (k2 = turnover-number, specific fiecărei enzime)

unde: k −1 + k 2
KM = ; (KM = constanta Michaelis-Menten,1913)
k1

Alte forme ale ecuației Michaelis-Menten

k1 ⋅ k 2
− rS = rp = ⋅ S ⋅ E0
k −1
k1 ⋅ k2
− rS = rp = ⋅ S ⋅ E0
k −1 + k2
k2
− rS = rp = ⋅ S ⋅ E0
k −1
+S
k1
94
 Cazurile limită ale ecuației M-M:
Vmax ⋅ S
S << K M rS =
KM

S >> K M rS = Vmax ≈ constant

0.1 K M < S < 10 K M rS = ecua ia M-M cu abatere de maxim

10%

Semnificația fizică a KM:

k1 ( ES )
= K eq = (echilibru prima reacție)
k −1 S⋅E
1 k1 ( ES )
= ≈
K M k −1 + k 2 S ⋅ E

k 2 << k −1 (echilibru rapid)

( ES ) S enzimă legată
= =
E K M enzimă liberă
95
Dacă: KM = S ½E este legată ți ½E este liberă

Dacă: K M << S toată enzima este legată

Dacă: K M >> toată enzima este liberă

Valori tipice pentru KM :

Enzimă Substrat KM (mol/L)

maltază maltoză 0.1
sucrază sucroză 0.01
fosfatază glicerol-fosfat 0.001
dehidrogenază acid piruvic 0.0001
complex BOD-organic 100 (g/m3)
complex NH4+ 0.55 (g/m3)
complex NO2- 1.4 (g/m3)
complex NO3- 0.1 (g/m3)

96
 Determinarea parametrilor cinetici ai ecuației
Michaelis-Menten din date experimentale
(curbe cinetice S(t))

a) Metode aproximative

a1) Diagrama Lineweaver-Burk

1 V max⋅S
− − rS =
rS
KM + S

⇒
1 KM + S K 1 1
1 − = = M ⋅ +
Vmax
rS V max⋅S Vmax S Vmax

1 0 1
−
KM S
97
a2) Diagrama Eadie
rS
E0 rS ( K M + S ) = V max⋅ S = k 2 ⋅ E 0 ⋅ S

k2 rS ⋅ K M + rS ⋅ S = k 2 ⋅ E 0 ⋅ S

rS ⋅ S = k 2 ⋅ E 0 ⋅ S − rS ⋅ K M S ⋅ E0

⇒
rS r
= k2 − K M S
0 k2 rS E0 S ⋅ E0
KM S ⋅ E0

Valori tipice ale constantelor M-M:

k1 = 105 – 109 L/mol · s

k-1 = 10 – 104 1/s
k2 = 1 – 106 1/s
KM = 10-6 – 10-1 mol/L
98
 Alte metode grafice de evaluare a constantelor M-M:
• metoda Eisenthal;
• metoda Cornish-Bowden;
• metoda Dixon;
• etc.

b) Metoda exactă - Regresia neliniară

n S, P 2
[ V̂ max , K̂ M ] = arg Min Φ = ∑ ∑ ( C i, u, exp − Ci , u , model )
u =1 i =1

99
 Mecanismele inhibiției enzimatice

Reac ie fără inhibi ie Reac ie cu inhibitor competitiv

Reac ie cu inhibitor Reac ie cu inhibitor

10
incompetitiv necompetitiv 0
 Modele cinetice enzimatice cu inhibiție

Inhibiție competitivă
k1 k2
S+E (ES) P+E
k-1
I+E (EI)
Ki
1 k
= i
K i k −1

I = I0 (concentra ie inhibitor)
k −1 + k 2
KS =
k1
Vmax ⋅ S
rP = ; V max = k 2 ⋅ E 0 ;
 I 
K S  1 +  + S
 K I  E 0 = E + ES + EI

dP
rP = = k 2 ( ES )
dt
101

Inhibiție ne-competitivă (non-competitive)
k1 k2
E+S (ES) E+P
k-1
k3 k-3 + I k4 k-4 + I
k5
EI (ESI)
k-5
• are loc la concentrații foarte mici ale S ;
• inhibitorul se leagă la un situs distinct de
cel al substratului, numit situs de legare;
• Vmax nu este atins niciodată, nici chiar la
concentrații foarte mari ale substratului;
V max = k P ⋅ E 0
Vmax ⋅ S
rP =
 I 
 1 +  + (K S + S )
 KI 
• inhibitorul reduce rp prin blocarea
centrilor activi; 102
 Vmax ⋅ S1 ⋅ S2
• cinetica M-M cu dublu substrat: − rS = rP =
( K M1 + S1 ) + ( K M2 + S2 )

Inhibiție incompetitivă (un-competitive)

k1 k2
E+S (ES) P+E
k-1
ki k-i + I

(ESI)

Vmax ⋅ S
rP =
 I 
K S + S ⋅  1 + 
 KI 

• are loc la concentrații foarte mari ale

substratului (S);
• asemănătoare catalizei chimice (A* + B*)
cu reacție pe suprafață.
103

Inhibiție alosterică

k1 kcat
nS + E (ESn) nP + E
k-1

Vmax ⋅ S n
− rS = rP =
K Sn + S n

V max = k cat ⋅ E 0

Inhibiție alosterică

Activare alosterică 104

 Influența temperaturii ți pH-ului asupra vitezei de reacție
ți activității enzimatice

a) Dezactivarea enzimei
• enzima se dezactivează în timp datorită schimbărilor structurale
conformaționale după ecuația:
dE
dt
= − kd ⇒ E = E 0 ⋅ e − kd ⋅t

k 2 ⋅ S ⋅ E k 2 ⋅ E 0 ⋅ e − kd ⋅t ⋅ S
rS = =
KM + S KM + S

b) Sterilizarea enzimei
• sterilizarea este similară dezactivării naturale dar are ca efect încetarea
viabilității organismului sau a celulei;
• sterilizarea se face sub influența căldurii, radiației sau a compuților
chimici;
105
• sterilizarea este un proces stocastic, aproximat printr-o cinetică de
ordin unu:
rd = − kd ⋅ X
(X = concentrația de biomasă activă)
X = X 0 exp ( − k d ⋅ t )

• timpul necesar reducerii populației de celule cu un factor de 10 este:

ln X X 0 ln 10
td = =
kd kd

X
Demo: = 0.1 = exp ( − kd ⋅ t )
X0
ln 0.1 = − kd ⋅ t d ⇒ − ln 10 = − kd ⋅ t d
ln 10
td =
kd

106