U.S.AM.V.

Facultatea de Biothenologii

LACTAT
DEHIDROGENAZA
Coordonator tiinific:
Asisten dr. Simion Vasilica

Absolent:
Baltoiu Mdlina Cornelia
Grupa: 6202

Bucureti
2016

CUPRINS
Introducere
Capitolul I - ENZIMELE - generaliti
I.1. Clasificarea enzimelor
Capitolul II - LACTAT DEHIDROGENAZA
I.1. Lactat dehidrogenaza generaliti
I.2. Determinarea activitii lactat dehidrogenazei
I.2.1. Dozarea LDH prin metoda spectrofotometric (cinetic)
Concluzii

Introducere
Enzimele sunt macromolecule de natur proteic, ce au
rol de catalizatori n reaciile din organismele vii .
Termenul de enzim a fost introdus de Khne n 1878 i
nseamn n drojdie, ceea ce arat c activitatea enzimelor
catalizatori ai reaciilor biochimice nu este legat de viaa
celulei de drojdie.
Enzima a existat din cele mai vechi timpuri, dezvoltnduse pe baze empirice, pe experiena ctigat de generaii.
n ultimii ani enzimologia s-a dezvoltat exploziv, pe baza
unor cercetri ample privind structura enzimelor, mecanisme de
reacii studiate la nivel
reglarea

proceselor

electronic
enzimatice

cuantic,

integrarea

cadrul metabolismului

intermediar. Sinteza chimic a unor enzime reprezint una din

marile performane ale enzimologiei moderne ce deschide
calea unor importante posibiliti de aplicabilitate teoretic i
practic.

S-au

obinut

purificate(proteaza,
celulaze, etc.) n
solide, care

pectinaze,

stare

liber

enzimatice

amilaze,
sau imobilizate

nalt

ribonucleaze,
pe

suporturi

deschid perspectiva obinerii unor complexe

multienzimatice,
enzimatici

preparate

pentru

utilizate
poluare,

ca
n

medicamente,

ca

microbiologie,

senzori
industria

alimentar, n industria medico-farmaceutic, n menaj.

Printre factorii care determin calitatea alimentelor ,
gustul i mirosul joac un rol important. Complexul de senzaii
compus din gust i miros formeaz arma. Substanele aromate
pot exista ca atare n legume i fructe sau se formeaz dup
recoltare sub influena activitii diferitelor enzime al cror
3

substrat poate fi aminoacizi, zaharide, derivai , lipide , acizi

grai sau alte substane numite precursori aromatici.
n general substanele aromatizante sunt uor volatile i
n timpul conservrii se pierd. Produsul conservat i pierde de
cele mai multe ori aroma de produs natural proaspt i capt
n schimb alte caractere organoleptice.
Cercettorii au constatat c prin sterilizare termic se
distrug pe lng
formarea

alte enzime i enzimele ce caracterizeaz

substanelor

precursorii

substanelor

aromatizante
aromatizante.

dar

nu

Dac

se
la

distrug
procesul

alimentar conservat se adaug preparate enzimatice extrase

din produsul natural (sau din
alt

plant

din

aceeai

familie), alimentul

conservat

redobndete gustul i mirosul specific al produsului crud.

Botanica i chimia agricol aplic analiza enzimatic n cercetarea
fiziologiei plantelor, n controlul calitii unor produse vegetale. Studiile privind
comportamentul la ger i la secet a unor plante de cultur folosesc analiza
enzimatic.
Calitatea seminelor este testat prin activitatea enzimatic a proteinelor,
a alfa amilazei. Folosirea
materialelor

preparatelor

enzimatice

pentru

hidroliza

celulozice, deschide perspective transformrii superioare a unor

reziduuri vegetale sau animale.

Enzimele i gsesc o larg aplicabilitate i n microbiologie.
Microorganismele sunt crescute n medii de cultur nct pot produce cantiti
mari dintr-o gam variat de substane organice.
n industria chimic enzimele sunt utilizate att ca reactivi chimici de
analiz, ct i ca reactivi chimici de sintez. n domeniul chimiei, proteinelor nu
li se poate concepe studiul secvenei de aminoacizi a unei proteine fr utilizarea
metodelor de hidroanaliz enzimatic cu proteinoze.
4

n chimia analitic sunt folosii electrozi enzimatici sensibili la

concentraia diferitelor substane.
n chimia preparativ se folosesc diferite transferaze pentru grefarea
unor grupri de compui organici rezultnd substane noi, ce se obin greu prin
metode chimice clasifice. Preparatele enzimatice sunt folosite n industria
textil, industria tbcriei, blnurilor, n curtorii chimice.
Importana deosebit a enzimelor explic varietatea domeniilor de
aplicabilitatea
acestora.
Capitolul I
ENZIMELE - generaliti
Enzimele

sunt

substane

organice

care

catalizeaz

reaciile de sintez i de degradare din organisme.

n

general,

enzimele

acioneaz

asemntor

catalizatorilor neenzimatici:
- acioneaz in cantiti extrem de mici, dar manifest o
activitate extrem de intens;
- nu se consum i nu se transform in reaciile catalizate;
- catalizeaz reacii termodinamic posibile, adic reacii care
corespund unei diminuri a energiei libere;
- nu modific starea final de echilibru a reaciilor ci numai
viteza cu care se realizeaz acest echilibru.
Reaciile

catalizate

de

enzime

se

numesc

reacii

enzimatice, iar substana care este transformat se numete

substrat.
n organismele vii sinteza enzimelor are loc in toate
celulele.

Studiul enzimelor obinute in stare pur a dus la concluzia c ele sunt

substane de natur proteic. Unele sunt holoproteine, iar majoritatea sunt
heteroproteine.
Substratul (S) reprezint compusul chimic de care se poate lega o enzim
(E) cu formarea unui complex activat enzim-substrat S + E ES. Aceast fixare
se face in zone bine determinate de pe suprafaa enzimei, numite "centri activi"
sau "situsuri catalitice" care sunt formate din resturi de aminoacizi din catena
polipeptidic, apropiai in spaiu in urma plierii lanului de aminoacizi.
Enzimele heteroproteice (cu structur binar) sunt formate din dou
componente: una proteic nedializabil i termolabil numit apoenzim i alta
neproteic, dializabil i termostabil numit coenzim.
n procesul biochimic, apoenzima fixeaz substratul i determin i
specificitatea de aciune, adic direcia reaciei, iar coenzima particip in mod
esenial la transformarea enzimatic. Aceste enzime prezint de obicei doi centri
activi: unul situat in fragmentul proteic (situsul catalitic), iar cellalt in zona din
molecul la care se ataeaz coenzima.
Coenzimele sunt reprezentate de substane cu structur diferit, multe
din acestea fiind vitamine sau derivai ai acestora, hormoni, metale etc.
Situsul allosteric, aparinand unei clase speciale de molecule proteice, se
caracterizeaz sub aspect structural prin dou trsturi generale distincte, in
strans corelaie i anume: zone care sunt eseniale pentru manifestarea
activitii catalitice (situs catalitic) sau pentru funcia de reglare a unor secvene
de reacii (situs allosteric).
O serie de enzime oligomere (formate din mai multe subuniti)
denumite i enzime allosterice care au rolul de reglare enzimatic, conin in
molecula lor, pe lng situsul catalitic i un al doilea situs numit "situs
allosteric"
O caracteristic esenial a enzimelor este marea lor specificitate, adic
ele acioneaz catalitic asupra unui singur substrat sau a unei grupe de substane
6

cu caracter chimic comun i catalizeaz numai anumite reacii. Deci

specificitatea este de substrat i de aciune.
Specificitatea de substrat.
Exist unele enzime care au specificitate absolut. De exemplu ureaza
(ureamid-hidrolaza) catalizeaz numai reacia de scindare a ureei in dioxid de
carbon i amoniac. Altele au ins specificitate relativ, de exemplu pepsina
hidrolizeaz toate tipurile de proteine.
Un caz deosebit este specificitatea stereochimic, adic o enzim
acioneaz numai asupra unuia din izomerii unui substrat, preferndu-l n raport
cu alt izomer. Se cunoate faptul c numai glucidele din seria steric D sunt
asimilate i aminoacizii din seria steric L.
Specificitatea de aciune este insuirea unor enzime de a alege, dintre
toate reaciile posibile, numai una pe care o vor cataliza. Pentru aceasta, energia
de activare este atat de mult coborat, ncat se poate stabili echilibrul.
De exemplu, un L-aminoacid poate suferi decarboxilarea numai sub
aciunea

decarboxilazelor,

iar

transaminarea

numai

sub

aciunea

transaminazelor. Deci fiecare enzim manifest o anumit specificitate de

aciune; specificitatea enzimelor se datoreaz in mare msur apoenzimei.
I.1. Clasificarea enzimelor
Aceast clasificare a enzimelor este realizat de comisia de enzime a
uniunii internaionale de chimie pur i aplicat(IUPAC):
1. Oxido-reductaze - catalizeaz reaciile de oxid reducere prin transfer de H2
sau electroni prin combinarea unui substrat de O2;
2. Transferaze - catalizeaz transferul unei grupri chimice, alta dect protonul
de la un substrat la altul;
3. Hidrolaze - catalizeaz hidroliza legturilor peptidice, glucozilice, a esterilor
din diferite substraturi prin adiia apei;
7

4. Liaze - catalizeaz scindarea legturilor din molecule pe alte ci dect n

prezena apei;
5. Izomeraze - catalizeaz izomerizarea optic, geometric i n funcie de tipul
de rearanjare molecular racemaze, cistrans, izomeraze, etc;
6. Ligaze - catalizeaz formarea legturilor covalente dintre molecule cu consum
energetic preluat din compui.

Capitolul II
LACTAT DEHIDROGENAZA
I.1. Lactat dehidrogenaza generaliti
Este o enzim intracelular, larg distribuit n organism, fiind ntlnit cu
precdere n rinichi, miocard, musculatura scheletic, creier, ficat i plmni
(Fig.II.1).

Figura I.1. Lactat dehidrogenaza

https://en.wikipedia.org/wiki/Lactate_dehydrogenase

LDH are o greutate moleculara de aproximativ 140.000 daltoni.

Actuala clasificare i nomenclatur a enzimelor se bazeaz pe principiile
i regulile stabilite de ctre Comisia de Enzime a Uniunii Interna ionale de
Biochimie. Aceast comisie a prezentat un sistem numerotat codificat, criteriul
esenial de clasificare constituindu-l tipul de reacie chimic catalizat de
enzim. Conform acestuia, fiecare enzim este codificat printr-un numr format
din 4 cifre desprite rin puncte. Toate enzimele cunoscute s-au ncadrat n 6
clase (grupe). Cele patru cifre prin care se indentific o enzim vor reprezenta n
ordine: clasa, subclasa, subsubclasa i poziia pe care o deine enzima n
subclas.
9

Astfel, lactat dehidrogenaza aparine la clasa 1, subclasa 1, subsubclasa

1, poziia 27, deci se codific: 1.1.1.27.
Lactat dehidrogenaza este un tetramer compus din dou subuniti: una
muscular (M) i una cardiac (H). Subunitile sunt codate de gene diferite i
apar asfel 5 izoenzime, LDH1-LDH5.
LDH (lactat dehidrogenaza) este prezent n citoplasma celulelor i
particip n stadiul final al glicolizei la interconversia piruvatului i lactatului
(Fig. II.1.).

Figura II.2. Piruvat redus la lactat

LDH este un indicator nespecific de lezare tisulara. Pentru a identifica
sursa cresterii nivelului enzimatic sunt necesare izolarea si cuantificarea celor 5
fractiuni diferite ale LDH-ului rezultate prin combinarea in diferite proportii a
celor doua tipuri de monomeri H si M: LDH-1 (H4), LDH-2 (H3M), LDH-3
(H2M2), LDH-4 (HM3) si LDH-5 (M4).
Subunitile nu sunt active din punct de vedere biochimic.
Specificitatea tisulara deriva din faptul ca in anumite tesuturi exista
sinteza specifica de diferite subunitati in raporturi bine definite. Astfel celulele
cardiace, eritrocitele si rinichii sintetizeaza preferential subunitati H (LDH-1
-H4), in timp ce hepatocitele sintetizeaza aproape exclusiv subunitati M.
Musculatura striata scheletala produce, de asemenea, in mare masura, subunitati
M, astfel incat LDH-5 creste atat in afectiuni hepatice cat si musculare. LDH-1
si LDH-5 sunt cel mai adesea utilizate pentru a indica patologie cardiaca sau
hepatica.

LDH-2

se

gaseste

in

eritrocite,

10

inima,

rinichi,

sistemul

reticuloendotelial, LDH-3 se intalneste preferential in plamani, limfocite si

pancreas, iar LDH-4 in musculatura striata, ficat, rinichi sau pancreas.
I.2. Determinarea activitii lactat dehidrogenazei
Enzima lactat dehidrogenaza localizat n citoplasm se determin
histoenzimatic printr-o coloraie albastru nchis (Fig.II.3.). Se utilizeaz ca
substrat lactat de sodiu n tampon fosfat pH 7,8 si NAD +, iar pentru vizualizarea
produsului o sare de tetrazoliu. Incubarea s-a fcut timp de 10 minute la 37C.
Locurile tisulare cu activitate enzimatic se evidentiaz printr-o coloratie
albastra-indigo.

Figura II.3. Activitatea LDH cu sgei sunt marcate zonele cu actvitate

enzimatic intens
Lactat-dehidrogenaza (LDH) poate fi determinat din ser sangvin sau din
omogenat tisular.
Reactivul conine: tampon fosfat disodic (50 mM, pH 7,5), NADH+H +
(0,1 mM) i piruvat (1 mM). Se calculeaz volumul fiecrui reactant astfel nct
volumul total de reacie s fie de 2000 l, din care 1900 l reactiv i 100 l ser
sau omogenat tisular. Reacia este declanat n cuva spectrofotometrului, prin
adugarea probei (ser sau omogenat tisular) care conine enzima. Lungimea de
und la care se face citirea este de 365 nm; se urmrete scderea concentraiei
NADH din mediul de reacie (scderea extinciei) prin citiri succesive la
11

intervale de un minut, atta timp ct reacia se desfoar aproximativ liniar (4-5

min.).
Determinarea activitii LDH n ficat, creier i ser.
Activitatea LDH a fost msurata prin metoda Horecker i Kornberg.
Reacia a fost realizat n cuv de cuar. Amestecul de reacie (3 ml) contine 1
ml tampon 0,2 M Tris-HCI (pH 7,4),0.15 ml 0,1 M KCI, 0.15 ml 50 mM piruvat
de sodiu, 0.20 ml de 2,4 mM NADH i solutie corespunzatoare de enzima
diluata. Activitatea enzimatic a fost monitorizat prin scderea absorbanei la
lungimea de unda 340 nm timp de 3 min. Amestecul de reacie fr enzim
proteic a servit ca martor n acest sistem de testare
I.2.1. Dozarea LDH prin metoda spectrofotometric (cinetic)
Principiul metodei
Lactat dehidrogenaza (EC 1.1.1.27: L-lactat: NAD+ Oxidoreductaza;
LDH) catalizeaz conversia piruvatului la L-lactat n prezena NADH, care este
transformat n NAD+.
Viteza de conversie NADH/NAD+ este msurat la 340 nm, i este
proporional cu activitatea LDH.
Proba
Ser nehemolizat, proaspat.
Plasma heparinizata.
Mod de lucru
ntr-o eprubeta se pipeteaza 1 ml amestec R1 + R2 si 10 l ser sau
plasm.
Se agit i se incubeaz timp de 1min la 370C.
Se msoar variaia absorbanei la = 340 nm fa de apa distilat, n
cuve de 1 cm, timp de 3 min., la fiecare minut.
Se calculeaz variaia absorbantei pe minut (A/min).
Calcul
12

CP = (A/min) x 16030 in U/l

unde: CP concentratia probei
A/min variatia absorbantei pe minut
Factor de conversie: U/L x 0.0167 = kat/L.
Valori normale
Aduli 135 - 225 U/l
Sugari 0 1 an 225 600
Copii 2 14 ani 120 - 300
Variaii fiziologice crete in efort fizic
Variaii patologice
Valori crescute:
n infarctul miocardic apar niveluri crescute de LDH la 36-55 ore de la debut,
care persista 3-10 zile;
n infarctul pulmonar creterile LDH se nregistreaz n decurs de 24 ore de la
debutul durerii toracice;
insuficienta cardiac congestiva, afeciuni hepatice (ciroz, alcoolism, hepatita
acuta viral), tumori solide, leucemii, limfoame, hipotiroidism, afeciuni
musculare (distrofii, traumatisme), anemii megaloblastice i hemolitice,
convulsii, delirium tremens, soc, hipoxie, hipotensiune, hipertermie, infarct
renal,

pancreatita

acuta,

fracturi,

obstructie

intestinala,

mononucleoza

infectioas.
Valori sczute:
se asociaz cu un rspuns bun la terapia citostatic.
I.3. Aplicaii
Determinarea LDH este util pentru diagnosticul retroactiv al infarctului
miocardic, stabilirea gradului de activitate a bolii n alveolita fibrozant
criptogenic i n alveolit alergic extrinsec, marker al hemolizei in vivo
13

(anemii hemolitice) sau in vitro (artefact), monitorizarea terapiei citostatice n

diverse tumori. LDH crete n infarctul miocardic, infarctul pulmonar,
insuficiena cardiac congestiv, afeciuni hepatice (ciroza, alcoolism, hepatita
acuta viral), tumori solide, leucemii, limfoame, hipotiroidism afectiuni
musculare (distrofii, traumatisme), anemii megaloblastice si hemolitice,
convulsii, delirium tremens, soc, hipoxie, hipotensiune, hipertermie, infarct
renal,

pancreatit

acut,

fracturi,

obstrucie

intestinal,

mononucleoza

infectioas.

Concluzii
Creteri ale LDH-1 si LDH-2 sugereaz existena unui infarct miocardic
sau a unei anemii, iar LDH-4 si LDH-5 n leziunile hepatice i procesele
neoplazice (care apar in proliferarea anormala a celulelor-tumori).
Determinarea activitii LDH se bazeaz pe transformarea NADH n
NAD+ n prezena substratului (piruvat).
Viteza de oxidare a NADH este proporional cu activitatea LDH.
Izoenzimele LDH pot fi separate din ser prin electroforeza pe folii de acetat de
14

celuloz, n gel de amidon, agar, poliacrilamid i pot fi vizualizate printr-o

reacie de culoare. n plus, anticorpii monoclonali ( technica Western Blot) pot fi
utilizai la detecia izoenzimelor.
De exemplu, se pot obine unii markeri (indicatori) tumorali pentru
fosfataza

acid (din prostat), fosfataza

alcalin (din placent) sau

deoxinucleotid transferaza. Msurarea activitii enzimatice nu constituie o

eviden suficient pentru diagnosticarea bolilor i de aceea aceasta se face
mpreun cu stabilirea unor simptome sau a altor tipuri de analize.
LDH este o enzim intracelular larg distribuit n organism, fiind
ntalnit cu precadere n rinichi, miocard, musculatur scheletic, creier, ficat i
plmni.
Dei cresterile LDH sunt nespecifice, testele sunt utile pentru
confirmarea diagnosticului de infarct miocardic sau pulmonar. n infarctul
miocardic persistenta nivelului LDH crescut este mai ndelungat dect a
celorlalte enzime.
LDH1 exist n esuturile cu metabolism predominant oxidativ (creier,
inim, rinichi); n aceste esuturi e favorizat sinteza izoenzimelor de tip H;
LDH5, LDH4 exit n esuturile cu metabolism predominant glicolitic (muchi
scheletic); n aceste esuturi e favorizat sinteza izoenzimelor de tip M; cele
dou catene H i M sunt distincte ntre ele.

n infarctul miocardic acut, LDH este aproape ntotdeauna crescut, nc

din primele 10-12 ore de la debut, atingnd un vrf dup 48-72 de ore.
Persistena valorilor crescute timp de 10-14 zile este util pentru diagnosticul
mai trziu la primul consult al pacientului dup o perioad suficient de lung
astfel nct valorile CPK i GOT s devin normale.
Valori ale LDH mai mari de 2000U/l sugereaz un prognostic foarte
rezervat. Deoarece exist numeroase afeciuni n care valorile LDH cresc, este
necesar i determinarea activitii izoenzimelor LDH1 i LDH2. Valorile LDH1
15

pot rmne crescute chiar dac cele ale LDH total revin la normal. n infarctele
minore, LDH1 poate fi crescut, n timp ce LDH total prezint valori normale. n
IMA asociat cu insuficiena cardiac congestiv pot apare valori crescute ale
LDH1 i ale LDH2. n insuficiena cardic congestiv propriu-zis, valorile
izoenzimelor LDH sunt normale.
Introducerea valvelor intracardiace prostetice determin constant
hemoliza cronic nsoit de creteri ale LDH total, ale LDH 1 i LDH2. Astfel de
creteri apar i nainte de interveniile chirurgicale la pacienii cu modificri
hemodinamie severe ale valvelor cardiace.

Tabel 1. Creteri ale izoenzimelor LDH n diferite tipuri de afeciuni

Afeciunea

Izoenzime LDH
crescute

Infarct miocardic acut

I i II

Infarct cortical renal acut

I i II

Anemie pernicioas

ocuri

electrice

termice, V

traumatisme
IMA cu congestie hepatic acut

I i V

Limfoame maligne

III i IV

Carcinom de prostat

Embolie pulmonar i infarct

II i III

Dermatomiozite

Determinarea activitii LDH este util i n cazul respingerii acute a

transplantului de inim deoarece LDH1 crete mai mult de 100U/l i - ca procent
- ajunge la 35% din LDH total n primele 4 sptmni dup intervenie. Aceste
16

valori pot scdea sub o terapie imunosupresoare corespunztoare; LDH total

continu s rmn crescut, chiar dac LDH1 revine la normal.

Bibliografie
Artenie, Biochimie, Ed. Universitii Al. I. Cuza, Iai, 1991
Elena Moldoveanu, Biochimie medical curs, Editura Universitii Titu
Maiorescu, Bucureti
K. Rathee, V. Dhull, R. Dhull, S. Singh, Biochemistry and Biophysics Reports 5
(2016) 3554.
S.N. Aisyiyah

Jenie, B.

Prieto-Simon, N.H.

Voelcker,

Biosensors

Bioelectronics 74 (2015) 637643.

Legninger, A.L., Biochimie vol I, Ed. Tehnic, Bucureti, 1987

17

and

L.V. Galbraith, F.Y. Leung, G. Jablonsky, R. Henderson, Clinical Chemistry 36

(1990) 1317-22.
S. Moldoveanu, Investigatii tanatochimice in vederea stabilirii diagnosticului de
deces -Teza de doctorat, Universitatea de medicina si farmacie, Gr. T. Popa, Iasi,
2013.
T .Marshall, J. Williams, K.M. Williams, Journal of Chromatography 569 (1991)
323-345

18