1

Enzime

4.2 Proprietațile enzimelor

4.2.1 Proprietati comune intre enzime si catalizatori anaorganici (sub1)

• Nu modifica enchilibrul reactiilor catalizate, dar grabesc atingerea acestuia

• Necesită concentrații mici
• Nu se consumă in reacțiile catalizate
• Scad energia de activare si cresa viteza de reacție
Energia de activare este energia necesară pentru ca toate moleculele dintr-un mol
de substrat sa atingă starea de tranziție (formarea complexului enzimă-substrat
necesită o energie mai mică decat starea de tranziție a substratului in absența enz-
imei)

4.2.2 Proprietați caracterisitce enzimelor (Sub2)

4.2.2.1 Specificitate
Specificitatea enzimelor are mai mult nivele: de reacție, de substrat si stereochim-
ică
Specificitatea de reacție este o caracterisitică a enzimelor care catalizează un sin-
gur tip de reacție si permite clasificarea enzimelor (ex. Transferaze, oxidoreduc-
taze, hidrolaze, lizaze)
Specificitate de substrat:
Absoluta: Enzima acționează asupra unui singur substrat (ex. Ureaza acționeaza
doar asupra urei, acetilcolinesteraza asupra acetilcolinei)
De grup: Enzima acționează pe o clasă de compuși inrudiți
 2

Largă: enzimele acționeaza pe un tip de legatura chimică (ex. Proteazele catal-

izează hidroliza legaturilor peptidice, glicozidazele catalizeazăhidroliza legaturilor
la care participă un monozaharid cu grupare hidroxil glicozidică)
• Tripsina acționează pe legături peptidice la care participă cu gruparea carboxil
lisina sau arginina
• Chimotripsina acționeaza pe legături peptidicie la care participă cu gruparea car-
boxil fenilalamina, tirozina sau triptofanul
Specificitatea stereochimică : Enzima acționează numai asupra unui enantiomer
sau asupra unuia din cei doi izomeri geometrici ai unui substrat ( ex. Lactatde-
hidrogenaza acționează pe acidul lactic in forma L)
Stereospecificitatea enzimelor se referă si la formarea produsului de reacție numai
sub forma unui izomer.

Mecanismul de acțiune al enzimelor (Sub3)

A) Formarea complexului enzimă-substrat (ES)
In lumea vie substarul (S) interacționează cu enzima (E), fomează intermediar un
complex enzimă-substrat (ES) care trece ulterior un prduși
(P), iar enzima se reface: E+S<—> E+P
Substratul este mai mic decat enzima. Tot experimental s-a demonstrate că o prți-
une restranș din enzimă este activa in procesul catalitic, aceasta prțiune numindu-
se centrul activ al enzimei.
 3

B) Centrul activ al enzimelor

In general, se consideră ca in centrul activ exista un centru de legare a substratului
si un alt centru catilitic care este responsabil de cataliza propriuzisa.
Complexul enzimă-substrat este o structura labila cu o viața foarte scurtă. Legarea
substratului de enzimă se face, prin forțe necovalente.
Referitor la modul de legare a substratului la centrul activ al enzimei s-au elaborat
2 modele:
1. Modelul lacăt-cheie, consideră ca centrul activ al enzimei si substratul se
potrivesc analog “cheiei” cu “lacătul”
2. Modelil “centrului activ indus, este un model mai dinamic si este cunoscut si
ca modelul cu “complementaritate indusă” sau mană manușă

Cresterea vitezei de reacție in prezența enzimei de 10^9 - 10^12 ori decăt in cazul
reacției necatalizate poate fi explicata prin urmatoarele tipuri de procese:
3) Cataliză de tip acid-bază : Protonii si gruparea hidroxilică (H+ si HO-) sint
specifice compușilor cu caracter acid si respectiv bazic.
4) Cataliza covalentă: Unele enzime se pot combină cu substratul formănd un
intermediar covalent instabil. In toate cazurile de cataliză covalentă legatura
enzimă (sau conezimă) cu substratul este mult mai labilă decăt in sibstratul in-
ițial. Serin proteazele ca: tripsina, chimotripsina și trombina.

4.2.2.2 Reglare (Communa de sub9 si 10)

Factorii care infulențeaza viteza unei reacții catalizate enzimatic intervin prin mod-
ficari asupra enzimei: temperatura, pH-ul, concentrația substratului, cantitatea de
enzimă, prezența unor inhibitori sau activatori.
Reglarea cantitații de enzimă
 4

• Enzimele constitutive se gasesc in cantitați constante, deoarece dagradarea lor

se desfășoara aproximativ in aceeași proporție ca și sinteza
• Enzimele inductibile au rata de sinteza mult mai mare decât cea de degradare;
de obicei produsul de reacție acționează ca inductor
• Enzimele represibile au rata de sinteza mult mai mica decât cea de degradare;
de obicei produsul de reacție acționeaza ca represor

Reglarea activitații enzimelor (sub10)

Unele enzime sunt interconvertibile si trecerea lor reversibilă intre forma activa si
inactiva se realizeaza prin formarea sau ruperea unor legaturi covalente; cele mai
multe enzime realizeaz1 această trecere prin fosforilare <—> defosforilare. Fosfo-
rilarea se realizează prin transferul unui rest fosfat de pe ATP pe un rest de serină,
treonină sau tirozină din strucutra enzimei aflate in alt loc decât centrul activ. De-
fosforilarea se realizează sub acțiunea unor fosfataze. Interconvertibilitatea enz-
imelor este utilă in desfășurarea proceselor metabolice deoarece unele enzime sunt
active in forma fosforilată, altele in forma defosforilată.
Un alt mechanism de reglare covalentă este activarea proenzimelor prin proteoliza
ireversibilă la locul de acțiune al enzimei. Prin clivarea unui fragment oligopep-
tidic din proenzimă, centrul activ devine accesibil pentru substrat. Prin acest
mecanism funcționează enzimele digestive și majoritatea factorilor coagulării si
fibrinolizei.

Reglarea alosterică a activitații enzimelor (Sub9)

Alosteria este capacitatea unor liganzi de a modifica funcționalitatea unor proteine
prin inducerea unor modificari conformaționale.
 5

Enzimele alosterice sunt oligomere, fiecare monomer prezentând câte un centru ac-
tiv. Monomerii pot prezenta si cate un centru alosteric in care se fixeaza un ligand
care induce modificari conformationale in centrul activ al monomerului, determi-

nand legarea cu dificultate a substratului sau determină legarea cu ușurință a sub-

stratului

2-Enzima alosterica cu efector negativ

3-Enzima alosterica cu efector positiv
Intre centre exista fenomene de cooperare:
- Homotropa (intre centrele active)
- Heterotropa (intre centrul activ si centrul alosteric)

Fiecare monomer prezinta doua conformații:

• R( Relaxată) cu afinitate crescută pentru substrat, stabilizată de efectorii pozitivi
denumiți activatori
• T (Tensionată) cu afinitate scazută pentru substrat, stabilizata de efectorii nega-
tivi
 6

Modele propuse pentru activarea alosterică:

• Modelul simetric: Monomerii sunt simultan in forma R, resoectiv T, oligomerul
avans o structura simetrica. In prezența substratului, toți monomerii trec din T in
R
• Modelul secvențial: Legarea substratului la primul monomer se face cu dificul-
tate, ceilalți monomeri fiind in starea R, MOdificarea confromației primului
monomer induce modificări corespunzâtoare ale monomerului vecin, astfel
legarea substratului devine din ce in ce mai ușoară
Ex. Oxigenarea hemoglobinei

Constanta Michaelis-Menten (Sub4)

Atingerea vitezei maxime, corespunde transformarii tuturor moleculelor de enzima
in complex ES
E+S<—>ES—> E+P. (Ireversibil)
Complexul ES trece ireversibil in produși.
Determinantă de viteză este reacția 3, cand enzima este saturata cu substrat
[Et]=[ES]. V0=Vmax si Vmax=K3[Et] unde [Et] este concentratia enzimei totale
Pentru o stare staționara, [ES] este practic constantă adica viteza cu care se
formeaza complexul [ES] este egala cu viteza lui de disociere:
V1=V2+V3
K1[E][S]=K2[ES] + K3[ES]=[ES](K2+K3) —> [E][S]/[ES]=K2+K3/K1=KM
KM este marime caracteristică fiecărei enzime.
Pentru multe enzime K3<K1, si K3<K2, astfel K3 se poate neglija iar KM devine:
KM=K2/K1=[E][S]/[ES] —> V0=Vmax/[S]/Km+[S] (ecuația MM)
 7

Astfel Km este o constantă de echilibru, constanta de disociere a complexului ES,

adica inversul constantei de asociere dintre enzimă si substrat
KM se poate defini ca constanta ce masoara taria interacției dintre enzimă si sub-
strat
Astfel afinitățile enzimelor pentru substratele lor sunt cu atât mai mici cu cât valo-
rile Km sunt mai mari

4.3 Cinetica Michaelis-Menten a reacțiilor enzimatice

Cinetica enzimatica studiază viteza reactiei catalizate de enzimă in funcție de con-

centratia enzimei, concentrația substratului, pH, temperatură, inhibitori

4.3.1 Influența temperaturii

Majoritatea reactiilor din organism se desfașoară optim la 37C, temperatura la care
viteza de reactie este maxima. Modificarea semnificativa a temperaturii fata de
temperatura optimă determină scăderea vitezei de reacție.

4.3.2 Influența pH-ului

Viteza maxima de reactie corespunde pH-ului optim si acesta este caracterisitc

mediului de reactie, pentru majoritatea enzimelor pH-ul optim este in jur de 7. Ex-
ista si valori de pH caracteristice anumitor țesuturi: ex. pH 2 pentru pepsina, pH 8
pentru tripsina.

4.3.3 Influenta concentratiei enzimei

 8

Pentru concentratia constanta de substrat, viteza de reactie variaza proportional cu

concentratia enzimei

4.3.4 Influenta concentratiei substratului (Sub5)

Graficul vitezei de reactie in functie de concentratiă de substrat (cand concentratia

de enzima este constantă) depinde de numarul centrelor de legare ale enzimei.
Pentru enzimele care au un singur centru de legare (enzime Micheliene) graficul
este un arc de hiperbola. La concetratii mici de substrat, viteza de reactie creste

aproape liniar cu concentratia substratului, la concentratii mari de substrat se atinge

viteza maxima, ceaa ce corespunde saturarii enzimei cu substrat.
 9

Pentru enzimele care ai mai multe centre de legare (enzime alosterice) graficul este

o sigmoida. Legarea substratului intr-un centru de legare facilitaeaza legarea sub-

stratului in urmatorul centru.

Afinitatea enzimei pentru substrat este reflectata in valoarea constantei Michaelis

(Km) majoritatea enzimelor fiind de tip Michelian. Km este egala cu concentratia
substratului pentru care V0 este jumatate din vmax. Reprezinta constanta de dis-
ociere a comlexului ES, valori mici ale constantei Km indica o legatura puternica
intre enzima si substrat.
Pentru v0= Vmax/2 ->Km
Vmax = Vmax.[S]/Km+[S] —> Km=[S]

4.3.5 Influenta inhibitorilor

Inhubitorii sunt compusi endogeni sau exogeni care determina scaderea activitatii
enzimelor. In funcite de modul de legare a inhibitorului la enzima sunt mai mult
tipuri de inhibitii:
• Inhibitia ireversibila: inhibitorul se leaga covalent la grupari din centrul activ al
enzimei
• Inhibitia reversibila: inhibitorul se league reversibil, prin legaturi slabe la enzima
 10

In centrul activ al enzimei: inhibitia competitiva

In alt loc, diferit de centrul activ: inhibitia necompetitiva
In alt loc decat centrul si dupa ce este
format complexul ES: inhibitia uncom-
petitiva

4.3.5.2 Inhibitia competitiva (Sub6)

Inhibitorul este analog structural cu
substratul si se leaga in centrul actic al
enzimei competitiv cu aceasta. Deter-
mina scaderea afinitatii enzimei pentru
substrat, deci creste Km si Vmax ra-
mane constant, dar necesare conctratii mari de substrat
E+S<—> ES—>E+P
+ I <—>EI
Daca substratul si inhibitorul au capacitate egala de legare, atunci enzima seleceaza
competitorii (substratul sau inhibitorul) in funcție de concentrație.

Ex. De inhibitori competitivi : Inhibarea succinat dehidrogenazei de câtre analogi

structurali ai substratului, adică acizi dicarboxilici.
Inhibarea folat sintazei, enzimă implicată in biosinteza acidului folic.
Inhibarea dihidrofolatreductazei enzimă implicată in transformarea folatului in
forma biologice activă, prin reducere.
 11

4.3.5.3 Inhibitia necompetitiva (Sub7)

Substatul si inhibitorul necompetitiv (In) nu sunt analogi structurali. Enzima poate

lega si (In) si S. Afinitatea E pentru S nu este modificata daca pe enzime s-a legat
(In)
Viteza reaction este diminata in inhibitia necompetitiva deoarece o parte din E ra-
mane blocata in forma EI nu se
modifica, deci Km nu se modi-
fica in prezența inhibitorului
Unele enzime care conțin gru-
pari - SH libere in alte poziții
decat centrul activ, pot fixa
prin legaturi slabe ioni ai met-
alelor grele Ag+, Hg2+ care
micșoreaza sau chiar anuleaza
activitatea enzimelor (așa se
explică efectul otravitor al unor
metale grele)
E+S <—> ES —> E+P
+I —> EI. +I = ESI
 12

4.3.5.4 Inhibitia uncompetitive (Sub8)

Inhibitorul se leaga numai la

complexul ES intr-un loc dis-
tinct de centrul activ, for-
mandu-se complexul inaktiv
EIS. Un astfel de inhibitor
modifica si Km si Vmax

E+S—> ES—>E+P
+I—>ESI

Complexe multienzimatice (SUB11) From Papers

Aceste complexe sunt assablari ale diferitelor proteine enzimatice int-un sistem, cu
scopul de a crește eficiența globală a procesului catalitic. Enzimele sunt fixate prin
legaturi slabe, pe o proteina centrală.
 13

Ex. acid gras sintetaza

Izoenzime (SUB12)

O mică parte din enzimele care austrucutră cuaternară. Izoenzimele se diferențiază

prin insușirile lor catalitice astfel:

- pot avea specificitați diferite pentru coenzime

- Pot avea afinitați diferite fața de un anumit substrat

Izoenzimele cele mai importante sunt:

- Lactat dehidrogenaza (LDH) : ce conține două tipuri de subunitați: H(heart) si

M(muscle). LDH catalizează in toate țesuturile reacția reversibilă de transfor-
mare a acidului lactic in acid piruvic.
- Creatin Kinaza (creatin fosfokinaza) este un dimer cu două tipuri de subunitați,
M(muscle) si B(Brain) : MM, BB, MB. Certain kinaza catalizează reacția re-
versibila:
Creatina + ATP <—> Fosfocreatina + ADP
- Fosfataza alcalină