Biochimie-Cursul 7-

Enzime
Enzimele araturi de centrul activ enzimatic care intotdeauna se gaseste in
zona hidrofoba a ghemului statistic, pot poseda si unul sau mai multe centre
alosterice, altul decat centrul activ, care se pot pozitiona oriunde de-a lungul
lantului polipeptidic si care au rolul de a recunoaste si de a lega efectorii alosterici
din mediu.

Intre efectorii alosterici(cofactori) si centrul alosteric, pot sa intervina

interactii de natura slaba, dar si interactii de natura covalenta.

Efectorii alosterici, dupa interactia cu centrul alosteric modifica conformatia

si configuratia ghemului statistic si astfel moduleaza patrunderea substratului la
nivelul centrului activ enzimatic.

Efectorii alosterici din punct de vedere al cresterii sau diminuarii

patrunderii substratului la nivelul centrului activ enzimatic pot actiona ca:
activatori sau inhibitori.
Cofactorii intotdeauna sunt de natura exogena si trebuie introdusi in
organism prin intermediul hranei, iar cofactorii de natura organica se numesc
coenzime.
Coenzimele sunt structuri organice de dimensiuni mici care au rolul de a
tensiona anumite legaturi covalente din structura protein-enzimei, de a se implica
in transferul gruparilor functionale sau a electronilor la nivelul substratului si
respectiv centrului activ enzimatic in vederea facilitarii transformarii substratului
in produs de reactie.
Enzimele alosterice(care contin si un centru alosteric) poseda de regula
structura cuaternara si sunt holoenzime, ele fiind constituite din
apoenzima(structura polipeptidica) si respectiv cofactor(structura nepolipeptidica,
neproteica).
Apoenzima in absenta coenzimei este inactiva enzimatic.(exista dar nu
functioneaza). Numai complexul apoenzima-cofactor este capabil sa patricipe la
cataliza in vederea transformarii substratului in produs de reactie.
Daca apoenzimele sunt termolabile(termo instabile) si nedializabile, cofactorii
datorita dimensiunilor lor mici sunt dializabili si termostabili.
 Structurile cuaternare (constituite din mai multe lanturi polipeptidice)
poseda polimorfism si din aceasta cauza pot exista sub forma mai multor structuri
de natura izoenzimice.

Izoenzimele se biosintetizeaza la nivelul aceluiasi tesut, sunt transportate

de la locul de biosinteza prin intermediul lichidelor biologice catre alte tesuturi
unde actioneaza dependent de natura mediului (pH, forta ionica, concentratie
substrat).

Izoenzimele fiind constituite din lanturi polipeptidice distincte(diferite) , dar

actioneaza asupra aceluiasi substrat pe care il transforma in acelasi compus de
reactie in conditii diferite, poseda configuratii diferite, dar si proprietati fizico-
chimice diferite .
Izoenzimele, de regula, actioneaza la nivelul unor tesuturi distincte din
organism, si de cele mai multe ori, se grupeaza sub forma unor sisteme multi
enzimatice la nivelul unei celule in asa fel incat, functia lor catalitica o exercita in
cascada: produsul de reactie al unei enzime este substratul altei enzime si asa mai
departe.
In cataliza multienzimatica , substratul unei enzime se biosintetizeaza la
locul de actiune al enzimei si astfel acesta nu necesita timp pentru transport de la
un tesut (lichid biologic) la altul.

Cinetica enzimatica

Enzimele pot actiona numai si numai asupra proceselor(reactiilor)

biochimice termodinamic-posibile(∆G<0) si astfel ele se manifesta prin scaderea
energiei de activare in asa fel incat o mare parte a moleculelor substratului sa
posede minimum de energie in vederea transformarii in produs de reactie.
O reactie biochimica se poate descompune in mai multe etape in cascada si
astfel insumarea acestora determina procesul global de transformare al
substratului in produs de reactie.
 Dpdv al cineticii enzimatice, se poate defini ca principal parametru viteza de
reactie ca fiind fie variatia concentratiei substratului in unitatea de timp, fie
variatia concentratiei produsului de reactie in unitatea de timp.

Deoarece in procesul de transformare a substratului in produs de reactie,

concentratia substratului scade in timp, iar variatia concentratiei substratului este
negativa(deci concentratie finala minus concentratie initiala asa am invatat noi in
termodinamica), raportdul dS/dt este negativ si din aceasta cauza, in expresia
vitezei de reactie se pune minus in fata raportului. in cazul 2: dP/dt nu mai e
nevoie pt ca e mai mult produs.
In genere in cataliza enzimatica, concentratia enzimei este deosebit de mica
comparativ cu concentratia substratului si se considera constanta in timp.
In procesul de cataliza, enzima este implicata in constituirea unui
intermediar ES care devine bogat energetic prin preluarea energiei de activare
ES*, ulterior aceasta stare de tranzitie se va transforma ireversibil in produsul de
reactie P.
 Daca se inregistreaza variatia vitezei de reactie in raport cu concentratia
substratului, se obtine o curba de tip Michaelis-Menten.
La concentratii mici ale substratului, viteza de reactie creste odata cu
cresterea concentratiei substratului. Proportional pana la o concentratie cand
viteza de reactie a procesului nu se mai modifica, cand se obtine viteza maxima de
desfasurare a procesului catalitic. Din acest moment, oricat substrat s-ar adauga
sistemului reactant, viteza de reactie (activitatea enzimatica) nu se mai
modifica(Vmax)

Variatia vitezei de reactie(activitatii enzimatice) cu concentratia substratului

este de tip hiperbola echilatera pentru enzimele michaeliene care poseda un
centru activ enzimatic, fara sa posede si un centru alosteric.
Ecuatia curbei de tip Michaelis-Menten pentru sistemul E+S->ES->E+P etc... este
V=vmax*[S]/Km+[S]
 Daca viteza instantanee a procesului catalitic este vmax/2 se obtine
concentratia substratului este egala cu Km(constanta Michaelis-Menten).
Km este definita ca fiind afinitatea enzimei in raport cu substratul, are
unitate de masura ca si concentratia substratului (mol/litru) si cu cat valoarea
acesteia este mai mare, cu atat afinitatea este mai mica, si invers.
Afinitatea enzimei in raport cu substratul(Km) prezinta importanta in
cinetica enzimatica deoarece ne permite sa apreciem procesul catalitic in
ansamblul sau.
 Daca concentratia substratului din ecuatia Michaelis-Menten este mai mare
decat Km, viteza instantanee a procesului de reactie este Vmax.
 Daca Km este mult mai mare decat concentratia substratului, viteza de
desfasurare a procesului catalitic este direct proportionaa cu concentratia
substratului, ecuatia fiind de ordinul I, fara termen liber, deci curba trece
prin origine.

Pentru enzimele ne-michaeliene(alosterice), variatia activitatii enzimatice in

raport cu concentratia substratului este de tip sigmoidal(la concentratii mici si
foarte mici ale substratului, activitatea enzimatica este slaba si foarte slaba, odata
cu cresterea concentratiei substratului se inregistreaza un salt puternic al
activitatii enzimatice, dupa care se atinge V=Vmax, cand activitatea enzimatica
este independenta de concentratia substratului)
 Atunci cand V=Vmax(platou) intreaga cantitate de enzima se gaseste sub
forma complexului ES si oricat s-ar adauga S in sistemul reactant, activitatea
enzimatica ramane maxim posibila pentru ca nu mai exista enzima libera.(baiat
holtei 40 de ani, a mers totul foarte bine, la un moment dat am ajuns la 40 de ani
am incheiat un contract cu o domnisoara, si dupa oricate fete ar sta pe langa
mine, gata)
Ecuatia Michaelis-Menten este greu de utilizat in practica si din aceasta
cauza s-a propus linializarea acesteia, prin inversare in loc de V scriem 1/V. In
acest mod, se obtine ecuatia unei drepte care nu trece prin origine deoarece in
ecuatia acesteia exista termenul liber 1/Vmax

In acest mod se obtine ecuatia Lineweaver-Burk, in care intersectia cu

ordonata ne poate da valoarea 1/Vmax(si calculam Vmax), iar intersectia cu
abscisa, ne poate oferi -1/Km.
 In reprezentarea 1/V in raport cu 1/S, pentru un sistem dat, se obtine astfel
o dreapta care intersecteaza cele doua axe de coordonate in 2 puncte distincte,
de unde se pot calcula 2 parametri cinetici: Km si Vmax simultan.

Inhibitorii enzimatici

In procesele enzimatice, la nivelul centrelor alosterice pot actiona atat

activatori enzimatici, cat si inhibitorii enzimatici
Inhibitorii pot induce inhibitia reversibila sau ireversibila.**ex de inhibitie
ireversibila cand imi prajesc ouala**
Inhibitia ireversibila de regula se dezvolta atunci cand la nivelul protein-
enzimei se stabilesc legaturi covalente (tari) in prezenta inhibitorului, acestea
determinand inactivarea ireversibila a enzimei prin modificarea ireversibila a
configuratiei ghemului statistic.
In inhibitia reversibila, de regula se stabilesc interactii de natura slaba intre
efectorul alosteric si centrul alosteric, existand un echilibru dinamic: enzima-
inhibitor si dependent de structura inhibitorului, structura centrelor active si
alosterice, inhibitia reversibila poate fi competitiva, necompetitiva, incompetitiva
si mixta.
In inhibitia reversibila competitiva, inhibitorul poseda o structura apropiata
de cea a substratului, si astfel, competitioneaza cu acesta la legarea la nivelul
centrului activ enzimatic.**daca eu ma aseman cu sotul altei doamne pot concura cu el si
invers, este reversibil**
In inhibitia reversibila, complexul E-I(enzima-inhibitor) format, va
determina scaderea concentratiei produsului de reactie rezultat in urma catalizei.
Daca concentratia substratului creste in timpul mentinerii concentratiei
inhibitorului, concentratia produsului de reactie tinde sa creasca.(legea lui Motoc,
prosti prosti dar multi).
 In reprezentarea 1/V in raport cu 1/S, la concentratii variabile ale
inhibitorului se obtine o familie de drepte, care la nivelul ordonatei, se
intersecteaza in acelasi punct (1/Vmax), iar la nivelul abscisei, se obtin tot atatea
intersectii, cate concentratii ale inhibitorului exista(-1/Km).
Din aceasta reprezentare, enzima poseda aceeasi valoare a vitezei maxime
de desfasurare in schimb, afinitatea acesteia este diferita: se modifica dependent
de concentratia inhibitorului si respectiv a substratului din sistem

In inhibitia reversibila necompetitiva , structura inhibitorului se

deosebeste total de cea a substratului(nu mai competitioneaza cu acesta la
legarea la nivelul centrului activ enzimatic, in schimb se poate lega centrului
alosteric enzimatic din enzima libera sau din complexul ES in asa fel incat se
moduleaza conformatia(configuratia) ghemului statistic, care determina
diminuarea activitatii enzimatice.
 In inhibitia reversibila necompetitiva in reprezentarea 1/v in raport cu 1/s
se obtine o familie de drepte corespunzatoare concentratiilor inhibitorului din
sistem, fiecare dreapta intersectand ordonata in cate un punct corespunzator cu
1/Vmax, si toate dreptele intersecteaza abscisa intr-un singur punct,
corespunzator 1/Km. Cu cresterea concentratiei inhibitorului, viteza maxima de
desfasurare a procesului catalitic scade mentinandu-se afinitatea enzimei in
raport cu substratul.
Factori care influenteaza cinetica de reactie

Temperatura influenteaza favorabil desfasurearea procesului catalitic la

valori mici ale acesteia, pana la un punct cand odata cu cresterea temperaturii
denaturarea protein-enzimei se intensifica, iar activitatea catalitica a acesteia
tinde sa scada.
Curba de variatie a activitatii enzimatice in raport cu temperatura este sub
forma unui clopot care prezinta un interval optim in care procesul catalitic se
desfasoara in apropierea valorii maxime a vitezei catalitice. Intervalul optim
contine si viteza maxima a procesului de o parte a acestuia, sa nu se confunde
maximum cu optim.

Curba de variatie a vitezei de reactie in raport cu temperatura este

expluatata in laboratorul clinic atunci cand se doreste mentinerea activiatii
enzimatice a unei probe in timp. Scaderea temperaturii de mentinere a
bioprobei(probei) prin refrigerare ( 8 grade celsius), sau prin congelare(-30 grade
celsius) determina ca enzimele componente sa isi mentina structura ghemului
statistic in forma intacta o perioada de timp, iar la revenirea temperaturii in
apropierea conditiilor normale, activitatea enzimatica sa revina .

In procesul catalitic, daca variaza concentratia enzimei, viteza de

desfasurare a procesului este direct proportionala cu concentratia enzimei prin
intermediul coeficientului k2(care este constanta de viteza).
k2 reprezinta viteza procesului enzimatic la concentratie unitara a
enzimei(daca E=1, V=k2). Din aceste considerente, k2 are unitate de masura 1/s,
iar inversul constantei de viteza(k2) se numeste CICLU CATALITIC.
 Ciclul catalitic are unitate de masura secunda, si reprezinta intervalul de
timp necesar unui sistem enzimatic pentru ca enzima sa reia ciclul catalitic adica
E+S reversibil ES pe k2 E+P

Constanta de viteza este dependenta de energia de activare a sistemului

prin intermediul unui factor ce ciocnire A.
k = A e-Ea/RT
Prin reprezentarea logaritmului constantei de viteza in raport cu inversul
temperaturii absolute, se obtine o dreapta din a carei panta(tg de alfa) este egal
cu –Ea/2,303*R , schema in curs

Din aceasta reprezentare se poate calcula(determina) foarte usor energia

de activare necesara procesului catalitic(care este definitorie).
Unitati de activitate enzimatica(U)
Reprezinta cantitatea de enzima care realizaeaza catalizarea unui micromol
de substrat intr-un minut si un litru

Activitatea enzimatica specifica:nr de unitati de activitate enzimatica pe unitatea

de greutate de enzima U/mg
Activitatea enzimatica moleculara : nr de moli de substrata transformate de 1
mol de enzima intr-un minut
Katal-ul: activitatea enzimatica prin care se transforma 1 mol de substrat intr-o
secunda
Unitatea de activitate enzimatică (U):
cantitatea E care catalizează 1 μM S / minut L;
Activitatea enzimatică specifică:
Nr. U / 1mg proteinenzimă (U/mg);
Activitatea enzimatică moleculară:
Nr. Mol S transformate de 1 mol E / minut.
Katal-ul:
AE care transformă 1 mol S / s.
Dacă [E] se raportează / L: 1U = 60 µKatal.

1U=60 de micro katali

Proteoliza limitata(zimogeni)
Zimogenii sunt protein-enzime inactive , biosintetizate la nivelul unor
tesuturi in forma inactiva. Transportate prin intermediul lichidelor biologice tot in
forma inactiva, iar la nivelul tesutului tinta (de actiune) in prezenta altor enzime
hidrolitice(hidrolaze) sufera un proces hidrolitic in urma caruia se elimina un
peptid de dimensiuni mici si astfel se transforma din forma inactiva in forma
activa si numai si numai la acest nivel si in interval relativ scurt reactioneaza
asupra substratului prezent in mediul de reactie.
zimogen=glicoproteina
Mecanisme catalitice
Mecanismele catalitice sunt ipoteze constituite pe baza unor reactii simple care in
cascada pot descrie procesul de transformare a substratului in produs de reactie in prezenta
enzimei.
1.Ipoteza tiparului rigid
In aceasta ipoteza se considera ca intre centrul activ enzimatic si substrat exista o
potrivire geometrica si electronica precum exista intre cheie si broasca. In aceasta ipoteza in
urma recunoasterii legarii si transformarii substratului, se obtine produsul de reactie alaturi de
enzima libera care este capabila sa reia ciclul catalitic

**A doua reactie nu este reversibila**

2.Ipoteza formarii complexului ES in prezenta coenzimelor
In aceasta ipoteza, intre apoenzima si substrat, se interpune coenzima in vederea
constituirii complexului ES in asa fel incat substratul sa isi modifice in urma interactiei structura
in vederea transformarii in produs de reactie. Din acest proces, se obtine alaturi de enzima
libera si coenzima modificata chimic a carei concentratie scade in timp(datorita consumului.
Din aceasta cauza conenzimele(vitaminele activate) trebuie sa fie introduse in
permanenta in organism prin intermediul hranei.
Pentru anumite coenzime exista la nivelul organismului uman echipament enzimatic
capabil sa transforme coenzima modificata in coenzima si astfel cantitatea de
coenzima(vitamina) preluata din mediu poate sa scada in timp
3.Ipoteza modificarilor conformationale
In aceasta ipoteza, la nivelul centrului activ enzimatic, trebuie sa existe
structuri polare incarcate partial electric, iar substratul trebuie sa fie polarizabil si
astfel in urma interactiei se realizeaza o potrivire electrostatica intre saricinile
leectrice partiale (delta minus langa delta plus) in asa fel incat in urma interactiei,
substratul sa isi modifice structura, sa transforme in produs de reactie si sa
repuna in libertate enzima.