Curs Biotehnologii enzimatice

PROPRIETĂȚI GENERALE ALE ENZIMELOR

Fiind biocatalizatori, enzimele respectă toate legile catalizei chimice și, pe lângă acestea,
ele prezintă și o serie de proprietăți specifice:
- măresc viteza reacțiilor chimice posibile din punct de vedere termodinamic prin scăderea
energiei de activare și instalarea cât mai rapidă a stării de echilibru;
- activitatea catalitică se manifestă în concentrații mici pentru a transforma concentrații mari de
substrat;
- la sfarșitul transformării, se regăsesc nemodificate din punct de vedere cantitativ și calitativ în
mediul de reacție.
Dată fiind natura proteică a enzimelor, precum și faptul că ele acționează în celula vie,
enzimele au și o serie de proprietăți speciale, care le diferențiază net de catalizatorii chimici. În
primul rând, eficiența catalitică a enzimelor este mai mare prin comparație cu cea a
catalizatorilor chimici. Enzimele acționează în condiții blânde de temperatură, pH, presiune
osmotică etc. O proprietate deosebită a enzimelor, total neîntâlnită în cataliza chimică este
reprezentată de specificitatea de acțiune a enzimelor, ceea ce determină faptul că o enzimă
catalizează transformarea unui singur substrat și doar în rare cazuri acționează asupra unui grup
de substraturi înrudite structural. În funcție de modul de manifestare, specificitatea de reacție este
de mai multe tipuri, și anume:
Specificitatea de reacție este tipul de specificitate cel mai des întâlnit și constă în
capacitatea enzimelor de a cataliza un anumit tip de reacție. Această proprietate a stat la baza
clasificării enzimelor, știut fiind faptul că, de exemplu, o oxidoreductază catalizează doar un
proces redox, o hidrolază va scinda hidrolitic substratul, o sintetază participă la sinteza unui
singur compus etc. Există și situații aparte, cum este cazul proteazelor, care prezintă concomitent
o activitate peptidazică, amidazică și esterazică. Aceste enzime catalizează reacții de scindare
hidrolitică a peptidelor, amidelor și esterilor, aceste reacții având loc în același centru activ și
după același mecanism de acțiune. Din punct de vedere a specificității de reacție, există și situații
aparte când una și aceeași enzimă izolată însă din materiale biologice diferite poate prezenta
activități catalitice diferite. De exemplu, din mușchiul cardiac de porc, din bumbac și din celulele
de Neurospora crassa, s-a obținut un preparat enzimatic cu activitate malat-dehidrogenazică.
 Acest lucru s-ar putea datora faptului că enzima s-ar putea să aibă 2 centre active, legând fie
un substrat, fie altul, și catalizând separat câte un anumit tip de reacție după un mecanism
specific, ceea ce înseamnă că manifestă specificitate de reacție datorată separat fiecărui situs
catalitic. Există situații când aceeași enzimă prezintă specificitate dublă sau chiar triplă, adică
participă la reacții asemănătoare din punct de vedere chimic, de exemplu enzima
dimetilamiltransferaza poate cataliza:
a) Reacția de biosinteză a farmezil-pirofosfatului prin utilizarea în calitate de substrate a
3,3-dimetilalilpirofosfatului și a 3-izopentenilpirofosfatului;
b) Reacția dintre farmezilpirofosfat și izopentenilpirofosfat cu formare de
pirofosfat+geranil-geranilpirofosfat;
c) Conversia izopentenil-pirofosfatuli în 3,3-dimetilalilpirofosfat.
Acest tip de specificitate de reacție se întâlnește la enzimele oligomere, când fiecare
subunitate componentă în parte prezintă un anumit tip de specificitate.
Specificitatea de substrat constă în capacitatea enzimelor de a cataliza transformarea
unui singur substrat, fiind total indiferente față de alte substanțe, chiar dacă aceste sunt
înrudite structural cu substratul. În procesul catalitic, la formarea complexului enzimă-
substrat, enzima recunoaște conformația structurală a întregii molecule de substrat a unei sau
unor grupări funcționale din aceasta și/sau o anumită legătură ce urmează a fi scindată. Deci,
acest tip de specificitate este condiționat de complementaritatea structurală dintre molecula
substratului și a centrului activ al enzimei. În funcție de modul de formare a complexului
enzimă-substrat, specificitatea poate fi specificitate absolută de grup, specificitate relativă de
grup, respectiv stereospecificitate.
Specificitate absolută de substrat este întâlnită la acele enzime care sunt capabile să
recunoască structura chimică a unei singure specii moleculare. De exemplu, ureaza prezintă o
specificitate absolută de substrat, catalizând doar reacția de hidroliză a ureei. Ureaza este însă
total inactivă, atât față de substrate asemănătoare structural cu ureea sau chiar față de
derivații ureei. Există un număr relativ mare de enzime implicate în reacții bimoleculare, care
prezintă specificitate absolută față de un singur substrat sau față de ambele substrate. Există
de asemenea enzime care prezintă specificitate diferită de substrat în funcție de sursa
biologică din care au fost izolate.
 Specificitatea relativă de substrat se întâlnește atunci când enzima manifestă
specificitate față de o anumită grupă funcțională din molecula substratului sau față de
anumite legături chimice din structura acestuia, fiind indiferentă față de restul moleculei.
Aceste enzime recunosc, de exemplu, legătura fosfo-esterică, catalizând hidroliza esterilor
acidului ortofosforic cu alcoolii primari, secundari și ciclici, precum și unii fosfo-esteri ai
glucidelor, mononucleotidelor și altele.
Stereospecificitatea enzimelor se referă la capacitatea acestora de a recunoaște un
anumit izomer geometric sau optic. Acest tip de specificitate este foarte des întâlnit, dat fiind
faptul că majoritatea compușilor bio-organici conțin atomi de carbon asimetrici, putând deci
exista sub forma celor 2 antipozi optici. Enzima este capabilă să recunoască doar unul dintre
cei 2 enantiomeri. Există situații când o anumită enzimă izolată dintr-o sursă biologică este
activă față de un izomer optic, iar aceeași enzimă izolată din altă sursă biologică recunoaște
antipodul optic al acestuia. De exemplu, lactatdehidrogenaza din mușchi este activă față de
izomerul levogir al acidului lactic, în timp ce lactatdehidrogenaza izolată din Lactobacillus
plantarum catalizează oxidarea acidului D-lactic.
Stereospecificitatea se manifestă și în reacțiile în care substratul are o moleculă simetrică,
dar produsul de reacție conține carboni chirali. În aceste situații, se realizează așa numita
sinteză asimetrică, adică se formează întotdeauna un singur izomer optic, și nu amestecul
racemic, cum se întâmplă în sinteza chimică organică. De exemplu, prin carboxilarea
propionil-coenzimei A, se formează întotdeauna metil-malonil-coenzima A (CoA).

O clasă specială de enzime o constituie racemazele, care acționează asupra ambilor

enantiomeri, cu formare de amestecuri racemice, de exemplu alanin-racemaza poate acționa
atât asupra L-alaninei, cât și asupra D-alaninei, formând amestecul racemic D,L-alanină.
Același tip de specificitate poate fi manifestat și față de izomerii geometrici, când o anumită
enzimă este activă față de izomerul trans al substratului și total indiferentă față de izomerul
cis sau invers. În urma acțiunii fumarat-hidratazei asupra acidului malic, se formează
întotdeauna acid fumaric și nu acid maleic. Tot izomerul trans se formează și prin reacția de
dehidrogenare a acidului succinic sub acțiunea succinat-dehidrogenazei.
Aspecte energetice ale reacțiilor enzimatice
Energia rezultată din diferitele reacții metabolice poate fi stocată în organismele vii sub
două forme diferite, și anume în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP și ale altor
compuși macroergici sau sub forma unui potențial de membrană. Aceste două rezerve sunt
comunicante, în sensul că energia potențialului de membrană poate trece sub forma
legăturilor macroergice și invers.
ATP-azele
Datorită existenței ATP-azelor membranare, potențialul de membrană poate fi în sinteza
moleculelor de ATP, așa cum se întâmplă în fosforilarea oxidativă și invers, hidroliza ATP-
ului sub acțiunea ATP-azelor permite reîncărcarea potențialului de membrană. Deși ATP-ul
este principala formă de stocare a energiei, aceasta mai poate fi stocată și în moleculele altor
compuși macroergici, cum ar fi creatinfosfatul, fosfoenolpiruvatul, acil-CoA etc. ATP-ul
necesar proceselor biosintetice poate fi generat pe două căi diferite:
1) Fotosinteza și respirația, fenomene ce au loc la suprafața membranei cloroplastelor și
respectiv, membrana internă mitocondrială. Aceste procese generează un potențial de
membrană care este convertit în ATP sub acțiunea ATP sintetazei. Această enzimă, care
este de fapt H+ATP-aza membranară ce poate acționa într-un sens sau altul în funcție de
condițiile concrete din celulă.
2) Reacțiile catabolice și de fosforilare între care amintim glicoliza, ciclul Krebs,
betaoxidarea acizilor grași, catena respiratorie etc. Există modalități prin care se poate
realiza un consum energetic simultan din ambele rezerve, cum ar fi acțiunea decuplanților
fosforilării oxidative, de tipul dinitrofenolului sau a altor agenți care măresc
permeabilitatea membranei pentru protoni. Dispariția potențialului de membrană
determină o intensificare a hidrolizei ATP-ului, datorită tendinței accentuate de
regenerare a acestei diferențe de potențial membranar. Atunci când activitatea ATP-azei
este inhibată de oligomicină sau alți inhibitori specifici, rezerva de ATP rămâne
nemodificată în pofida existenței decuplantului și continuă să-și îndeplinească rolul.
Aceasta înseamnă că în prezența unui inhibitor al ATP-azei, decuplantul inhibă imediat
potențialul de membrană, dar are o acțiune întârziată asupra ATP-azei. Un exemplu
concret al transportului activ prin potențialul de membrană îl reprezintă translocarea
ATP-ADP la nivelul membranei interne mitocondriale. Moleculele de ADP au cu o
sarcină negativă mai puțin față de ATP, ceea ce determină o tendință de expulzare a câte
unei molecule de ATP în schimbul alteia de ADP, care intră în matrice. Oxidarea unui
substrat, sub acțiunea unei dehidrogenaze specifice este însoțită în mod curent de
reducerea NAD+ la NADH. Dacă reacția are loc în citosol, electronii sunt transportați în
interiorul mitocondriei. Dacă acești electroni reapar în mitocondrie sub formă de NADH,
această coenzimă se reoxidează în catena respiratorie. Reducerea și reoxidarea NAD+
determină expulzarea protonilor în exterior, când se realizează transportul electronilor la
nivelul a 3 verigi ale catenei respiratorii:
- Transferul de la complexul I la ubichinonă (CoQ);
- Transferul electronilor de la complexul III;
- Transferul la nivelul complexului IV, ce corespunde citocrom-C-oxidazei.

Protonii nu traversează liber membrana mitocondrială, ci cu ajutorul unor transportori

specifici, printre care se numără și ATP-aza fixată pe membrana internă mitocondrială.
Reîntoarcerea a 2 protoni în interior determină deplasarea echilibrului reacției în sensul
sintezei ATP-ului, când enzima preia rolul ATP-sintetazei. ATP-ul reprezintă în toate
celulele vii o sursă energetică ușor disponibilă și regenerabilă. Cuplarea între biosinteza și
hidroliza ATP-ului este de o importanță capitală pentru celule, deoarece necesitățile
energetice ale acestora sunt foarte mari. Importanța regenerării ATP-ului este reflectată și de
faptul că în corpul uman de exemplu, în fiecare zi, se sintetizează o cantitate de ATP ce
reprezintă cel puțin jumătate din propria sa greutate. Această reciclare continuă este
rezultatul activității unor ATP-aze, activitate însoțită de un flux de ioni ce traversează
membranele, de aceea aceste enzime se numesc ATP-aze ionofore. În această categorie se
regăsesc 3 tipuri de ATP-aze, și anume:
1) ATP-azele de tip P, care sunt reprezentate de ATP-aza ce transportă ionii de Ca2+ și H+ și
asigură echilibrul ionilor de Na+ și K+ de o parte și de alta a membranelor la eucariote.
Mecanismul lor de reacție include formarea unui intermediar fosforilat. În această
categorie mai intră Ca2+-ATP-aza din reticulul endoplasmatic și ATP-aza transportoare
de K+ din unele specii bacteriene.
2) ATP-azele de tip V sunt localizate în membranele organitelor subcelulare, altele decât
mitocondriile (vacuolele, lizozomii) și funcționează ca pompe de protoni, când se
expulzează câte 2 protoni pentru fiecare moleculă de ATP hidrolizată.
3) ATP-azele de tip F, reprezentate de ATP-azele localizate în mitocondrii și în bacterii. Au
masă moleculară mai mare de 450000 D și conțin un număr diferit de catene
polipeptidice ( 8 la E. coli; 8 sau 9 la cea din cloroplaste; 10 sau mai multe la ATP-aza
mitocondrială din levuri și cel puțin 13 la enzima mitocondrială din mușchiul cardiac).
 Reglarea activității enzimelor
Una din principalele caracteristici ale metabolismului substanțelor și energiei o constituie
capacitatea sa de autoreglare și autocontrol prin care toți parametrii biochimici și fiziologici
sunt menținuți între limite normale. Această caracteristică a metabolismului este asigurată,
printre altele, de mecanismele prin care se realizează reglarea activității enzimelor implicate
în diferite secvențe metabolice. Aceste mecanisme sunt extrem de diferite, iar în funcție de
modul de realizare, ele pot fi grupate astfel:
a) Reglarea activității enzimelor prin acțiunea modulatorilor;
b) Reglarea activității enzimelor prin fosforilare-defosforilare;
c) Reglarea activității enzimelor la nivelul conversiei zimogenilor în enzime active;
d) Reglarea biosintezei de novo a enzimelor.
a) Reglarea activității enzimelor prin acțiunea modulatorilor. Enzime alosterice

Inițial, termenul de alosterie a fost utilizat pentru a desemna orice modificare

conformațională a enzimelor survenită ca urmare a interacțiunii acestora cu orice compus care se
leagă în afara centrului activ. Deși hemoglobina nu este o enzimă, fenomenul de alosterie s-a
studiat prima dată în cazul acțiunii 2,3-difosfogliceratului asupra proprietăților acestei proteine.
2,3-difosfogliceratul interacționează cu hemoglobina la nivelul unui situs care este diferit de
situsurile de legare ale oxigenului. Prin extrapolare, noțiunea de efect alosteric a fost extins și
asupra efectelor cooperative. Prin efect cooperativ se înțelege modificarea indusă în molecula
hemoglobinei în urma fixării primelor molecule de oxigen. Un efect cooperativ nu se întâlnește
decât la enzimele oligomere, adică la acele enzime care prezintă structură cuaternară. La baza
acestui efect, stă fenomenul prin care, în momentul în care un efector se leagă la nivelul unui
situs de legare disponibil, în una din subunități, care tinde să-și modifice conformația,
modificarea respectivă transmițându-se și celorlalte subunități. Studiile efectului alosteric au
demonstrat că orice modificare conformațională survenită la una din subunități se transmite
tuturor celorlalte în așa fel încât să se păstreze o simetrie a moleculei în integralitatea sa. Are loc
astfel, o modificare a întregului sistem pe principiul totul sau nimic. Studiul enzimelor alosterice
a pus în evidență următoarele caracteristici comune: toate posedă structură cuaternară, au o
comportare cinetică nemichaeliană, suferă modificări conformaționale fără pierderea capacității
catalitice și joacă în general o funcție reglatoare, în special în secvențele biosintetice.
b) Reglarea activității enzimelor prin fosforilare-defosforilare
Un număr mare de enzime, în special din grupa proteinazelor, prezintă în structura
centrului activ un rest de serină sau alt hidroxi-aminoacid indispensabil activității catalitice.
Gruparea hidroxilică a acestui rest de aminoacid poate da reacții de fosforilare. Fixarea
radicalului fosfat blochează accesul substratului la centrul activ, enzima inactivându-se. Atunci
când condițiile concrete din celulă impun reactivarea enzimei, se realizează procesul de
defosforilare prin hidroliză. Aceste reacții de fosforilare- defosforilare reprezintă un mecanism
de reglare a activității enzimelor foarte des întâlnit. Există și situația inversă, când forma activă
este reprezentată de enzima fosforilată, iar forma inhibată este enzima defosforilată. Un exemplu
clasic de reglare prin fosforilare- defosforilare îl reprezintă glicogen-fosforilaza, care catalizează
reacția de polimerizare a glicogenului prin fosforoliză.

La baza acestui efect stă acțiunea ridicată a fosforilazei, iar glucozo-1-fosfatul rezultat este
consumat rapid prin izomerizarea sa în glucozo-6-fosfat. Acest lucru se petrece în 2 etape:

Glicogen-fosforilaza poate exista sub două forme o formă fosforilată, numită fosforilaza
A, care este catalitic activă și o formă defosforilată, numită fosforilaza B, care este inactivă.
Activarea enzimei constă în conversia fosforilazei B în forma A, transformare care este
reversibilă. Din această cauză, glicogen-fosforilaza este supusă reglării prin două mecanisme
paralele un control alosteric sub acțiunea diferiților efectori și un control realizat prin fosforilare
și defosforilare, modificare covalentă ce se realizează la nivelul restului de serină din centrul
activ. Conversia fosforilazei B în fosforilaza A are loc sub acțiunea unei kinaze specifice, numită
kinaza fosforilazei, activată la rândul ei de alte protein-kinaze. Această enzimă conține în
moleculă 16 catene polipeptidice, ce formează o structură de tipul ( α-β-γ-δ)4. Dintre acestea,
catenele α, β și γ sunt subunități catalitice, în timp ce subunitățile δ sunt capabile să-și lege ionii
de Ca și poartă denumirea de calmodulină. Subunitățile β sunt primele care suferă fosforilarea
sub acțiunea protein-kinazei și activează la rândul lor subunitățile γ fără disociere, în timp ce
subunitățile α se fosforilează ultimele. În momentul în care subunitățile α s-au fosforilat, ele
modifică conformația protomerilor, facilitând defosforilarea acestora.
O altă enzimă a cărei reglare se realizează prin fosforilare-defosforilare este izocitrat-
dehidrogenaza, ce catalizează o reacție importantă din ciclul Krebs.
 În prezent se cunosc două izocitrat-dehidrogenaze, și anume NAD dependentă, localizată
exclusiv intramitocondrial și alta NADP dependentă, localizată în citosol. Mecanismul de acțiune
al acestei enzime este strâns legat de acțiunea unei protein-kinaze, fosforilarea și defosforilarea
izocitrat-dehidrogenazei fiind catalizată de o enzimă multifuncțională, numită kinază/fosfatază
izocitrat-dehidrogenaza, care-și manifestă activitatea într-un sens sau altul în funcție de
compoziția mediului intracelular.
c) Reglarea activității enzimelor la nivelul conversiei zimogenilor în enzime active
Există enzime ce se sintetizează sub forma unor precursori imediați inactivi, numiți
zimogeni care, după ce sunt transportați prin diferite mecanisme la locul de acțiune, suferă unele
transformări de cele mai multe ori de natură hidrolitică, fiind convertiți în enzime active. Aceste
scindări hidrolitice sunt catalizate în majoritatea cazurilor de serin-proteinaze. Cele mai multe
enzime sintetizate sub forma zimogenilor inactivi aparțin clasei hidrolazelor, majoritatea fiind
proteinaze.
Tripsina și chimotripsina sunt sintetizate sub forma precursorilor inactivi tripsinogen și
chimotripsinogen. Conversia tripsinogenului în tripsina activă este declanșată în intestin la un
pH de 5-6 sub acțiunea unei serin-proteinaze specifice, numită enteropeptidază sau enterokinază,
după care procesul continuă autocatalitic. Activarea tripsinogenului constă în clivarea unui
fragment hexapeptidic, această scindare putând fi și autocatalitică, deoarece legătura peptidică
din poziția 6,7 care se rupe, este formată din lizină, iar specificitatea de substrat a enzimei se
manifestă față de aminoacizii bazici lizină și arginină.
Chimotripsinogenul se activează prin scindarea hidrolitică a mai multor legături peptidice.
Dintre acestea, un rol determinant îl prezintă hidroliza legăturilor peptidice dintre resturile de
aminoacizi dintre resturile 15,16, ulterior scindându-se și legăturile 14,15 146,147, respectiv
147-148. La toți chimotripsinogenii, indiferent de sursa biologică, tripeptida 1-3 nu se elimină,
deoarece restul de cisteină 1 de la capătul N-terminal, formează o punte disulfidică cu un alt rest
de cisteină dintr-o cu totul altă zonă a catenei polipeptidice.
Subtilizina este o altă enzimă ce se sintetizează sub forma zimogenului său inactiv. Multă vreme
s-a crezut că toate serin-proteinazele formează o grupă unică de enzime a căror mecanism de
activare și acțiune conservă modelul ancestral. Această ipoteză a fost infirmată prin studiul
subtilizinelor ce prezintă o organizare spațială total diferită. Subtilizinele sunt proteinaze
extracelulare produse de Bacillus subtilis și alte specii înrudite. Ele conțin în centrul activ resturi
de serină, histidină și acid aspartic, fără a exista vreo analogie structurală cu centrul activ al
serin-proteinazelor de tipul tripsinei. Subtilizina se sintetizează sub forma precursorului inactiv
numit prosubtilizină, ce conține în molecula sa o secvență peptidică numită semnal și o
prosecvență suplimentară, alcătuită din 75 de resturi de aminoacizi. Prosubtilizina este fixată de
peretele celular al bacteriei sub această formă, fiind inactivă. Eliberarea zimogenului din
membrană și conversia în subtilizina activă se realizează într-un proces autocatalitic. Prosecvența
rămâne atașată de membrană, aceasta reprezentând fragmentul polipeptidic, care obstrucționează
centrul activ. Acest mecanism de activare, numit coada șopârlei este unic în seria proteinazelor,
neexistând nicio altă peptidază care se activează în acest mod.
Plasmina sau fibrinolizina este o proteinază plasmatică, ce se formează din zimogenul inactiv
plasminogen, ea jucând un rol important în diferite procese precum solubilizarea cheagurilor de
sânge, conversia precursorilor hormonilor polipeptidici în hormoni activi etc. Plasminogenul
liber reprezintă aproximativ 0,5 % din proteinele plasmatice, iar activarea sa se realizează atât
autocatalitic, cât și sub acțiunea unor factori tisulari și sanguini, care acționează asupra
plasminogenului, ca proteinaze specifice. Plasmina activă este o serin-proteinază ce conține în
centrul activ aceeași triadă ca și tripsina, iar conversia zimogenului în enzimă activă se face prin
clivarea unui fragment polipeptidic de la capătul C-terminal în urma scindării legăturii peptidice
arginină 560 – valină 561. După scindarea acestei legături, plasmina rezultată este instabilă și
realizează imediat clivarea unui fragment, conținând 76 resturi aminoacizi de la capătul N-
terminal al lanțului polipeptidic.