Tema nr. 4: REGLAREA ACTIVITĂȚII ENZIMELOR.

UTILIZAREA
ENZIMELOR ÎN PRACTICA MEDICALĂ
Ecaterina Pavlovschi, dr. șt. med., asist. univ.
1. Mecanismul de acțiune al enzimelor. Ecuația lui Michaelis-Menten și semnificația Km.

2. Influența concentrației enzimei și a substratului, a pH-ului și a temperaturii asupra

activității enzimatice

3. Specificitatea enzimelor (tipurile, exemple).

4. Activarea și inhibiția enzimelor:

a) activarea enzimelor prin proteoliza limitată. Zimogenii (proenzimele).

b) inhibiția activității enzimelor (reversibilă și ireversibilă, competitivă și

necompetitivă).

5. Reglarea activității enzimelor (reglarea alosterică, reglarea covalentă). Importanța

principiului de retroinhibiție.

6. Izoenzimele – particularitățile structurale și funcționale, valoarea lor biomedicală.

7. Utilizarea enzimelor în practica medicală: Enzimodiagnosticul;
8. Principiul determinării activității enzimelor. Unitățile de activitate a enzimelor (unitatea
internațională, katalul, activitatea specifică).
 Mecanismul
de acţiune al E

Pentru ca reacția să aibă loc este necesar ca molecula de S şi E să contacteze între ele,
pentru aceasta e necesar de conștientizarea unei noțiuni ca:

Energia de activare – este energia necesară tuturor moleculelor unui mol de S, care
la o anumită t pot să atingă starea de tranziție (corespunzătoare apexului barierei
energetice) (KJ/mol; kcal/mol)
E - micșorează energia de activare ale reacțiilor chimice.
Cu cât mai mult scade energie de activare, cu atât mai eficient acționează
catalizatorul, şi cu atât mai mult se accelerează reacția.
 Energia de activare a reacției
necatalizate
Energie

S
Energia de activare a reacției
catalizate
G P

Progresul reacției
Enzimele reduc energia de activare fară să afecteze energia
liberă a reacției (G). Astfel, enzimele cresc viteza de
reacție.
 Mecanismul de acţiune al E
Prima etapă:
Difuzia S spre E şi legarea cu CA al E – formarea complexului ES
1. de scurtă durată
2. depinde de concentrația substratului şi de viteza lui de
difuzie spre centrul activ al enzimei.

S + E ↔ E-S
2. Transformarea complexului
primar ES în unul sau cîteva ES* → EP → E + P
complexe activate - ES*, ES** -
cu dereglarea legăturilor S,
ruperea lor sau formarea noilor
legături în urma interacţiunii
grupelor catalitice ale E.

3. Separarea produșilor reacţiei

de CA al E şi difuzia lor în mediul
ambiant (complexul EP disociază
în E şi P).
!Enzima este neschimbată și poate
cataliza o nouă reacție.
 CINETICA ENZIMATICĂ
Studiază viteza reacției enzimatice,
luând în considerație factorii fizico -
chimici ce o influențează.
 Cinetica enzimatică și valoarea Km
Doi indici - VMAX și KM,
caracterizează hiperbola.

Viteza maximă (VMAX) -

reprezintă numărul de
molecule de substrat care
sunt transformate în produs
de către o moleculă de enzimă
într-o unitate de timp, atunci
când enzima este complet
saturată cu substrat.
 Cinetica enzimatică și valoarea Km

Km sau constanta Michaelis-Menten

este definită ca concentrația substratului (exprimată în moli/litru)
necesară pentru a produce jumă tate din viteza maximă într-o reacție
catalizată de enzimă .
Aceasta indică faptul că jumă tate din moleculele de enzimă (adică 50%)
sunt legate cu moleculele de substrat atunci câ nd concentrația
substratului este egală cu valoarea Km.
 Cinetica enzimatică și valoarea Km

Valoarea Km este o constantă caracteristică a unei enzime date.

Este un indicator al stabilită ții complexului ES:
‒ o valoare mică Km indică o afinitate puternică între enzimă și substrat,
‒ o valoare mare Km reflectă o afinitate slabă între ele.
Pentru majoritatea enzimelor, valorile Km sunt cuprinse în intervalul 10-5 pâ nă la
10-2 moli.
Factorii care influenţiază viteza reacției
enzimatice

• Concentraţia S
• Concentraţia E
• Temperatura
• pH
Factorii ce influențează viteza reacţiei enzimatice –
concentraţia substratului

Grafic se reprezintă sub formă

de o curbă de tip hiperbolic.
în perioada iniţială a reacţiei V
creşte pe măsură ce creşte [S].
La un moment dat cînd CA al E
este ocupat de S – V nu mai creşte.
Ea rămâne constantă şi corespunde
V max a reacţiei.
Factorii ce influențează viteza reacţiei enzimatice –
concentraţia enzimei

în condiţii standard 2 mol de E

într-o anumită perioadă de timp
vor transforma de 2 ori mai
multe molecule de S decât 1 mol
de E (relaţie direct
proporţională).
 Factorii ce influențează viteza reacţiei enzimatice –
pH-ul mediului de reacţie

H + și OH- sunt încărcați și,

prin urmare, interferează cu
legăturile hidrogen și ionice care
mențin structura tridimensională
a enzimei, deoarece acestea vor fi
atrase sau respinse de
încărcăturile create de legături.
Această interferență
determină o schimbare a formei
enzimei și a centrului activ, ce va
influența activitatea E.
 Factorii ce influențează viteza reacţiei enzimatice –
pH-ul mediului de reacţie

 Fiecare E are pH optim

propriu (manifestă
activitate max).
 Majoritatea E celulare au
pH-ul optim - 6-8 (7,4)
 excepţii: hidrolazele acide
lizozomale pH= 5;
 MAO din membrana MC
externă pH= 10.
Influenţa pH-ului asupra activităţii E

La E digestive pH optim este cel al sediului lor de acţiune:

1. Pepsina – pH 1,5 – 2,0
2. Amilaza pancreatică - pH 7,2
3. Tripsina - pH 7,8-8,0
 Factorii ce influențează viteza reacţiei
enzimatice – temperatura mediului de reacţie

• Creșterea temperaturii crește energia cinetică pe care o au

moleculele. Într-o soluție, aceasta înseamnă că există mai multe
coliziuni aleatorii între molecule pe unitate de timp.
• Deoarece enzimele catalizează reacțiile prin ciocnirea aleatorie cu
moleculele de substrat, creșterea temperaturii crește rata de reacție,
formând mai mult produs.
 Factorii ce influențează viteza reacţiei
enzimatice – temperatura mediului de reacţie
• Creșterea temperaturii, de asemenea, pune
tensiune pe legă turile care mențin structura
3D și starea activă a E.
• Pe mă sură ce crește temperatura, mai multe
legă turi se rup, în special legă turile de
hidrogen și ionice mai slabe. Ruperea
legă turilor în enzimă va determina
modificarea formei centrului activ.
• Această modificare a formei înseamnă că
centrul activ este mai puțin complementar
cu forma substratului, astfel încâ t este mai
puțin probabil să se catalizeze reacția. În
cele din urmă , enzima va deveni denaturată
și nu va mai funcționa.
 Factorii ce influențează viteza reacţiei
enzimatice – temperatura mediului de reacţie

• Astfel, pe măsură ce crește temperatura, inițial rata de reacție va crește, din

cauza creșterii energiei cinetice.
• Totuși, efectul ruperii legăturii va deveni mai mare și mai mare, iar rata de
reacție va începe să scadă.
• Temperatura la care are loc rata maximă de reacție se numește
temperatura optimă a enzimei. Ea este diferită pentru enzime diferite.
 Factorii ce influențează viteza reacţiei
enzimatice – temperatura mediului de reacţie

 Unele E a microorganismelor
termofile sunt active la t de
80°C
 La t joase E se inactivează
(excepţii: catalaza: activitate
max la t=0 °C)
 Specificitatea
- este capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un
număr mare de S unul particular.
- este condiţionată de complimentaritatea
conformaţională şi electrostatică între CA al E şi S.
 Specificitatea enzimelor
Tipurile:
I. De reacţie
II. De substrat
A. Absolută
B. Relativă
C. stereospecificitate
 Specificitatea enzimelor
I. Specificitatea de reacţie:
enzimele catalizează un anumit tip de reacţie
ce stă la baza clasificării lor: o reacţie
redox, un transfer a unei grupe
funcționale, formarea unei legături, etc.
 Specificitatea de reacţie a enzimelor

I. Oxidoreductaze
II. Transferaze
III. Hidrolaze
IV. Liaze
V. Izomeraze
VI. Ligaze
VII. Translocaze (din 2018)
 II. Specificitatea de substrat a enzimelor
1. Specificitate stereochimică
enzima catalizează transformarea doar a unui singur
stereoizomer al substratului din multitudinea existentă
Hexokinaza – specificitate la D- glucoză
Oxidazele – specificitate la L-AA
Fumaraza – specificitate la izomerii trans-cis
 Specificitatea de substrat a enzimelor
2.A Specificitatea absolută
enzima catalizează transformarea doar a unui
singur substrat (ureaza, arginaza, carbanhidraza)

UREAZA
 Specificitatea de substrat a enzimelor
2.B Specificitatea absolută
enzima catalizează
transformarea unui
grup de substrate
analogice structural
 Specificitatea de substrat a enzimelor
3. Specificitatea relativă - A
enzima catalizează transformarea unei anumite
grupe sau legături chimice din diverse substanţe
chimice
Ex. pepsina hidrolizează legăturile peptidice formate de
grupele carboxilice ale aminoacizilor aromatici –
Phe, Tir şi Trp
 Specificitatea de substrat a enzimelor
Specificitatea relativă - B
enzima catalizează transformarea unei grup
numeros de substanţe cu diferită structură
chimică în acelaşi mod
Ex. citocromul P450 – hidrolizează câ teva mii de
substanţe
 Activarea și inhibiția enzimelor
I. Activarea enzimelor
* specifică/nespecifică
* proteoliză parțială
II. Inhibiția enzimelor
* specifică/nespecifică
* reversibilă/ireversibilă
* competitivă/necompetitivă
 Reglarea covalentă - Proteoliză limitată

• Unele enzime (proteine) se

sintetizează în forma neactivă de
precursor – proenzime (zimogeni)
Exemplu:
1) enzimele digestiei: pepsinogenul,
chimotripsinogenul, tripsinogenul,
proelastaza, procarboxipeptidaza -
scindeaza proteinele în stomac şi
duoden.
2) coagularea sângelui e determinată
de cascada de reacţii cu activitate
proteolitică;
 Proteoliză limitată
- este scindarea unui sector al catenei în rezultatul
căreia E se restructurează şi se formează CA.
 Importanța biologică a prezenţei
formelor neactive
Zimogenii sunt produse la locurile de sinteză
(mucoasa gastrică pentru pepsinogen, pancreasul
pentru toate celelalte), activările se produc la locul de
acțiune (stomac, intestin subțire)
1. Protejază de proteoliză proteinele celulelor
producătoare de E.
2. Este o forma de rezervă a E, care rapid pot fi
activate şi intervin în reacţie.
 Inhibiţia enzimatică
I. Competitivă
II. Necompetitivă
III. Retroinhibiţia
 Inhibitorii enzimatici
 Inhibitorii enzimatici sunt compuși care influențează
negativ activitatea enzimelor - pe care o pot anula definitiv
sau temporar.
 Ei pot afecta situsul catalitic al enzimei sau orice altă
regiune a moleculei, astfel influențând legarea substratului
de enzimă.
 Acțiunea inhibitorilor enzimatici este importantă pentru
controlul proceselor biochimice, pentru a întelege
mecanismele de acțiune a unor medicamente, droguri,
otrăvuri, pentru a urmări etape dintr-un proces metabolic.
Inhibiţia competitivă
1. inhibitorul (I)
este analog structural al
substratului (S)

la enzimă se atașează cel a

cărui concentrație este mai
mare
E+I ---- EI
!!! Este o inhibiţie reversibilă- I
poate fi înlăturat cu
adăugarea în exes a S.
 Inhibiţia competitivă
 Viteza de reactie atinge Vmax ca si cum I nu ar fi prezent, daca
se măreste suficient de mult [S]
 nu modifică V max
 dar creşte mult Km, micşorând afinitatea E pentru S.
Inhibiţia competitivă
Sulfanilamidele
1. Analogi structurali ai acidului p-
aminobenzoic (APAB)
2. Concurează cu APAB în sinteza
acidului folic la micro-
organisme
3. Ac. folic participă la sinteza
nucleotidelor
4. Carența folatului are efect
bacteriostatic.
 Inhibitorul este diferit ca
Inhibiţie 
structură de substrat
necompetitivă  Inhibitorul se atașează în locus
diferit de CAct
 Frecvent exercită asemenea
acțiune Me grele (Pb, Hg etc.) –
prin inhibarea grupării SH
E+S+I-----→ESI
!!!Acest tip de inhibiţie nu se
înlătură prin exces de substrat.
- poate fi înlăturat de substanţe care
leagă I – numite reactivatori
 I necompetitivi scad
Vmax dar nu afectează Km
 Reglarea activității enzimelor
Alosterică
• Efectorii alosterici sunt compusi cu masa moleculară mică, fară analogie cu
S și care activează reacțiile enzimatice (efectori pozitivi) sau le inhibă
(efectori negativi)
• Efectorii alosterici sunt prezenți la locul de acțiune al E variind doar
concentrația acestora
• E alosterice sunt inhibate de produsul de reacție prin retroinhibiție sau
inhibiție de tip feedback
 Reglarea activității enzimelor
Modificare covalentă (fosforilare/defosforilare)
unele E sunt active în forma fosforilată, iar altele în forma
defosforilată.
Ex.: glicogen fosforilaza – activă în forma fosforilată;
glicogen sintaza – este activă în forma defosforilată
 Reglarea genetică a reacţiilor
enzimatice
I. Enzime constitutive – se sintetizează cu
viteză constantă și sunt esențiale pentru
supraviețuirea celulei
II. Enzime inductibile – se produc la apariția
în sistem a substratului
III. Enzime represibile – sinteza se inhibă de
produs
 Organizarea enzimelor în celule
I. Enzime solitare
II. Complexe polienzimatice
 organizate funcţional (enzimele glicolitice)
 organizate structural (enzimele biosintezei
acizilor graşi)
 cu organizare mixtă – funcţional -
structurală (enzimele ciclului Krebs)
 Izoenzimele
I. Forme moleculare multiple ale unei
enzime
II. Modalitate de adaptare la condiţii
diferite specifice diferitor organe şi
ţesuturi
III. Catalizează una şi aceeaşi reacţie, dar în
diferite condiţii
 STRUCTURA IZOENZIMELOR
Sunt E oligomere, cu structură cuaternară, alcătuite din
cel puţin 2 protomeri diferiţi
 Ex. LDH (lactat – piruvat)
 Prezintă un tetramer, alcătuit
din 2 tipuri de subunităţi (H
– inimă; M- muşchi) în
diferite raporturi; codificate
de gene diferite.
 HHHH – inimă;
HHHM;HHMM; HMMM;
MMMM – muşchi
 Izoformele lactat dehidrogenazei
(LDH)
 LDH-1 (4H) - în inimă
 LDH-2 (3H1M) - în sistemul reticuloendotelial
 LDH-3 (2H2M) - în plămâni
 LDH-4 (1H3M) - în rinichi
 LDH-5 (4M) - în ficat și mușchiul striat
(H este tipul de monomer intâlnit in inimă, iar M este monomerul caracteristic
izoenzimei hepatice și musculare)

Rol în diagnosticul medical

indicând distrugeri celulare
 Lactat dehidrogenaza - LDH
Oxidoreductază, participă la glicoliza anaerobă, catalizând reacția reversibilă de
conversie a acidului lactic în acid piruvic;

Valoarea diagnostică
LDH1 - ↑ infarct miocardic
LDH 5 - ↑ maladii hepatice,
distrofie musculară
Creatinkinaza sau creatinfosfokinaza (CK sau CPK)
Catalizează formareaATP
din creatin fosfat și ADP;
3 forme izoenzimatice:
CK-M2, CK-MB, CK-B2

Izoenzima Localizare Creștere

CK-MM Mușchi striati, Distrofii musculare, rabdomioliză,
miocard, creier, polimiozită/dermatomiozită, traumatisme
tiroidă; musculare, infarct miocardic, tumori al
sistemului nervos central, hipotiroidie;
CK-MB Miocard, muschi Infarct miocardic (după 4-6 ore de la debut),
striati,prostată, uter; miocardita, cardiomiopatii, distrofii
musculare,carcinom de prostată, postpartum;
CK-BB Creier, tub digestiv, Infarct cerebral, chirurgie pe creier, infarct
uter, rinichi, plamâni; intestinal;
 Creatinfosfokinaza (CPK)

Muşchi
CPK – MM Miodistrofii
scheltic
Muşchi Miocardiopatii,
CPK – MB
cardiac infarct
Ischemii
CPK – BB Creier
cerebrale
Comportarea în dinamică a activităților CK și LDH în infarctul miocardic
Intervalul de timp de la debut
Enzima până la detectarea până la până la Observații
unor creșteri cu atingerea normalizarea
valoare diagnostică valorilor maxime valorilor
CK(CPK) 4-8 ore 16-36 ore 3-6 zile CK-MB - mai specifică
pentru miocard
LDH 8-14 ore 24-60 ore 7-15 zile Izoenzimele LDH1 si LDH2
sunt mai pentru miocard
 Utilizarea E în practica medicală
Preparatele farmaceutice contemporane sunt
asociate şi conţin ca regulă următoarele enzime:
 tripsină,
 chimotripsină,
 lipază,
 amilază,
 pancreatină,
 bromelaină,
 papaină,
 rutină (vit. P).
 Utilizarea E în practica medicală
Efectele exercitate de preparatele
enzimatice
1.De substituţie (E digestive)
2.Fibrinolitică şi trombolitică
3.Antiedematică
4.Analgezică
5.Antiinflamatoare
6.Imunomodulatoare
 Metodele de determinare a activităţii E
Viteza reacţiei este proporţională cu
1.Viteza consumului substratului
2.Viteza formării produsului
3.Viteza transformării coenzimei
Cantitatea substanţei respective se
determină colorimetric.
 Unităţile de măsurare a activităţii E
1. 1 UI – catalizează transformarea 1 mol de substrat
într-un minut în condiţii standard
2. 1 Cat (catal) – catalizează transformarea 1 mol de
substrat într-o secundă în condiţii standard

Condiţiile standard – pH-ul ~ optim;

t = 25˚C;
p = 1 atm;
C substratelor = 1 M.