UNIVERSITATEA DE STIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

,, ION IONESCU DE LA BRAD” , IAȘI

Facultatea de Horticultură

TCCB

Tehnologii fermentative

UTILIZAREA ENZIMELOR SI LEVURILOR IN

INDUSTRI VINULUI

Sef lucr. dr. LIPSA Florin

VĂTĂMĂNELU Leonard

Anul I, TCCB

1
 Enzilmele din struguri
Enzimele sunt proteine sau protide specializate in cataliza reactiilor biochimice
din must si vin. Dupa Willstatter, enzimele sunt biomolecule complexe formate dintr-un
suport coloidal de natura proteica, termolabil si nedializabil, catalitic inactiv numit
aponemiza, la care se adauga una sau mai multe componente neproteice active,
termostabile si ultrafiltrabile, numite coenzime.complexul apoenzima + coenzima =
holoenzima, caruia I se atribuie activitatea enzimatica.

Rolul coenzimei, denumita si cofactor, este indeplinit de macromolecule cu

structuri chimice foarte diferite ( vitamine, trifosfo – ribonucleotide ) sau simpli ioni
metalici. Rolul cofactorilor este indispensabil pentru manifestarea activitatii catalitice a
enzimei sau pentru potentarea activitatii. Activitatea optima a unor enzime este
conditionata de prezenta concomitenta atat a coenzimei cat si a ionului metalic.

Situsurile enzimatice
Biomoleculele de enzime au in structura lor anumite zone cu o secventa de
aminoacizi si conformatie specifica, de numite situsuri. Aceste zonesunt esentiale
pentru manifestarea activitatii catalitice a enzimelor ( situs catalitic ) sau pentru functia
de reglare a unor secvente de reactii ( situs allosteric ).

Situsul catalitic reprezinta zona de care se leaga in mod specific substratul de

reaztie. Include grupele chimice active ale catenelor laterale de la radicalii aminoacizilor
( - NH2, - SH, - OH, - COOH ), care participa la stabilirea legaturii dintre enzima si
substrat, de terminand astfel reactia specifica enzimatica.

Situsul allosteric se intalneste la enzimele oligomere, constituite din doua sau

mai multe subunitati ( protomeri ), denumite enzime allosterice. Pe langa situsul
catalitic, enzimele oligomere au un al doilea situs numit situs allosteric, care explica
mecanismele de reglare enzimatica a unor reactii ( conformatiile posibile pe care le pot
lua moleculele de enzime ).

2
 Caracteristicile enzimelor
Ca biocatalizator, enzimele se caracterizeaza prin urmatoarele insusiri
generale:

 Actioneaza in cantitati extrem de mici si au o actiune catalitica foarte puternica;

 Nu se consuma si nu se transforma, prin reactiile catalizate;

 Determina reactii extrem de rapide, fiind cei mai eficienti catalizatori;

 Orienteaza si maresc viteza reactiilor biochimice, determinand scaderea energiei

de activare a moleculelor de substrat asupra carora actioneaza;

 Nu modifica starea finala de echilibru a reactiilor, ci numai viteza cu care se

realizeaza starea de echilibru;

 Se disting printr-o specificitate de actiune, ceea ce inseamna ca transformarea

unui substrat intr-un produs de reactie este catalizata de un anumit timp de
enzima.

Reactiile enzimatice

Mecanismul prin care enzimele isi exercita functia catalitica se explica astfel:

 Asocierea enzimei ( E ) cu substratul ( S ) asupra caruia actioneaza si formarea

unui complex intermediar enzima – substrat ( ES ) disociabil;

 Molecula de substrat activata ( S* ) este transformata in produsul de reactie ( P ),

timp in care enzima se elibereaza si se fixeaza din nou pe o alta molecula de
substrat.

In functie de sensul lor de evolutie, reactiile catalizate de enzime pot fi:

 Reversibile E + S ↔ ES* ↔ P + E

 Ireversibile E + S ↔ ES* → P + E

3
 Pentru trecerea de la starea initiala a substratului ( S ) la starea activa
tranzitorie ( S* ), in timpul transformarii S → P este nevoie de o anumita cantitate
de energie, denumita energie de activare. Energia de activare exprima diferenta
dintre nivelul de energie a starii de tranzitie a moleculelor de substrat activate
si nivelul energetic al moleculelor de substrat aflate in starea initiala. Ca orice
catalizator, enzimele reduc energia de activare a moleculelor de substrat ( S ),
determinand o stare de tranzitie a acestora, stare cu un nivel energetic mai
scazut.

Clasificarea enzimelor
In functie de tipul general al reactiilor chimice pe care le catalizeaza,
enzimele se impart in sase clase si anume:

 Oxidoreductaze;

 Transferaze;

 Hidrolaze;

 Liaze;

 Izomeraze;

 Ligaze ( sintetaze ).

Fiecare clasa , la randul ei se subdivizeaza in subclase si subsubclase. In

struguri, respectiv in must, se intalnesc enzime din clasele oxidoreductazelor,
hidrolazelor si liazelor.

Hidrolazele
Enzimele din clasa hidrolazelor catalizeaza reactiile de scindare hidrolitica a
moleculelor de substrat, prin clivajul legaturilor dintre un atom de carbon si alti atomi,
sub actiunea apei. Reactia generala este:

4
 Hidrolaze

R1 – O – R2 + H2O R1 – OH + R2 – OH

Legaturile chimice care pot fi scindate cu ajutorul hidrolizelor sunt: legatura

glicozidica, legatura peptidica si legatura esterica. In struguri, hidrolazele sunt
reprezentate prin glucozidaze, pectolaze si proteinaze.

Invertaza si zaharaza

Este o β – D – fructofuranozidaza care scindeaza legatura β – fructozidica din

zaharoza, cu formarea de α – glucoza si β – fructoza.

Inca din 1860, Berthelot a pus in evidenta rolul invertazei in transformarea

zaharozei in zaharuri fermentescibile. Aceasta enzima este prezenta inca din strugurii
verzi si actioneaza rapid, la concentratiile de numai 2 – 3 g de zaharoza existenta in
struguri. Manifesta activitate maxima in mediu acid ca cel al mustului, unde face
invertirea zaharului care se adauga prin operatiunea tehnica de saptalizare.

Pectolazele si pectinazele
Sunt reprezentate in struguri prin doua tipuri de enzime care degradeaza
membranele pectocelulare si usureaza eliberarea mustului din pulpa boabelor: pectin –
metil – esteraza ( PME ) care desface pectina prin hidroliza in acid pectic cu eliberarea
alcoolului metilic si poligalacturonaza ( PG) care desface pectina in acizi uronici liberi

Pielitele boabelor suant bogate in pectolaze, astfel incat prin zdrobirea strugurilor
mustul se imbogateste in aceste enzime. Din cauza pH – ului acid al mustului activitatea
PME este slaba, dar suficienta pentru a desface pectina si a elibera alcoolul metilic in
proportie de 80% in decursul a 48 de ore. Activitatea PG este mult mai lenta,
descompunerea pectinelor cu eliberarea acizilor uronici realizandu-se in cateva zile.

Deoarece activitatea enzimelor pectolitice naturale din struguri este slaba, se

folosesc in vinificatie preparatele enzimatice de tip industrial ( Pectozin, Ultrazin ).
Acestea faciliteaza extractia mustului din bostina la presare, contribuind la marirea

5
randamentului in must ; eliberarea polifenonilor si substantelor odorante din pielitele
boabelor; deburbarea mustului; limpezirea vinului.

Proteinazele ( peptidaze)
Sunt hidrloaze care catalizeaza scindarea hidrolitica a legaturilor peptidice din
structura protidelor.

Proteinazale se gasesc in strugurii verzi, in cantitati foarte mici. Incepand de la

parga, ele devin foarte active. La prelucrarea strugurilor se regasesc in resturile de
pulpa si joaca un rol important in declansarea fermentatiei alcoolice. In acest scop sunt
ajutate si de enzimele produse de catre levuri ( exoenzime ) .

Rolul proteinazelor este de a elibera din peptide acizii aminici cu catena scurta,
pentru a putea fi asimilati de catre levuri. Se pare ca proteinazele actioneaza si asupra
membranelor celulelor de levuri ininte de declansarea fermentatiei, pentru a le reda
hedrofilia.

Oxidoreductazele
Enzimele din clasa oxidoreductazelor catalizeaza reactiile de fixare a oxigenului
molecular pe compusii fenolici din must si vin. Principalele tipuri de oxidoreductaze
intalnite la struguri sunt enzimele: tirosinaza, polifenoloxidaza si lacaza. Tirosinaza si
polifenoloxidaza fac parte din enzimele proprii ale strugurilor, pe cand lacaza este
produsa de ciuperca Botrytis cinerea, care ataca strugurii la maturare.

Din punct de vedere chimic, oxidoreductazele sunt proteide care au in molecula

lor ioni de cupru ( cuprioxidaze ) . intervin in procesele de oxidare din must si vin, prin
transferul de electroni de pe metabolit, direct la oxigenul molecular. De aceea mai sunt
denumite si transelectronaze.

Tirosinaza si polifenoloxidaza
Sunt prezente in strugurii verzi ( nematurati ), fiind fixate pe organitele celulare
( mitocondrii, cloroplaste ). Se regasesc in resturile de pulpa din must, unde activitatea
lor este foarte intensa.

6
 Tirosinaza manifesta o activitate specifica cresolazica asupra monofenolilor ( β –
cresolului si 1 – tirosinei ), pe cand polifenoloxidaxa are activitate specifica
catecholazica ( de brunificare ) asupra orto-difenolilor, cum este pirocatechina
( catecholul ). Initial s-a crezut ca aceste doua enzime pot manifesta actiune cresolazica
numai cu plata cu cea catecholazica, motiv pentru care in literatura de specialitate mai
veche sunt intalnite sub ambele denumiri, fara a se face distinctie intre ele.

Fermentatia alcoolica a mustului

Procesul de fermentatie alcoolica sta la baza transformarii mustului de struguri in
vin. Este un proces biologic datorat activitatii unor microorganisme vii, denumite levuri
sau drojdii , care transforma zaharurile din must in alcool si dioxid de carbon. Termenul
de levura este adoptat din limba latina (levere= a ridica) si reflecta efectul vizibil al
actiunii lor fermentative, iar termenul de drojdii semnifica masa mare de celule care
rezulta din multiplicarea levurilor ca microorganisme.

Ecuatia chimica globala a fermentatiei a fost stabilita de catre Gay-Lussac, inca

din anul 1815 :

C6H12O6 = 2 CH3 – CH2OH + CO2

180 g glucoza 92 g alcool etilic 88 g dioxid de carbon

Ecuatia sa nu reda complexitatea fenomenelor care se petrec in timpul

fermentatiei si nici produsii secundari care se formeaza, alaturi de alcoolul etilic si
dioxidul de carbon.

Nu toate zaharurile din must urmeaza calea de transformare dupa ecuatia

stabilita de Gay-Lussac. O parte din ele se descompun prin fermentatia glicertopiruvica,
dupa ecuatia lui Neuberg:

C6H12O6 CH2OH-CHOH-CH2OH + CH3-CO-COOH

Glicerol Acid piruvic

Acidul piruvic care apare la sfarsitul glicozei este decarboxilat si se formeaza

aldehida acetica, iar aceasta este redusa in final in alcool etilic:

CH3-CO-COOH CH3-CHO + CO2

CH3-CHO-NADH2 CH3-CH2OH + NAD

7
 Aceste doua reactii sunt cuplate si constituie un mecanism de oxidoreducere :
daca NADH2 nu este reopxidat, glicoliza se opreste de indata ce s-a terminat reducerea
NAD. Precizam ca NAD ( nicotin-amida-dinucleotida) este coenzima de hidrogenazelor
care sunt enzime din grupa oxido-reductazelor cu importanta majora in metabolismul
levurilor.

Levurile din vinificatie

Levurile sunt ciuperci ( fungi) microscopice, foarte raspandite in natura. Solul fiind
rezervorul principal al levurilor. In microbiota solului, levurile sunt totusi mai putin
numeroase decat bacteriile. Din sol, levurile ajung pe struguri sub forma de spori, prin
intermediul particulelor de pamant, stropilor de apa provocati de ploi; prin actiunea
vantului, insectelor, etc. pruina, ca substanta ceroasa aflata pe suprafata boabelor,
contribuie la retinerea unui numar foarte mare de levuri (forme vegetative sau de
rezistenta).

Din punct de vedere morfologic, levurile sunt ciuperci unicelulare de forma

eliptica, ovoida, alungita sau in forma de lamaie. Marimea lor variaza foarte mult, in
raport cu specia: lungimea de 4 – 20 µ, iar grosimea (diametrul) 2 – 10 µ. Pentru a
putea fi observate la microscop este nevoie de un grosisment de 400 – 500 marimi
(diametre). Inmultirea levurilor se face prin inmugurire, mai rar prin sciziparitate.

Sistematica levurilor. Levurile din vinificatie, apartin in cea mai mare parte
ciupercilor din clasa Ascomycotina si apoi ciupercilor din clasa Deuteromycotina (Fungi
imperfecti). Cele din clasa Ascomycotina formeaza spori, pe cand Fungii imperfecti nu
formeaza spori.

Cercetarile au stabilit ca levurile implicate in vinificatie apartin la 36 de specii

sporogene si 31 specii asporogene. O clasificare a levurilor implicate in vinificatie este
prezentata in tabelul de mai jos. Levurile sporogene sunt cele mai importante si apartin
familiei Saccharomycetaceae, care se subdivide in mai multe genuri: Saccharomyces,
Hansenula, Hanseniaspora, Debaryomices, Nadsonia, Candida. Levurile asporogene
apartin familiei Cryptococcaceae, care se subdivide in genurile: Cryptococcus,
Torulopsis, Brettanomyces, Kloeckera.

8
 Fiecare specie de levuri este reprezentata prin mai multe suse (tulpini). Susa find
descendenta pura obtinuta, plecand de la o singura celula, cu insusiri valoroase,
recunoscute. Ansamblul suselor care apartin aceleiasi specii, constituie rasa sau
varietatea de levuri, cu caractere fiziologice commune. Prin incrucisarea a doua suse
din aceeasi specie se obtine o linie fertile de levuri. La randul sau, specia fiind
constituita din mai multe suse fertile.

Diferentierea speciilor si suselor de levuri se face dupa aptitudinea lor de a

fermenta si asimila diferite zaharuri, la care se adauga galactoza si meliobioza.Un
principiu pur theoretic, deoarece strugurii nu contin galactoza si nici meliobiloza.

Succesiunea levurilor in procesul de fermentatie. In mod natural, inceputul

fermentatiei alcoolice a mustului este asigurat de catre levurile asporogene care produc
primele cantitati de alcool (4 – 6 % vol). Foarte rapid, mustul intrat in fermentatie este
invadat de levurile sporogene din genul Saccharomyces, denumite si levuri
fundamentale. La sfarsitul fermentatiei, specia de levuri dominant este Saccharomyces
oviformis cu putere alcooligena mare (levura de finisare a vinului).

Levuri selectionate
In comparatie cu alte biotehnologii fermentative, in vinificatie materia prima nu se
pasteurizeaza inainte de a fi introdusa in fluxul tehnologic si contine o microflora de
levuri si bacterii, de o valoare tehnologica incerta. De aceea, folosirea levurilor
selectionate se impune ca o conditie esentiala pentru obtinerea vinurilor de calitate.
Selectia unei suse (tulpini) de levuri valoroase este o munca indelungata, 4 – 5 ani.
Variabilitatea genetica a levurilor din microbiota epifita a strugurilor, reprezinta principala
sursa de selectie a levurilor. Criteriile de selectie sunt urmatoarele:

 Comportamentul levurii in timpul fermentatiei;

 Randamentul in alcool si puterea alcooligena, cantitatea de zaharuri ramase

nefermentate;

 Capacitatea de fromare a glicerolului si alcoolilor superiori;

 Aciditatea volatile care se formeaza;

 Rezistenta la temperaturile ridicate sau scazute.

9
 Formele sub care se folosesc levurile in vinificatie. Multa vreme levurile
selectionate s-au folosit in vinificatie, in exclusivitate sub forma de culturi umede, pe
medii solide (must agarizat) sau lichide (must sterilizat). Livrarea culturilor se face in
flacoane, pungi din plastic special inchise in conditii aseptic, capacitate 100 – 500 ml.Pe
baza lor se prepara apoi maielele de levuri selectionate.

Levuri uscate active ( LUA). Se folosesc in vinificatie, incepand cu anul 1964 si

prezinta avantajele ca se pot pastra active timp de mai multi ani si sunt mai rezistente la
fenomenele de degenerare. Se pot administra direct in must.

Biomasa de levuri selectionate se separa de mediul de cultura lichid prin

centrifugare, dupa care se usuca cu ajutorul unui current de aer cald la o temperatura
de maximum 45o C. Prin procesul de uscare, apa intracelulara trece prin membrane
celulelor, fara sa se deterioreze.

Inainte de a fi introduse in must, levurile uscate trebuie rehidratate in vederea

revitalizarii lor. Rehidratarea se poate face cu must proaspat nesuflat sau cu o solutie
apoasa de zahar, folosindu-se 10 l la 1 kg de levuri uscate. Pentru usurarea rehidratarii
levurilor, mustul sau solutia zaharata se incalzeste la 35 – 40 o C, in care caz durata de
rehidratare este scurta de 20 – 25 min.

Avantajele pe care le ofera folosirea levurilor in stare uscata:

 Inceput rapid de intrare in fermentatie, deoarece 10 g/hl. levuri uscate

corespund la 25 milioane cellule de levuri vii la miliardul de must;

 Fermentare uniforma si completa a mustului, cu randament maxim in

alcool;

 Continut scazut in acizi volatili si in aldehida acetica;

 Se pot folosi concomitent levurile selectionate de la specii si suse diferite.

Levurile liofilizate se obtin din culturi tinere de levuri selectionate, prin eliminarea
totala a apei sub vid, la temperaturi joase. In prealabil, levurile sunt congelate la – 30 -
-- 40 o C, pentru a se usura eliminarea apei din celule. Liofilizarea se face intr-un mediu
coloidal (amestec de gelatina si glucoza), pentru o mai buna conservare a vitalitatii
levurilor.

Levurile liofilizate se prezinta sub forma de pudra si se livreaza in ambalaje

ermetic inchise. Pentru utilizarea lor se recomanda rehidratarea prealabila, in vederea
revitalizarii celulelor. Multe din preparatele de levuri liofilizate se administreaza direct in

10
must, in dozele recamandate prin instructiunile de utilizare care insotesc preparatele
respective.

Exista pe piata foarte multe preparate cu suse de levuri liofilizate. Cele mai
cunoscute sunt levurile “MAURIVIN” lansate pe piata europeana de producatorul de
levuri australian MAURI FOODS; apoi producatorii francezi de levuri, OENOS-
FRANCE, MARTIN-VILLATE si LITORAL-OENOLOGIE, care produc preparate pudra
de levuri liofilizate ce se adauga direct in must.

Levurile capsulate sau imobilizate. Astfel de preparate rezulta din fractiunea

insolubila rezultata de la autoliza levurilor, separata prin centrifugare, spalata si uscata
dupa o tehnica speciala, apoi infasurata in anvelope sau membrane celulare.

Anvelopele celulare contin 1/3 manoproteine, materii glucozidice 42-56%, din

care glucani si manani 70%, lipdide 17-23%, materii minerale 2.5-5.5% si ergosterolo
1%. Anvelopele celulare absorv acizii grasi inhibitori ai fermentatiei (acizii cu catena
mijloie). Datorita bogatiei lor in factorii de supravietuire (steroli, acizi grasi cu catena
nesaturata), levurile capsulate stimuleaza desfasurarea fermentatiei alcoolice si
malolactice. Prin eliberarea monoproteinelor, acestea se combina cu taninul si
atenueaza astringenta vinurilor, se intensifica culoarea la vinurile rosii.

Folosirea levurilor capsulate: 20 g/hl imediat dupa transformarea primelor 50 g

de zahar din must; la vinificarea in rosu, adaosul se face sub caciula plutitoare de
bostina.Pentru reluarea fermentatiei, se folosesc doze de 30-40 g/hl la vinurile rosii
trase de pe drojdie si 15-20 g/hl la vinurile albe. O larga utilizare si-au gasit levurile
imobilizate in alginati la producerea vinurilor spumate, pentru eliminarea etapei de
remuaj.

Levurile manipulate genetic

Construirea de levuri modificate genetic prin transferul de ADN clonat, permite

introducerea de insusiri pe care nu le poseda genul Saccharomyces, oferind astfel
posibilitatea de modelare a aptitudinilor tehnologice ale levurilor. Semnalul a fost tras de
cercetatorul Hennie van Vurren (1995) din Africa de Sud, care a obtinut “levurile
malolactice” cu ajutorul carora se realizaeaza concomitent, transformarea zaharurilor
din must in alcool si a acidului malic in acid lactic. Obtinerea acestei suse de levuri s-a
facut prin clonarea genelor(manipulare de gene).

11
In prezent, mai multe echipe de cercetatori lucreaza la constrcutia levurilor prin
transferul de gene: la INRA din Montpellier (Franta) s-a obtinut o susa de levuri
acidifiante, care produc in acelasi timp cu alcoolul si acodul lactic, fiind folosita la
fermentarea musturilor slabe acide in vederea echilibrarii aciditatii vinurilor.

Pentru producerea vinurilor spumante s-au construit levuri floculante, prin

introducerea de gene codante pe o proteina de suprafata la celulele de levuri. Astfel de
levuri manipulate pot fi utilizate pentru scurtarea perioadei de remuaj la producerea
sampaniei.

In viitor levurile nu se vor mai rezuma doar la transformarea mustului in vin; ele
vor imbogati vinurile in arome, in esteri volatili etc.

12