CURS 2

ENZIME-2

FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ VITEZA UNEI REACȚII ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacţie
2. pH-ul mediului de reacţie
3. Concentraţia enzimei
4. Concentraţia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori - inhibitori
1. TEMPERATURA MEDIULUI DE REACTIE
 Temperatura mediului de reacţie „efector fizic”
• La 0°C enzimele îşi încetează în mod reversibil activitatea (efect de conservare a
activităţii, sau inactivare reversibilă);
• La o temperatură > 50oC enzimele sunt inactivate ireversibil, prin denaturarea
structurii proteice a apoenzimei;
• Excepţie: bacteriile termofile, îşi menţin activitatea şi la temperaturi > 80oC.

Temperatura optimă = temperatura corespunzătoare vitezei maxime de acţiune a enzimei

(aproximativ 40°- 50°C)

2. INFLUENŢA pH-ului MEDIULUI DE REACŢIE ASUPRA ACTIVITĂŢII

ENZIMELOR

pH-ul mediului de reacţie = concentraţia ionilor de hidrogen

pH-ul optim al unei enzime: pH-ul mediului de reacţie pentru care activitatea enzimei
respective ca şi viteza de reacţie este maximă.
Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim de acţiune este chiar pH-ul normal al
mediului în care ele îşi îndeplinesc funcţia catalitică.
La majoritatea enzimelor pH-ul optim este în jurul valorii 7

1
Influenţa exercitată de pH-ul mediului se datorează:
 ionizării centrilor activi din molecula enzimei;
 ionizării substratului, modificându-se astfel activitatea sa pentru centrii
activi ai enzimei => modificarea vitezei de formare a complexului enzimă-
substrat.

Exemplu – amilaza salivară acţionează numai la nivelul cavităţii bucale deoarece este
inhibată de pH-ul acid al stomacului.

3. INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI ENZIMEI ASUPRA VITEZEI DE REACŢIE

Viteza de reacţie este proporţională cu concentraţia enzimei [E].
Dar, cu cât concentraţia de enzimă este mai mare cu atât cantitatea de substrat necesar
desfăşurării reacţiei va fi mai mare.

2
 în condiţii normale (N),

- în cazul reducerii concentraţiei de

substrat (B),

- în prezenţa activatorilor (A) sau a

inhibitorilor (I) enzimatici în mediul de
reacţie,

- în prezenţa unor impurităţi (C).

Porţiunea din grafic O – C’ = perioadă

de „lag”

4. INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI SUBSTRATULUI ASUPRA VITEZEI REACŢIILOR

ENZIMATICE

Fiecare din cele trei reacţii se caracterizează printr-o viteză de reacţie (v+1, v-1 și
v+2) și respectiv printr-o constantă de viteză specifică (k+1, k-1 și k+2);
• Viteza procesului enzimatic ireversibil v+2 reprezintă de fapt viteza propriu-zisă
a reacției enzimatice, iar ea tinde către viteza maximă (Vmax) atunci când toată
enzima este inclusă în complexul ES (adică [ES]=[E])
Deci, viteza reacței globale depinde de viteza de disociere a complexului ES,
exprimată matematic printr-o constantă de disociere - KM (sau constantă
Michaelis)

3
Semnificaţia biochimică a constantei Michaelis-Menten (KM)
KM :
 este un parametru cinetic, practic şi util pentru evaluarea acțiunii unei
enzime;
 este o caracteristică a fiecărei enzime, independentă de concentraţia de
enzimă;
 se exprimă în unităţi de concentraţie de substrat (moli/litru).
Valorile KM variază :
 în funcţie de structura substratului ;
 în funcţie de pH-ul mediului de reacţie ;
 independent de concentraţia enzime

4
 KM este o constantă ce poate fi determinată practic din datele experimentale
Pentru o reacţie enzimatică simplă, KM redă „capacitatea de disociere a lui ES în E şi S”.
 KM redă tăria legăturii între E şi S.
 1/KM reprezintă afinitatea enzimei pentru substratul său
 valori mici ale KM, (1/KM mare) => afinitate mare a enzimei pentru substrat (10-5
- 10-8 mol/L) ;
 valori mari ale KM (1/KM mic) => afinitate mică (legături slabe între E și S) (10-1-10-2
mol/L).
Pentru multe enzime valoarea KM = 10-2- 10-8 M

EFECTORII ENZIMATICI – DEFINIȚIE

Se numesc efectori enzimatici substanţele care pot mări sau micșora
activitatea catalitică a unei enzime, deci care pot accelera sau
respectiv diminua viteza unei reacţii enzimatice.
Efectorii enzimatici pot fi activatori sau inhibitori

1. Activatorii enzimatici
• substanţe nespecifice;
• natură anorganică sau organică;
• capabili să accelereze viteza unei reacţii enzimatice.

Tipuri de de mecanisme de activare enzimatică

1. Activarea prin acţiunea protectoare a unor substanţe asupra enzimelor

2. Activarea prin favorizarea legăturii dintre enzimă şi substrat
3. Activarea prin favorizarea trecerii unor enzime din starea inactivă
(zimogene, proenzime) în forma catalitică activă
4. Activarea enzimelor cu rol reglator prin adenozin monofosfat ciclic
(AMPciclic, AMPc).
5. Activarea prin control genetic

5
 Tipuri de mecanisme de activare enzimatică

1. Activarea prin acţiunea protectoare a unor substanţe asupra enzimelor:

Exemplu: cisteina şi glutationul redus (GSH)

grupările –SH libere = acţiune activatoare, protectoare a grupărilor –SH

esenţiale, situate în centrul activ al unor enzime;

unele vitamine: tocoferoli, filochinone, acid ascorbic protejează multe 

enzime de acţiunea toxică a peroxizilor lipidici care apar uneori în cursul
metabolismului.

2. Activarea prin favorizarea legăturii dintre enzimă şi substrat.

Unii ioni metalici pot înlesni formarea complexului ES prin diferite mecanisme:
Exemple:

• menţinerea substratului în centrul catalitic al enzimei: ionii de magneziu (Mg2+)

în cazul pirofosfatazei, favorizează legătura dintre enzimă şi substrat;
• Alţi ioni metalici pot fi chiar cofactori enzimatici:
• ATP (adenozin trifosfat) –aza, fosfotransferazele, fosfohidrolazele –

activate de Mg2+;
• amilaza (de origine animală) – activată de Na+ şi anionul clorură, (Cl-);
• tirozinaza, ceruloplasmina, citocrom oxidaza – activate de Cu2+;
• alcool dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, carboxi-peptidaza,

anhidraza carbonică – activate de Zn2+;

• enzimele din procesul coagulării - activate de Ca2+;
• citocromii, peroxidaze, catalaza – activate de Fe2+ sau Fe3+;

6
3. Activarea prin favorizarea trecerii unor enzime din starea inactivă
(zimogene, proenzime) în forma catalitică activă.
Mecanismul: hidroliza unor legături peptidice specifice.
• Are loc înlăturarea unui inhibitor şi „demascarea centrului catalitic”.

Exemplu:
Proenzimele inactive (digestive) sunt convertite la enzime active prin
proteoliză limitată (pepsina, chimotripsina, tripsina, enzimele coagulării
sângelui, fibrinolizei)

. Activarea enzimelor cu rol reglator prin adenozin monofosfat ciclic (AMPc)

Exemplu: Activarea protein kinazelor sub acţiunea AMPc este un exemplu de reglare
alosterică

Protein kinazele sunt ENZIME ALLOSTERICE formate din 4 subunităţi :

- 2 subunități catalitice care cuprind centrul catalitic activ;
- 2 subunități reglatoare care au un centru de fixare pentru AMPc (activator)

7
 Rolul biologic al protein kinazelor

Protein kinazele de tip A, C și G au rolul de a transfera grupări fosfat de la

molecula de ATP la grupările –OH a unor aminoacizi specifici (serină, treonină,
tirozină), din structura anumitor proteine => forme active (fosforilate)

8
9
 2. Inhibitorii enzimatici
3.
Substanţe care prin prezenţa lor în mediul de reacţie diminuează sau
anihilează activitatea enzimelor

INHIBIŢIA IREVERSIBILĂ = INACTIVARE

„otrăvuri enzimatice” sau „otrăvuri catalitice”

Caracteristicile inhibiţiei ireversibile:

 
legare covalentă (deci puternic) de centrul catalitic al enzimei
 
 acţiune lentă, este necesar un anumit timp de contact dintre inhibitor şi enzimă


Gradul de inhibiție Nu
este afectat de diluţia mediului de reacţie şi nici de

concentraţia de enzimă!
 
inhibiţie NESPECIFICĂ

Exemple:
• Enzimele care au în centrul catalitic aminoacizi cu gruparea –SH

• Enzimele care au în centrul catalitic serina, deci un aminoacid cu gruparea –OH

Exemple de inhibitori ireversibili cu proprietăţi alchilante:

Monoiod-acetamida este un agent inhibitor cu

proprietăţi alchilante pentru fosfataze.
Alchilează grupările –SH din structura unor centri activi ai
enzimelor.
Diizopropil-fluorofosfat (DFP sau DIFP) - compus organofosforic (pesticid).
Inhibă prin fosforilare enzimele care au în centrul activ serina.

10
Exemple: acetilcolinesteraza, chimotripsina.
DIFP este un toxic nervos : inhibă acetilcolinesteraza => blocarea transmiterii influxului nervos
=> paralizie.

Mecanismul de acțiune al acetilcolinesterazei

Centrul activ (Ser, His) 1. 2.

Acetilcolina
(substrat)

+ H2O

4. 3.

Enzima are 2 centri activi :

- Anionic (leagă ionul amoniu)
- Esterazic (Ser, His) - se atașează de legătura esterică

Inhibiția colinesterazei sub acțiunea compușilor organofosforici

• Paraoxonul – inhibitor de colinesterază (metabolit toxic al insecticidului paration);

gaz de luptă sau agent pentru studiul experimental al intoxicației organofosforice
• Pralidoxima și obidoxima – reactivatori de colinesterază (antidoturi)

Obidoxima înlătură gruparea fosforil de la nivelul centrului esterazic al enzimei, reactivând

afinitatea catalitică față de substratul fiziologic

11
 INHIBITORII REVERSIBILI
Caracteristici generale:
• în general, se poate elimina inhibitorul din mediul de reacție (prin dializă);
• se poate restaura activitatea enzimatică;
• este un proces rapid;
• nu este o inhibiţie specificăcompetitiv
• există mai multe modalităţi de inhibiţie reversibilă necompetitiv noncompetitiv
kI - constanta de inhibiţie (exprimă tăria legăturilor stabilite între enzimă și inhibitor)

INHIBIȚIA COMPETITIVĂ – Caracteristici generale

 inhibitorul se fixează pe acelaşi centru catalitic al enzimei

 inhibitorul intră în competiţie pentru centrul activ al enzimei;
 presupune o analogie de structură dintre substrat şi inhibitor;
 legătura dintre enzimă şi inhibitor este de aceeaşi natură cu cea
dintre enzimă şi substrat;
 inhibitorul competitiv reduce numărul de molecule de enzimă care
leagă substratul;
 se pot, deci, substitui reciproc în funcţie de concentraţia lor în mediul
de reacţie
 deci inhibiţia competitivă poate fi reversată prin creşterea
concentraţiei substratului;
 din punct de vedere cinetic Vmax rămâne constant, KM creşte

12
 Exemplu de INHIBIȚIE COMPETITIVĂ

Inhibiţia competitivă a succinat dehidrogenazei

COOH Succinat COOH

CH2 dehidrogenaza
CH
CH2 HC
COOH COOH
FAD FADH2
Acid succinic Acid fumaric

- Datorită prezenţei a două grupări –COOH ionizabile (-

COO
- COO-), malonatul şi alţi acizi dibazici (ex. acid glutaric),
CH2 COO ce au o distanţă potrivită între cele două grupări
CH2 - anionice, pot acţiona ca inhibitori competitivi pentru
CH2 COO succinat dehidrogenază.
CH2 - Aceste constatări au dus la concluzia că centrul catalitic
COO - COO pentru succinat dehidrogenază are două grupări încărcate
- pozitiv aşezate spaţial în aşa fel încât să fie capabile să fixeze
COO
grupările carboxil încărcate negativ ale substratului.

13
 INHIBIŢIA NECOMPETITIVĂ
Caracteristici generale:
 Formarea complexului activat (ES) are loc normal
 Inhibitorul se leagă în alt centru catalitic decât substratul
 Inhibitorul se combină numai cu complexul (ES) => un complex
inactiv (ESI )
 Complexul inactiv ( ESI ) se formează urmând un mecanism
secvențial ordonat, plecând numai de la complexul (ES).
 Complexul ( ESI ) fiind inactiv, are loc inhibarea reacției enzimatice,
nu se mai pot forma produşi finali de reacţie.
 Din punct de vedere cinetic, fiecare parametru Vmax şi KM este
micşorat prin acelaşi factor, care depinde de concentraţia
inhibitorului şi constanta reacţiei de inhibiţie.
Acest tip de inhibiţie se întâlneşte în cazul enzimelor ce catalizează reacţii între
două substrate.

14
 INHIBIŢIA MIXTĂ (denumită şi NONCOMPETITIVĂ)
Caracteristici generale:
 Inhibitorul se poate lega de enzimă direct, simultan cu legarea
substratului, dar se poate lega şi cu complexul activat (ES)
 Inhibitorul se leagă în alt centru activ decât substratul (deci se poate
lega de enzimă simultan cu substratul)
 Acţiunea inhibitorului nu poate fi reversibilă prin creşterea
concentraţiei substratului
Din punct de vedere cinetic: scade Vmax și KM rămâne relativ aceeași

15
 INHIBIŢIA ALLOSTERICĂ
Efectorii allosterici
• Acţionează asupra conformaţiei spaţiale a enzimelor de tip allosteric

ENZIME ALLOSTERICE
Termenul de „allosteriam” desemnează proprietatea caracteristică
a unor enzime de a funcţiona prin variaţii (allo) ale conformaţiei
tridimensionale (steriam).

Caracteristici structurale
• Sunt proteine complexe cu rol reglator în reacţiile metabolice
• Sunt formate din subunităţi monomere identice (protomeri)
• Structura cuaternară reprezintă asocierea simetrică a
protomerilor componenţi
• Sunt enzime cu mai mulţi centri activi
• Enzimele allosterice pot adopta în mod reversibil mai multe
stări conformaţionale distincte care diferă prin:
- Număr de protomeri
- Distribuţia protomerilor
- Afinitatea protomerilor pentru efectorii stereospecifici
60

16
• Enzimele allosterice au mai multe situsuri de legare
- un situs de tip „catalitic” care realizează transformarea propriu-zisă a substratului, şi care se
află situat pe subunitatea catalitică a enzimei;
- mai multe situs-uri allosterice de care se pot lega efectorii enzimatici (activatori sau
inhibitori), situaţi pe subunitatea reglatoare a enzimei.
• Între situsul catalitic şi cel allosteric există anumite interacţii: efect cooperant. Legarea
inhibitorului allosteric la situsul allosteric induce modificarea tridimensională a moleculei
proteinei enzimatice

• Centrul activ catalitic al enzimei devine inapt pentru a fixa substratul

• Enzimele allosterice manifestă o comportare cinetică diferită de cea postulată în teoria
Michaelis Menten.
Aspectul sigmoid este atribuit structurii cu mai mulţi protomeri, a existenţei mai multor situsuri
de legare pentru fiecare moleculă de enzimă între care se manifestă efecte de cooperare.

17
 Inducţie şi inhibiţie enzimatică prin control genetic

F. Jacob și J. Monod, 1961

• GENĂ STRUCTURALĂ = ansamblul de triplete nucleotidice din ADN nuclear

care codifică biosinteza unei molecule de enzimă (proteină)

• Transcrierea mesajului purtat de gena structurală la ARN mesager (ARNm)

corespunzător este asigurat de un ansamblu nucleotidic care se numește
GENĂ OPERATOARE (operator) și care de obicei se găsește în vecinătatea
GENEI STRUCTURALE deci la locul unde începe transcrierea la ARNm.

• La rândul său operatorul este controlat de o proteină numită REPRESOR a

cărui sinteză este controlată de GENA REGLATOARE.

• În vecinătatea operatorului se găsește o regiune promotoare necesară

pentru începerea transcrierii.
Enzimele pot fi prezente în celulă în cantităţi aproximativ constante = exprimare
constitutivă.
Ex: enzimele lanţului respirator mitocondrial = ENZIME CONSTITUTIVE
Anumite enzime pot fi prezente în mod obişnuit sub forma unei exprimări mai
slabe (sau chiar să nu fie deloc exprimate) dar a căror biosinteză să crească
semnificativ (chiar de mii de ori) în anumite condiţii, în special atunci când
substratul lor este prezent în exces = enzime inductibile.
Ex: enzimele implicate în metabolismul xenobioticelor (medicamente) – citocromii
P450

18
 Inhibiţie şi inducţie enzimatică prin control genetic –
Importanță practică în acțiunea medicamentelor!

• Unele medicamente pot induce biosinteza de enzime necesare propriei lor

metabolizări => Importanţă farmacologică și toxicologică - stă la baza
fenomenului de obişnuiţă la medicamente şi a toxicomaniei.
Exemplu: tranchilizantele, antihistaminicele, anestezicele, hipoglicemiantele, analgezicele, şi în mod
deosebit – barbituricele, determină o creştere a activităţii unor enzime microzomale din
hepatocit (glucuronil transferaza, alcool dehidrogenaza, etc).

• Inducţia enzimatică stă şi la baza fenomenului de rezistenţă la medicamente.

Exemplu: biosinteza enzimei penicilinaza la microorganisme, în prezenţa penicilinei; apariţia
enzimei indică formarea unei linii genetice rezistente la antibiotice.

• Ca răspuns la lezările celulare cauzate de expunerea la compuşi

xenobiotici (medicamente, compuşi toxici poluanţi), celulele elaborează
mecanisme de apărare adaptativă ce includ, între altele, şi inducţia unor gene
specifice care codifică în special biosinteza unor enzime de biotransformare.
Exemplu: citocromul P450 (CYP), glutation-S-transferaza (GST), sau UDP-glucuronil transferaza (UGT).

19