1. Constanta de echilibru.

Legea
acțunii maselor
2. Definirea, clasificarea și
Cap. I. caracterizarea solutiilor
3. Electroliți. Disociere
ELEMENTE DE CHIMIE electrolitică
ANALITICĂ 4. Echilibrare acido-bazice
5. Echilibrare de oxido-reducere
6. Echilibrare cu formare de
combinații complexe
7. Echilibrare de precipitare
 Expresia constant de echilibru reprezintă relația fundamental a echilibrului chimic numită
legea acțiunii maselor , care poate fi enunțată astfel:

"Starea e echilibru este caracterizată printr-un raport constant între produsul

concentrațiilor produșilor de reacție și produsul concetrațiilor reactanților ,fiecare dintre
concentrații fiind ridicată la o putere corespunzătoare coeficentului stoichiometric respective."
Pe baza mărimii constantei de echilibru, K, se pot face previziuni asupra sensului unei reacții
chimice. Astfel,cu cât valoarea constant de echilibru este mai mare , cu atât va fi mai pronunțată
tendința ca reacția să decurgă în sensul formării produșilor săi.

Datorită caracterului său dinamic, echilibrul chimic poate fi deplasat într-un anumit sens prin
acțiunea separate sau simultană a următorilor factori care îl influențează : concentrația,
temperature , presiunea.

Sensul deplasaării unui echilibru chimic este dictat de principiul formulat de Le Chatelier :
"Aplicarea unei constângeri exterioare determină deplasarea poziției de echilibru a unui sistem
chimic în sensul dimininuării acesteia."
 
Prin urmare:

•Dacă se mărește concentrate uneia dintre speciile component ale unui system de reacție ,
echilibrul chimic se deplasează în sensul consumării unei cantități cât mai mare din substanța
repectivăș
•Prin ridicarea temperaturii ,echilibrul unui system chimic se deplasează în sensul în care se
consumă căldură (process endoterm)
•Măriea presiunii deplasează echilibrul unei reacții , care se desfașoară în fază gazoasă, în
direcția care determină scăderea numărului de moli al sistemul.
 Pentru exemplificare, în tabelui I.1. sunt prezentate câteva sisteme de reacție și modul de
aplicare a pricipiului Le Chatelier pentru anularea parțială a efectului unei acțiuni exterioare
asupra echilibrului lor.

 
Tabelui I.1. Exemple de aplicare a principiului Le Chatelier
I.2. Definirea, clasificarea si caracterizarea soluțiilor
Soluția este un amestec omogen de două sau mai multe substanțe între care nu se produc
interacțiuni de natura chimică.
Componentle amestecului care reprezintă o soluție sunt:
Dizolvantul (solventul)- substanță chimică prezentă în proporțiacea mai mare și nu-și
modifică starea de agregare;
Substanța dizolvată (solvit sau solute)- compomemta care se găsește în cantitate mai mică;
După stare lor de agregare , soluțiile pot fi solide,lichide și gazoase (tabelul I.2.). Din puncr
de vedere al analizei chimice ,ca mai mare relevanță o au soluțiile lichide , care pot fi
apoase ,partial sau neapoase;

Tabelul I.2. Clasificarea soluțiilor în funcție de starea de agregare

 În condiții de echilibru, cantitatea maximă de substanță dizolvatș mai mic decît
corespunzător soluțiilor nesaturate se numesc nesaturate. Soluțiile nesaturate se remarcă
prin cea mai largă și frecventă aplicabilitate practică.
Soluțiile suprasaturate sunt definite prin potențialul lor de a dizolva cantitați de
substanță mai mare decît cele conținute de soluțiile nesaturate. Soluțiile nesaturate se
particulatizează prin gradul înalt de instabilitate.
Din punct de vedere al analizei chimice este deosebit de importantă problema
preparării și exprimării corecte a concentrațiilor soluțiilor.
Concentația unei soluții este o marime care indica raporul dintre cantitatea de substanță
dizolvată și cantitatea de solvent sau de soluție (exprimată în unitați de masă sau volum).

În practica analitică se uilizează frecvemt urmatoarele modalitați de exprimare a

concentrației soluțiilor:
Concentrația procentuală de masă (%,): numarul de mol dizolvată în 100g soluție;
Concentrația molară (molaritatea) (m sau [],moli/L)numărul de moli (molecule-gram) de
substanță solvită într-un litru de solutie:
Concentrația normală (normalitatea ) (n sau N,echiv/L) numărul de echivalenți gram de
substanță dizolvatț într-un litru de soluție;
Titrul ( T,g/ml) numărul de grame de substanță solvită într-un mililitru de soluție
  
I.3.Electroliți.Disociere electrolitică

Electroliți sunt substanțe generatoare de sluții caracterizate prin :

Conduc curentul electric prin intermediul ionilorș
Nu respectă legile soluțiilor ideale. (O soluție ideală este rezultatul dizolvării a două
substanțe, care decurge fără nici o variație de volum și nici o degajare sau absotbție de
energie.)
 
Sunt electroliți majoritatea substanțelor anorganice, dar și acizii șă bazele organice.
Comportarea specială a electroliților se explică prin disocierea lor în particule încărcate
electric, care se numesc ioni. Capacitatea ionilor pozitivi (catoni) și negative (anioni) de a
migra sub acțiunea unui camp electric asigură conductibilitatea electrică a soluțiilor de
electroliți. Așadar ,electroliții sunt conductor ionici (de ordinal II).

Fenomenul de desfacere în ioni a moleculelor unui electrolit prin dizolvare într-un

solvent adecvat sau prin ropire se numeste disociere electrolitică (ionică).
Pentru caracterizarea cantitativă a acestui process se folosește mărimea nuite grad de
disociere. Gradul de disociere se noteaza cu α și reprezinta fracțiunea ionizată dintr-un
mol de electrolit (tabelul I.3.). Uzual ,gradul de disociere se exprimă în procente ,α
%=100 α. În aceste cazuri valorile gradului de disociere sun cumprinse între 0 și 100%.
Tabelul I.3. Caracterizarea tcomportării chimice a soluțiilor de electroliți
 I.4. Echilibre acido-bazice
I.4.1. Teorii despre acizi și baze

Primele definiții ale acizilor si bazelor datează din anul 1806, când Davy a considerat
hidrogenul ca purtător al propietaților acide. Dezvoltarea în timp a chimiei a fost marcată
de evoluîii smnificative în abordarea caracterului acido-bazic al substanțelor, soldate cu
elaborarea unei serii de teorii , sistematizate în tabelul I.4.
Prima definiție modernă a acizilor și a bazelor a fost dată de Arrhenius care a elaborat
teoria ionică. Conform acestei teorii, acizii sunt substanțe a căror disociere , la dizolvarea
în apa ,decurge cu eliberare de ioni OH-­ .Prin reacția dintre un acid și o bază (numită
reacția de neutralizare) se formează sare și apă.
 
Limitele teoriei ionice sunt asociate cu :
Se aplică numai pentru aicizi și baze slabe în soluții apoase;
Nu explică propietațile acido-bazice ale substanțelor care nu conțin H + sau OH-
Cea mai importantă teorie despre aiczi și baze este cea protolitică, fundamentată de
Bronsted-Lowry ,în anul 1923 ,pe baza transferului de protoni.
Protonul,particula elementară cu masa l și sarcina +l este identic cu ionul H +. În solulții
apoase acest ion nu pare exista decât în stare hidratată ;ionul H 3O+, se numește hidroxoniu
(se notează simplificat H+);
În conformitate cu teoria protolitică, acizii sunt substanțe capabile să cedeze protoni
(H+). Spre deosebire de acizi ,bazele sunt definite ,conform acestei teorii , prin
capacitatea lor de a acepta (fixa )protoni.
Observație: În mod riguros, prin luarea în considerație a activității ionilor de hidrogen,
respectiv de hidroxil , se pot defini șiurmătoarele mărimi:

Cunoașterea pH-ului unei soluții joacă un rol esențial în executarea unei reații care stă la baza
unei metode de analiză. Calcularea pH-ului unei soluții apoase se face în funcție de natura
substanței dizolvate (acide ,bază, sare) și de tăriea electrolitului respectiv (tabelul I.8) .
I.4.3. Tăria acizilor și bazelor
În conformitate cu teoria protolitică, tăria unui acid sau a unei baze este determinată de
abilitatea subtanței respective de a ceda, respective de a primi un proton.
Pentru compararea tăriei diferitelor cupluri aid-bază, drept pereche acido-bazică de referință
se alege solventul.
Dacă se utilizează apa, ca solvent standrad atunci în soluția apoasă a unui acid se stabilește
echilibrul :
1.4.5. Soluţii tampon de pH
A. Definirea şi mecanismul de funcţionare

În scopul atenuării influenţei semnificative manifestate de concentraţia ionilor de hidrogen

asupra echilibrelor chimice, în analiza calitativă şi cantitativă se recurge, în nenumărate cazuri, la
utilizarea soluţiilor tampon.
Soluţiile tampon sunt amestecuri chimice care au proprietatea de a menţine aproape constantă
concentraţia ionilor de hidrogen (respectiv pH-ul) la adăgarea unui acid tare sau a unei baze
tari.
Pentru a-şi îndeplini funcţia de reglare a acidităţii şii bazicităţii mediului în jurul anumitor valori
de pH, o soluţie tampon trebuie să fie formată din doi componenţi:
unul care să fixeze protoni;
altul care să elibereze protoni.

Tabelul 1.8. Relaţii de calcul ale mărimilor ce caracterizează echilibrele care se stabilesc în soluţii apoase de
Mărimea
Acizi tari monoprotici, HX
Baze tari monoprotice, MOH
Acizi slabi monoprotici, HA
acizi, baze, săruri
Relaţia de calcul Semnificaţia
HX → H + + X − ;
[H + ] = [X − ] = Ca Disociere completă;
MOH → M + + OH + ; C=concentraţie totală, mol/L
ሾOH + ሿ= [M + ] = Cb
HA = H + + A− ; Disociere parţială,
ሾH + ሿ
[A− ] reversibilă, relaţia
Ka = simplificată (Ka≤10-5)
[HA]
[H + ] = ሾA− ሿ ; ሾHAሿ= Ca − [H + ]
[H + ] = ඥK a Ca
Baze slabe monoprotice, BOH
Acizi slabi polipritici, HnA
Baze slabe poliprotice,
B(OH)n
Săruri ale acizilor tari cu baze
tari, MX
Săruri ale acizilor tari cu baze
slabe, BX
BOH = B + + OH − ; Disociere parţială,
ሾB + ሿ
[OH − ] reversibilă, relaţia
Kb = simplificată (Ka≤10-5)
[BOH]
[B + ] = ሾOH − ሿ
;
BOH = Cb − [OH − ]
ሾOH − ሿ= ඥK b Cb
Dacă K1/K2 ≥ 104, so
ሾH + ሿ= ට K a 1 Ca
neglijeză disocierea în
treptele următoare
ሾOH − ሿ= ට K b 1 Cb
ሾH + ሿ= ඥK w Săruri fără hidroliză
B + + H2 O ↔ BOH + H + ; Hidroliză acidă relaţii
simplificate de calcul:
K w Cs
ሾH + ሿ= ඨ - constantei de hidroliză;
Kb - gradului de hidroliză
Kw
Kh = ;
Kb

Kw
h=ඨ
K b ∙ Cs

Săruri ale bazelor tari cu acizi A− + H2 O ↔ HA + OH − Hidroliză alcalină

slabi, MA Kw ∙ Ka
H+ ൧= ඨ
ൣ
Cs
Kw
Kb =
Ka
Kw
h=ඨ
K a ∙ Cs

Săruri ale acizilor slabi cu B + + A− + H2 O ↔ BOH + HA Dacă:

baze slabe Kw ∙ Ka
- Ka = Kb, soluţia are
H+ ൧= ඨ
ൣ caracter neutru (pH = 7);
Kb - Ka > Kb, soluţia are
Kw caracter acid (pH < 7);
Kh = - Ka < Kb, soluţia este
Ka ∙ Kb
alcalină ( pH > 7)

ඥK h
h=
1 + ඥK h

h = ඥK h
Soluţii tampon Ca Se opun variaţiilor de pH la
H+ ൧= Ka
ൣ
HA/MA Cs adăugarea unor cantităţi
Cele mai uzuale tipuri de soluţii tampon sunt rezultatul amestecării:
o unui acid slab (HA) cu sarea acestuia cu o bază tare (MA), de exemplu acid acetic/acetat de
sodiu, CH2COOH/CH3COONa;
o unei baze slabe (BOH) şi sarea acesteia cu un acid tare (BX), de exemplu hidroxid de
amoniu/clorură de amoniu, NH4OH/NH4Cl.
Acţiunea prin care o soluţie tampon se opune variaţiilot de pH este datorită echilibrelor care se
stabilesc (tabelul 1.9).

Tabelul 1.19. Mecanismul de funcţionare a soluţiilor tampon

Tipul soluţiei tampon Factorul perturbator Echilibrul care asigură
menţinerea aproape constantă a
pH-ului
HA/MA HA ↔ H+ + A− Adăugarea de bază H+ + OH− ↔ H2 O
MA → M+ + A− Adăugarea de acid A− + H+ ↔ HA
BOH/BX BOH ↔ B+ + OH− Adăugarea de acid OH− + H+ ↔ H2 O
BX → B+ + X− Adăugarea de bază B+ + OH− ↔ BOH

De exemplu, pH-ul unui soluţii tampon CH3COOH/CH3COONa rămâne relativ

constant, datorită desfăşurării următoarelor reacţii, la adăugarea unei cantităţi mici
de: a) NaOH: CH COOH + NaOH ↔ CH COONa + H O
3 3 2
b) HCl: CH3 COONa + HCl ↔ CH3 COOH + NaCl
B. Reglarea pH-ului mediilor biochimice

Mecanismele de reglare specifice organismelor vii asigură invariabilitatea „mediului lor intern”.
Între acestea, o poziţie cheie este ocupată de acţiunea de tamponare prin care mediile biochimice
se opun variaţiilor de pH datorate substanţelor (metaboliţi) cu caracter acid sau bazic generetare
în cursul desfăşurării proceselor metabolice. Astfel, conform unor date estimative, un om adult
normal elimină zilnic prin plămâni şi prin rinichi, echivalentul a aproximativ 30 L soluţie de acid
1N şi, respectiv, 100 mL de soluţie de acid 1N. Exercitarea acţiunii de tamponare a unor sisteme
tampon din plasmă şi eritrocite (carbonat acid – 53%; hemoglobină şi oxihemoglobină -35%;
proteine – 7%; fosfat organic – 3%; fosfat anorganic – 2%) se soldează cu menţinerea constantă a
pH-ului sângelui uman la valoarea de 7,40,05.
Explicarea acestui mecanism de tamponare este posibilă prin luarea în considerare a proceselor
acido-bazice din sânge:
Explicarea acestui mecanism de tamponare este posibilă prin luarea în considerare a proceselor
acido-bazice din sânge:
glucidele şi grăsimile, principala sursă de energie a organismului uman, se oxidează practice
total, în timpul unor procese metabolice normale. Dioxidul de carbon, rezultat în urma acestor
oxidări parcurge următoarele etape: diyolvarea în apă → difuzia prin plasmă în eritrocite →
conversia enzimatică în acid carbonic:
 CO2 + H2 O ↔ H2 CO3
(1.47)
 în eritrocite există două sisteme biochimice acido-bazice, oxihemoglobina (HHemO2)
HHemO2 ↔ H + + HHemO2−
(1.48)
şi hemoglobin (HHem)
HHem ↔ H + + Hem−
(1.49)
-
 component Hem anihilează influenţa acidului carbonic pe care-l transform în carbonat acid
(HCO3-) printr-o reacţie al cărei echilibru este mult deplasat spre dreapta:
H2 CO3 + Hem− ↔ HHem + HCO3 −
(1.50)
−
 la nivelul plămânilor unde ajung ionii HCO3 transportaţi de sânge, hemoglobina este
oxidată la oxihemoglobină:
HHem + O2 ↔ HHemO2 ↔ H + + HemO2 −
(1.51)
din a cărei disociere rezultă ioni de hidrogen care acţionează asupra carbonatului acid pe care-l
transformă în acid carbonic:
H + + HCO3 − ↔ H2 CO3
(1.52)

 în urma descompunerii enzimatice a acidului carbonic se formează, alături de apă, dioxid

de carbon, care este ulterior eliminat prin plămâni în timpul respiraţiei
1.5. Echilibre de oxido-reducere
1.5.1. Reacţii de oxido-reducere

Reacţiile de oxido-reducere sunt reacţiile însoţite de un transfer de electroni () de la un reducător

la un oxidant. Notaţiile prescurtate uzuale ale reducătorului şi oxidantului sunt “red” şi
respectiv ”ox”.
 Reducătorul cedează electroni, se oxidează:
red ↔ ox + nē
(1.53)
2+ 4+
De exemplu, ionul Sn prin cedarea a doi electroni, se oxidează la Sn :
Sn2+ ↔ Sn4+ + 2ē
(1.54)
Oxidarea este procesul de cedare de electroni. În urma desfăşurării acestui proces,
numărul de oxidare al atomilor (valenţa aparentă) creşte. Oxidantul acceptă electroni, se reduce:
ox + nē ↔ red
(1.55)
3+
Astfel, de exemplu, prin acceptarea unui electron, ionul feric (Fe ) se reduce la ionul
feros (Fe2+):
Fe3+ + 1ē ↔ Fe2+
(1.56)
Reducerea este procesul de acceptare de electroni de către o specie chimică. Prin
reducere, numărul său de oxidare scade.
Se precizează că în cazul a numeroşi compuşi biochimici numărul de oxidare ala tomilor
se calculează prin atribuirea numărului de oxidare +1 pentru hidrogen şi +2 pentru oxigen.
Speciile chimice între care are loc transferul de eletroni formează un cuplu (sistem) redox
îm care:
 unui reducător îi corespunde oxidantul conjugat;
 unui oxidant îi corespunde reducătorul conjugat.
Cuplurile redox implicate în echilibrele de mai sus pot fi scrise simplificat astfel:
Sn /Sn2+; Fe3+ /Fe2+, sau în general, ox/red.
4+

Deoarece electronii, ca şi protonii, nu pot exista liberi în soluţie, cele două fenomene,
oxidarea şi reducerea, se petrec concomitent între două cupluri redox conjugate până la stabilirea
echilibrului redox. Astfel, de fapt, echilibrele de reducere (1.56) şi de oxidare (1.54) au
semnificaţie numai dacă sunt considerate împreună:
2Fe3+ + Sn2+ ↔ 2Fe2+ + Sn4+
(1.57)
 Aşadar, procesul de oxido-reducere este unitar, compus din două semireacţii (de oxidare şi de reducere)
îndreptate în sensuri contrare, în care numărul de electroni cedaţi de reducător trebuie să fie egal cu numărul de
electroni primiţi de către oxidant. În general, un proces de oxido-reducere, poate fi reprezentat în următoarea
formă simplificată:
ox1 + pē ↔ red1 | × m (1.58)
red2 − mē ↔ ox2 | × p (1.59)
Numărul de electroni transferaţi va fi identic dacă prima ecuaţie se înmulţeşte cu m, iar a doua ecuaţie cu p:
m ox1 + m pē ↔ m red1
p red2 − m pē ↔ p ox2

m ox1 + p red2 ↔ m red1 + p ox 2

(1.60)
După cum se observă, pe baza electronilor transferaţi se stabilesc şi coeficienţii stoechiometrici ai unei reacţii
redox.
Exemple:
Să se stabilească coeficienţii următoarelor reacţii redox:
 1.5.2. Potenţialul redox

A. Generalităţi

Tendinţa oxidanţilor sau a reducătorilor de a accepta sau de a ceda electroni este diferită,
fiind funcţie de structura electronică a acestora.
Pentru aprecierea cantitativă a capacităţii (puterii) oxidante sau reducătoare a unui cuplu
redox se utilizează mărimea numită potenţial redox.
Fie sistemul redox: 𝐨𝐱 + 𝐧ē ↔ 𝐫𝐞𝐝. Dacă în soluţia sa se introduce un electrod inert de
platină, datorită schimbului continuu de electroni între electrod şi soluţie, se stabileşte o diferenţă
de potenţial a cărei valoare este definită prin relaţia lui NERNST:

RT [ox]
E= E 0ox /red + ln
nF [red]
(1.61)
La temperatura standard de 25°C (T=273,15 + 25 = 298,15 K), dacă se înlocuiesc valorile
2,303𝑅𝑇
constantelor R şi F şi se trece la logaritmi zecimali, 𝐹 = 0,059; astfel încât relaţia lui
Nernst devine:
0,059 [ox]
E = E0 + lg
n ሾredሿ
(1.62)

Seminificaţia termenilor din relaţia lui Nernst poate fi sistematizată astfel:

 De exemplu, sistemul oxido-reducător Fe3+ + 1ē = Fe2+ este caracterizat prin
potenţialul redox:
0 0,059 [Fe3+ ]
E = EFe 3+ /Fe 2+ + lg
1 ሾFe2+ ሿ
(1.63)
În cazul sistemelor redox la a căror transformare participă şi ionii de hidrogen:
q
ox + nē + qH + ↔ red + H2 O
2
(1.64)
relaţia lui Nernst ia forma:
0 0,059 [ox]
E = EFe 3+ /Fe 2+ + lg [H + ]q
n ሾredሿ
(1.65)
Astfel, pentru descrierea cuplului Cr2 O72− + 6ē + 14H + ↔ 2Cr 3+ + 7H2 O, se recurge la
un potenţial redox a cărui expresie este:

0 0,059 [Cr2 O72− ]

E = ECr 2− /2Cr 3+ + lg [H + ]14
2O 7 6 ሾCr 3+ ሿ
(1.66)
 Potenţialul redox este o mărime a cărei valoare nu poate fi determinată în mod absolut.
Experimental, se poate măsura numai valoarea relativă a acestuia, reprezentând diferenţa de
potenţial (tensiunea electromotoare, t.e.m.) a unor celule electrochimice formate prin asocierea
unui electrod indicator de platină cufundat în soluţia cuplului redox cu un electrod etalon, de
referinţă. Ca electrod de referinţă se utilizează electrodul normal de hidrogen, ENH, al cărui
potenţial este, prin convenţie, egal cu zero. Electrodul normal de hidrogen este constituit dintr-o
placă de platină platinată imersată într-o soluţie în care concentraţia ionilor de hidrogen este 1N
şi care este saturată, prin barbotare, cu hidrogen molecular la presiunea de 1atm şi funcţioneză pe
baza reacţiei: H2 − 2ē ↔ 2H + . Electrodul normal de hidrogen se reprezintă schematic prin lanţul
electrochimic: Pt, H2 ሺ1atmሻ| H + ሺ1Nሻ.
Potenţialul acestui electrod este:
0 0,059 [H + ]2
E = E2H + /H 2 + lg
2 ൣPH 2 ൧
(1.67)
Dacă ሾH + ሿ= 1N, iar PH 2 = 1atm, potenţialul electrodului normal de hidrogen devine:
E=E0=0.
Conform relaţiei lui Nernst, dacă electrodul inert de platină este introdus într-o soluţie în
care [ox]=[red], atunci în raport cu electrodul normal de hidrogen se măsoară E=E0, E0 fiind
potenţialul redox standard.
Definit ca o mărime constantă corespunzătoare cazului în care concentraţiile celor două
forme ale unui cuplu redox sunt egale, potenţialul redox standard coracterizează tăria oxidanţilor
şi reducătorilor astfel:
 valori E0 > 0 indică un oxidant mai puternic decât H+;
 valori E0 < 0 definesc un reducător mai puternic decât H2
 B. Potenţialul redox al sistemelor biochimice

Este de notorietate faptul că, în interiorul celulelor vii, metabolizarea materiei nutrtive se
realizează prin intermediul unor enzime (dehidraze) care funcţionează ca transportori
intermediari ai hidrogenului de pe un donor (forma redusă) pe un acceptor (forma oxidată) a
sistemelor biochimice redox. În acelaşi timp, sistemul citocromic transformă oxigenul in oxigen
activ.
Desfăşurarea acestor procese metabolice din organismele vii este guvernată de potenţilele
redox ale sistemelor biochimice.

Tabelul 1.10. Caracterizarea afinităţii pentru electroni a unor compuşi de importanţă biochimică prin valorile
potenţialelor redox (pH=7)

Compusul Temperatura, Potenţialul Compusul Temperatura, Potenţialul

biochimic °C redox, V biochimic °C redox, V
Adrenalina 30 +0,38 Cistina 25 -0,14
Citocromul a 20 +0,29 Piruval 25 -0,14
Citocromul c 25 +0,26 FAD 35 -0,18
Tionina 30 +0,06 Hem 20 -0,23
Glutationul 25 +0,04 NAD 30 -0,28
Hidrogenul 25 0,000 Safranina 30 -0,29
Luciferina 18 -0,05
 1.5.3. rH-ul sistemelor biochimice

Cunoaşterea modului în care acţionează sisteele biochimice individuale şi studierea

mecanismelor de interacţiune dintre ele a impus caracterizarea lor şi printr-o altă mărime, notată
rH2 (sau rH). Prin analogie cu pH-ul, rH2-ul se defineşte ca logaritmul yecimal cu semn schimbat
al concentraţiei hidrogenului molecular, [H2], sau a presiunii parţiale a acestuia, pH 2 :
rH2 = lgሾH2 ሿ= − lg pH 2
Corelaţia dintre rH şi pH se defineşte prin luarea în consideraţie a echilibrului redox 𝐻2 −
2ē ↔ 2H+ şi a potenţialului redox al unui electrod de hidgrogen, E h, pe suprafaţa căruia se
stabileşte acest echilibru. În aceste condiţii, rH2 -ul unui mediu biochimic depinde de pH-ul
acestuia conform relaţiei:
Eh
rH2 = + 2pH
0,029
Valorile rH2 -ului (la pH=7), caracteristice unor substanţe implicate în procesele biochimice
din organismele vii sunt prezentate în tabelul 1.11 şi pot fi interpretate astfel:
 cu cât rH-ul are o valoare mai mică, cu atât compusul biochimic respectiv are un caracter
reducător mai accentuat. De exemplu, acidul ascorbic (rH2 = 18) exercită acţiune reducătoare
asupra substanţelor cu valori ale rH2 -ului mai mari (citocromul a - rH2 = 23,8; citocromul c-
rH=22,7) şi respectiv oxidantă asupra sistemelor cărora le sunt caracteristice rH-uri mai
mici (glutation-rH=15,4; cistina-rH=9,3; codehidraza- rH2 = 5).
 Tabelul 1.11.Valorile rH2 − ului unor substanţe de importanţă biochimică

Substanţa Temperatura, 𝒓𝑯𝟐 Substanţa Temperatura, 𝒓𝑯𝟐

°C °C
Adrenalina 30 26,3 Luciferina 18 12,3
Citocromul a 20 23,8 Ferment 25 12,0
galben
Chinhidrona 25 23,5 Cistină 25 9,3
Citocromul c 25 22,7 Piruvat 35 8,2
Vitamina C 25 18,0 FAD 20 7,8
Tionina 30 16,0 Hem 30 6,4
Glutationul 25 15,4 Codehidraza 25 5,0
I
Hidrogenul 25 14,0 NAD 30 4,8
Safranina 30 4,0

 in cadrul celulelor vii, reolul de trasportori intermediari ai hidrogenului de pe un donor pe un

acceptor este îndeplinit numai de anumite sisteme biochimice, în ordinea crescătoare a
valorilor caracteristice al rH2 -ului;
 celulele care trăiesc în anaerobioză au valorile ale rH2 -ului, determinate de caracterul oxido-
reducător al sistemelor biochimice pe care le conţin şi care tind spre zero. Celulele care trăiesc
în aerobioză se caracterizează prin existenţa unor sisteme redox cu valori ale rH-ului cuprinse
în intervalul 6 – 20.
 1.5.4. Sisteme tampon redox

Soluţiile sistemelor redox, care au capacitatea lor de a se opune variaţiilor semnificative ale
potenţialului redox la adăugarea de oxidanţi sau de reducători se numesc soluţii tampon oxido-
reducătoare (redox).
Pentru a putea anihila efectul adaosului de oxidant sau de reducător asupra potenţialului
redox, o soluţie tampon redox trebuie să conţină atât:
 reducător, care să furnizeze electroni oxidantului care se adaugă;
 oxidant, care să accepte electroni de la reducătorul adăugat.
În acest context, toate soluţiile cuplurilor redox reversibile pot acţiona ca soluţii tampon
oxido-reducătoare. De exemplu, sunt soluţii tampon redox soluţiile în a căror compoziţie intră
ioni de Fe2+ şi Fe3+, Sn2+ şi Sn4- sau Cu- şi Cu2-.
La nivel celular, o cerinţă vitală este menşinerea potenţialului redox şi implicit a rH2 -ului
mediilor biochimice la valori sensibil constante şi optime pentru desfăşurarea proceselor
metabolice.
Protejarea întregii activităţi a celulelor vii este asigurată de prezenţa unor sisteme biochimice
tampon redox.
Exemple:
 sistemul cisteină (donorul de hidrogen)/cistină (acceptorul de hidrogen) ocupă o
poziţie cheie în procesele de oxido-reducere celulară (respiraţie):
  glutationul, o tripeptidă provenită din acid glutamic, cisteină şi glicocol ester un
trasportor intermediar al hidrogenului în diverse procese redox din organismele vii,
datorită abilităţii sale de a trece din forma redusă în cea oxidată şi invers:

1.6. Echilibre cu formare de combinaţii complexe

Combinaţiile complexe sunt combinaţii complexe a căror formare se bazează pe unirea mai
multor ioni şi molecule neuter prin legături coordinative.
O combinaţie complexă presupune existenţa a două tipuri de specii chimice:
 specia chimică generatoare de coplex sau ionul (atomul) central. Este un acceptor de
electroni (un ion metalic= care are tendinţa de a realiza o configuraţie electronică
stabilă pe stratul electronic exterior;
 specia chimică donoare de electroni, care posedând cel puţin o pereche de electroni
neparticipanţi la elementul cel mai electronegativ din constituţia sa este susceptibilă de
a coordina ionul central. Aceasta se numeşte ligand (adend) şi poate fi de natură
anorganică sau organică. Un ligand care conţine o singură pereche de electroni
neparticipanţi (cum este de exemplu molecula de amoniac, NH3) se numeşte
monodentat. Liganzii cu structură mai complex şi care conţin mai multe perechi de
electroni neparticipanţi (de tipul etilenaminei, H2N-CH2-CH2-NH2) care le conferă
capacitatea de a forma mai multe legături coordinative cu ionul central poartă
denumirea de polidentanţi.
Dacă se notează cu M ionul central şi cu L ligandul şi se neglijează sarcinile acestora, o
reacţie de complexare se poare reprezenta prin următorul echilibru:
M+nL↔MLn
Numărul liganzilor din complexul format, n, se numeşte număr (indice) de cordinaţie. În mod
uzual, valorile indicelui de coordinaţie sunt 4 şi 6; în cazri rare, acestea pot fi 2, 3 sau 8.
Clasificarea combinaţiilor coplexe se poate face în funţie mai multe criterii, după cum
urmează:
  sarcina complexului, diferenţiază între:
- complecşi neutri (Fe(SCN)3 ; Hg(CN)2);
- complecşi anionici ([AgCl4]3-; [BiI4]-);
- complecşi cationici ([Ag(NH3)2]- ; [Cu(NH3)4]2+)
 pe baza numărului de ioni centrali, există următoarele tipuri de combinaţii complexe:
 mononucleare (care conţin un singur generator de complex)
([Zn(NH3)4]2+; [Co(CN)6]3-);
 polinucleare (care au mai mulţi ioni centrali legaţi între ei prin punţi de legătură)
([Fe3(CH3COO)6(OH)2]+; [Ag2I3]-)
 în conformitate cu modul de combinare, se disting:
o complecşi de adiţie – formaţi prin unirea simplă a moleculelor neionizabile sau
ionizabile
(HCl + AuCl3↔ H[AuCl4])
o complecşi de interpunere – în care liganzii separă cationul de anionul altei sări
(CuSO4 + 4NH3 ↔ [Cu(NH3)4]SO4)
o chelaţi – complcşi cu liganzi organici şi structură ciclică (ionul metalic patricipă la
închiderea unui heterociclu de 5 sau 6 atomi)
Cea mai importantă caracteristică a unei combinaţii complexe este stabilitatea ei, care
reprezintă o măsură directă a tăriei legăturilor dintre ionul central şi liganzi.
În soluţia unui sistem ion metalic – ligand, complecşii se formeayă în trepte. Constantele de
echilibru ale reacţiilor succesive sau totale de formare constituie un crtiteriu cantitativ de
evaluare a stabilităţii combinaţiilor complexe (vezi tabelul 1.12).
Stabilitatea combinaţiilor complexe depinde de:
 natura reactanţilor
 condiţiile experimentale (pH-ul soluţiei, tăria ionică, natura solventului, prezenţa altor
ioni care pot acţiona asupra speciilor complexului)
Dependenţa dintre stabilitatea complecşilor şi factorii de mediu este exprimată cantitativ prin
intermediul constantelor condiţionale sau aparente de stabilitate – constante de stabilitate în
condiţii reale.
Printre combinaţiile complexe de importanţă biochimică se pot enumera:
- hemoglobina, a cărei funcţie fiziologică este de a transporta oxigenul de la plămâni la
ţesuturi, se compune dintr-o proteină cu masă moleculară foarte mare, globina, unită de
colorantul propriu-zis, hemul, de care este legat coordinativ un atom de fier (II):

- citocromii şi fermentul respirator, care îndeplinesc rolul de enzime oxido-reducătoare,

sunt complecşi ai fierului
- clorofila, care joacă un rol extrem de important în lumea vegetală este un complex al
magneziului în care ligandul este o moleculă organică foarte complicată.
 1.7. Echilibre de precipitare

Precipitarea reprezintă reacţia chimică de transformare a unei substanţe solubile întro-o formă
greu solubilă (denumită precipitat). De exemplu, reacţia de echilibru (1.71) dintre sarea MX şi
reactivul precipitant BA se soldeză cu formarea precipitatului MA:
(M+ + X-) + (B+ + A-) = MA + (B+ + X-)
(1.71)
Tabelul 1.12. Mărimi care descriu stabilitatea combinaţiilor complexe

Asupra gradului de producer a unei reacţii de precipitare îşi pun amprenta următorii
parametri:
 Solubilitatea molară a unui precipitat, S, este măsura numărului de moli care se
dizolvă, la o temperatură dată, întru-un litru de soluţie saturată a acestuia;
 Produsul de solubilitate (Ks) al unei combinaţii greu solubile în soluţie saturată este
egal cu produsul concentraţiilor ionilor săi, la puteri corespunzătoare coeficienţilor
stoechiometrici ai echilibrului de disociere respectiv. Astfel, în cazul unui precipitat de
tip MmAn, oricât de greu solubil ar fi, o mică parte din acesta este dizolvată şi disociată
în ioni, conform echilibrului:
 MmAn(solid) ↔ MmAn(soluţie) ↔ Mn++nAm-
DIZOLVARE DISOCIERE (1.72)

expresia produsului de solubilitate este dată de relaţia:

KS=[Mn+]m ∙[Am-]n
(1.73)
De exemplu, expresiile matematice care definesc produsele de solubilitate ale unor
combinaţii greu solubile sunt de forma:

Precipitatul Formula chimică Echilibrul de disociere Relaţia de definiţie a KS

Clorura de argint AgCl AgCl ↔ Ag+ + Cl- KS = [Ag+] ∙[Cl-]
Sulfatul de bariu BaSO4 BaSO4 ↔ Ba2+ + SO42- KS = [Ba2+] ∙[SO42-]
Fluorura de calciu CaF2 CaF2 ↔ Ca2+ + 2F- KS = [Ca2+] ∙[F-]2
Fosfatul de plumb Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2 ↔ 3Pb2+ + 2PO43- KS = [Pb2+]3 ∙[PO43-]2
Sulfura de argint Ag2S Ag2S ↔ 2Ag+ + S2- KS = [Ag+]2 ∙[S2-]

La o temperatură dată, produsul de solubilitate este o mărime constantă şi caracteristică

fiecărui precipitat.
Pentru deducerea relaţiei de dependenţă S – Ks, în produdul de solubilitate, concentraţiile la
echilibru (în moli/L) ale ionilor unui precipitat în soluţie saturată se exprimă în funcţie de
solubilitatea lor molară. Pentru cazul în care la echilibru participă S moli precipitat M mAn,
concentraţiile ionilor corespunzători, în soluţie saturată, la echilbru, vor fi:
[Mn+] = Ms; [Am-] = nS
KS = (mS)m ∙(nS)n = mm ∙nn ∙Sm+n
(1.74)
de unde rezultă:
m +n KS
S= ඨ
mm ∙ n n
(1.75)
 Valoarea produsului de solubilitate permite aprecierea condiţiilor în care se poate forma
un precipitat. Astfel dacă:
 [Mn+]m ∙[Am-]n ≥ KS
 [Mn+] ∙[Am-]n < KS
Acţiunea factorior care influenţează reacţiile de precipitare se poate manifesta atît asupra
stării solide cât şi asupra ionilor din soluţie.
Asupra fazei solide acţionează preponderent următorii factori:
 fenomenul de polimorfism;
 gradul de hidratare;
 temperatura;
 adsorbţia unor ioni străini;
 reacţia chimică.
Cei mai importanţi factori a căror acţiune se exercită asupra fazei lichide sunt:
 tipul şi concentraţia ionilor din soluţie;
 pH-ul;
 procesele de hidroliză, complexare, redox;
 natura solventului;
Impactul acestor factor asupra solubilităţii precipitatelor este sistematizat în tabelul 1.13.
 Tabelul 1.13. Factorii cu influenţă majoră îb reacţiile de precipitare

Factorul Definire Modul de acţiune

Excesul de precipitat (efectul
ionului comun)
Tăria ionică (efectul salin)
pH-ul
Influenţa manifestată asupra Determină scăderea
proceselor de precipitare de solubilităţii precipitatului.
prezenţa în faza soluţie a
unui exces (faţă de
compoziţia stoechiometrică a
compusului greu solubil) al
unuia dintre ionii componenţi
ai precipitatului.
Acţiunea ionilor străini, Se manifestă prin creşterea
inerţi asupra solubilităţii solubilităţii precipitateor.
precipitatelor.
Influenţa concentraţiei Creşterea solubilităţii
ionilor de hidrogen asupra precipitatelor.
precipitatelor care sunt săruri
ale acizilor slabi (sulfuri,
oxalaţi) şi hidroxizi.
 1.8. Bibliografie

1. D. Harvey, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill, Boston, 2000.

2. R. Kellner, J. M. Mermet, M. Otto, H. M. Widner (Eds), Analytical Chemistry, Willey –
VCH, Weinheim, 1998.
3. C. Luca, Al. Duca, Al. I. Crişan, Chimie analitică şi analiză instrumentală, Editura Didactică
şi pedagogică, Bucureşti, 1983.
4. V. Magearu, Controlul analitic al proceselor biotehnologice, Editura Tehnică, Bucureşti,
1988.
5. M. Pele, Chimie analitică şi analiză instrumentală, MatrixRom, Bucureşti, 1999.
6. D.J. Pietrzyk, C. W. Frank, Chimie analitică, Editura Tehnică, Bucureţti, 1989.
7. L. Tofan, D. Şuteu, Chimie analitică I, curs litografiat, Universitatea Tehnică „Gh. Asachi”,
Iaşi, 2001,
 Cap. II.
ANALIZA CHIMICĂ
 II.1. Definitia și clasificarea metodelor de analiză chimică
 II.2. Metodologia analizei chimice
 II.3. Validarea metodelor de analiză
 II.4. Bibliografie

Într-o accepțiune de maximă generalitate, obiectivul principal al biochimiei
analitice îl reprezintă elaborarea teoriilor și metodelor de analiză calitativă și
cantitativă pentru stabilirea compozitiei și structurii materialelor biologice. Astfel,
este bine cunoscută larga aplicabilitate a metodelor de analiză chimică în medicină
și toxicologie judiciară, în activitatea inspectoratelor sanitare, în institutele de
sănătate publică, în laboratoarele biochimice, etc. Dincolo de conceptele teoretice
discutate în literatură, specialiști din domeniul biochimiei au nevoie de strategii
experimentale și metode de studiu care să raspundă unor scopuri concrete, capabile
să furizeze informații cu un grad mare de relevanță, concordante cu natura probei
investigate și obiectivele impuse de un anumit tip de studiu.
 II.1. Definiția și clasificarea metodelor de analiză chimică
Analiza chimică are ca obiectiv stabilirea compoziției calitative și cantitative
a materialului de analizat, și poate fi descrisă ca o succesiune a două etape distincte:
analiza calitativă
analiza cantitativă.
Analiza calitativă serveste la decelarea constituenților (elemente, grupuri de elemente,
grupări funcționale) care fac parte din cornponența materialului de analizat, iar prin
analiza cantitativă se determină proporțiile în care acești constituenți se găsesc in
materialul supus analizei. Analiza cantitativă nu poate fi realizată fără o cunoaștere exactă a
componenților materialului de analizat, ca fiind întotdeauna precedată de analiza calitativă.
Tot analiza calitativă poate da și unele informații orientative, dar utile pentru analiza
cantitativă care determină alegerea metodelor de analiză.
Analiza chimică se execută pe probe, care reprezintă cantități de mărime variabilă,
separate din întreaga masă de material supus analizei, astfel încât rezultatul ei să
reflecte cu un grad cât mai mare de fidelitate compoziția exactă a acesiuia. Realizarea unei
analize chimice necesită în general cunoașterea însușirilor fizico-chimice a componenților
materialului, a legăturii dintre însușirile fizice și cele chimice, care de obicei se traduc printr-o
anumită comportare a acestora. Metodele analizei chimice pot fi clasificate după mai multe
criterii, mai mult sau mai puțin particulare, în funcție de scopul urmărit, procesele care stau la
baza metodei, sensibilitate, etc. În figura II. I este redată o clasificare a metodelor de analiză
bazată pe considerente de ordin metodologic, iar in tabelul II.1 este prezentată o clasificare
uzuală a metodelor de analiză în funcție de scopul urmărit și de principalele procese și mecanisme
care stau la baza diferitelor grupuri de metode.
 Metodele de identificare sunt
reacții analitice de diverse tipuri (cu
schimb de protoni, redox, cu formare de
precipitate, cu formare de combinatii
complexe), care se pot executa in soluție
sau chiar in topitură, pe hârtie
cromatografică sau pe lamă de
microscop. Aceste reacții pun în
evidență unele proprietăți ale
componentului de analizat, și trebuie să
îndeplinească trei condiții principale: (i)
să fie perceptibile (adică, să evidențieze
schimbarea unei proprietăți; de ex:
schimbarea culorii soluției; formarea unui
precipitat, sau degajarea unui gaz); (ii) să
fie selective (gradul de selectivitate al
unei reacții este cu atât mai mare cu
cât numărul componenților de analizat
care dau reacție pozitivă este mai mic); (iii)
sa fie sensibilă (adică, să permită
identificarea unei cantități cât mai mici de
component de analizat).
Tot pentru identificare se pot utiliza și unele
metode instrumentale: spectrometria de UV-
VIS și IR, spectrometria de masă,
spectrometria de rezonanță magnetică
(RMN), dar care datorită aplicațiilor
deosebit de importante pe care le au în
analiza cantitativă au fost incluse în
categoria metodelor de determinare.
 În ultimii ani o largă utilizare în analiza calitativă au căpătat metodele spot de identificare și determinare
semicantitativă a substanțelor organice și anorganice. Acestea constau in executarea unor reacții analitice deosebit de
sensibile pe hârtie cromatografică, în microtuburi de testare sau pe alte suporturi.
Metodele de separare au ca scop general fracționarea unui amestec omogen sau eterogen în părțile sale
componente ( figura II. 2). De cele mai multe ori separarea este considerată ca fiind un pretratament aplicat probei de
analizat cu scopul de a elimina din proba supusă analizei, componenții care pot provoca interferențe pe parcursul
analizei. Pe lângă metodele de separare care au la bază echilibrele termodinamice și efectele cinetice, există și o
varietate relativ largă de metode fizice și fizico-chimice de separare ( vezi tabelul II.1).
În cazul ideal, separarea a doi componenți 1 si 2 dintr-un amestec constă în izolarea lui 1 Intr-o fază unde
componentul 2 este exclus și transferarea lui 2 într-o fază care îl exclude pe 1. Un astfel de proces de separare include
trei etape: (i) în prima etapă se pleacă, în majoritatea cazurilor, de la un sistem omogen, la care se ajunge prin aplicarea
unui procedeu fizic sau chimic (topire solubilizare, etc.) asupra probei de analizat; (ii) în cea de-a doua etapă are loc
obținerea unui sistem eterogen în care cei 2 componenți se distribuie preferențial, și care se poate realiza prin:adaugarea
unui solvent nemiscibil, creșterea temperaturii până la volatilizarea unui component, adăugarea unui agent de
precipitare, etc., (iii) ăn etapa a3-a se urmărește separarea fazelor sistemului eterogen și izolarea acestora prin
procedeefizice, mecanice sau uneori chiar chimice.
Foarte rar se poate realiza o separare cantitativă a componentelor unui amestec ăntr-o singură etapă. În majoritatea
cazurilor o separare acceptabilă din punct de vedere analitic se obtine utilizând o succesiune bine determinată de
procedee de separare.
Metodele de determinare cuprind la rândul lor două mari categorii de metode de analiză: metodele chimice și
metodele instrumentale.
Metodele chimice (gravimetria, volumetria, analiza de gaze sau gaz volumetria – vezi tabelul II.1) se bazează pe
măsurarea sirectă a masei și respectiv volumului, și presupune efectuarea unor operații simple utilizând sticlăria
obișnuită de laborator și a unor aparate și dispozitive simple, Aceste metode sunt relativ independente, nu necesită o
etalonare, deoarece raportul dintre „semnalul analitic măsurat” și „masa/volum” este precis cunoscut. Din acest punct de
vedere, metodele chimice sunt considerate metode absolute.
Metodele instrumentale se bazează pe măsurarea unor proprietăți corelate direct sau indirect cu compoziția sau
structura chimică și presupun utilizarea unor echipamente complexe bazate pe principii optice, electrice sau termice. În
acest caz raportul dintre „semnalul analitic măsurat”/„masă (volum)” se determină cuajutorul unor aparate care necesită
o etalonare prealabilă.
 A. METODE DE IDENTIFICARE
Reacții analitice: cu schimb de protoni, redox, cu formare de precipitate, cu formare de combinații
complexe.
B. METODE DE SEPARARE ȘI CONCENTRARE
Procese mecanice Procese fizice Procese chimice
Cernere Cromatografie solid-gaz; solid-lichid; lichid- Precipitarea selectivă
Filtrare,ultrafiltrare lichid Solubilizarea selectivă
Sedimentare Extracție lichid-lichid Electrogravimetrie
Dializă Electroforeză Schimb ionic
Cromatografie de excludere Dializă Mascare
Sublimare
Cristalizare fractionată
Topire zonală
Separare magnetică

C. METODE DE DETERMINARE
Metode chimice Metode instrumentale
-prin reacții acido-bazice în mediu apos sau neapos;  Metode optice:spectrometria de emisie /absorbție atomică; spectrometria de
-prin reacții redox: absorbție atomică; spectrometria de absorbție moleculară (UV, VIS, IR),
• permanganometrice; spectrometria de fluorescență, etc.
• bicromatometrice;  Metode electroanalitice: pH-metrice; potențiometrice; polarografice;
• iodometrice; electrogravimetrice; conductometrice; volatmetrice; electrocromatografice,etc
• cerimetrice;  Metode cromatografice: pe hârtie; în strat subțire; pe coloană (LP,HPLC);
-prin reacții de precipitare; gazcromatografie, etc.
• argentometrice;  Metode magnetice: spectrometria de rezonanță magnetică nucleară (RMN);
-prin reacții cu formare de combinații complexe; spectrometria de rezonanță magnetică de spin (RES), etc.
• complexonometrice cu liganzi anorganici;  Fragmentometrice: spectrometria de masă
• chelatometrice;  Difractometrice: difractometria cu raze X; cu neutroni rapizi; cu electroni; etc.
-prin reacții cu formare de compuși nedisociați;  Termice: termogravimetria (TG); termogravimetria derivată (DTG); analiza
• mercurimetrice; termică diferențială (ATD)
 Radiometrice: diluție izotopică; activare cu neutroni; etc.
 Metode combinate:cromatografia de gaz-spectrometria de masă (GC-MS);
spectrometria de UV-VIS; extracție-spectrometrie de UV-VIS; etc.

Gaz-volumetrice
Tabelul II.1. Clasificarea generală a metodelor de analiză în funcție de scopul urmărit și principalele procese și mecanisme care stau la baza lor.
Figura II.2. Schema generală a unui proces de separare.
Metode Avantaje
Chimice -procese simple și precise;
-echipamente simple și ieftine;
-în majoritatea lor au la bază
măsurători „absolute”
Instrumentale -determinări rapide;
-sensibilitate ridicată;
-rezultate sigure;
-utilizează cantități mici de probă;
-pot fi investigate amestecuri
complexe;
Tabelul II.2 Avantaje și dezavantajele metodelor analitice.
Dezavantaje
-flexibilitate mică;
-timp mare de analiză;
-precizie moderată;
-specificitatea este uneori mică;
-necesită o etalonare prealabilă și
continuă a aparaturii;
-sensibilitatea și precizia depind de
aparatura și metoda utilizată la
etalonare;
-costul inițial și de întreținere al
aparaturii este ridicat;
-posibilitatea de lucru într-un interval
limitat de concentrații;
 Spre deosebire de metodele chimice, metodele instrumentale au un caracter relativ,au o viteză mare de
execuție și posibilități de înregistrare automată, astfel încât ele pot fi aplicate la controlul analitic continuu și automat a
sistemelor analitice. Deseori, la utilizarea metodelor instrumentale nu este necesară o prelucrare chimică a materialului
supus analizei, însă este indispensabilă realizarea prealabilă a unor seturi de etaloane sintetice, cu un conținut exact
cunoscut a elementelor de determinat, cu care să se poată face compararea.
Principalele avantaje și dezavantaje ale utilizării metodelor chimice și a celor intrumentale sunt
prezentate în tabelul II.2.
Un alt criteriu utilizat pentru clasificarea metodelor de analiză este în funcție de cantitatea relativă a
componenților din probă (figurile II.3,4), deși de multe ori cantitatea relativă a unui component într-o probă nu reprezintă
un indiciu pentru importanța chimică sau biochimică a acestuia.
 Dacă pentru determinarea macrocomponenților se pot utiliza cu rezultate sigure metode
chimice de analiză, în cazul microcomponenților determinările analitice impun aplicarea unor metode
care să poată furniza rezultate precise la analiza unor probe cu un număr mare de componenți și un
grad mare de complexitate. În aceste cazuri sunt recomandate metodele instrumentale care pot furniza
rezultatele cele mai bune.
 Nu în ultimul rând, în funcție de scopul lor practic, oarecum independent de principiile care stau
la baza lor, metodele de analiză pot fi:
Metode de marcare – sunt caracterizate de un grad mare de precizie și sunt utilizate pentru
stabilirea compozitiei chimice a materialelor folosite ca materii prime sau a produselor acestora.
Precizia ridicată a acestor metode este asigurată prin efectuarea unor operații suplimentare, care însă
duc la creșterea timpului de analiză.
Metode rapide – sunt aplicate pentru controlul proceselor tehnologice, în fazele principale de
lucru. Aceste metode au o precizie mai mică, dar suficientă pentru a asigura calitatea cerută și o
utilizare cât mai eficientă a materiilor prime.
Metode de control – se utilizează atunci când este necesară verificarea unor rezultate obținute cu
ajutorul metodelor de marcare. Aceste metode sunt de fapt metode de marcare cu o precizie mai
rdicată, datorită precauțiilor de execuție și a unor operații suplimentare care au rolul de a înlătura
erorile accidentale sistematice.
Metode de arbitraj – se aplică în cazul contestațiilor și a litigiilor asupra calității unor materii
prime, produse derivate sau finite.În general, aceste metode sunt standardizate, iar analizele se execută
în laboratoare diferite sau de un alt analist cu calificare superioară.
 II.2. Metodologia analizei chimice
Efectuarea analizei unui material biochimic, prin metode chimice sau instrumentale, necesită
cunoașterea proprietăților fizice și chimice ale acestuia și a legilor fundamentale ale chimiei și
biochimiei. Indiferent de domeniul în care sunt aplicate metodele analitice, corelarea principiilor
teoretice cu date experimentale are o importanță deosebită deoarece numai în acest mod se poate
obține semnificația concretă a rezultatelor experimentale. Aceste corelații sunt fundamental necesare,
dar nu și suficiente. Caracterizarea materialelor biochimice necesită studii suplimentare privind
„istoria” biologică și biochimică a materialului analizat (figura II.5), deoarece în interpretarea
rezultatelor o importanță deosebită o are cunoașterea provenienței acestuia.
 Din această cauză, în ultima vreme tot mai multe opinii susțin necesitatea
introducerii termenului de „strategie experimentală” sau „strategie a metodologiei
analitice”, care desemnează totalitatea etapelor necesare pentru realizarea unei analize
chimice.
Determinarea compoziției și structurii materialelor biochimice necesită în
majoritatea cazurilor elaborarea unor strategii experimentale complexe, în care etapele
de lucru trebuie să țină cont de scopul urmărit, de complexitatea probei studiate, de
costul și utilitatea studiului. Toate aceste considerente fac ca dormularea unui algoritm
general cu o largă aplicabilitate să fie dificil de formulat. În tabelul II.3 sunt prezentate
etapele generale ale unei analize chimice.
Prima etapă a unei analize chimice o reprezintă stabilirea clară a obiectivelor
urmărite pe baza cărora se poate elabora o strategie experimentală optimă pentru
rezolvarea corectă a problemei analitice. Această etapă trebuie întotdeauna urmată de
precizarea unor factori, cum sunt: (a) domeniul de concentrație – deoarece am văzut că
metodele chimice pot fi folosite cu succes în determinarea macrocomponenților, în
timp ce pentru microcomponenți este necesară utilizarea metodelor instrumentale; (b)
precizia și sensibilitatea cerută – cu cât proba de analizat este mai mică, cu atât metoda
de analiză trebuie să fie mai sensibilă; (c) selectivitatea – în cazul probelor complexe
este necesar ca metodele de analiză utilizate să fie selective; (d) rapiditatea,
disponibilitatea tehnică și costul analizei – sunt cerințe sirect corelate cu dotarea
tehnică a laboratorului unde se fac analizele și prezența unui personal calificat.
 În cazul analizelor biochimice este recomandată alegerea a două sau mai multe metode
care să se completeze reciproc și care să permită respectarea cât mai riguroasă a cerințelor.
O analiză cantitativă se bazează pe măsurarea unei proprietăti corelate, direct sau
indirect, cu cantitatea de component din proba supusă analizei. În condiții ideale, nici un alt
component al probei nu trebuie să contribuie la măsurătoarea efectivă, lucru destul de rar întâlnit în
practică.

Tabelul II.3 Etapele generale ale unei analize în cazul probelor biochimice

1. Alegerea procedurilor analitice:

(i). Condiții: -determinate de obiectivul studiului;
-determinate de natura probei de analizat;
(ii). Metode: -chimice;
-instrumentale;
(iii). Cerințe: -analitice (exactitate, acuratețe, precizie);
-rapiditate,cost, utilitate.

2. Prelevarea probelor și obținerea probei reprezentative

3. Pregătirea probei pentru analiză:
(i) Pretratamente:solubilizare, concentrare; eliminare interferențe,etc.
(ii) Etalonarea aparaturii;
(iii) Monitorizare.

4. Măsurătorile analitice propriu-zise

5. Prelucrarea datelor analitice și interpretarea rezultatelor

 Din această cauză, realizarea unei analize presupune parcurgerea mai multor etape, stabilite
riguros încă de la început, care pot fi grupate în patru grupe importante:
1.Prelevarea probei din materialul supus analizei;
2.Trecerea componentului de analizat într-o formă compatibilă pentru măsurare (sampling-ul);
3.Măsurarea propriu-zisă a semnalului analitic;
4.Prelucrarea și interpretarea rezultatelor.
Astfel, procesul de măsurare a unui semnal analitic corespunzător probei de analizat se poate
face numai după o serie de transformari și prelucrări (fizice, chimice sau mecanice) ale probei luate în
lucru.
 II.2.1. Prelevarea probelor pentru analiză
Pentru realizarea unei analize chimice nu se utilizează întreaga cantitate de material prelevată ci
numai o anumită parte din acesta. Cantitatea de material care este utilizată în vederea analizei se
numește probă de analizat, iar în figura II.6 este prezentat schematic modul de obținere al acestora
plecând de la materialul de analizat inițial. Mărimea și numărul probelor, precum și modul de
prelevare și pregătire al acestora depind de o serie de factori, cum sunt: mărimea lotului, natura
materialului de analizat, tipul și numărul analizelor ce trebuie efectuate în laborator, obiectivele
analizei, etc.
Întodeauna o probă este corespunzătoare pentru analiză dacă această este reprezentativă, adică
dacă respectă proportiile în care componentii sunt prezenți în materialul de analizat. Dacă acest
material este omogen, prelevarea probei nu constituie o problemă deosebită, indiferent de starea de
agregare a acestuia; practic pentru analiză se va lua o probă de mărime corespunzătoare. Dacă
materialul supus analizei este eterogen, pentru obținerea unor probe reprezentative sunt necesare
precauții suplimentare.
 În funcție de gradul de omogenitate al materialului inițial, prelevarea probelor de analizat se
poate face prin:
i.Extragerea la întâmplare a unor cantități de material omogen, din diferite părți ale întregului:
Extragerea materialului pentru probe după un plan statistic elaborat în prealabil (cazul materialelor
ii.
eterogene: pulberi, emulsii, suspensii, aerosoli, etc.);
iii.Colectarea probelor în mai multe etape (cazul aflate în curgere).
Prelevarea, pregătirea, manipularea și conservarea probelor necesare unei analize chimice se face
după standarde și normative bine stabilite, concordante cu natura, starea de agregare, cantitatea
acestora și obiectivele propuse de analiză.
II.2.2. Sampling-ul
Se realizează după o strategie stabilită în prealabil, în funcție de natura probei, obiectivele
analizei și dotările tehnice ale laboratorului, și are ca scop aducerea probei de analizat și dotările
tehnice ale laboratorului, și are ca scop aducerea probei de analizat într-o formă compatibilă cu metoda
utilizată pentru o anumită determinare.
În literatură, opiniile specialiștilor referitoare la semnificația termenului de „sampling” sunt
împărțite, principalul element de divergență fiind includerea alături de pregătirea probei și
pretratamentul aplicat acesteia și a operațiilor de prelevare a probelor. Indiferent însă de semnificația
atribuită sampling-ului trebuie avut in vedere faptul că această etapă influențează într-o masură
foarte mare relevanța analitică și semnificația rezultatelor obținute.
Realizarea unui sampling optim, presupune cunoașterea cât mai exactă a surselor de erori ce pot
interveni și a ponderii acestora. În general, operațiile incluse într-un sampling complet pot fi grupate
în trei categorii:
a) Sampling-ul primar – se efectuează pe teren, la locul de prelevare și include: prelevarea propriu-zisă, conservarea și
transportul probelor.
b) Sampling-ul secundar - include predominant operații de ordin mecanic, denumite generic operații de pregătire a
probei, și vizează refleectarea compoziției medii a materialului de analizat. În acest scop se folosesc operații de:
uscare(pentru eliminarea umidității), sfărâmare, mărunțire, cernere (în vederea obținerii unei granulații mai mici de
1 mm a materialului de analizat), omogenizare ( pentru realizarea unei distribuții granulometrice și compoziționale
uniforme a particulelor de material de analizat) și reducerea probei (vizează obținerea unei cantități de material care
trebuie să îndeplinească simultan două condiții: să fie minimă și compatibilă cu scopul analizei).
c) Sampling-ul terțiar – cuprinde operații de solubilizare, concentrarea analitului (specia de analizat) și eliminarea
interferențelor.
Solubilizarea – deși nu este întotdeauna necesară, multe din metodele de analiză presupun utilizarea probei sub
formă de soluție, motiv pentru care alegerea metodei și a agenților de solubilizare determină în mare măsură
rapiditatea și corectitudinea analizelor. Metodele uzuale de solubilizare sunt: (i) dizolvarea și dezagregarea pe
cale umedă - se poate realiza prin tratare cu solutii de acizi, baze, sau amestecuri de acizi sau baze, la
presiune normală sau sub presiune, la rece sau la cald; (ii) dezagregarea pe cale uscată - presupune topirea
probei cu fondanți (vezi tabelul II.4).
În funcție de natura probei și de scopul urmărit se poate recurge după caz la sonificarea probei, solubilizarea
parțială a anumitor componente din probă, solubilizări selective cu agenți chelatizanți și/sau schimb ionic, etc.
Concentrarea – este o operație necesară atunci când specia de analizat (analitul) se găsește în probă într-o
concentrație foarte mică, care nu poate fi sesizată de metodele de analiză. Acest inconvenient poate fi de cele mai
multe ori eliminat prin reducerea volumului de soluție în care a fost dizolvată proba, adică prin concentrare. În
funcție de natura probei, de tipul speciilor de analizat și gradul necesar de reducere, concentrarea se poate realiza
prin: (i) procedee fizice: evaporarea, distilare (simplă sau fracționată) etc; (ii) procedee chimice: schimb ionic,
extracție cu solvenți, etc.
Eliminarea interferențelor – deoarece o analiză cantitativă presupune măsurarea unei proprietăți corelate cu
cantitatea de component din proba supusă analizei, în condiții ideale nici un alt component din probă nu trebuie să
contribuie la măsurătoarea efectivă. Din această cauză, în etapa de pregătire a probei pentru analiză de multe ori
este necesară aplicarea unor tratamente care să diminueze sau să elimine interferențele celorlalți componenți în
proba de analizat.
 Tabelul II.4. Principalii agenți de solubilizare utilizați în analiza chimică

Probe anorganice Probe organice

Pe cale umedă Pe cale uscată Pe cale umedă Pe cale uscată
Apa distilată KHSO4 HNO3 O2
HCl 25% Na2CO3 H2SO4 Na2O2
HNO3 30% K2CO3 HclO4 Na
HClO4 70-72% Na2B4O7 HNO3 + HclO4 (1:1) K
H2SO4 98% Na2O2 HNO3 + H2O2
Apă regală KclO3 HCl + HclO4
(HCl:HNO3=3:1) KNO3 HNO3+H2SO4+H2O2
NaOH (KOH) 20-40%
Acizi organici
 În practică în funcție de natură componentului de analizat și de natura probei din care provine
acesta se pot aplica mai multe procedee de reducere sau eliminare a interferențelor:
1)Modificarea controlată a condițiilor de lucru (pH, forța ionică, potențial redox, temperatură, etc);
2)Modificarea stării de oxidare sau a formei de speciație a analitului și/sau a speciilor interferente din
proba de analizat;
3)Mascarea componenților interferenți prin transformarea acestora în combinații complexe stabile și
inactive în raport cu metoda de analiză utilizată (vezi tabelul III.5);
4)Separareacomponenților interferenți prin precipitare/ dizolvare selectivă, extracție cu solvenți sau
schimb ionic.
II.2.3. Măsurarea semnalului analitic
Procesul prin care se stabilește compoziția chimică, calitativă sau cantitativă, parțială sau totală,
a unei probe definește procesul analitic de măsură (figura II.7).
Procesul de măsurare a unei proprietăți fizico-chimice corespunzătoare probei de analizat
decurge numai după o serie de transformări și prelucrări a probei inițiale luate din materialul supus
analizei, care are rolul de a aduce proba de analizat într-o formă compatibilă cu procesul de măsurare.
Dacă alegerea metodei de analiză este greșită, atunci în urma procesului de măsurare fie semnalele
analitice obținute experimental sunt inexistente, fie acestea nu pot fi interpretate în raport cu proba
inițială. Din acest motiv, selecția metodei optime pentru un anumit studiu și calibrarea (etalonarea)
acesteia, reprezintă etape esențiale în analiza chimică.
 Tabelul II.5. Agenți de mascare utilizați pentru unele elemente esențiale în biochimie

Element Agent de mascare

Al Acetat; acetilacetonă; BF4- ; citrat; EDTA; C2O42-; F-; formiat; manitol; 2,3-
dimercaptopropanol; HO-; salicilat; sulfosalicilat; tartrat; trietanol-amină; tiron
Ca BF4- ; citrat; N,N-dihidroxietilglicină; F-; EDTA; fosfat; tartrat
Co Citrat; CN- ; dietilditiocarbamat; 2,3-dimercaptopropanol; dimetil-glioximă; etilendiamină;
EDTA; F-; glicină; H2O2; NH3; NO2; 1,10-fenantrolină; SCN-; tartrat.
Cu Acid ascorbic +KI; citrat; CN-; dietilditiocarbamat; 2,3-dimercaptopropanol; etilendiamină;
EDTA; glicină; hexacianocobalt (III); hidrazină; NH 2OH; HCl; NH3; 1,10-fenatrolină;
sulfosalicilat; tartrat
Fe Acetilacetonă; acid ascorbic; C2O42-; citrat; CN-; 2,3-dimercapto-propanol; EDTA; F-;
NH2OH HCl; NH3; HO-; oxină; 1,10-fenantrolină; 2,2′- dipiridil; fosfat; SCN -; acid
sulfanilic; sulfosalicilat; tartrat; acid tioglicolic; tiron; trietanolamină
Mg Citrat; C2O42-; acid ciclohexan- 1,2- diaminotetraacetic; N,N-dihidroxietilglicină; EDTA; F -;
glicol; hexametafosfat; HO-; P2O72-; trietanolamină
Ni Citrat; CN-; N,N-dihidroxietilglicină; EDTA; F-; dimetilglioximă; glicină; malonat; NH3;
1,10-fenatrolină; sulfosalicilat; tartrat; SCN -; acid tioglicolic; trietanolamină
Zn Citrat; SCN-; N,N-dihidroxietilglicină; 2,3-dimercaptopropanol; ditizonă; EDTA; F -;
Glicerol; glicol; ferocianură; NH3; HO-; tartrat; trietanolamină
 Indiferent de tipul metodei de analiză, aplicarea lor are în comun următoarele
caracteristici generale:
1)Condițiileexperimentale – trebuie să fie stabilite prin totalitatea parametrilor care
determină natura chimică și fizică a sistemului analitic studiat și a măsurătorilor ce
trebuie efectuate;
2)Semnalul de intrare – reprezintă perturbarea aplicată sistemului pentru obținerea unui
semnal caracteristic măsurabil;
3)Semnalul de ieșire (răspunsul) – totalitatea fenomenelor care au loc în sistem sub
acțiunea semnalului de intrare, iar când acesta nu este măsurabil, el este transformat
într-un semnal măsurabil cu ajutorul traductoarelor;
4)Alegerea semnalului de ieșire – pentru analizele cantitative se aleg numai acele
semnale care dau informațiile cele mai utile ( cu selectivitate și sensibilitate maximă),
pot fi măsurate rapid și pot fi interpretate teoretic.
Purtătorul informațiilor analitice rezultate din procesul de măsurare a unei
proprietăți fizico-chimice cu ajutorul unui instrument (aparat) analitic se numește
semnal analitic.
Figura II.7. Reprezentarea simplificată a unui proces analitic de măsură
 Purtătorul informațiilor analitice rezultate din procesul de măsurare a unei proprietăți
fizico-chimice cu ajutorul unui instrument (aparat) analitic se numește semnal analitic.
În general, pentru alegerea riguroasă a unui instrument analitic în raport cu un scop
analitic precizat trebuiesc avute în vedere următoarele: (i) raportul „semnal”/„zgomot de
fond” să fie optim; (ii) viteza de răspuns să fie cât mai mare; (iii) utilizarea unei aparaturi
cât mai simple, cu sensibilitatea și selectivitatea necesară scopului propus; (iv) să aibă
funcție de transfer liniară și cu pantă mare.
 II.2.3-1. Selecția metodei pentru analiză
Selecția unei metode analitice se realizează în funcție de o serie de condiții impuse pe
de o parte de obiectivele analizei și natura probei, iar pe de altă parte de cerințe analitice
(exactitatea, precizia, acuratețea, sensibilitatea, etc) și cele economice (costul, utilitatea,
rapiditatea, etc)
Din punct de vedere analitic, pentru alegerea unei metode trebuiesc precizate conditiile
de optim în raport cu natura probei de analizat a următorilor factori:
a) Acuratețea metodei – evaluată cel mai adesea prin deviația valorii măsurate față de
valoarea adevărată:
Deviația=│ – A│
unde: – media aritmetică a determinărilor experimentale; A – valoarea reală a mărimii
determinate.
b) Precizia metodei – poate fi determinată cu ajutorul parametrilor redați în tabelul II.6.
 c) sensibilitatea metodei (Si) – caracterizează modificarea răspunsului semnalului analitic produs de către un
instrument de analizat față de variația concentrației componentului de analizat.

Si  PCi( x )  dCid [ f (Ci )] (II.2)

 unde : P – mărimea măsurată ; x – parametru fizico-chimic ; Ci – concentrația componentului din proba de
analizat.

Tabelul II.6.
Parametrii
utilizați în
chimia analitică
pentru
evaluarea
preciziei unei
metode de
analiză.

unde : Xi – valoarea determinării experimentale ; X – media aritmetică a determinărilor experimentale;

n – numărul de determinări experimentale.
 După Feigl (1949), sensibilitatea unei metode analitice se poate
caracteriza prin două marimi : limita de detecție ( de recunoaștere)
și limita de diluție ( volumul maxim de soluție în care se poate
determina cantitatea de analit corespunzătoare limitei de detecție ).
Conform acestei accepțiuni, limita de detecție și limita de diluție
definesc o concentrație maximă la care un analit poate fi decelat
print-o metodă dată. Cu cât limita de detecție este mai mică și
limita de diluție este mai mare, cu atât metoda este mai sensibilă.
 Conform recomandării IUPAC, sensibilitatea metodelor analitice se
exprimă prin parametru D (sau pD = -logD), definit prin relația:
(II.3)
1
D  V  1016  mv
unde : V – limita de diluție (ml) – reprezintă volumul maxim
de soluție ce conține 1 g analit în care acesta mai poate fi
decelat; v - volumul de soluție utilizat la efectuarea
determinărilor; m – limita de detecție (µg).
În tabelul II.7. sunt prezentate comparativ cele mai
frecvente metode utilizate în analiza chimică în funcție de
sensibilitatea lor.
d) limita de detecție – reprezintă conținutul minim ce
poate fi decelat cu ajutorul unei metode date de analiză.
Astfel, limita de detecție este dată de valoarea concentrației
de analit determinabil, pentru care valoarea semnalului
analitic obținut ( Ymin) satisfice relația : Ymin ≥ σγ ; unde :
σγ – deviație standard ( vezi paragraful II.2.4-2.).
  Tabelul II.7. Compararea principalelor metode de
analiză în funcție de sensibilitatea lor.

e) domeniul de lucru - se estimează cel mai adesea

experimental și reprezintă domeniul de concentrație al analitului
în care răspunsul analitic este dat de o funcție liniară. Domeniul
de lucru arată practic între ce limite trebuie să se gasească
concentrația analitului în probă pentru ca rezultatele obținute cu
ajutorul unei metode de analiză date să fie exacte și precise.
 III.2.3-2. Etalonarea metodelor de analiză
 Etalonarea metodelor de analiză și a aparatelor analitice este o altă etapă
importantă în efectuarea determinărilor analitice. Metoda de etalonare se alege în
funcție de: metoda de analiză utilizată, răspunsul aparatului, interferențele ce pot
apărea, numărul de probe supuse analizei, cerințele impuse de obiectivele analizei.
 Principalele metode de etalonare a metodelor de analiză și aparatelor sunt :
(1) metoda curbei de etalonare; (2) metoda adițiilor standard (metoda adaosului);
(3) metoda standardului intern.
 1.Metoda curbei de etalonare
 Presupune: plecând de la o soluție etalon primar a speciei de analizat (analit),
se prepară prin diluție o serie de soluții de concentrație cunoscută și crescătoare,
pentru care se măsoară valoarea semnalului analitic. La prepararea soluțiilor etalon
diluate din etalonul primar se respectă legea diluției : c1v1 = c2v2; unde : c1,c2 –
concentrațiile soluțiilor de etalon primar și, respectiv, etalon diluată; v1 ,v2 –
volumele celor două soluții. Reprezentarea grafică a semnalului analitic în funcție
de concentrația speciei de analizat constituie curba de etalonare (figura II.8), cu
ajutorul căreia se poate determina concentrația speciei de analizat din probe
reale. Curbele de etalonare trebuie verificate periodic.
Figura II.8. Aliura generală a curbei de
etalonare.
 Pentru determinarea conținutului de analit din proba de analizat se
procedează astfel : se aduce analitul în aceeași formă ca și cea din
soluțiile etalon ( printr-un procedeu convenabil ) și se ajustează
condițiile de lucru ale probei de analizat astfel încât ele să fie
identice cu ale soluțiilor etalon. Se măsoara semnalul analitic pentru
proba de analizat în aceleași condiții ca și pentru soluțiile etalon.
Conținutul de analit din proba de analizat se determină prin
interpolare liniară grafică pe curba de etalonare (figura II.8).

 Metoda curbei de etalonare este cea mai frecvent utilizată

metodă de etalonare. Principalul ei avantaj rezultă din faptul că
face posibilă medierea mai multor valori obținute pentru același
etalon, și prin urmare poate aproxima mai bine datele analitice
( crește astfel precizia determinărilor).

2. Metoda adițiilor standard
 Această metodă se utilizează mai ales atunci când interferențele
datorate celorlalți componenți din proba de analizat ( efectul
matricei ) sunt mari și nu pot fi eliminate printr-un procedeu
convenabil. Pentru aplicarea acestei metode este necesar ca semnalul
analitic măsurat să depindă liniar de concentrația speciei de analizat,
iar în absența acesteia, răspunsul aparatului să fie zero.
 În funcție de cerințele analizei etalonarea prin metoda adițiilor
standard poate fi aplicată în două variante :
 a) în soluția probei de analizat, de concentrație cx ( pentru care
semnalul analitic are valoarea Sx ), se adaugă o cantitate exact
cunoscută dintr-o soluție etalon ce conține analitul (cet) și se măsoară
semnalul analitic obținut (Sx+et). Concentrația analitului din proba
astfel analizată se calculează cu ajutorul relației :

 (II.4)
 Dacă în proba de analizat s-a adăugat o cantitate din soluția etalon
mult mai mică decât cantitatea probei analizate atunci relația II.4
poate fi aplicată ca atare. În caz contrar trebuie efectuate o serie de
corecții în care să se țină cont de variația de volum.
cx  Sx
cx cet Sx  et
 b) Varianta grafică conduce la rezultate mai precise decât prima variantă și se aplică mai ales, în cazul
analizelor în soluție. În general se procedează astfel : în mai multe flacoane cotate se introduc volume egale din
proba de analizat. În fiecare flacon se adaugă apoi volume crescătoare exact cunoscute dintr-o soluție etalon ce
conține specia de analizat. Flacoanele se aduc la semn cu un solvent adecvat, se omogenizează și se fac
deteminările analitice. Se reprezintă grafic valorile semnalelor analitice obținute în funcție de concentrațiile
cunoscute ale speciei de analizat introduse din soluțiile etalon (figura II.9).

Figura II.9.
Determinarea
concentrației
analitului din
proba de
analizat
utilizând
metoda
adițiilor
standard
Valorile obținute vor fi mai mari în cazul unui efect de matrice pozitiv, și mai mici dacă
efectul matricei este negativ. Indiferent însă de efectul matricei, prelungirea dreptei
obținute va intersecta abscisa în punctul corespunzător valorii concentrației analitului din
proba supusă analizei (cv - care se poate calcula cu ajutorul ecuației dreptei de
regresie).
 3. Metoda standardului intern
 Metoda standardului intern se aplică frecvent în spectrometria de emisie și
absorbție atomică, cromatografie de gaze și de lichide, etc., și constă în
următoarele : atât în proba de analizat, cât și în cele etalon se adaugă
cantități fixe și exact determinate dintr-o substanță pură (standard intern).
Se măsoară răspunsul aparatului (semnalul analitic), care va depinde atât
de concentrația speciei de analizat, cât și de cea a standardului intern.
 Standardul intern trebuie ales astfel încât să îndeplinească următoarele
condiții : (i) să fie o substanță asemănătoare speciei de analizat (ii) să dea
un semnal care poate fi ușor măsurat și care nu interferă cu semnalul dat
de specia de analizat; (iii) semnalul analitic obținut să nu fie influențat de
celelalte componente ale speciei de analizat.
 În afara metodelor de etalonare menționate în acest paragraf există și
altele aplicabile numai la anumite tipuri de metode de analiză sau aparate
analitice. În general, aceste metode se bazează fie pe compararea
semnalului analitic dat de un etalon și proba de analizat, fie pe dependența
dintre semnalul analitic și concentrație (de cele mai multe ori această
dependență este una liniară) exprimată riguros printr-o lege cantitativă
care stă la baza metodei.

II.2.4. Prelucrarea și interpretarea rezultatelor
 Așa cum am văzut, efectuarea unei analize presupune parcurgerea mai
multor etape de lucru (pregătirea probei, cântăriri, dizolvări și diluții, citiri
la aparate de măsură, etc.), în condiții experimentale bine stabilite. Toate
aceste operații sunt afectate de erori, ceea ce înseamnă că rezultatele
obținute nu reprezintă exact valoarea mărimii măsurate, ci un grup de
valori apropiate de aceasta ( tabelul II.8 ). Din această cauză este necesar
să se cunoască în ce măsură un rezultat analitic este acceptabil și demn de
încredere, dar și natura erorilor care îl afectează.

 II.2.4-1. Erori. Tipuri de erori

 Eroarea este un termen utilizat curent pentru descrierea diferenței dintre
două valori măsurate. Prin definiție o ”eroare” reprezintă (i) diferența
dintre valoarea măsurată și valoarea adevărată, sau (ii) incertitudinea
estimată în efectuarea unei determinări exprimată în termeni statistici.
  Tabelul II.8.
 Principalele surse de erori la efectuarea unei analize chimice.
 În funcție de natura cauzelor care le produc, erorile pot fi:
 1) Erori sistematice (de metode) - sunt determinate de cauze permanente, care se repetă în
toate determinările experimentale și afectează exactitatea rezultatelor analizei. Principalele
cauze care generează erorile sistematice sunt : (i) imperfecțiunile aparatelor și instrumentelor
de măsură ; (ii) etalonarea incorectă a aparatelor și dispozitivelor de măsură; (iii) citirea
incorectă pe scala dispozitivelor de măsură; (iv) procesele secundare care interferă cu procesul
analitic de măsură ; (v) caracterul necantitativ al unor operații de separare sau concentrare a
speciei de analizat; (vi) impurificarea accidentală a soluțiilor și reactivilor; (vii) manipularea
greșită a aparaturii și deficiențe în tehnica de lucru.
 2) Erori întâmplătoare (erori aleatorii, de reproductibilitate) - sunt determinate de cauze
necunoscute, neprevăzute și variabile, care se pot schimba atât ca mărime cât și ca semn la
determinări repetate. Aceste erori afectează precizia și fidelitatea măsurătorilor, nu pot fi
anticipate și apar datorită condițiilor specifice în care se realizează determinările :
variabilitatea condițiilor de lucru (temperatură, presiune, concentrații, etc.), imperfecțiuni ale
senzorilor, impurificări accidentale, neatenția în timpul lucrului, etc. Aceste erori pot fi tratate
statistic, iar determinările experimentale repetate permit reducerea semnificativă a acestora.
 3) Erori nepermise - sunt datorate neglijenței în pregătirea determinărilor experimentale,
carențelor în lucru, sau a greșelilor de calcul a datelor experimentale.
 Orice determinare are un anumit grad de incertitudine care variază odată cu modificarea
procedeului de lucru și schimbarea aparaturii experimentale. Erorile, indiferent de natura lor,
afectează atât exactitatea cât și precizia unei determinări experimentale (tabelul II.9).
Tabelul II.9. Legătura dintre tipurile de erori analitice, distribuția rezultatelor,
exactitatea și precizia determinărilor
 Observație:
 1) Exactitatea (acuratețea) : unui rezultat experimental - este un
criteriu de măsură a abaterii valorii măsurate experimental de la
valoarea adevărată. Exactitatea este efectată de erorile sistematice; cu
cât erorile sistematice sunt mai mici cu atât exactitatea rezultatelor
este mai mare. Evaluarea exactității presupune cunoașterea valorii
adevărate, ceea ce nu este întotdeauna posibil, deoarece nu în toate
cazurile există un etalon ce poate fi utilizat pentru comparație. Atunci
când nu se cunoaște valoarea reală, pentru evaluarea exactității se
utilizează media aritmetică a tuturor determinărilor, considerată ca fiind
cea mai apropiată de valoarea reală.
 2) Precizia (fidelitatea) : este un criteriu de măsură a reproductibilității
măsurătorilor. Dacă diferența dintre măsurători repetate este mare,
atunci precizia determinărilor este mică. Precizia este afecată atât de
erori întâmplătoare, cât și de sensibilitatea metodei de analiză. Cu cât
erorile întâmplătoare sunt mai mici și numărul determinărilor este mai
mare cu atât precizia rezultatelor este mai mare (tabelul II.9). Precizia
unui rezultat nu este suficientă pentru aprecierea determinărilor și ea nu
se poate lua în considerare decât în lipsa erorilor sistematice.
 
În aceste condiții, evaluarea preciziei și siguranței unui rezultat experimental
presupune cunoașterea naturii și siguranței unui rezultat experimental
presupune cunoașterea naturii și mărimii erorilor care pot afecta determinările
Ea

A 100 experimentale. Pentru evaluarea erorilor experimentale pot fi folosite
următoarele mărimi :
 Eroarea absolută (Ea) - se calculează pentru fiecare rezultat în parte, și este
egală cu diferența dintre valoarea adevărată A ( care ar trebui să se obțină
dacă nu s-ar face nici o eroare ) și rezultatul unei determinări X. Atunci când
valoarea reală A nu se cunoaște, se poate lua în calcul media aritmetică () a
determinărilor experimentale.
 Ea = X - A (III.5-a) Ea = X - X (II.5-b)

Eroarea relativă (Er) - se calculează ca fiind raportul

procentual dintre eroarea absolută și valoarea adevărată sau
media aritmetică a determinărilor experimentale:

Er = Ea/A · 100% ; (III.6-a) Er = E a/X ·100%; (II.5-

b)

În general, pentru aprecierea exactității rezultatelor

experimentale nu este suficientă numai cunoașterea erorii
absolute. Astfel, atunci când eroarea absolută se raportează
la o valoare mică a mediei aritmetice a determinărilor,
eroarea relativă este mare și poate să conducă la concluzii
greșite.
 II.2.4-2. Eliminarea datelor nesigure
 În mod curent, se consideră că, cu cât numărul măsurătorilor efectuate pentru o probă dată
este mai mare, cu atât crește certitudinea că media aritmetică a valorilor obținute
corespunde mai bine rezultatului adevărat.
 Deoarece în practică nu este întotdeauna posibilă realizarea unui număr foarte mare de
determinări experimentale ( fie metoda de analiză nu permite acest lucru, fie cantitatea de
probă disponibilă pentru analiză este prea mică), se pune problema care dintre rezultatele
obținute pot fi acceptate și care trebuie eliminate. Eliminarea datelor experimentale nesigure
depinde de gradul de exactitate impus analizei respective și se poate realiza utilizând
criteriile prezentate în tabelul II.10.
 Observație:
 Se consideră o mărime A, pentru care se fac o infinitate de măsurători experimentale, și se
obțin o infinitate de rezultate X. Prin reprezentarea grafică a valorilor Xi în abscisă, în funcție
de frecvența apariției lor, se obține o curbă sub formă de clopot, numită curbă de distribuție
normală a lui Gauss (figura II.10).
Figura III.10. Curba de
distribuție normală a lui
Gauss.
Tabelul II.10. Criterii de eliminare a
rezultatelor experimentale nesigure.

n - numărul
determinărilor
experimentale;
Xi - valoarea
determinării
experimentale;
X - media aritmetică
a determinărilor
experimentale.
 Se poate observa din figura II.10 că frecvența este maximă pentru
media aritmetică μ, față de care frecvența scade simetric de o parte și de
alta a acesteia, prin urmare abaterile de la medie se produc cu aceeași
probabilitate în ambele sensuri.
 Curba de distribuție normală a lui Gauss are două puncte de inflexiune.
Distanța dintre primul punct de inflexiune și valoarea mediei aritmetice μ
se numește abatere standard (σ). Mărimea abaterii standard
caracterizează reproductibilitatea (precizia) metodelor de analiză, și,
respectiv a determinărilor experimentale. Este evident că, cu cât
valoarea abaterii standard este mai mică, cu atât metoda de analiză este
mai reproductibilă, iar rezultatele obținute sunt mai precise.
 Trebuie menționat faptul că aplicarea acestor teste statistice, care sunt
bazate pe un număr relativ mare de date, la seturi mici de date (<5)
poate să inducă erori. Din această cauză, pentru seturi mici de date, este
preferabil să se ajungă la incertitudine prin evaluarea erorilor procedeului
în cadrul măsurătorilor. Această tehnică se numește propagarea erorilor,
și se bazează pe combinarea incertitudinilor estimate în mărimile
măsurabile (variabile independente) pentru a obține incertitudinea unei
mărimi calculate (variabilă dependentă). Această estimare a incertitudinii
poate fi comparată cu deviația medie, pentru a aprecia dacă toate sursele
ce contribuie semnificativ la incertitudinea totală sunt acceptate sau nu.
 II.3. Validarea metodelor de analiză

 Validarea metodelor de analiză urmărește să demonstreze că o

metodă de analiză dată corespunde utilizării pentru care a fost
elaborată și că performanțele metodei considerate, stabilite prin studii
de laborator, satisfac cerințele pentru ca această metodă să poată fi
aplicată. Astfel, validarea metodelor de analiză presupune descrierea
detaliată a modului de lucru al metodei (pentru ca ea să poată fi
reprodusă cu ușurință), calculele aferente, rezultatele experimentale
și tratarea statistică a acestora.
 Prin metoda de analiză validată se înțelege acea metodă de
analiză pentru care au fost explorate și documentate o serie de
parametri analitici, cu scopul de a crește încrederea în metodele
respective și a le face unanim acceptate de către întreaga comunitate
științifică și de către diferite organisme internaționale de specialitate.
 Principalii parametri care fac obiectul validării unei metode de
analiză sunt: (i) exactitatea sau acuratețea; (ii) fidelitatea sau
precizia; (iii) repetabilitatea; (iv) reproductibilitatea; (v) linearitatea;
(vi) specificitatea; (vii) sensibilitatea și (viii) robustețea. Definițiile
acestor parametri sunt stabilite la nivel internațional - cu ajutorul
normelor ISO- și sunt unanim acceptate, asigurându-se astfel o
evaluare științifică sigură (tabelul II.11).
Tabelul II.11. Definițiile
parametrilor de
validare
conform normelor
ISO.
 De cele mai multe ori, determinarea acestor parametri se face statistic și implică realizarea unui număr mare de
studii de laborator, în condiții experimentale identice, în aceleași laboratoare și în laboratoare diferite, de către același
analist și de către analiști diferiți. După centralizarea datelor experimentale se procedează la calculul parametrilor de
validare și apoi la întocmirea dosarului de validare, pentru metoda de analiză vizată.
În practică, pentru a simplifica această procedură de validare, nu este necesar calculul tuturor parametrilor de validare
enumerați în tabelul II.11, pentru fiecare metodă de analiză, în parte. În funcție de școpul urmărit, pentru validare sunt
selectate doar criteriile cele mai importante (tabelul II.12), care permit descrierea detaliată a metodei și definesc clar
performanțele analitice ale acesteia.

 Tabelul II.12. Principalele criterii de validare utilizate în funcție de scopul metodei de analiză.

Prin cunoașterea și respectarea normelor descrise mai sus se urmărește creșterea încrederii în
rigurozitatea științifică a rezultatelor experimentale și a conținutului metodei de analiză, se
urmărește asigurarea calității analitice prin creșterea onestității și responsabilității analistului.
 II.4. Bibliografie 
1) I. Sârghie, L. Tofan, D. Șuteu, L. Bulgariu, G. Rusu, Analiza cantitativă Lucrări
practice, Editura Performantica, Iasi, 2005
2) G. Popa, V. Croitoru, Chimie analitică cantitativă. Gravimetrie, Editura Didactică
și Pedagogică, București, 1971.
3) J. A. Dean, Handbook of Analytical Chemistry, McGraw-Hill Inc., New York, 1995.
4) G. D. Christian, Analytical Chemistry, John Wiley & Sons Inc., New York 1994.
5) C.Gh. Macarovici, Analiza chimică cantitativă anorganică, Editura Academiei
Române, Bucuresti, 1979.
6) D. J. Pietrzyk, C. W. Frank, Chimie analitică, Editura Tehnică, București, 1989.
7) L. Kekedy, Chimie analitică calitativă, Ed. Scrisul Românesc, Craiova,1982.
8) D. Bulgariu, C. Rusu, Metode instrumentale de analiză în geoștiințe. Vol.
I.Prelevarea probelor. Sampling, Edirura Demiurg, lasi, 2005.
9) A. F. Dănuț, Metode instrumentale în analiză chimică, Editura Științifică București,
1995.
10) E. Jercan, Metode de separare în chimia analitică, Editura Tehnică Bucuresti,
1983.
11) J. H. Kennedy, Analytical Chemistry: Principles, Sanders, New York, 1990.
12) V. Armeanu, Chimie analitică, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1971.
13) AI. Duca, Chimie analitică generală, I.P. Iași (curs litografiat), 1974.
14) C. Luca, AI. Duca, 1. AI. Crișan, Chimie analitică și analiză
15) instrumentală, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1983.
16) G. E. Baiulescu, T. Născuțiu, Metode fizice de analiză a urmelor, Editura Tehnică, București, 1974.
17) AI. Duca, Al. Nacu, C. Calu, Chimie analitică și analiză instrumentală, I.P. Iași (curs litografiat), 1980.
18) D. A. Skoog, Principles of Instrumental Analysis (3rd edition), Saunders College Publishing, Philadelphia,
1985.
19) L. Roman, M. Bojiță, R. Săndulescu, Validarea metodelor de analiză și control. Bazele teoretice și practice,
Editura Medicală, București, 1998.
20) S.E.Allen (eds), Chemical Analysis of Ecological Materials (2nd edition), Blackwell, Oxford, U.K.,1989
21) B. J. Alloway, D. C. Ayers, Chemical Principles of Environmental Pollution, Blakie, London, 1994.
22) R. Cornelius, H. Crews, J. Caruso, K. Heuman, Handbook of Elemental Speciation: Techniques and
Methodology, John Wiley & Sons lnc., Ltd., New York, 2003.
23) J. P. Sibilia, A Guide to Materials Characterization and Chemical Analysis (second edition), Wiley-VCH, New
York, 1996.
24) E. V. Alexeevski, R.K.Golț, A.P. Musakin, Analiza cantitativă, Editura Tehnică, București, 1955.
24) C. A. Bicking, Principles and Methods in Sampling, in: Treatise on Analytical Chemistry,
part 1, Vol., cap. 6, 1960, p. 299-359.
25) G. W. Bryden, L.R. Smith, Sampling for Environmental Analysis, Am. Lab., July 30, 1989.
26) J. Pawliszyn (eds.), Sampling and Sample Preparation for Field and Laboratory, Elsevier,
Amsterdam, 2002.
27) K. W. Bruland, R.P. Franks, G.A. Knauer, J.H. Martin, Anal.Chim. Acta, 105 (1979) 233.
28) M. A. Frason (ed), Standard Methods for the Examination of Waste Water (14th edn.),
America Public Health Association, Washington D.C.,1976.
29) S. Mănescu, M. Cucu, M. L. Diaconescu, Chimia sanitară a mediului, Editura Medicală,
București, 1978.
30) W. E. Van der Linden, Pure & Appl. Chem., 61 (1989) 91. .-
31) Gh. Morait, L. Roman, Chimie analitică, Editura Didactică și Pedagogică, București,
1983.
32) A. Ringbom, Complexation in Analytical Chemistry, Interscience Publishers, New York,
1963.
33) L. Roman, O. Bârzu, Implicatiile biomedicale ale combinațiilor complexe, Editura Dacia,
Cluj-Napoca, 1979.
34) C. Liteanu, S. Gocan, A. Bold, Separatologie analitică, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1981
35) D.L. Massart, A. Dijkstro, L. Kaufmann, Evaluation and Optimization of Laboratory Methods and Analytical
Procedures, Elseviere, London,1978.
36) H. A. Strobel, W.R. Heineman, Chemical instrumentation: A Sistematic Aproach, Wiley, New York, 1989.
37) H. Willard, H. Merritt, L. Lynne, J.A. Dean, Instrumental Methods of Analysis, (5th Ed.), van Nostrand Comp.,
New York, 1981.
38) F. Feigl, Chemistry of Specific, Selective and Sensitive Reactions, Academic Press, 1949
39) L.G. Hargis, Analytical Chemistry. Principles and Techniques, Pretince Hall, New Jersey, 1988.
40) E. F. McFarren, R. J. Lishka, J. H. Parker, Anal. Chern., 42(3) (1970) 358.
41) International Organization for Standards, Accuracy (Trueness and Precision) of measurment Methods and Results,
Part 1-6, ISO 5725, Geneva, 1994.
42) D. Bilba, L. BuIgariu, Metode spectrometrice de analiză. Lucrări practice, Editura Performantica Iași, 2005.
43) International Standard Organization, ISO Guide to the Expression of Uncertainly in Measurment, Geneva, 1993.
44) EURACHEM GUIDE, Quantifying Uncertainty in Measurment, Laboratory of the Government Chemist,
London, 1995.
45) C. Liteanu, I. Rică, Teoria și metodologia statistică a analizei urmelor, Editura Scrisul Românesc, Craiova,
1979.
46) C. Miller, J. N. Miller, Statistics for Analytical Chemistry, Ellis Harwood, Chichester, 1993.
47) D. Ceaușescu, Tratarea statistică a datelor chimico-analitice, Editura Tehnică, București, 1973.
 Cap.III METODE CHIMICE DE ANALIZA A BIOMOLECULELOR
III.1. Analiza titrimetrică(volumetrică)
III.2. Analiza gravimetrică
III.3. Bibliografie

Metodele chimice(titrimetria și gravimetria) sunt recomandate pentru analiza

macrocomponenţilor.Aceste probe presupun utilizarea unei reacţii chimice ȋn
care este implicată specia de analizat;pe baza stoechiometriei reacţiei se poate
calcula conţinutul analitului prin:
1.măsurarea volumului de soluţie de reactiv necesar desfășurării
reacţiei(analiza titrimetrică sau volumetrică)
2.măsurarea cantităţii (masei) unui produs rezultat din reacţie (analiza
gravimetrică)
Se evidenţiază prin simplitate,precizie și costuri mici,dar au sensibilitate
mică și sunt cronofage și poluante.
 III.1. Analiza titrimetrică(volumetrică)
III.1.1.Caracteristicile definitorii ale titrimetriei

Metodele analizei cantitative guvernate de măsurarea exactă a volumului de soluţie de

reactiv de concentraţie riguros cunoscută,consumat ȋntr-o reacţie stoechiometrică prin care
specia de analizat se transformă complet ȋntr-un alt produs poartă numele de metode
titrimetrice(volumetrice).
Efectuarea unei determinări printr-o metodă volumetrică presupune parcurgerea
următoarelor etape reprezentative :

Măsurarea exactă a volumului de soluţie de analizat

↓
Asigurarea condiţiilor de evidenţiere a sfarșitului reacţiei
↓

Titrarea
↓
Sesizarea practică a punctului de echivalenţă
↓

Măsurarea exactă a volumului de echivalenţă

↓
Calculul și interpretarea rezultatelor analizei
Reacţiile chimice pot fi operaţionale ȋn determinările titrimetrice numai dacă
ȋndeplinesc,alături de condiţiile impuse tuturor reacţiilor cantitative(să fie
stoehiometrice,rapide,totale și neȋnsoţite de procese secundare) și o condiţie specifică
:sfarșitul lor să poată fi marcat printr-o schimbare ușor sesizabilă a uneia dintre
proprietăţile fizice sau chimice ale soluţiei analizate.
Specia chimică de dozat(ion,element sau substanţă) se numeștie titrat .Reactivul care
provoacă transformarea chimică practic totală (ȋn proporţie de cel puţin 99,9% ) a speciei
analizate se numește titrant .
Titrarea este operaţia de adăugare treptată,ȋn volume mici,din biuretă,a soluţiei de titrant
ȋn soluţia de analizat.
Un alt aspect specific titrimetriei este cel al identificării cat mai exacte a momentului ȋn
care reacţia de titrare,riguros selectată,este practic totală.Acest moment corespunde
adăugării titrantului ȋn cantitate echivalentă celei de titrat și este denumit punct de
echivalenţă .Volumul de reactiv de titrare scurs din biuretă pană ȋn acest moment
reprezintă volumul de echivalenţă .
Pentru determinare punctului de echivalenţă ( punct final teoretic al titrării ) se
utilizează o proprietate a soluţiei analizate ,care ȋn apropierea acestui moment suferă o
schimbare ce poate fi sesizată vizual sau cu ajutorul unui aparat.
 Ȋntr-o titrare,punctul de echivalenţă se determină cu o anumită eroare,deoarece
schimbarea produsă ȋn sistemul de analiză nu coincide perfect momentului
echivalenţei.Momentul la care se percepe modificarea unei anumite proprietăţi a
soluţiei (schimbarea de culoare,apariţia sau dispariţia unui precipitat,variaţia bruscă a
conductibilităţii electrice a soluţiei etc.) se numește punct final al titrării deoarece ȋn
acest moment se oprește titrarea.
Calculul rezultatelor ȋn analiza volumetrică are la bază principiul (legea)
echivalenţei, care poate fi formulat astfel : cantităţi ȋn care reacţionează chimic
substanţele supuse unei titrări sunt ȋntotdeauna strict echivalente.
Una dintre formele cele mai uzuale ale legii echivalenţei este :
N1V1 = N2V2 (III.1)
ȋn care:
N1 , N2 = concentraţiile normale ale celor două soluţii ;
V1= volumul soluţiei titrate ;
V2= volumul de echivalenţă al soluţiei de reactiv de titrare.
Așadar, calcularea concentraţiei soluţiei de analizat,N 1 , prin intermediul legii
echivalenţei :
N1 = N2V2/V1 (III.2)
Este condiţionată de utilizarea unor soluţii de concentraţii riguros cunoscute (soluţii
titrimetrice).
Deoarece, ȋn majoritatea cazurilor, din substanţele care pot ȋndeplini rolul de titrant
nu se pot prepara direct soluţii titrimetrice , determinările propriu-zise sunt precedate de
o operaţie de standardizare , care presupune stabilirea concentraţiei exacte a acestor
soluţii prin titrarea lor cu substanţe etalon (tabelul III.1.)
Titrantul Substanta standard utilizata
Denumirea
Hidroxidul de sodiu,NaOH Acidul oxalic(M=126)
Acidul clorhidric ,HCl Carbonatul de sodiu
anhidru (M=106)
Permanganatul de Acidul oxalic (M=126)
potasiu,KMnO4
Tiosufatul de sodiu Bicromatul de
Na2S3O4◦5H2O potasiu(M=294)
Iodul , I2 Solutia titrata de tiosulfat
de sodiu(M=248,2)
Reactia de standardizare
Formula chimica
H2C2O4◦2H2O H2C2O4+2NaOH=Na2C2O4+2H2O
Na2CO3 Na2CO3+2HCl=2NaCl+H2CO3
H2C2O4◦2H2O 5H2C2O4+2KMnO4+3H2SO4=K2SO4+
2MnSO4+10HCO2+8H2O
K2Cr2O7 K2Cr2O7+6KI+14HCl=2CrCl3+8KCl+
3I2+7H2O+I2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4
O6
Na2S2O3◦5H2O I2+2Na2S2O3=2NaI +Na2S4O6

Cele mai importante criterii de diferenţiere ȋntre metodele titrimetrice sunt corelate cu :
-tipul reacţiei de titrare;
-modul de efecuare a titrărilor;
-modalitatea de sesizare a sfarșitului titrării;
-mediul(apos sau neapos)ȋn care se execută titrările.
Astfel,din punct de vedere al reacţiei care stă la baza metodei de determinare există:
-titrări acido-bazice;
-titrări redox; -titrări prin reacţii cu formare de combinaţii complexe;
-titrări prin reacţii de precipitare;
 Pe baza modalităţii de execuţie a titrărilor,se pot defini următoarele tipuri de metode
titrimetrice
• directe ,ȋn care soluţia de analizat se adaugă treptat titrant,pană la punctul de
echivalenţă;
• prin diferenţă (inverse) ,particularizate prin tratarea substanţei de analizat cu un
volum determinat,ȋn exces dintr-o soluţie titrata și retitrarea excesului cu un alt reactiv;
• indirecte, aplicate ȋn cazurile ȋn care o specie de analizat care nu poate reacţiona direct
cu titrantul este implicată ȋntr-o reacţie chimică al cărei produs este ulterior titrat cu
reactivul de titrare .
 Ȋn funcţie de modul ȋn care se determină punctul de echivalenţă, metodele
volumetrice se clasifică ȋn :
• metode chimice (titrimetria chimică);
• metode instrumentale (titrimetria instrumentală)
  Determinarea chimică(vizuală) a sfarșitului unei titrări se realizează cu ajutorul
unor substanţe chimice numite indicatori .
Ȋn metodele instrumentale de titrare,se urmărește ,cu ajutorul unor aparate
adecvate,variaţia unor proprietăţi fizice ale soluţiei titrate (conductibilitate
electrică,absorbanţă etc.)
Pe baza mediului ȋn care se execută titrările ,se disting :
• metode titrimetrice ȋn mediu apos;
• metode titrimetrice ȋn mediu neapos;
 III.1.2. Indicatori
Desfășurarea unei reacţii de titrare este ȋnsoţită de variaţia continuă a concentraţiilor
speciilor implicate.Cea mai importantă variaţie a concentraţiei (sau a unei proprietăţi
corelate cu aceasta ) -salt- se produce ȋn jurul punctului de echivalenţă .
Indicatorii sunt substanţe care au o proprietate(culoare,fluorescenţă,turbiditate)
susceptibilăde a se modifica ȋn funcţie de concentraţia anumitor ioni dintr-o soluţie
titrată.
Schimbarea proprietăţii monitorizate nu se produce instantaneu,ci ȋntr-un anumit
domeniu de concentraţii,denumit interval(domeniu) de viraj .
Ȋn scopul utilizării lor la determinarea punctului de echivalenţă,indicatorii trebuie să
ȋndeplinească următoarele condiţii :
• să funcţioneze reversibil;
• să se caracterizeze printr-un interval de viraj cat mai ȋngust;
• sa aibă solubilitate suficient de mare ȋn mediul de titrare;
• capacitatea ridicată de schimbare a proprietăţii să permită folosirea lor ȋn concentraţii
mici;
• să prezinte stabilitate ȋn condiţii experimentale date.
Pentru aprecierea cat mai exactă a sfarșitului unei titrări,se selectează
indicatorul(tabelul III.2.) care suferă o schimbare ușor observabilă cat mai aproape de
punctul de echivalenţă al unei titrări acido-bazice ,redox,de complexare sau de
precipitare.
 Tabel III.2.Indicatori
Indicatorii Principiul de functionare Exemple
INDICATORI ACIDO-BAZICI
De culoare Modificarea culorii unor compusi organici(acizi si Metiloranj
-simpli; baze slabe) in functie de pH-ul sistemului titrat-titrant Rosu metil
-micsti; Fenolftaleina
-universali timolftaleina
De fluorescenta
Schimbarea fluorescentei in functie de pH-ul Benzoflavona
Turbidimetrici
mediului de titrare Eozina
De adsorbtie
fluoresceina
Modificarea brusca,la un anumit pH ,a stabilitatii 3-alfa-fenil-beta-acetiletil-4-
unor sisteme coloidale,cu producerea fenomenului de oxicumarina
floculare Izonitrozo-acetil-p-amino-
azobenzen
La pH-ul de echivalenta,sarea unui cation utilizata in Eozina-Pb(NO3)2
amestec cu indicatorul,preipita sub forma de Fluoresceina-SnCl2
hidroxid.Prin adsorbtia pe hidroxidul astfel Galben de tiazol MgCl2
format,indicatorul isi schimba culoarea si devine mai
vizibil

INDICATORI
METALOCROMICI
(utilizati in titrarile Capacitatea unor substante organice de a forma Eriocrom negru T
complexonometrice complecsi colorati cu ionii metalici poate Murexid
determina schimbarea culorii solutiei la variatia Piridilazonaftol
brusca a concentratiei cationului titrat Acidul sulfosalicilic
INDICATORI REDOX

De culoare Schimbarea culorii unor compusi organici in Albastru de metilen

De fluorescenta functie de potentialul redox al solutiei titrate Difenilamina
Reactivi ai ionilor benzidina
turbidimetrici
Modificarea fluorescentei in functie de potentialul Rodamina B
redox al sistemului de titrare Alfa-naftoflavona

Modificarea potentialului redox al solutiei Combinatii complexe colorate

determina variatia concentratiei unui ion ale unui cation cu un reactiv
metalic,component al unui sistem redox reversibil organic
si,prin aceasta se produce schimbarea de culoare

In functie de variatia potentialului redox al OsO4 ;AuCl3

solutiei,unele substante anorganice trec in Acidul selenios
precipitate fine sau coloidale

INDICATORI utilizati in titrimetria bazata pe REACTII DE PRECIPITARE

Reactivi ai ionilor Formarea unui precipitat sau a unui complex Cromatul de potasiu
De adsorbtie colorat u ionul care se dozeaza sau cu titrantul Alaunul feric
acestuia

Modificarea culorii sau a fluorescentei la adsorbtia Fluoresceina

pe suprafata unui precipitat Eozina
Rodamina 6G
 III.1.3.Titrimetria prin reacţii acido-bazice

Titrimetria prin reacţii cu transfer de protoni se bazează pe interacţiuni stoechiometrice de forma:

Acid1+Baza2 ⇔ Baza1+Acid2 (III.3)
Alegerea titrantului optim se bazează pe necesitatea respectării condiţiei ca reacţia de titrare să fie
practice cantitativă ,adică Acid1 să fie neutralizat de Baza2 ȋn proporţie de minimum 99,9% fapt care
impune ca valoarea constantei de echilibru a procesului (II.3.)

K=[Baza1][Acid2]/[Acid1][Baza2]=Ka1/Ka2

Unde Ka1 si Ka2 sunt constantele de aciditate ale cuplurilor cărora aparţin titratul (Acid 1) si titrantul
( Baza2 ) să fie :
 
K= 99,9◦99,9/0,1◦0,1~106 sau Ka1/Ka2 ≥ 106
 
Ȋn funcţie de titrantul utilizat,se deosebesc :
• metode alcalimetrice al căror obiectiv este determinare substanţelor cu proprietăţi acide prin titrarea lor
cu o bază adecvată ( hidroxidul de sodiu,hidroxidul de potasiu );
• metode acidimetrice ,aplicabile pentru determinarea substanţelor cu caracter alcalin prin folosirea unui
acid potrivit (acid clorhidric,acid sulfuric) cu rol de reacţie de titrare;
Desfășurarea reacţiei de titrare poate fi descrisă printr-o dependenţă de forma :
pH=f (volumul de titrant sau procentul titrat )
Reprezentarea grafică a acestei dependenţe se numește curbă de titrare acido-bazică.Curbele de
titrare acido-bazică sunt curbe logaritmice al căror aspect depinde de :
 natura și tăria electroliţilor implicaţi ȋn reacţia de titrare;
 concentraţiile acestora;
 temperatură;
 natura solventului.
 Pentru estimarea vizuală a sfarșitului unei titrări se folosesc cel mai frecvent indicatori acido-
bazici de culoare.Modificarea culorii acestor indicatori,care sunt acizi sau baze organice slabe,ȋn
funcţie de pH-ul mediului de titrare,a fost explicată ȋn diverse moduri,elaborandu-se mai multe
teorii,ȋntre care se remarcă teoria cromoforo-ionică.Conform acestei teorii,factorul determinant ȋn
virajul culorii este modificarea de structură ce se produce simultan cu schimbarea gradului de
disociere a indicatorului.
Mărimea intervalului de viraj caracteristic,definit ca domeniul de pH ȋn care se produce
schimbarea de culoare este de circa două unităţi de Ph.Asfel :
• metiloranjul ȋși schimbă culoarea de la roșu la galben ȋn intervalul de pH de la 3,1 la 4,4 ;
• domeniul de viraj( de la roșu la galben) caracteristic pentru indicatorul roșu de metil corespunde
valorilor de pH cuprinse ȋntre 4,4 și 6,2 ;
• fenolftaleina se caracterizează printr-un interval de viraj situat ȋntre pH=8,2 și pH=10 ,ȋn care
schimbarea culorii sale este de la incolor la roșu ;
• virajul timolftaleinei de la incolor la albastru se produce ȋn domeniul de pH 9,4 -10,6.
Indicatorul cel mai potrivit pentru o titrare acido-bazică se alege asfel ȋncat pH-ul corespunzător
punctului de echivalenţă să fie inclus ȋn intervalul său de viraj și cat mai aproape de mijlocul
acestuia,
Ȋn analiza compușilor biochimici,metodele titrimetriei acido-bazice ocupă o poziţie prioritară

Exemple ilustrative :
 
 DETERMINAREA DIOXIDULUI DE CARBON

Sub aspect biochimic,dioxidul de carbon este considerat un metabolit primar,produs de celula vie
ȋn timpul procesului de respiraţie .Ȋn acest context ,CO 2 este unul dintre cei mai importanţi parametri
biotehnologici generali,care furnizează indicaţii de strictă utilitate asupra metabolismului
microorganismelor .
 Procesele biochimice generatoare de CO 2 ca metabolit primar sunt reacţii enzimatice de
decarboxilare.De exemplu,prin decarboxilarea acidului piruvic,ȋn prezenţa catalitică a enzimei
specifice,piruvat-decarboxilază,se eliberează progresiv CO 2,conform reacţiei :
CH3-CO-COOH → CH3-CHO+ CO2
Ȋn general,ȋn condiţii aerobe,un proces de biosinteză decurge conform următoarei scheme
simplificate :
SUBSTRAT + O2+ Sursă de azot → BIOMASA CELULARA + CO2 + H20
adică,de exemplu
C6H1206 + O2 + NH3 → Biomasă de drojdie + CO 2 + CO2
Monitorizarea continuă a dioxidului de carbon care se formează din abundenţă pe tot parcursul
desfășurării proceselor biochimice industriale este impusă de creșterea acidităţii mediilor din
bioreactoare,cu importante consecinţe asupra dezvoltării microorganismelor.
Manifestarea pregnantă a prezenţei uneia dintre cele trei forme distincte ȋn care poate exista
dioxidul de carbon ȋn soluţie este dictată de pH care-și pune puternic amprenta asupra
următoarelor echilibre chimice :
CO2+ H2O ↔ H2CO3
H2CO3 + H2O ↔ HCO3− + H3O+
HCO3− + H20 ↔ CO32− + H3O
Aceste echilibre sunt puternic deplasate spre forma nedisociată,acidul carbonic , H 2CO3 (sau
CO2+ H2O) ,care este un acid foarte slab (Ka 1=3,72 ◦10-7 ; Ka2=5,75 ◦10-11 ) și nu poate fi titrat
direct cu o bază tare.De aceea determinarea dioxidului de carbon dizolvat sau din gaze se bazează
pe principiul absorbţiei sale ȋntr-o soluţie alcalină de volum și concentraţie exact și precis
cunoscute și titrarea ulterioară a excesului cu o soluţie de acid tare de titru cunoscut,conform
schemei simplificate prezentată ȋn figura III.1
 TITRAREA soluţiei care conţine excesul de Ba(OH)2 cu o soluţie 0,02N de
HCl ,ȋn prezenţa fenolftaleinei ca indicator :
Ba(OH)2 ȋn exces +2HCl →BaHCl2 +2H2O
↓

Filtrarea precipitatului de carbonat de bariu , BaCO3

↓
ABSORBTIA CO2 ȋntr-un anumit volum,luat ȋn exces de soluţie de hidroxid de
bariu 0,02N :
CO2+Ba(OH)2 ȋn exces→BaCO3↓+ H2O (Ba(OH)2 ȋn exces)
Figura III.1.Reprezentarea schematică a principiului determinării CO2 prin absorbţie ȋn soluţie alcalină și titrare
acido-bazică.
Pentru determinarea conţinutului total de dioxid de carbon:
CO2total = CO2dizolvat + CO2ionizat
Se impune parcurgerea următoarelor etape :
-eliberarea ȋntregii cantităţi de CO2 prin acidularea probei lichide de analizat ( la pH<5) cu acid sulfuric sau acid
clorhidric ;
-efectuarea a două determinări paralele,pe o probă acidulată și o probă neacidulată,măsurate din aceeași soluţie
supusă analizei ;
-determinarea,prin diferenţă , a dioxidului de carbon provenit din formele ionizate (HCO 3- și CO32- )
•DOZAREA AZOTULUI
Ȋn mediile biochimice de analizat azotul poate exista sub diferite forme anorganice (amoniac ,amoniu
,nitriţi,uree,aminoacizi etc.).Ȋn majoritatea cazurilor,titrarea acido-bazică este precedată de transformarea diverselor
surse de azot ȋn speciile amoniac (NH3) sau amoniu (NH4+) (tabelul III.3.) a căror dozare se particularizează prin
ușurinţă si simplitate .
Metoda Principiul metodei Observaţii
Dezagrega- Ȋntr-un balon Kjeldahl rezistent la temperatură,probele de Este una dintre cele mai
re Kjeldahl analizat se tratează cu H2SO4 concentrat,la fierbere,ȋn importante metode de
prezenţa unor agenţi oxidanţi (acid cloric,apă oxigenată) și transformare a
catalizatori (săruri mercurice,săruri de cupru).Ȋn aceste substanţelor cu
condiţii energice se produce următoarea succesiune de azot.Metoda nu poate fi
transformări :carbonizarea substanţelor organice→ implicată ȋn cazul nitro-,
oxidarea carbonului la CO2 → conversia diferitelor forme de azo- sau azoxi-derivaţilor
azot ȋn sulfat de amoniu → transformarea amoniului ȋn
amoniac (prin neutralizarea excesului de acid și
alcalinizare).
Schimbarea NH3↔ NH4 (mediu ↔ acid mediu bazic) Solubilitatea
pH-ului Conţinutul de NH3,respectiv NH4+ din soluţie depinde de pH- amoniacului ȋn soluţie se
soluţiei ul mediului,astfel : micșorează la creșterea
probei de - pH<7, soluţia conţine numai NH4+; temperaturii și a tăriei
analizat - Ph=9,22 ,soluţia conţine 50% NH4+ și 50% NH3 ; ionice
- Ph=11,5 singura specie cu azot prezentă ȋn soluţie este
NH3.
Bazată pe Ureea, un important compus utilizat ca sursă de azot ȋn Hidroliza ureei se poate
reacţii de numeroase biotehnologii este descompusă cantitativ ȋn NH3 efectua ȋn mediu acid
hidroliză și CO2,conform reacţiei : sau ȋn mediu bazic
OC(NH2)2+ H2O → 2NH3 + CO2 (t=100◦) Hidroliza enzimatică se
Ȋn prezenţa ureazei,ureea este descompusă prin hidroliză produce numai ȋn mediu
enzimatică : acid
+ -
Pe bază de reacţii Ȋn prezenţa unor aminoacidoxidaze Amoniacul asfel rezultat poate fi
enzimatice (AAO),azotul din aminoacizi este convertit ȋn ulterior convertit ȋn
ioni NH4+: amoniac,prin ajustarea pH-ului
AA+ O2 → RCOO- + CO2 + NH4+ la valori >11,5
Bazată pe reacţii Prin oxidare cu permanganat de potasiu,ȋn NH4+ ȋn mediu alcalin trece ȋn
redox mediu acid,azotitul este transformat ȋn azotat: amoniac
5NO- + 2MnO4- + 6H+ → 5NO3-+ 2Mn2+ +
3H2O
Ulterior, prin mineralizare azotaţii sunt trecuţi
ȋn amoniu .

Determinarea conţinutului de amoniac liber (Kb =1,79◦10 -5) dintr-o soluţie apoasă se face prin
titrare cu o soluţie standardizată de acid clorhidric,conform reacţiei :
NH3 + HCl → NH4Cl
La punctul de echivalenţă al titrării soluţia are caracter slab acid (pH e=5,12), astfel ȋncât ca
indicator se folosește roșu de metil .
Ușoara volatilitae a amoniacului din soluţie limitează drastic aria de aplicablitate a acestei
variante titrimetrice simple.Ȋn majoritatea cazurilor,pentru dozarea azotului din amoniacul liber, se
preferă antrenarea amoniacului cu vapori de apă și distilarea acestuia ȋn aparatul Parnas-Wagner
(figura III.2). Distilatul este prins ȋntr-o cantitate cunoscută de soluţie titrată de H 2SO4, luată ȋn exces,
când are loc reacţia :

2 NH3+ H2SO4 ȋn exces → (NH4)2SO4 + (H2SO4excesul)

După neutralizarea amoniacului,excesul de acid sulfuric este titrat cu o soluţie standardizată
de NaOH 0,1N :
H2SO4 ȋn exces+2NaOH→Na2SO4 +2H2O

Figura II.2. Aparatul Parnas-Wagner (1-

balon generator de aburi;2-sistem electric
de ȋncălzire;3-palnie pentru introducerea
apei;4-tub din plastic rezistent la
temperatură;5-vas intermediar;6-palnie
pentru introducerea probei;7-
refrigerent;8-vas Erlenmayer cu soluţie
titrată de H2SO4 pentru colectarea
amoniacului distilat).
 Pentru determinarea conţinutului de azot din diversele sale forme de existenţă se impune
cuplarea mineralizării prin dezagregare Kjeldahl cu antrenarea cu vapori și distilarea ȋn aparatul
Parnas –Wagner și cu titrarea inversă al cărei principiu a fost prezentat mai sus.Ȋn acest caz,se
supun analizei trei probe care se prelucrează,după cum urmează :

Proba 1-N din NH3 liber
antrenarea cu vapori de apă;
-captarea amoniacului ȋntr-un exces
de soluţie titrata de H2SO4
-titrarea excesului de H2SO4 cu o
soluţie standardizată de NaOH
Proba 2-N anorganic din NH3 si
NH4+
-alcalinizarea probei;
-separarea amoniacului prin distilare
ȋn aparatul Parnas-Wagner;
-titrarea distilatului
Proba 3-N total
-mineralizare prin metoda Kjeldahl;
-alcalinizarea cu vapori și distilarea
ȋn aparatul Parnass-Wagner;
-titrarea

Azotul din diferitele specii chimice eventual prezente ȋn mediile biochimice este rezultatul
următoarelor diferenţe :
N(din proba 2 ) - N(din proba 1 )= N din NH4+
N(din proba 3) - N(din proba 2)= Norganic și N din NO2- și NO3-

 DOZAREA AMINO-ACIZILOR
 
Neutralizarea reciprocă a grupărilor prezente ȋn aminoacizi (substanţe amfotere) ȋmpiedică
efectuarea cu rezultate satisfăcătoare a titrării grupei carboxil cu hidroxid de sodiu sau a titrării grupei
aminice cu acid clorhidric.Ȋn aceste condiţii,se impune o etapă preliminară de tratament al cărei rol
este de a se atenua manifestarea funcţiunii bazice,asfel ȋncat principiul metodei de dozare acido-bazică
ȋn mediu apos a amino-acizilor poate fi reprezentat schematic astfel :
TRATAREA soluţiei de analizat cu aldehidă formică : R-NH2 +O=CH2→R-N=CH2+H2O
Bază Schiff
↓
TITRAREA cu o soluţie standardizată de NaOH ȋn prezenţa timolftaleinei ca indicator

III.1.4. Titrimetria acido-bazică ȋn mediu neapos

Rezultatele promiţătoare obţinute la ȋnceputul secolului XX de

D.V.Orlander(care a titrat acizi slabi ȋn solvenţi organici), J.B.Connant,N.F.Hall și
T.H.Werner (care au efectuat titrări ȋn acid acetic anhidru) au fost aprofundate și
perfecţionate ȋn timp,lărgind considerabil aria posibilităţilor de dozare acido-bazică
a substanţelor ȋn general,și a celor organice ȋn special.
Ȋn multe cazuri,ȋn biochimia analitică,titrimetria acido-bazică ȋn mediu
neapos este metoda de elecţie,datorită următoarelor avantaje pe care le prezintă :
Simplitate,rapiditate și ușurinţă de aplicare;
Gama extrem de largă a substanţelor titrabile,care cuprinde:
• Substanțe insolubile în apa;
• Substanțe care formează în apă emulsii nestratificate;
• Substanțe care deși se dizolvă în apă nu prezintă puncte de echivalență
nete;
 • Izomeri;
• Combinații chimice din aceeași serie omologă;
• Amestecuri de acizi;
• Baze;
• Săruri.
 Exactitatea crescută a determinărilor
 Modificarea proprietăților chimice ale substanțelor: radicală dar într-o manieră care nu
afectează rezultatele determinărilor
 Posibilitatea determinării unor extracte în solvenți organici obținute din diferite
probe ,fara o prealabilă separare a componenților.

III.1.4.1.Solvenţi neapoși-clasificare si efecte asupra tăriei acido-bazice a

electroliților
Asupra analizei titrimetrice in mediu neapos își pun amprenta următorii factorii:
• Proprietățile acide sau bazice ale solventului;
• Proprietăţile electrice ale unui mediu,caracterizate prin mărimea constantei
dielectrice , (denumită si permitivitate);
• Tăria unui acid sau a unei baze in soventul respectiv.
În acest context ,principalele criterii de clasificare a solvenților sunt corelate cu acești
parametri.
 Tabelul III.4.Clasificara solventilor

Criteriul de clasificare Clasa de sovenți Definiție Exemple

Caracterul participării in APROTICI Compuși chimici inerți, Hidrocarburi
procesele acido-bazice ale căror molecule nu (hexan,benzen,toluen)
cedează si nici nu acceptă Derivați
protoni. halogenați(CCl4,CHCl3)

Substanțe care au
PROTOLITICI capacitata de a ceda sau
accepta protoni.

Combinatii chimice ale

Protogeni caror molecule au
(acizi) tendinta de a ceda protoni

Compuși chimici
Protofili acceptori de protoni
(bazici)
Substanțe care pot ceda
Amfiprotici sau accepta protoni
Natura efectului exercitat DE NIVELARE Solvenții in mediile Solvenți protofili
de solvenți asupra tăriei cărora se egalează tăriile caracterizati prin valori
relative a acizilor si DE DIFERENTIERE electroliților mari ale constantei
bazelor dielectrice
Solvenții care Solvenți aprotici
diferențiază tăriile
electroliților
Acizii sau bazele participa in solvenți neapoși la echilibre care pot fi
descrise succint astfel:formarea unei perechi de ioni → disocierea
perechii de ioni in ioni liberi.
Exemple:

Electrolitul Proprietațile solventul Echilibrele corespunzatoare

neapos SH

Acidul HA Bazice sau amfiprotice HA + SH ↔ SH+2*A- ↔ SH+2+ A-

Baza B Acide sau amfotere B+SH ↔ BH+ *S- ↔BH+ +S-

În condițiile în care echilibru acido-bazic într-un solvent amfiprotic SH este asimilat cu
o reacție conjugată,este valabilă următoarea corelație:
KS =KHA*KB
Dependența exprimată prin ecuația de mai sus poate fi interpretată astfel:
Produsul dintre constanta de aciditate si constanta bazei conjugate este egal cu marimea
constantei de autoprotoliza a solventului respectiv. In mod asemănător apei valoarea
constantei de autoprotoliză unui solvent amfiprotic determină scara aciditații
solventului respectiv,care din punct de vedere practic are următoarea semnificație:cu
cât este mai largă,cu atât salturile de pH in timpul titrării sunt mai pronunțate.Acest
fapt oferă posibilitatea titrărilor diferențiate ale amestecurilor de electroliți.
Cea mai largă utilitate practică au solvenții ale căror scări relative de aciditate au fost
stabilite in raport cu acidul percloric si hidroxidul de tetraetilamoniu.
Studiile efectuate asupra soluțiilor de electroliți in medii neapoase au relevat faptul că
tăria acidă sau bazică a uneia sau aceleasi substanțe se modifică semnificativ in
funcție de acțiunea cumulativă a mai multor factori ,intre care determinante sunt
proprietațile acido-bazice ale dizolvantului.
•În mediul solvenților protogeni,scaderea numărului de substanțe care iși manifestă
proprietățile acide este insoțită de creșterea numărului de compuși chimici având
caracter bazic (de exemplu ,in acid acetic glacial,manifestarea proprietăților acide ale
unor acizi carboxili dispare,acizii tari in apa devin slabi,iar bazele iși intensifică
proprietățile bazice)
•Acțiunea solvenților protofili se soldează cu creșterea tăriei acizilor (care din slabi in
apă pot deveni tari)si diminuarea bazicității unor substanțe;
•Gradul de reducere a tăriei acizilor și a bazelor in mediul unor solvenți amfiprotici
este dependent de constantele lor dielectrice si de posibilitatea formării legăturilor de
hidrogen;
•În solvenții aprotici ,acizii tari devin slabi ,iar tăria acizilor slabi se modifică intr-o
măsură nesemnificativă.
•Acțiunea de diferențiere si nivelare ,guvernată de aceeași factori care determină și
modificarea tăriei acido-bazice(caracterul acido–bazic al solvenților valoarea constantei
dielectrice ,capacitatea de solvatare)este descrisă succint in tabelul III.5
Natura solventului Acțiunea de diferențiere și de nivelare în funcție de:
Proprietățile acido-bazice ale Constanta dielectrica
solventului
SOLVENȚII Micșoreaza și diferențiază Cu valori mari ale constantei
PROTOGENI tăria acizilor dielectrice au o acțiune de
Măresc și nivelează tăria diferențiere mai puternică
bazelor decât cei ale căror constante
sunt mici
SOLVENȚII Măresc și nivelează tăria Ale caror constante
PROTOFILI acizilor dielectrice sunt mari nivelaza
Micșorează și diferențiază tăria acizilor,iar cei
tăria bazelor caracterizați prin constante
dielectrice mici diferențiaza
tăria acizilor
SOLVENȚII Prezintă acțiune de
AMFIPROTICI diferențiere mai accentuată
decât acțiunea de
nivelare,atât pentru acizi cât
și pentru baze.
SOLVENȚII Este eliminată problema Au acțiune de diferențiere
APROTICI nivelării ,datorită valorilor mici ale
constantelor dilectrice
III.1.4.2 Alegerea solventilor ,titrantilor si indicatorilor pentru
determinari titrimetrice in medii neapoase

La baza alegerii solventului neapos in mediul caruia dozarea

titrimetrica a unei substante se poate efectua in conditii
optime(tabelul III.6.)stau criterii de tipul:
-Cea mai mica valoare a raportului dintre constanta de
autoprotoliza a solventului(Ks)si constanta de disociere a acidului
sau a bazei ;
-Proprietăți de diferentiere cat mai accentuate(mai ales in cazul
titrarii amestecurilor de componenti)
 Tabelul III.6.Alegerea mediului neapos de titrare

Titrantul Solvenții utilizați

Substanțe cu -bazici,cu valoare ridicată a constantei dielectrice
proprietăți acide Amfiprotici(alcooli,cetone,nitrili)
Aprotici
Amestecuri de soventi
Substanțe care Acizi ,cu valoare ridicată a constantei dielectrice
manifestă caracter Amfiprotici
bazic Aprotici
amestecuri de solvenți
Amestecuri de acizi Cetone
tari,acizi slabi si acizi nitrili
foarte slabi Amestecuri de hidrocarburi cu nitrili si cetone

Amestecuri de baze Cetone,nitrili,nitroderivati

Amestecuri de hidrocarburi cu cetone si nitrili
Uneori titrarea amestecurilor de baze slabe se efectueaza în acid
acetic anhidru
Săruri care în medii Mediul de titrare se alege dupa aceleași criterii ca și în cazul acizilor
neapoase își sau bazelor
manifestă caracterul
acid sau bazic
• Stabilirea punctului de echivalenta al titrarilor in mediu
neapos se face frecvent cu indicatori (tabelul III.7.)al
caror mecanism de functionare este asemanator celor
utilizati in solutii apoase.
• In principiu ,de exemplu in solventi protogeni(acid
acetic anhidru)au larga aplicabilitate indicatorii cu
functie bazica.Conditia care se impune este ca acestia
sa formeze cu solventul ,perechi de ioni care trebuie sa
fie mai putin stabile decat perechile de ioni care s-ar
forma intre baza titrabila si solventul neapos.
• In mod uzual,pentru marcarea punctului de echivalenta
in determinarea titrimetrica a acizilor se recurge la
timolftaleina sau albastru de bromtimol.La dozarea
substantelor cu functie bazica rolul de indicator este
indeplinit de cristal violetul,rosu de
chinaldina,albastrutimol,verdele de bromcrezol.
Ca titranti se utilizeaza frecvent acizi sau baze tari.In
general,solutiile de titrant se prepara in solventul
in care se executa titrarea.
Astfel,pentru determinarea combinatiilor ,care,in
mediu neapos manifesta proprietati bazice ,se
recurge la titranti acizi cum ar fi:
• Acidul percloric in acid acetic glacial;
• Acidul percloric in dioxan ,alcooli sau cetone;
• Acizii alchilsulfonici;
• Acidul p-toluensulfonic;
• Acidul 2,4-dinitrobenzensulfonic;
• Acidul 2,4,6-trinitrobenzensulfonic;
• Acidul fluorosulfonic;
• Acidul triflorometansulfonic.
 Tabelul III.7. Indicatori folosiți în titrarile in mediu neapos
Solventul Indicatorul Virajul
Acid acetic anhidru Soluție 0,1 – 1% de cristal Violet albastru închis
violet în acid acetic →albastru verzui →verde
gălbui
Solutie 0,5% de roșu crezol galben→roz→roșu
in acid acetic
clorbenzen(1:1)
Acetona Soluție 0,2% de Incolor→albastru
timolftaleină în metanol
Soluție 0,2% de fenolftalină incolor→roșu
în metanol

Benzen Soluție saturată de incolor→roșu

fenolftaleina in benzen
Soluție saturată de verde Albastru→galben
de bromcrezol în benzen
Diclorometan Soluție 0,1% de Galben →roz
aminoazobenzen în
cloroform
 În calitate de titrant al substanîelor care în medii neapoase funcționeaza ca acizi pot fi folosite
numeroase baze, între care se remarcă: hidroxizii sau alcoolatți de tetraalchilamoniu ;metoxidul de
sodiu; metoxidul de potasiu; mono-,di- și tributilamina;trietilamina; piridina; hidrurile metalice.

III.1.4.3. Aplicații de importanță biochimică

1. TITRAREA SUBSTANȚELOR CU FUNCȚIUNI BAZICE (amine, amino-acizi,
alcaloizi, vitamine, antibiotice)
 Medii de titrare
Proprietățile bazice ale substanțelor dozabile acidimetric se manifestă în solvenți protogeni,
amfiprotici, aprotici și amestecuri de solvenți.
Dintre solvenții protogeni se remarcă acidul acetic anhidru, care are cea mai mare aplicabilitate,
deoarece oferă posibilitatea titrării diferențiate a amestecurilor de două ,trei și patru baze. În afară de
acid acetic, titrarea bazelor se poate efectua și în anhididra acetică, acid formic sau amestecuri de
acid acetic + anhidrida acetică; acid acetic + acid formic etc.
Caracterizați prin bune proprietăți de diferențiere, solvenții amfiprotici (acetona, ciclohexanul,
acetonitrilul)se folosesc ca medii de titrare a bazelor individuale și a amestecurilor multicomponente
de baze tari și slabe, obținaâdu-se puncte de echivalență mai nete decât în cazul solvenților
protogeni.
Unele dozări acidimetrice se realizează în solvenți aprotici (benzen, cloroform, dicloretan) care
au avantajul de a asigura mărirea constantelor dielectrice ale substanțelor titrabile.
 Soluții titrante
Cei mai utilizați titranți sunt soluțiile 0,2-0,02N de acid percloric și acid clorhidric, preparate în
solvenții în care se execută titrarea. Pentru stabilirea titrului acestor soluții se utilizează carbonatul
de sodiu anhidru, ftalatul acid de potasiu, difenilguanidina.
 Exemple reprezentative
 AMINELE în acid acetic anhidru sunt titrate cu o soluție de acid percloric în acid
acetic, pe baza următoarelor reacții:
R-NH2 + CH3COOH ↔ RNH3+ + CH3COO-
HClO4 + CH3COOH ↔ CH3COOH2+ + ClO-4
RNH3++ ClO-4  R-NH2 + HClO4
CH3COOH2++ CH3COO-  2 CH3COOH
R-NH2 +HClO4↔ RNH2 *HClO4
 AMINO-ACIZII în mediu de acid acetic anhidru pot fi titrați direct cu soluții de
acid percloric de concentrații exact și precis cunoscute. Pentru dozarea amino-
acizilor insolubili în acid acetic anhidru se folosește tratarea cu o soluție
standardizată de acid percloric în exces și retritarea acestuia cu o soluție de acetat
de sodiu în prezența indicatorului cristal violet.
 COMBINAȚIILE CARBONILICE de tipul semicarbazonelor , fenilhidrazonelor,
4-nitrofenilhidrazonelor manifestă în mediu de anhidridă acetica proprietăți bazice
accentuate și pot fi dozate prin titrarea cu solutții de acid percloric.

2.TITRAREA COMBINAȚIILOR CU PROPRIETĂȚI ACIDE (fenoli,

acizi grași, acizi dicarboxilici, anhidride și cloruri acide)
 Medii de titrare
Pentru executarea dozărilor alcalimetrice ale combinațiilor care în mediu neapos
manifestă proprietăți acide se folosesc solvenți protolitici si aprotici (tabelul III.8 )
Clasă de solvenți Exemple Substanțe titrabile

PROTOLITICI Dimetilamina
protofili Etilendiamina
Piridina Acizi foarte slabi
Dimetilformamida

protogeni Acid formic

Acid acetic Acizi minerali slabi in
Acid propionic prezența acizilor organici

amfiprotici Alcool metilic

Alcool etilic
Acool izobutilic Acizi și amestecuri de acizi
Metiletilcetona
Acetonitrilul
APROTICI Cloroformul Acizi tari
Tetraclorura de carbon Acizi slabi
Benzenul Acizi foarte slabi
toluenul Amestecuri de acizi
 Pentru dozarea acizilor organici greu solubili se folosesc
amestecuri glicolice (glicoli+alcooli; glicoli+cetone;
glicoli+hidrocarburi).

Soluții de titranți
Pentru titrarea combinațiilor de importanță biochimică având
proprietăți acide accentuate in medii neapoase pot fi utilizați
următorii titranți:
- baze anorganice (soluții metanolice si etanolice de hidroxid de
potasiu si hidroxid de sodiu);
- baze organice (soluții de amine: piridina, mono-, di-, și
tributilamina, trietanol-n-amina etc.);
- acetații metalelor alcaline;
- alcoolații metalelor alcaline (sodiu, potasiu, litiu)
Pentru standardizarea acestor baze se utilizează frecvent
acidul benzoic și acidul salicilic.
 Exemple ilustrative
• ACIZII GRAȘI SUPERIORI (monocarboxilici) insolubili în apă se
titrează cu grad înalt de precizie în alcooli, cetone, cloroform, benzen,
toluen, piridină, etilendiamină. Reacțiile care la titrarea unui acid slab HA
cu o soluție metanolică de hidroxid de tetraetil-amoniu în mediu de
piridină si alcool etilic sunt:
HA+ C5 H5N ↔ C5 H5NH++ A- HA+ C2H5OH ↔C2H5OH2++ A-
(C2H5)4NOH ↔ (C2H5)4N++ OH- (C2H5)4NOH ↔ (C2H5)4N+
+OH-
(C2H5)4NOH+ HA ↔ (C2H5)4NA+H2O
(C2H5)4NOH+ HA↔ (C2H5)4NA+H2O
• FENOLII se titrează cu rezultate satisfăcătoare in solvenți bazici,cum sunt
piridina si etilendiamina.Derivații fenolilor care conțin in pozițiile orto- si
para- grupa aldehidică,cetonică,esterică sunt acizii mai tari decât fenolii
nesubstituiți si pot fi titrați in mediu de dimetilformamidă.Rezorcina poate
fi titrata cu succes si in acetonț sau metil –etil cetonă.
• ACIZII DICARBOXILICI se comportă in soluții neapoase ca amestecuri
de acizi cu tarii diferite.De aceea,titrarea acizilor dicarboxilici se face in
solvenți de diferențiere(alcool
izopropilic,acetonă,acetonitril,benzen,cloroform)cu soluții alcoolice de
hidroxid de potasiu sau soluții neapoase ale unor baze cuaternale de
amoniu.
 III.1.5.Titrimetria prin reacții redox

Titrimetria prin reacții redox este guvernată de interacțiunea dintre substanțe cu caracter
oxidant si substanțe cu caracter reductant,a căror formă generală este:
Ox1+red2↔red1+ox2
Utilizarea unei reacții de acest tip în determinările volumetrice este condiționată de măsura în
care aceasta răspunde următoarelor cerințe esențiale:
•să conducă la transformări cantitative;
•să decurgă cu viteză mare;
•să permită sesizarea cu ușurință a punctului de echivalență.
Metodele titrimetriei redox pot fi impărțite în două grupe mari :
1.metode de determinare a substanțelor cu caracter reducător folosind ca titranți substanțe
oxidante:
– permanganometria (titrantul este o soluție de permenganant de potasiu);
– bicromatometria (soluția titrantă este de bicromat de potasiu);
– iodometria (reactivul de titrare este o soluție apoasă de iod )
2.metode de determinare a substanțelor cu caracter oxidant ,utilizând drept titranți soluțiile unor
substanțe reducătoare: tiosulfat de sodiu, sulfat feros etc.
Criteriile de baza in alegerea reactivului de titrare ,coreapunzator naturii speciei care se
determina,sunt diferenta dintre potentialele redox standard si numarul de electroni care se schimba
intre cuplurile redox implicate.
Pe parcursul adaugării titrantului astfel selectat se produc variații de potențial corespunzatoare
modificărilor conținue ale concentrațiilor formelor oxidată și redusă care alcatuiesc sistemul de
analizat. Aceste procese sunt reprezentate grafic prin intermediul curbelor de titrare redox, care
descriu dependența dintre variația potențialului redox al sistemului titrat-titrant și procentul sau
volumul de soluție titrantă adăugat.
 Curbele de titrare redox se compun din două ramuri cu un salt de potențial
corespunzător procentului de titrant de 100% (punctul de echivalență).
Sesizarea vizuală a punctului de echivalență în titrimetria redox este posibilă:
 cu indicatori redox, prezentați în tabelul III.2.
 prin autoindicare, atunci când una dintre substanțe participante la titrare este
colorată.
Într-o titrare redox selectarea celui mai potrivit indicator se face luând în
considerare :
 domeniul de viraj (intervalul de potențial în care se produce modificarea
proprietății indicatorului redox)care trebuie să fie situat cât mai în interiorul
saltului de potențial redox din jurul punctului de echivalență.
 valoarea potențialului punctului final al titrării (când se sesizează cel mai
bine schimbarea de proprietate)să fie cât mai apropiată de cea a potențialului
de echivalență.
Impactul metodelor titrimetriei redox in biochimia analitica este ilustrat în
continuare prin cateva aplicatii de larg interes:

DOZAREA OXIGENULUI
Datorită influenței sale asupra microorganismelor, oxigenul reprezintă un
parametru chimic de maximă importanță pentru majoritatea proceselor biochimice
(tabelul III.9.)
Tabelul III.9. O2 –Indicator la intensității metabolismului energetic al microorganismelor
 Cantitatea de oxigen consumată în cursul unui proces biochimic
corelată cu dioxidul de carbon format depinde de stoechiometria
reacțiilor biochimice desfășurate. De aceea, cunoașterea cantitativă a
acestui indicator oferă informații de maximă utilitate asupra
mecanismelor care stau la baza producerii unor reacții biochimice.
Metodele titrimetrice de determinare a oxigenului din medii
biochimice sunt guvernate de abilitățile oxidante ale O2față de anumite
substanțe reducătoare.Între acestea,se remarcă metodele Winkler și
Cooper.

•Metoda Winkler
Elaborată în anul 1888,metoda Winkler se bucură și astăzi, datorită
rezultatelor satisfăcătoare pe care le furnizează, de o largă
aplicabilitate în dozarea O2 dizovat în diferite medii biochimice.
Principiul metodei
La baza metodei stă o serie de reacții chimice a căror succesiune
este redată schematic în figura III.3.
OXIDAREA cantitativă a hidroxidului de mangan de către O 2 conținut în
proba supusă analizei : 2 Mn(OH)2+ O2 → 2HMnO3

Acidularea probei

ELIBERAREA DE IOD prin reacția acidului manganos cu iodură de sodiu

sau de potasiu, în exces :
H2 MnO3+2I-+6H+↔I2+Mn2++3H2O
Mn4+2e-↔Mn2+
2I-↔I2+2e-

TITRAREA IODULUI ELIBERAT cu o soluție de tiosulfat de sodiu de

concentrație exact si precis cunoscută:
2Na2S2O3+I2→Na2S4O6+2NaI
2S2O32-↔S4O62-+2e-
I2+2e-↔2I-

Figura III.3. Reprezentarea schematică a principiului metodei Winkler.

 Pentru indicarea sfârsitului reacției în titrarea iodului cu soluția de tiosulfat de
sodiu se folosește amidonul,care formează cu iodul elementar un compus de
incluziune de culoare albastru intens,care dispare odată cu reducerea iodului:
I2 +amidon ↔I2 Amidon (albastru)
↓+Na2S2O3 → 2I- +Amidon (incolor)
Iodul pus în libertate în urma titrării probei de analizat cu soluție alcalină de
iodură de sodiu sau de potasiu este în cantitate echivalntă cu cea de oxigen. În aceste
condiții calculul cantității de oxigen dizolvat în medii lichide, dozabil prin metoda
Winkler se bazează pe corespondența:
lEo2...................lEH2MnO3……………….lEl2……………….lENa2S2O3

Observații:
•Efectuarea propriu-zisă a determinărilor de O2 dizolvat prin metoda Winkler
trebuie să fie precedată de adăugarea în probele investigate de sulfat de cupru și acid
sulfanilic (pentru precipitarea produselor biologice și inhibarea activității biologice).
•În scopul anihilării efectului prezenței unor specii chimice (oxidante sau
reducătoare)interferente au apărut diferite variante înbunatățite ale metodei
Winkler.În condițiile în care una dintre speciile cu cea mai importantă acțiune
interferentă este ionul azotic, o variantă a metodei Winker utilizează reducerea
azotiților din proba biochimică de analizat cu azidă de sodiu , Na N3 care se adaugă
în soluție alături de iodura alcalină și mascarea Fe3+ cu acid fosforic sau florură de
potasiu.
• Metoda Cooper
Datorită simplității ei ,metoda Cooper este extrem de utilizată ,atât în activitățile de cercetare
cât și în industria de biosinteză pentru determinarea consumului de oxigen al
microorganismelor sau pentru estimarea eficacității dispozitivelor de aerație ale
bioreactoarelor.
Principiul metodei
 Oxidarea rapidă a sulfitului de sodiu de către oxigenul dizolvat în proba biochimică,în
prezența catalitică a unor cantități mici de ioni ai metalelor tranziționzle ,cum ar fi Cu2+ sau
CO2+ Pentru efectuarea analizei ,un volum de soluție titrată de sulfit de sodiu ,determinat
astfel încât după ce are loc reacția cu oxigenul din proba ,sulfitul să rămână în exces ,se
tratează cu proba de analizat:
Na2SO3( EXCES)+O2→ Na2SO4+ Na2SO3( EXCES)
 Tratarea rapidă a probei cu un volum determinat dintr-o solutie titrată de iod, luată în exces:
Na2SO3( EXCES)+I2+H2O → 2NaI+H2SO4+I2 EXCES)
SO32-+H2O-2e ↔ SO42-
I2+2e ↔ 2I-
 Titrarea excesului de iod cu o soluție standardizată de tiosulfat de sodiu când are loc reacția:
I2(exces)+2 Na2S2O3 → 2NaI+ Na2S4O6
Conform acestui principiu, metoda Cooper permite tot determinarea indirectă a
oxigenului dintr-o proba , în funcție de tiosulfatul de sodiu consumat la titrare, în prezența
amidonului utilizat ca indicator.
 DETERMINAREA ZAHARIDELOR

Din punct de vedere analitic, zaharidele, care reprezintă importante surse de carbon pentru mediile de cultură,
se diferențiază astfel:
- grupa zaharidelor reducătoare (zahăr reducător) – cuprinde aldozele a căror grupare aldehidică poate fi
oxidată; sunt exprimate, uzual, în glucoză;
- grupa zaharidelor nereducătoare: fructoza, zaharoza, amidonul, celuloza etc.;
- grupa zaharidelor totale, în care sunt incluse atât zaharidele reducătoare cât și cele nereducătoare.
În cele mai multe cazuri, metodele chimice de dozare a zaharidelor se bazeaza pe proprietățile lor reducătoare.
Zaharidele nereducătoare sunt supuse în prealabil unei hidrolize acide, soldată cu obținerea de glucoză, care se
poate doza prin metode specifice (Fehling, Ionescu-Matiu).

• Metoda Fehling
Denumită după reactivul de bază (soluția Fehling), a cărui componentă de bază care este redusă de funcțiunea
aldehidică a glucidelor la oxid cupros, această metodă este aplicabilă pentru dozarea zaharurilor reducătoare.
Soluția Fehling se obține prin amestecarea unor volume egale de soluție de sulfat de cupru (40g
CuSO4x5H2O/L soluție) și de sare Seignette (tartrat dublu de sodiu și potasiu) (200 g sare Seignette + 150 g
NaOH/L soluție), însoțită de producerea reacței:
2 CuSO4 + 4 NaOH Sare Siegnette (CuOH)2O + 2 Na2SO4 + H2O
albastru

În prezența zaharidelor reducătoare (cum este de exemplu glucoza), oxidul bazic de cupru astfel format se
reduce la oxid cupros, Cu2O, de culoare roșie. În același timp, funcțiunea aldehidică a glucozei se oxidează,
conform reacției:
CHO COOH
 
(CuOH)2O + (CH -OH)4  Cu2O + (CH -OH)4 + H2O
 
CH2OH CH2OH
În continuare, se poate adopta una dintre variantele de titrare descrise succint în tabelul III.10. 144
 Tabelul III.10. Variante de titrare caracteristice dozării glucidelor prin metoda Fehling.

Varianta Principiul Indicatorul

titrimetrică
IODOMETRICĂ - tratarea excesului de oxid bazic de cupru cu o soluție de iodură
de potasiu, în exces:
(CuOH)2O + 4KI + 2H2SO4  I2 + 2CuI + 2K2SO4 + 3H2O Amidon

- cantitatea echivaletă de iod astfel eliberată se titrează cu o soluție

standardizată de tiosulfat de sodiu:
2Na2S2O3 + I2  2NaI + Na2S4O6

PERMANGANO- - oxidarea Cu2O format cu sulfat feric, în mediu acid:

METRICĂ Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4  CuSO4 + 2FeSO4 + H2O

- titrarea cantității echivalente de sulfat feros, FeSO 4 , obținută în KMnO4

urma reacției de mai sus, cu o soluție de permanganat de potasiu
de concentrație exact si precis cunoscută, la pH=0:
10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4  5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO4 +
8 H2O

145
• Metoda Ionescu-Matiu
Această metodă se poate utiliza în 2 variante pentru dozarea glucozei din medii biochimice:
1. Titrarea soluției de analizat care conține glucoză cu fericianura de potasiu, în mediu alcalin:
CHO COOH
 
(CH -OH)4 + 2K3[Fe(CN)6] + 2KOH  (CH -OH)4 + 2K4[Fe(CN)6] + H2O
 fericianura de potasiu  ferocianura de potasiu

CH2OH CH2OH

Pentru sesizarea sfârșitului acestei titrări se folosește ca indicator acidul picric.

2. Ferocianura de potasiu rezultată prin tratarea unei anumite cantități de probă de analizat cu un
volum determinat, în exces de fericianură de potasiu, conform reacției de mai sus este titrată, în
mediu acid, cu o soluție standardizată de permanganat de potasiu:
5K4[Fe(CN)6] + KMnO4 + 4 H2SO4  5K3[Fe(CN)6] + MnSO4 + 3K2SO4 + 4H2O

Precizare
Aplicarea oricăreia dintre metodele descrise este jenată de substanțele proteice prezente întotdeauna
în cantități semnificative în toate mediile de cultură. De aceea, acțiunea interferentă a compușilor
proteici este anihilată prin precipitarea lor cu ferocianură de zinc, Zn4[Fe(CN)6] 2, preparată prin
amestecarea unor soluții de acetat de zinc și ferocianură de potasiu.

146
 METODA KARL-FISCHER

Bazată pe reacția de reducere cantiativă a iodului de către dioxidul de sulf, în prezența apei (I 2 + SO2 +
2H2O  2HI + H2SO4), metoda Karl-Fischer este de notorietate pentru determinarea umidității unor
produse. Se aplică, în special, probelor cu un conținut scăzut de apă, cum sunt unele produse
medicamentoase obținute prin biosinteză sau diferite produse cerealiere folosite ca materii prime în
diferite biotehnologii. De asemenea, prin intermediul metodei Karl-Fischer poate fi determinată
indirect și o gamă vastă de substanțe care reacționează cantitativ cu apa sau produc apă pe parcursul
desfășurării unor reacții de hidroliză și, respectiv deshidratare.

Principiul metodei
În fapt denumirea de Karl-Fischer este atribuită unei metode de titrare redox în mediu neapos. Mediul
de titrare este constituit din piridină (Py) și exces de metanol (CH 3OH) în care oxidantul (I2) și
reducătorul (SO2) implicați în reacția de bază a metodei se găsesc în forme asociate:
I2 + Py  Py I2
SO2 + Py  Py SO2
Reacția redox se desfășoară în 2 etape succesive, care necesită prezența apei și, respectiv a metanolului:
1. Py I2 + Py SO2 + Py + H2O  2PyH+ I- + Py SO3
2. Py SO3 + CH3OH  PyHSO3 O  CH3
În aceste condiții reacția redox globală care stă la baza metodei Karl- Fischer îmbracă forma:
I2 + SO2 + 3Py + CH3OH + H2O  2PyH+ I- + PyHSO3 O  CH3
Reactiv Karl- Fischer.
147
Observații
 În multe cazuri, pentru a se evita acțiunea interferentă a unor oxidanți sau reducători, se
recomandă cuplarea metodei Karl- Fischer cu separarea apei prin distilare azeotropă.
 În serii mari, determinarea apei prin metoda Karl- Fischer se execută cu ajutorul unor biurete
special destinate acestui scop.

III.2. Analiza gravimetrică

III.2.1. Principiul analizei gravimetrice

Gravimetria (gravis = greu și metron = măsură) se bazează pe măsurarea directă a masei cu ajutorul
balanței analitice.
Principiul metodei de determinare gravimetrică a unui analit poate fi redat schematic astfel:

Transformarea speciei de analizat într-un compus de compoziție chimică stabilă și cunoscută.

Separarea compusului obținut de ceilalți componenți ai probei.

Cântărirea lui la balanța analitică

Calculul concentrației speciei determinate

148
 În funcție de tehnicile utilizate pentru obținerea și separarea compusului supus ulterior cântăririi, se
disting următoarele variante ale analizei gravimetrice
gravimetria de precipitare, în care analitul este precipitat din soluția apoasă a probei sale, cu ajutorul
unui reactiv adecvat;
gravimetria bazată pe formarea de combinații volatile, care include metode în care se poate măsura:
- pierderea de masă a probei analizate (de exemplu determinarea umidității);
- creșterea de masă, datorată absorbției unei combinații gazoase într-un mediu adecvat ( de exemplu:
Canorganic combustie CO2 (g) absorbție sol. NAOH ).
electrogravimetria, în cadrul căreia se cântărește un electrod, înainte și după efectuarea unui proces de
electroliză, soldat cu depunerea compusului de analizat.
Caracteristicile definitorii ale metodelor gravimetrice sunt nivelurile ridicate ale exactității și preciziei
lor. În acest context, analiza gravimetrică este deosebit de utilă pentru:
- dozarea unor componenți majori sau minori ai probelor de analizat;
- stabilirea concentrației exacte a unor soluții;
- verificarea altor metode cantitative de determinare.
Principalele dezavantaje ale metodelor gravimetrice sunt corelate cu faptul că acestea implică un
volum mare de operații a căror executare necesită un timp relativ îndelungat.
Cea mai mare aplicabilitate practică au metodele gravimetriei de precipitare. Aceasta este guvernată de
precipitarea speciei chimice de analizat (cation sau anion) sub forma unui compus greu solubil și
prelucrarea ulterioară a acestuia, soldată cu obținerea unei combinații stoechiometrice, de compoziție
cunoscută, care poate fi în final cântărită cu precizie, la balanța analitică.
Compusul greu solubil obținut în urma precipitării se numește formă de precipitare.
149
Combinația chimică, de compoziție bine definită și stabilă, rezultată prin prelucrarea precipitatului poartă
numele de formă gravimetrică (formă de cântărire).
Obținerea informațiilor cantitative se bazează pe corelațiile de masă dintre proba de analizat și
forma de cântărire. Asigurarea valabilității acestor corelații presupune respectarea următoarelor condiții:
•precipitarea totală a speciei de analizat, sub forma unei combinații greu solubile, cu un grad cât mai
redus de impurificare;
•stoechiometria și stabilitatea formei gravimetrice.
O analiză gravimetrică se descrie prin următoarea succesiune de etape:
- cântărirea probei de analizat;
- solubilizarea probei de analizat;
- precipitarea speciei de analizat;
- prelucrarea formei de precipitare
• filtrarea precipitatului;
• spălarea precipitatului;
• tratamentul termic (uscarea și calcinarea);
- cântărirea formei gravimetrice;
- calculul rezultatelor analizei.
Efectuarea propriu-zisă a fiecăreia dintre aceste operații este precedată de selectarea judicioasă a
condițiilor experimentale optime, în scopul minimalizării erorilor.

150
 III.2.2. Particularitățile etapelor specifice analizei gravimetrice de precipitare

A. Percipitarea
Operați de precipitare decurge cu transformarea unei combinații solubile într-un compus puțin disociat,
greu solubil care se numește precipitat.
Formarea unui precipitat este un proces complex, multifazic a cărui desfășurare este condiționată de
atingerea valorii produsului de solubilitate corespunzător, de către produsul concentrațiilor ionilor unui
precipitat. Astfel pe parcursul adăugării progresive a unor cantități mici de reactiv în soluția de analizat,
procesul de precipitare evoluează conform următoarei scheme simplificate:
soluție nesaturată a precipitatului  soluție saturată a precipitatului  soluție suprasaturată a
precipitatului  germeni de cristalizare (cristalite)  particule coloidale  microcristale 
macrocristale.
Din punct de vedere al analizei gravimetrice przintă relevanță numai acele precipitate care răspund
următoarelor cerințe:
• valori cât mai mici ale solubilității (S < 10 -5 moli/l);
• structuri morfologice adecvate unei filtrări rapide și unei spălări practic complete a impurităților;
• compoziție chimică bine definită și constantă sau capacitate de transformare într-o astfel de
combinație.
Pentru asigurarea îndeplinirii acestor condiții, metodele gravimetrice se bazează pe:
- utilizarea unui exces de reactiv precipitant, de regulă 10-50  față de cantitatea teoretic necesară
(efectul ionului comun de micșorare a solubilității precipitatelor);
- alegerea, în măsura posibilităților existente, a unor precipitate cristaline care nu absorb impurități, se
depun rapid și sunt ușor de filtrat și spălat ;
- folosirea tratamentelor termice (uscarea și calcinarea) soldate cu obținerea unor forme gravimetrice,
supuse ulterior cântăririi la balanța analitică.
151
 Se estimează că, deși nu răspund întotdeauna condițiilor impuse în gravimetrie, cea mai largă utilizare o
au reacțiile anorganice de precipitare a speciilor ionice de analizat sub formă de hidroxizi și sulfuri, sulfați,
fosfați. De o deosebită importanță sunt reactivii precipitanți organici. Aceștia formeză combinații complexe
greu solubile, între care, din punct de vedere al analzei gravimetrice, se remarcă: complecșii interni
(chelați), complecșii de tip sare și aminele complexe. Acești produși greu solubili au proprietăți specifice,
stabilitatea termică fiind una dintre cele mai reprezentative pentru scopurile gravimetrice.

B. Prelucrarea formei de precipitare

1. Filtrarea precipitatelor
În determinările gravimetrice, prin filtrare se realizează separarea cantitativă a precipitatului de soluția în
care s-a format.
În determinările gravimetrice frecvente, pentru efectuarea operației de filtrare se pot utiliza hârtiile de
filtru cantitative sau creuzetele filtrante (tabelul III.11).
Tabelul III.11. Utilizarea tehnicilor de filtrare în practica analizei gravimetrice

Forma de precipitare Tehnica de filtrare Tratamentul termic ulterior

recomandată
Nu are o compoziție bine Prin hârtia de filtru cantitativă Calcinare
definită și stabilă
Este o combinație Prin creuzet filtrant Uscare
stoechiometrică de compoziție
cunoscută

152
 Hârtiile de filtru utilizate în analiza cantitatică sunt hârtii speciale, tratate, care în urma arderii lasă un
reziduu de cenușă sub limita de sensibilitate a balanței. Se particularizează prin puritate și porozitate.
Hârtiile de filtru cantitative trebuie să aibă un grad înalt de puritate, astfel încât calcinarea lor să decurgă
cu obținerea unei cantitâți de cenușă mai mică de 0,2 mg.
Pentru reținerea totală a precipitatelor, hârtia de filtru cantitativă trebuie să se caractrizeze printr-o
porozitate corespunzătoare. Porozitatea diferențiază între trei calități de hârtie de filtru cantitativă după
cum urmează:
•cu pori mari, utilizată pentru precipitatele gelatinoase (hidroxizi amfoteri, sulfuri metalice);
•cu pori medii, compatibile cu precipitatele macrocristaline (clorura de argint);
•cu pori mici, folosite în cazul precipitatelor microcristaline (sulfatul de bariu, oxalatul de calciu).
Creuzetele filtrante din sticlă se folosesc pentru filtrarea precipitatelor în a căror aducere la o compoziție
stabilă este implicată numai uscarea. Ele îndeplinesc triplu rol: de pâlnie, de filtru și de creuzet. Masa
filtrantă este reprezentată printr-o plăcuță de sticlă sinterizată, de o anumită porozitate. Deoarece sunt
foarte rapide, filtrările prin creuzet filtrant sunt eficiente pentru efectuarea unor determinări gravimetrice în
serie.

2. Spălarea precipitatelor
În scopul îndepărtării impuritățior reținute de precipitat și de filtru este operațională spălarea, care se
efectuează pe parcursul filtrării.
Compoziția lichidelor de spălare se selectează în funcție de natura precipitatului, după următoarele
criterii de bază:
• reacție negativă cu precipitatul și cu ionii reținuți de acesta;
•acțiune adsorbantă asupra ionilor străini de preecipitat;
•volatilitate, care permite îndepărtarea sa rapidă prin uscare și calcinare. 153
 În majoritatea cazurilor, spălarea precipitatelor se face cu apă distilată, soluții de electroliți, solvenți
organici (tabelul III.12).
Tabelul III.12. Lichide de spălare
LICHIDUL DE SPĂLARE CAZURI RECOMANDATE

Apă distilată Absența pericolului de pierdere de precipitat prin

Soluții diluate ale reactivilor de precipitare
Soluții de electroliți (acid clorhidric, săruri de
amoniu ale acizilor volatili etc.)
Solvenți neapoși (alcool, eter, acetonă)
solubilizare (precipitatele cristaline cu solubilitate
foarte mică)
Pentru situațiile în care cantitatea de precipitat
dizolvată la spălarea cu apă este mai mare decât
cea admisă într-o determinare gravimetrică.
Precipitate gelatinoase
Precipitate obținute cu reactivi organici

În practică, volumul de lichid necesar pentru o bună purificare și numărul de spălări în care se folosește
acesta sunt limitate de solubilitatea precipitatelor și de precizia balanței analitice la care se efectuează
cântărirea. Se estimează că, în timpul spălării, pierderea de precipiat prin dizolvare nu trebuie să
depășească 0,1 mg.
În general, pentru purificarea precipitatelor gelatinoase sunt suficiente 5-6 spălări. În cazul
precipitatelor cristaline, operația de spălare se repetă de 4-5 ori. La fiecare spălare, volumul de lichid
recomandat este de 5-6 ml.
154
 3. Tratamentul termic
În vederea obținerii formei gravimetrice stabile și de compoziție cunoscută, care să poată fi cântărită,
precipitatele, după ce au fost filtrate și spălate sunt supuse unui tratament termic. Prelucrarea termică a
precipitatelor poate consta din uscarea sau calcinarea lor. Cei mai importanți parametri sunt temperatura
și timpul tratamentului termic.
Principalul criteriu care stă la baza selectării temperaturilor la care se efectuează uscrea sau calcinarea
este acela ca rezuduul obținut să aibă o compoziție fixă.
Timpii de uscare sau calcinare sunt dependenți de natura formei precipitate și de cantitatea de precipitat.
Prelucrarea termică a precipitatelor se efectuează până la masă constantă, ceea ce înseamnă că, la
repetarea uscării sau calcinării, precipitatul nu mai pierde din masa lui.

• Uscarea
Efectuarea uscării vizează îndepărtarea excesului de lichid de spălare reținut de precipitat. Uscarea nu
afectează compoziția chimică a precipitatului. Uscarea poate fi singura formă de prelucrare termică a unui
precipitat sau se poate efectua în vederea calcinării acestuia.
În determinările gravimetrice în care forma de precipitare coincide cu forma de cântărire, precipitatele
filtrate prin creuzete filtrante sunt prelucrate termic numai prin uscare. Aceasta se poate realiza:
ola temperatura camerei
- în curent de aer uscat;
- în exicator, cu substanțe deshidratante (CaCl 2, H2SO4 concentrat, silicagel etc.);
- în vid.
ola temperaturi de 100- 200C, în etuve electrice termoreglabile;
ola temperaturi de 200- 400C, în blocuri metalice, cum este blocul de aluminiu.
155
• Calcinarea
Calcinarea vizează obținerea unei combinații stoechiometrice, de compoziție stabilă. Acest tip de
tratament termic constă în încălzirea precipitatelor (filtrate prin hârtia de filtru cantitativă) la
temperaturi ridictae (500- 1200C). Calcinarea înglobează:
o Arderea hârtiei de filtru și convertirea acesteia în cenușă;
o Transformarea chimică a precipitatului.
Calcinarea este o operație fundamentală în toate determinările gravimetrice în care forma de precipitare
este diferită de forma de cântărire. Pentru calcinarea precipitatelor a căror compoziție chimică nu este
bine definită sau constantă se folosesc creuzete de porțelan. Acestea se pregătesc, în prealabil, în
aceleași condiții în care va fi prelucrat termic și precipiatul.
Calcinarea se poate efectua la becurile de gaz sau în cuptoare electrice. Parametrii procesului
(temperatura și timpul de calcinare) sunt în strictă corelație cu natura precipitatului.

C. Cântărirea formei gravimetrice

Creuzetul răcit (de porțelan sau filtrant) conținând forma gravimetrică se cântărește la aceeași balanță
analitică la care s-a cântărit și creuzetul gol.
Cantitatea de formă cântărită se obține prin diferență între masele constante ale creuzetului cu precipitat
prelucrat termic și gol.

D. Calculul rezultatelor analizei

Unul dintre cele mai uzuale moduri de exprimare a rezultatelor unei analize gravimetrice este sub forma
conținutului procentual al speciei chimice determinate în proba analizată. La baza efectuării acestui
calcul stă egalitatea:
156
 x = Md
p Mc (III.8)
sau
x = p  Md
Mc

în care:
x= masa unei specii X (element, ion, compus) care se determină;
p= masa formei cântărite;
Md= masa atomică sau moleculară a speciei X care se determină;
Mc= masa moleculară a formei cântărite.
Dacă masa probei luată în analiză este a (g), raportul Md / Mc nu depinde de aceasta. Acest raport are o
valoare constantă în toate determinările gravimetrice de același tip și se numește factor gravimetric, factor
de transformare sau factor analitic (f).
Raportul dintre masa atomică sau moleculară (Md) a speciei analizate și masa moleculară a formei
cântărite (Mc), multiplicate, fiecare cu coeficienții stoechiometrici ai reacției de precipitare care stă la
baza definește factorul gravimetric.
Valorile acestor factori sunt înscrise în tabele specifice și stau la baza selectării celei mai adecvate
metode de determinare gravimatrică a unei specii chimice. Astfel cu cât valoarea factorului de
transformare este mai mică, cu atât precizia analizei gravimetrice este mai mare.
Prin urmare, cantitatea de specie care se determină gravimetric este produsul a 2 factori:
x =p  f ( III.9)
157
 În cazul considerat, conținutul procentual al speciei X se poate calcula conform relației:
X= 100  p  f
a
În biochimie, metodele gravimetrice sunt utilizate, în special pentru separarea proteinelor prin
precipitare. În soluții apoase, proteinele înglobează în molecula lor un număr destul de mare de molecule
de apă, ceea ce le asigură o solubilitate ridicată în astfel de soluții. Prin adăugarea unor reactivi organici
(de ex. alcool etilic, acid tricloracetic, acid picric) sau anorganici (săruri ale unor ioni metalici, acizi
minerali), moleculele de apă sunt înlocuite cu molecule de reactiv, și în consecință are loc precipitarea
reversibilă sau ireversibilă a proteinelor. Deoarece precipitarea proteinelor se bazează pe scăderea
solubilității acestora prin adăugarea unor reactivi adecvați, se poate spune că acest proces nu este unul
selectiv, iar utilizarea lui în analiza cantitativă este limitată.
Cu toate acestea, precipitarea prezintă importanță în îndepărtarea proteinelor a căror prezență deranjează
în lichidele biologice supuse analizei.

III.3. Bibliografie

1. P. V. Alexeevschi, R. K. Golt, A. P. Musakin, Analiza cantitatică, Editura Tehnică, București, 1995.

2. D. Bejan, D. Bîlbă, L.Tofan, D. Șuteu, C. Păduraru, L. Bulgariu, Metode chimice de analiză-
Îndrumar de laborator, Editura PERFORMANTICA, Iași, 2003.
3. D. Bîlbă, L. Tofan, Chimie analitică și analiză instrumentală (metode chimice)- Lucrări practice,
Editura PERFORMANTICA, Iași, 2003.

158
 4. D. Bîlbă, L. Tofan, Chimie analitică și analiză instrumentală- Lucrări practice, Editura
PERFORMANTICA, Iași, 2006.
5. C. Calu, Al. Duca, Al. Nacu, Chimie analitică și analiză instrumentală, vol.II, Institutul Politehnic
Iași (slitografiat), 1980.
6. C. Liteanu, E. Hopîrtean, Chimie analitică. Volumetria, Ediția a VI-a, Editura Didactică și
Pedagogică, București, 1972.
7.C. Luca, Al. Duca, Al. I. Crișan, Chimie analitică și analiză instrumentală, Editura Didactică și
Pedagogică, București, 1983.
8. V. Magearu, Controlul analitic al proceselor biotehnologice, Editura Tehnică, București, 1988.
9. Gh. Morait, L. Roman, Chimie analitică, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1983.
10. I. Sârghie, Titrimetrie, Universitatea Tehnică “Gh. Asachi” Iași (curs litografiat), 1993.
11. I. Sârghie, L. Tofan, D. Șuteu, L. Bulgariu, G. Rusu, Analiza cantitativă- Lucrări practice, , Editura
PERFORMANTICA, Iași, 2005.
12. , L. Tofan, D. Șuteu, Chimie analitică I, Universitatea Tehnică “Gh. Asachi” Iași (curs litografiat),
2001.
13. S. Fișel, A. Bold, R. Mocanu, I. Sârghie, Chimie analitică cantitativă. Gravimetria, Editura
Didactică și Pedagogică, București, 1973.
14. GR. Popa, V. Croitoru, Chimie analitică. Gravimetria, Editura Didactică și Pedagogică, București,
1971.

159
 CAP. IV. METODE DE SEPARARE ȘI CONCENTRARE
IV.1. Considerații generale
IV.2. Mecanisme de separare
IV.3. Clasificarea și caracterizarea metodelor de separare
IV.4. Particularitășile metodelor de separare-concentrare în analiza compușilor
biochimici
IV.5. Bibliografie
IV.1. Considerații generale
Separarea produsului util (proteine, enzime, aminoacizi, medicamente etc.) din mase de fermentație sau
din produse naturale de compoziție complexă reprezintă o etapă de importanță excepțională în
biotehnologii.
În general, mediile de fermentație se caracterizează prin comportare nenewtoniană, iar compușii
biochimici cu masă moleculară mare prezintă mobilitate mică, labilitate chimică și termică, risc de
modificări configuraționale, instabilitate la forțele de forfecare și la tensiunile interfaciale.
Literatura de specialitate oferă informații referitoare la metodele de separare a compușilor biochimici
precum și la procedeele specifice anumitor clase de substanțe de impact biotehnologic.
Bioanaliza corectă a unei probe multicomponente este guvernată de o regulă fundamentală conform
căreia orice operație de măsurare trebuie precedată de o separare eficientă a bioconstituenților.
Dacă se consideră că amestecul supus unei bioanalize este format din componenți, atunci, din punct de
vedere analitic, separarea este privită ca un proces ipotetic prin care se realizează izolarea a n fracțiuni
macroscopice distincte.
Se impune respectarea condiției ca fiecare fracțiune izolată să conțină unul dintre constituenții
amestecului inițial. 160
 Așadar, o separare are drept obiectiv bioanalitic crearea condițiilor care să permită determinarea exactă
și precisă a componenților biochimici din proba inițială, prin desprinderea lor în medii libere de orice
interferență.
Majoritatea metodelor de separare au la bază izolarea componenților în faze diferite.
Faza reprezintă o parte omogenă a unui sistem, delimitată de celelalte componente prin suprafețe
distincte la a căror interfață se produce o variație bruscă a proprietăților fizice.
Condiția esențială impusă pentru ca două specii să se separe una de cealaltă prin izolarea în faze diferite
este ca procesul să fie selectiv. Astfel, o separare ideală a doi componenți A și B coprezenți într-o fază
omogenă presupune izolarea componentului A într-o fază care exclude prezența constituentului B care
este transferat într-o altă fază care să manifeste respingere față de A.
Sursele de selectivitate sunt localizate la nivel molecular, fiind generate de următoarele proprietăți ale
biomoleculelor:
•masa moleculară;
•conformația și configurația;
•polaritatea grupelor funcționale reactive și nereactive;
•interacțiuni specifice.
Etapele importante ale unui proces de separare pot fi redate schematic astfel:

Contactarea fazelor Stabilirea echilibrului de Izolarea fazelor

distribuție

161
 În cadrul oricărui proces de separare, momentul stabilirii echilibrului corespunde absenței fenomenului de
transfer interfazic, care sub aspect macroscopic, reprezintă un repaus aparent absolut. De fapt, în acest moment,
datorită faptului că echilibrul este un proces dinamic, transferurile interfazice se desfășoară cu viteze egale în
ambele sensuri.
Echilibrul unei specii oarecare S (denumită generic solut) care se repartizează în două faze 1 și 2 puse în
contact poate fi descris prin ecuația:
(S)1  (S)2 (IV.1)
Acest echilibru se exprimă cantitativ prin mărimea numită coeficient de distribuție D. Acesta se calculează ca
raportul concentrațiilor analitice C (care pot include orice formă: ionică, moleculară, etc.) ale solutului între cele
două faze puse în contact:
D= C2
C1 (IV.2)
În general valorile coeficienților de distribuție reflectă toate interacțiunile reversibile și ireversibile dintre
speciile chimice și fazele sistemului de separare (tabelul IV.1). Aceste interacțiuni sunt foarte variate, între ele
fiind posibile tranziții continue.

IV.2. Mecanisme de separare

Natura interacțiunilor sistematizate în tabelul IV.1 determină mecanismul de separare. În metodele de separare
acre vor fi studiate în continuare, distribuția unei specii chimice între cele două faze se realizează prin
următoarele mecanisme fundamentale: adsorbție, absorbție și schimb ionic.

162
 Tabelul IV.1. Tipuri de interacțiuni care se manifestă în procesele de separare

Tipul interacțiunii Caracterizare

Legături intermoleculare
(de tip Van der Waals)
de orientare (Keesom) -definesc atracția electrostatică între molecule cu
dipol permanent;
de inducție (Debye) -descriu atracția electrostatică dintre moleculele cu
dipol indus;
de dispersie (London) -apar între molecule nepolare, ca urmare a unor
interacțiuni între atomii moleculelor
Legături de hidrogen Sunt de natură electrostatică, de tip special,
(intermediare între legăturile chimice și legăturile depinzând de prezanța unui atom de hidrogen legat
intermoleculare) covalent și 2 atomi puternic electronegativi (fluor,
oxigen)
Legături interionice Se realizează între elemente cu electonegativitate
foarte diferită, prin transfer de electroni și atracții
de tip columbian.
Legături covalente Se stabilesc între elemente având caracter chimic
apropiat, prin punere în comun de electroni, cu
formare de perechi de electroni.

Se impune precizarea faptului că, în majoritatea cazurilor, în procesul de separare sunt implicate mai
multe mecanisme, dintre care unul este predominant. 163
 1. Adsorbția
Adsorbția este fenomenul de reținere a unei specii chimice dintr-o fază gazoasă sau lichidă pe suprafața
unei faze solide (fig. IV.1). Faza solidă, denumită adsorbant, se particularizează prin porozitate înaltă și
suprafață eterogenă, pe care există un număr mare de centri cu activitate variabilă de adsorbție
S S
 Lichid  Gaz

Lichid Lichid

Figura IV.1. Transferul reversibil al unei specii chimice S între fazele procesului de adsorbție.
În funcție de natura interacțiunilor de suprafață care se manifestă între sorbit și centrii activi ai
adsorbantului, se deosebesc 2 tipuri fundamentale de adsorbție: fizică și chimică.
Adsorbția fizică este rezultatul acțiunii forțelor intermoleculare slabe, de tip Van der Waals. Adsorbția
fizică se definește prin:
•formarea pe suprafața adsorbantului a unor straturi polimoleculare suprapuse (adsorbție în multistrat);
•gradul redus de selectivitate;
•reversibilitatea termodinamică (între procesele opuse de adsorbție și desorbție se stabilește un echilibru
dinamic a cărui poziție este dependentă de natura sistemului sorbit-sorbent);
•viteza mare de desfășurare a procesului (barieră energetică joasă);
•caracterul exoterm al procesului.
164
 Adsorbția chimică presupune formarea unor legături chimice între sorbit și sorbent. Adsorbția chimică
se deosebește de cea fizică prin următoarele caracteristici:
•acoperirea suprafeței sorbentului cu un strat de adsorbție monomolecular (adsorbție în monostrat,
datorată faptului că legile ionice sau covalente se manifestă pe distanțe aproximativ egale cu dimensiunile
moleculelor);
•datorită pozițiilor bine determinate pe care le ocupă moleculele chemosorbite pe suprafața sorbentului,
stratul monomolecular chemosorbit nu prezintă mobilitate superficială;
•selectivitate, astfel încât se observă manifestarea unei anumite preferințe adsorbant-sorbit, dependentă de
afinitatea lor chimică;
•consum de energie mai mare, datorită formării legăturilor chimice între atomii care prezintă orbitali
neocupați de pe suprafața fazei solide și atomii moleculelor străine (figura IV.2);

Figura IV.2. Legături interatomice pe suprafață.

•desfășurarea lentă, uneori ireversibilă a proceselor implicate;

•ridicarea tempereturii este însițită de creșterea rapidă a cantității de molecule chemosorbite.
165
 Complexitatea proceselor de adsorbție este confirmată de faptul că, uneori, este posibil ca după
realizarea stratului monomolecular, adsorbția să se producă, în continuare, prin formarea pe suprafața
fazei solide a unor straturi bimoleculare, trimoleculare sau polimoleculare (fenomenul de condensare
capilară prin adsorbția moleculelor unui gaz în condiții de presiune ridicată).
Pentru descrierea echilibrelor implicate se utilizează izotermele de adsorbție (Freundlich și Langmuir),
care sunt reprezentări grafice ale unor funcții q=f (C) (figura IV.3), în care q este cantitatea de substanță
adsorbită pe gram de adsorbant, iar C –concentrația ei în soluție la echilibru.

Cantitatea FREUNDLICH
adsorbită, q
LANGMUIR

Concentrația soluției la echilibru, C

Figura III.3. Izoterme de adsorbție.

166
 2.Absorbtia
Consta in incorporarea unei faze gazoase sau lichide in masa altei faze lichide.
Mecanismul absorbtiei corespunde unui proces de transfer de masa interfazic controlat
prin solubilitate.
In cazul absorbtiei gaz-lichid, pentru descrierea distributiei gazelor greu solubile
intr-o anumita faza se utilizeaza legea lui Henry:
i=Hi.Xi
i=presiunea partiala a componentului “I” in faza gazoasa;
Hi=constanta lui Henry, dependenta de natura fazelor gaz-lichid in contact,de
concentratia gazelor, presiune si temperatura;
xi= functia molara a componentului “I” in faza lichida;
Procesele de absorbtie lichid- lichid care se desfasoara in sisteme statice sunt similare
celor caracteristice extractiei cu solventi.
In descrierea ansamblului de interactiuni moleculare specifice procesului de absorbtie
trebuie sa se tina seama atat de caracteristicile fizico –chimice ale solutiilor cat si
caracteristicile hidrodinamice si constructive ale sistemului.
Dintre acestea prioritate are polaritatea care dirijeaza distributia unui component intre
fazele sistemului de absorbtie.
Tabelul IV.2.Importanța parametrului  in descrierea mecanismului de absorbtie
 3.Schimbul ionic
Schimbul ionic implica inlocuirea ionilor din solutia de analizat cu ioni de acelasi semn
care provin dintr –o faza solida, prin desfacerea si formarea de noi legaturi ionice , fara
modificari esentiale de structura. Schimbul poate fi cationic , daca ionii implicati in proces
sunt pozitivi si, respectiv anionic, in cazurile in care ionii interschimbabili sunt negativi.
Chiar daca si in acest caz retinerea speciilor din solutie se produce pe o suprafat solida,
deosebirea fundamentala dintre procesul de schimb ionic si cel de absorbtie deriva din natura
si morfologia materialului absorbant , care , in majoritatea cazurilor este o matrice polimera
in a carui structura exista grupari functionale care au capacitate de schimb .
Mateialele solide care poseda grupari functionale fixe si ioni mobili –contraioni-
susceptibili de a fi inlocuiti de ioni de sarcina similara din solutiile cu care vin in contact se
numesc schimbatori de ioni .
Mecanismul de separare din schimbul ionic este guvernet de reactiile chimice de dublu
schumb care se produc intr un sistem eterogen : schimbator de ioni – solutie de electrolit.
Schimbul ionic este un proces steoechiometric si reversibil care, se bazeaza pe legile
electoneutralitatii :contraionii din schimbator sunt inlocuiti cu o cantitate echivalenta de ioni
cu aceeasi sarcina din solutie . Reversibilitatea procesului de schimb ionic (faptul ca ionii
absorbiti de un schimbator pot fi trecuti ,cu usurinta,in solutie) are o importanta deosebita in
aplicatiile sale practice.
 Selectivitatea schimbului ionic este rezultatul actiunii combinate a unei multitudini de
factori, intre care influenta semnificativa asupra echilibrului interfazic schimbator de ioni –
solutie au:
• caracteristicile fizico-chimice ale materialului solid :granulatia , porozitatea ,
numarul si natura grupelor functionale ;
• propietatile ionilor participanti la schimb:natura , sarcina si dimensiunile acestora,
raza ionului hidratat , poparizabilitatea etc;
• compozitia, concentratia , pH-ul, taria ionica si temperatura solutiei exterioare.

IV.3.Clasificarea si caracterizarea metodelor de separare

Principalele criterii de clasificare a metodelor de separare sunt corelate cu:

•natura fazelor intre care se distribuie componentii amestecului de analizat ;
•natura procesului predominant;
•numarul de stadii in care se realizeaza distributia componentilor intr un sistem
bifazic.
 Majoritatea metodelor de separare se bazeaza pe existenta a doua faze distincte in contact
intre care se distribuie componentii unei probe .Dupa starea lor de agregare,fazele pot fi
gazoase(G), lichide(L), si solide(S), in procesele de separare fiind posibile urmatoarele
combinatii:
-gaz-lichid(G-l);
-gaz-solid(G-S);
-lichid-solid(L-S);
-lichid-lichid(L-L);
Dupa natura fazelor unui sistem bifazic, metodele de separare pot fi clasificate astfel:

Gaz-lichid Gaz-solid Lichid-lichid Lichid-solid

Distilarea Absorbtia; Extractia; Cromatografia
Cromatografia Cromatografia Cromatografia Lichid-solid
Gaz-lichid Gaz-solid; Lichid-lichid Cromatografia pe gel
Sublimarea Excluziunea Cromatografia de afinitate
Flotatia ionica Precipitarea
Fractionarea prin Topirea zonala
curgere in camp Cristalizarea
Functionala
Schimbul ionic
Absorbtia.
 Se impune precizarea faptului ca exista si metode bazate pe separarea componentilor intr o
singura faza :electrodializa,electroforeza etc.
Separarea si concentrarea componentilor se realizeaza printr-o gama larga de metode bazate
pe diferite procese fizico-chimice , fizice si chimice(tabelul IV.4.)

TabelulIV.4. Principalele metode fizice si chimice de separare si concentrare

Metode fizice Metode chimice si fizico-chimice

Volatilizarea(distilare,sublimare) Extractia cu solventi
Cristalizarea Metode sorbtive
Topirea zonala Precipitarea
Filtrarea si filtrarea pe gel Metode electrochimice
Ultracentrifugarea Flotatia
Metode criogene Dializa

In functie de numarul de trepte implicate in realizarea distributiei componentilor probei in

sisteme bifazice de separare, se disting:
-metode statice (intr–un singur stadiu);
-metode dinamice sau cromatografice (in mai multe trepte).
 Realizarea unui sistem eficient de separare-concentrare-purificare a unui compus bioactiv
implica respectarea restrictiilor operationale dictate de:natura ,structura si compozitia
substantei utile ,precum si de cerintele de calitate impuse ,fara a neglija aspectele economice
si ecologice.In acest context ,metodele de separare aplicabile in analiza biochimica trebuie
sa prezinte urmatoarele caracteristeci:
a)Adaptabilitatea descrie performantele unei metode de separare in aplicabilitatea la
componenti cu proprietati cat mai variate .De exemplu, adaptabilitatea cromatografiei de
gaze este limitata numai la compusi care pot adusi cu usurinta in stare
volatila.Cromatografia prin schimb ionic si elecroforeza sunt metode adaptabile la separarea
speciilor ionice.
b)Capacitatea de incarcare reprezinta cantitatea maxima dintr-un amestec care poate fi
separata cu eficienta buna printr –un singur proces , cu mentinerea structurii si neafectarea
configuratiei sau a bioreactivitatii. Acest parametru variaza in limite foarte largi , de la
microorganisme pana la kilograme.
c)Capacitatea de fractionare a unei metode de separare corespunde numrului maxim de
componenti potential separabili printr-o singura operatie .Astfel , capacitatea de fractioanare
a cromatografiei si electroforezei este relativ mare, fiind cuprinsa intre 10 si 100 . In cazul
altor metode de separare , insa, capacitatea de fractionare este egala cu 2(extractie intr-o
singura treapta ,cristalizarea)
d) Selectivitatea se refera la capacitatea intrinseca a unei metode de separare de a distinge
doi componenti pe baza unor fenomene fizico-chimice fundamentale.
e) Viteza de separare si aparatura .In general sunt preferate metodele rapide si care nu
necesita o aparatura prea sofisticata si scumpa.
O separare eficienta, presupune, in unele cazuri, combinarea mai multor tehnici intr-un
procedeu unitar de separare –concentrare-purificare.

IV.4.Particularitatile metodelor de separare –concentrare in analiza

compusilor biocimici

Separarea–concentrarea reprezinta o etapa indispensabila in analiza compusilor biochimici

, datorita dificultatilor legate de limita scazuta de determinare a specilor de analizat , de
necesitatea utilizarii unor probe nereprezentative din cauza masei mici a acestora , de absenta
probeler de referinta , precum si de influenta matricei asupra semnalului analitic.
Spre deosebire de speciile anorganice , metodele de separare si concentrare utilizate in
analiza compusilor biochimici implica anumite restrictii legate de instabilitatea
componentilor biochimici si riscul transformarii acestora, de posibilitatea impurificarii probei
si de nereproductibitatea rezultatelor analitice.
In cazul substantelor biochimice, efectuarea unui control riguros al conditilor
experimentale este imperios necesara, deoarece, orice actiune, chiar
intamplatoare(apa,solventi organici, temperatura,presiunea, agenti oxidanti sau reducatori,
microorganisme) se poate solda cu modificarea necontrolata a naturii si concentratiei
biocomponentilor de determinat.
 Pentru pvrevenirea impurificarii probei si pierderii de componenti trebuie sa se tina seama
de provenienta probei si de conditiile de pastrare a acesteia, de puritatea reactivilor utilizati,
de absenta contaminantiloi chimici si biologici in laborator si in instalatiile de efecuare a
separarii. Se mentioneaza, de asemenea, ca la analiza sostemelor de neechilibru terodinamic
caracteristice microrganismelor,probele biologice sau alimentare pot contine o serie de
compusi rezultati dupa prelucrarea produselor initiale,fapt care complica demersul analitic.
Alegerea metodei de separare –concentrare-purificare a componentiilor biochimici depinde
atat de caracteristicile probei supusa analizei, proprietatile speciei de interes(masa moleculara,
volatilitate etc.) de concentratia acestuia in proba, cat si de particularitatile metodei ulterioare
de determinare cantitativa.
Principalele metode de separare de larga aplicabilitate biochimica pot fi descrise sumar,
dupa cum urmeaza:

Metode bazate pe volatilizare : distilare simpla, distilare fractionata, distilarea in vid,

distilarea la presiune ridicata, la temperatura joasa, distilarea azeotropa, extractiva,
moleculara, cromodistilarea,sublimarea in vid etc. Distilarea este una dintre cele mai vechi
tehnici utilizate la separarea comusilor biochimici. Literatura de specialitate inregistreaza
numeroase aplicatii biochimice, in analiza de:
-acizi grasi si esterii lor;
-analiza toxicologica si farmaceutica;
-analiza bauturilor;
-analiza compusilor cu azot (proteine, aminoacizi);
 -concentrarea biocomponentilor in urme;
-cercetari in analiza seriilor omologe, produsi de reactie, grad de polimerizare,produsi de
oxidare, de reducere etc.

Metode extractive : extractia cu solventi oragnici, extractia de afinitate, extractia in faza

solida.
Prin extractie cu solventi (denumita si extractia lichid-lichid) componentii unui amestec
lichid omogen sunt separati pe baza diferentelor intre solubilitatile lor in unul sau mai multi
dizolvanti adaugati .Extractia lichid-lichid se particularizeaza prin simplitate, rapiditate,
usurinta manipularii, aplicabilitatea intr-un domeniu larg de concentratii, selectivitate si
sensibilitate ridicate.Princiliile extractiei lichid-lichid au fost adaptate cerintelor separarii
produselor biochimice prin selectarea solventilor selectivi si a variantelor adecvate de
extractie , in functie de particularitatile fizico- chimice ale sistemului supus separarii.
O metoda cu impact deosebit este extractia cu fluide supercritice , care au capacitatea de
dizolvare asemanatoare cu a lichidelor si caracteristici de transport similare gazelor. Printre
avantajele acestei metode extractive pot fi mentionate: posibilitatea controlului prin
intermediul solutiilor selective ,presiunii si a temeperaturii si asigurarea unei viteze mari de
trnsfer de masa.Extractia cu fluide supercritice este indicata in separarea compusilor
prezenti in concentratie mica in medii de fermentatie (acizi carbixilici, alcooli, antibiotice,
vitamine liposolubile).
 Extractia si transportul prin membrane lichide sunt aplicate pentru extragerea
antibioticelor beta –lactamice,precum si a nuor hidroxiacizi si aminoacizi.
Sistemele de extractie bifazice apoase,cu faze nemiscibile s-au remarcat prin
performantele in separarea proteinelor ,enzimelor, cloroplastelor si acizilor nucleici.
Extractia in faza solida este superioara extractiei lichid-lichid , deoarece presupune un
consum mic de solventi organici , in contextul aplicarii mai multor mecanisme de
extractie.Mecanismele utilizate sunt: sorbenti cu faza normale, cu faze opuse, sorbenti de
schimb ionic,polimeri cu amprenta moleculara.Au fost obtinute rezultate promitatoare in
concentrarea medicamentelor, metabolitilor si a compusilor endogeni din fluide biologice.
Datorita simplitatii, pretului scazut, compatibilitatii cu sistemele analitice automatizarii,
detectiei la nivel de ppm si eliminarii necesitatilor utilizarii solventilor microextractia in
faza solida este de interes pentru probe biologice (urina , plasma,par) si alimentare,in care
poate fi combinata cu electroforeza capilara.

Metodele cromatografice : metode de separare si concentrare utilizate frecvent in

analiza produselor de biosinteza care se bazeaza pe diferite mecanisme de retentie,
dependente de natura fazei stationare si de specia biochimica de interes.In spectrul larg al
procedeelor de separare ocupa o pozitie prioritara,deoarece in conditii moderate asigura o
rezolutie inalata .
 Se utilizeaza variante cromatografice ,precum: cromatografia de deplasareprin intereactii
hidrofobe,cromatografia cu faze inverse, cromatografia de permeatie prin gel, cromatografia
circulara cu elutie in trepte, cromatografia prin perfuzie,cromatografia de lichide de inalta
performanta , cromatografia de afinitate si imunoafinitate , cromatografia de schimb
ionic.Alegerea unei anumite tehnici presupune considerarea dimensiunii particulei de sorbent
si a geometriei coloanei .Particulele mari ofera avantaje, precum:un pret de cost relativ
scazut,o buna rezistena la curgere si un randament superior .Comparativ cu acestea,
particulele mici asigura o rezolutie inalta si utilizarea unor volume mici de eluent.
Cromatografia de deplasare prin interactii hidrofobe este utilizata in scopuri analitice si
preparative pentru separarea unor amestecuri binare de proteine.
Cromatografia cu faze inverse a dat rezultate deosebite in determinarea compusilor cu
masa moleculara relativ mica (peptide,antibiotice, oligonucleotide), asigurand o recuperare
inalta, cu o rezolutie foarte buna.
Cromatografia de pereatie prin gel este recomandata in etapele finale , cand agregatele sau
formele polimere ale bioprodusului sunt izolate in volume micsorate.
Cromatografie circulara cu elutie in trepte este aplicata mai ales pentru separarea speciilor
biochimice ale caror caracteristici de retente sunt foarte diferite.In anumite conditii de operare
specia retinuta selectiv este concentrata in etapa de elutie.
Cromatografia de imunoafinitate utilizeaza reactia anticorp-antigen pentru separarea
selectiva a unui compus din martrici complexe.
 Electroforeza este una dintre cele mai eficiente tehnici in analiza produselor
biotehnologice si biochimice ,care permite separarea, izolarea si determinarea dimensiunii
si puritatii speciilor testate. Exista diferite tipuri de electroforeza (zonala , zonala pe coloane
capilare,capilara etc.)cu avantaje ,dezavantaje si particularitati in studiul speciilor
biochimice.
 Electrocromatografia pe coloane capilare (CEC) combina cracteristicile cromatografiei de
inalata performanta si ale electroforezei capilare.Tehnica CEC asigura separari de molecule
neutre in analize farmaceutice sau determinarea unor compusi naturali ,precum:
trigliceride ,carotinoide, mono-si polizaharide , enantiomeri ai aminoacizilor ,proteine
,peptide si anticorpi.
 Dializa si electrodializa sunt metode de separare a solutilor diluate de proteine si de
eliminare a sarurilor . Se bazeaza pe propritatea unor membrane (material bidimensional
prin care patrund selectiv anumie substante) semipermeabile de a fi traversate de molecule
mici ale apei si ale sarurilor minerale folosite drept tampon sau salefiant de precipitate.

IV.5. Bibliografie

1. A.Bold, Metode de separare și concentrare, Institutul Politehnic Iași (curs litografiat),

1997.
2. V. Gorduza, L. Tofan, D. Șuteu, E. V. Gorduza, Biomateriale-Biotehnologii-Biocontrol,
Editura CERMI, Iași, 2002.
3. E. Jercan, Metode de separare în biochimia analitică, Editura Tehnică, București, 1983.
4. C. Liteanu, S. Gocan, A. Bold, Separatologie analitică, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1981.
5. C. D. Nenițescu, Chimie generală, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1979.
6. D. J. Pietryzk, C. W. Frank, Chimie analitică, Editura Tehnică, București, 1989.
 CAP. V. EXTRACȚIA CU
SOLVENȚI
V.1. Delimitări conceptuale
V.2. Extracția fizică lichid-lichid
V.3. Extracția reactivă lichid-lichid
V.4. Extracția prin membrane
lichide
V.5. Extracția prin micele inverse
V.6. Extracția cu fluide supercritice
V.7. Extracția în sisteme cu două
faze apoase
V.8. Extracția solid-lichid
V.9. Bibliografie
 Analiza chimică a probelor biochimice include, cel
puțin teoretic, două etape: separarea
componentului de analizat din probă și
determinarea cantitativă a acestuia. Dacă, pentru
determinarea cantitativă a componenților au fost
dezvoltate o serie de metode directe care reduc la
minim necesitatea separării, există cazuri când
această etapă este obligatorie.
 Astfel, atunci când metodele de analiză utilizate
sunt insuficient de sensibile, când interferențele
datorate celorlalți constituenți ai probei sunt
prea mari, când distribuția componentului de
analizat în probă este neomogenă sau când
calibrarea metodei de analiză este dificilă
datorită lipsei materialelor de referință, utilizarea
extracției cu solvenți, ca metodă de separare și
concentrare, poate înlătura toate aceste
dificultăți.
 Extracția cu solvenți este una dintre cele mai
frecvent folosite metode de separare și
concentrare, atât în practica de laborator,cât
și la scară industrială, datorită avantajelor pe
care le oferă: aparatură simplă, timp de lucru
scurt, metodologia de lucru nu este
laborioasă, se poate aplica într-un domeniu
larg de concentrații, eficacitate și
selectivitate ridicată, posibilitatea recuperării
solventului, domenii de utilizare variate etc.
 V.1. DELIMITĂRI
CONCEPTUALE

 Extracția cu solvenți este procesul prin

care se realizează transferul unei
substanțe dizolvate între două sau mai
multe faze ale unui sistem eterogen,
definit în sens termodinamic. Acest
transfer se poate realiza prin interacțiuni
fizice, fizico-chimice sau chimice, iar
compușii supuși distribuției interfazice
manifestă preferințe pentru una din fazele
sistemului de extracție, participând astfel
selectiv la procesul de transfer (figura V.1).
 Figura V.1. Schema generală a unui proces de
separare
 V.1.1 DEFINIȚII

 Termenul de extracție cu solvenți se referă,

cu precădere la procesele în care transferul
substanței dizolvate se realizează între două
faze ale unui sistem lichid-lichid, unde una
dintre faze este o soluție apoasă, iar cealaltă
– un solvent de natură organică.
 Starea finală a procesului de extracție, corespunzătoare
echilibrului se numește repartiție sau distribuție lichid-
lichid, iar substanța chimică a cărei distribuție se studiază –
distribuent sau solut.
 Sistemul de extracție este alcătuit dintr-o fază apoasă – în
majoritatea cazurilor o soluție de electrolit, care conține de
cele mai multe ori substanța supusă extracției și o fază
organică formată fie dintr-un solvent organic, fie dintr-un
amestec de agent extractant și un diluant adecvat.
 Solventul – o substanță sau un amestec definit de substanțe
de natură organică, în stare lichidă, cât mai nemiscibil cu
faza apoasă, care este capabil să dizolve sau să extragă
solutul.
 Agentul de extracție (extractantul) – o substanță cu
proprietăți de solvent; se utilizează de obicei dizolvat într-un
diluant adecvat și formează cu solutul specii chimice
complexe, care se transferă mult mai eficient în faza
organică, decât solutul simplu.
 Diluantul – substanță organică lichidă, care are rolul de a
dizolva extractanții solizi și speciile extrase: nu are
proprietăți extractive în raport cu solutul, dar îmbunătățește
unele proprietăți macroscopice ale fazei organice
(densitatea, tensiunea superficială etc).
 Diluantul și extractantul se comportă împreună ca un
solvent, aceștia formează soluții lichide în domeniul de
temperatură al apei, care sunt stabile din punct de
vedere chimic și care,în contact cu apa sau soluții
apoase de electroliți, pot fi considerate solvenți.
 Studiul sistemelor de extracție din punct de vedere
analitic, are în vedere o abordare chimică, care vizează
stabilirea echilibrelor implicate în procesul de transfer
dintre faze, precum și a naturii speciilor extrase. Multe
dintre studiile de specialitate relevă faptul că, una din
condițiile preliminare pentru realizarea extracției este
formarea unor specii chimice fără sarcină electrică. De
aceea, în tratarea proceselor de extracție cu solvenți, se
pleacă de la solutul prezent inițial numai în una dintre
faze (faza apoasă) și se urmăresc etapele transferului
acestuia în cealaltă fază, prin alegerea judicioasă a
condițiilor experimentale (pH, concentrația
extractantului, prezența unor electroliți inerți etc), care
să determine deplasarea echilibrului de repartiție în
sensul dorit.
V.1.2 CLASIFICAREA SISTEMELOR DE
EXTRACȚIE

 Dezvoltarea multilaterală a sistemelor de

extracție, atât din punct de vedere al
compoziției, cât și al comportării acestora, fac
practic imposibilă realizarea unei clasificări
generale. Totuți, în literatură sunt enumerate
mai multe propuneri de clasificare, bazate pe
diverse criterii, prezentate schematic în figura
V.2.
 V.1.3. PARAMETRII CANTITATIVI AI
EXTRACȚIEI

 Plecând de la această aproximație, se poate

aprecia că procesul de extracție presupune
existența a cel puțin trei stadii principale:
 formarea speciei extractibile;
 repartiția speciei formate;
 interacțiuni chimice ale speciei extrase în faza
organică.
 Experimental, cel mai simplu mod de a
caracteriza sistemele de extracție cu solvenți,
se realizează cu ajutorul studiilor de
distribuție, care oferă informații concrete
despre maniera de repartiție a solutului între
cele două faze în funcție de parametrii
experimentali considerați.
 Utilizarea eficientă a metodelor de extracție
necesită cunoașterea dependenței
parametrilor de extracție de variabilele (pH,
concentrașie, temperatură, tărie ionică etc)
sistemului, dependențe care pot fi obținute
din date experimentale sau, dacă sistemul
studiat nu este prea complex, din calcul, pe
baza constantelor de echilibru.
 Spectrul larg al caracteristicilor agenților de
extracție, împreună cu varietatea în
comportare a speciilor chimice furnizează
mumeroase posibilități de studiu utilizând
metodele de extracție cu solvenți.
 Dacă se consideră o substanță A, care se
repartizează între cele două faze ale sistemului de
extracție, conform echilibrului:
A A0 =˃ K= , (V.1)

descrierea cantitativă a extracției se face cu

ajutorul unor mărimi,denumite generic –parametri
ai extracției, care sunt prezentate în tabelul V.1.

 Dificultățile cele mai mari pentru prezicerea

teoretică a parametrilor de extracție și a
calculului mărimilor termodinamice în sistemele
bifazice și multi-componente sunt datorate
comportării ne-ideale a celor două faze lichide și
a evaluării aproximative a coeficienților de
activitate a componentelor din sistem.
 TABELUL V.1. PARAMETRII CANTITATIVI AI EXTRACȚIEI CU
SOLVENȚI.
Parametrul Relația de calcul Definiție
cantitativ
Constanta de - valabil în cazul sistemelor simple, când substanța care se
distribuție repartizează are aceeați compoziție în ambele faze; este
egală cu raportul concentrațiilor substanțeiA în cele două
faze.

Coeficientul de - valabil când solutul participă la echilibre secundare, în cel

distribuție puțin una din fazele sistemului; este dat de raportul
stoechiometric a concentrațiilor tuturor speciilor prezente
în cele două faze.

Gradul de extracție - fracțiunea de solut extrasă în fază organică.

Procentul de - procente de solut extrase în fază organică.

extracție

Factorul de - cantitatea de solut extrasă după n etape de extracție,

recuperare considerând volumele celor două faze egale.

Factorul de - mărime ce caracterizează gradul de separare a doi

selectivitate componenți în același sistem de extracție.

Notații: - volumul fazei apoase și respectiv, volumul fazei organice; speciile

notate cu indicele “0” reprezintă speciile care se găsesc în faza organică, iar cele
notate fără indice – speciile prezente în faza apoasă.
 V.2. EXTRACȚIA FIZICĂ LICHID-
LICHID

 Deși performanțele acestor sisteme de extracție

sunt destul de modeste, sistemele de extracție
fizică lichid-lichid și-au găsit o largă
aplicabilitate în domeniul biochimic, mai ales
datorită simplității lor. Sistemele de extracție
fizică lichid-lichid sunt sistemele în care
moleculele (M) se găsesc sub aceeași formă
atât în faza apoasă, cât și în cea organică. În
acest caz, extracția lor din soluția apoasă în
faza organică, are la bază solubilitatea diferită a
solutului în sovenți apoși și organici.

(M)soluție apoasă(M)fază organică K=D=

(V.2)
 În această categorie intră biomoleculele care în
timpul extracției nu suferă transformări chimice,
trecând în faza organică sub aceeași formă în
care se găsesc și în soluția apoasă. Pentru
extracția acestor specii se utilizează solvenți
organici, de obicei inerți (care nu conțin în
molecula lor atomi cu proprietăți donoare
pronunțate), care nu interacționează chimic cu
speciile extractibile, motiv pentru care aceste
sisteme sunt considerate sisteme cu o
comportare ideală.
 În cazul cel mai general, extracția fizică
lichid-lichid presupune parcurgerea
următoarelor etape:
1. contactarea soluției inițiale cu solventul
organic;
2. solubilizarea și difuzia solutului în faza
organică;
3. separarea celor două faze: extractul – faza de
solvent organic, care conține solutul și
rafinatul – soluția apoasă inițială din care s-a
extras solutul;
4. recuperarea solventului.
 Solvenții utilizați în cazul sistemelor de extracție
fizică trebuie să îndeplinească trei condiții
esențiale:
 să nu reacționeze chimic cu solutul – rolul
solventului fiind doar de a asigura un mediu
preferențial pentru solutul aflat în faza apoasă;
 să fie stabili din punct de vedere chimic – se
asigură astfel posibilitatea recuperării și re-
utilizării solventului în mai multe procese de
extracție;
 să fie stabil din punct de vedere termic –
permite realizarea extracției la temperaturi
ridicate.
 Din această cauză, pentru selectarea unui
solvent adecvat pentru extracția fizică a unei
anumite biomolecule se au în vedere în
principal proprietățile chimice ale clasei din
care face parte, dar și o serie de parametri
fizici (masa moleculară, punctul de fierbere,
punctul de topire, temperatura critică,
densitatea fazei lichide, presiunea de vapori,
tensiunea superficială, căldura specifică,
vâscozitatea, constanta dielectrică, momentul
de dipol, indicele de refracție etc.) care permit
o anticipare cât mai exactă a comportării
solventului în sistemul de extracție.
 Din punct de vedere al proprietăților chimice,
solvenții organici pot fi împărțiți în mai multe
categorii, în funcție de grupările funcționale din
moleculă (tabelul V.2). Astfel, este de așteptat ca
solvenții organici a căror molecule nu includ grupări
donoare sau acceptoare, capabile să formeze
legături de hidrogen, care au momente de dipol
mici ca valoare (de ex. hidrocarburile alifatice,
unele hidrocarburi aromatice, sulfura de carbon,
tetraclorura de carbon etc.) să fie cele mai
adecvate pentru a fi utilizate în sistemele de
extracție fizică.
 Pe de altă parte, s-a observat experimental că, cu
cât gradul de covalență al biomoleculei este mai
mare, cu atât afinitatea pentru faza apoasă este
mai mică, iar preferința acesteia pentru solventul
organic inert cu a cărui structură dezordonată se
acomodează mai ușor, crește.
 Clasă de Gruparea Observații
solvenți funcțională
Hidrocarburi alifatice R-H - solvenți inerți

Hidrocarburi aromatice Ar – H - solvenți inerți; benzenul deși frecvent

utilizat este considerat un agent
cancerigen
Hidrocarburi clorurate R – Cl; Ar – Cl - Solvenți inerți la temperatura camerei;
usor instabili la distilare; ridică probleme
de coroziune datorită formării HCl

Eteri -C-O-C- - Formează peroxizi explozivi în prezența

aerului și lumini (excepție fac: metil-t-
butileter și t-amil-metileter)

Cetone -C=O - Instabile în mediu alcalin

Aldehide -CH=O - Foarte reactive, sunt oxidate cu ușurință
la acizi carboxilici; condensează în mediu
acid sau alcalin

Esteri -RCO-O-R- - instabili în mediu acid sau bazic

Alcooli și fenoli R-OH; Ar-OH - Au o stabilitate redusă
Amine R-NH2; Ar- NH2 - Formează săruri cu grupările acide ale
biomoleculelor

TABELUL V.2. CLASIFICAREA SOLVENȚILOR ORGANICI ÎN FUNCȚIE DE GRUPĂRILE FUNCȚIONALE DIN

MOLECULA LOR
 Viteza extracției, în acest caz, depinde de aria
suprafeței de contact dintre cele două faze și de
solubilitatea biomoleculelor în faza apoasă,
respectiv în cea organică, iar creșterea eficienței
extracției se poate face prin:
 alegerea unui solvent adecvat, în care solutul să
fie cât mai solubil;
 adăugarea, în faza apoasă, a unor săruri
anorganice cu efecte de salting-out puternice, care
să nu interacționeze cu solutul, dar care să
determine o scădere a solubilității acestuia în fază
apoasă.
o Nu întotdeauna distribuția speciilor cu legături
covalente se desfășoară conform prevederilor
teoretice. Abaterile observate experimental se
datorează intervenției unor procese secundare,
cum ar fi: ionizarea, hidroliza sau polimerizarea, fie
în fazăapoasă, fie în cea organiză, echilibre care
influențează randamentul de extracție.
 Una dintre cele mai importante aplicații ale
extracției fizice lichid-lichid este separarea
biomoleculelor din lichidele de fermentație. În
lichidul final obținut în urma procesului de
fermentație, biomoleculele se găsesc în
concentrații foarte mici (0,5 – 8 %) și sunt în
general compuși labili din punct de vedere
chimic și tehnic. Mai mult, în lichidele de
fermentație se găsesc și numeroși altți compuși
labili din punct de vedere chimic și termic. Mai
mult, în lichidele de fermentație se găsesc și
numeroși alți compuși secundari, cu proprietăți
fizice și chimice asemănătoare, ceea ce face ca
separarea și purificarea acestora să fie extrem
de dificilă.
 Extracția fizică lichid-lichid a biomoleculelor din astfel
de lichide de fermentație presupune tratarea
acestuia cu un solvent organic nepolar (de ex. eter
de petrol, diclormetan, dicloretan etc) când se extrag
biomoleculele nepolare, fie tratarea cu un solvent
polar (de ex. alcooli, esteri, eteri, cetone etc.) când în
faza organică vor trece biomoleculele polare.
 Dacă în cazul primei grupe eficiența extracției va fi
determinată doar de modalitatea de asigurare a
contactului intim (suprafață de contact mare, agitare
energică) dintre cele două faze ale sistemului de
extracție, în cazul celei de-a doua categorii principala
problemă o reprezintă solubilitatea relativ mare a
biomoleculelor polare în mediu apos, care determină
scăderea randamentului procesului de extracție.
 Numeroși acizi carboxilici sunt obținuți prin procese de
fermentație și prin reacții enzimatice. Datorită asocierii
accentuate a acestora în soluțiile apoase eficiența extracției
lor cu solvenți organici este mică (tabelul V.3).
Acid carboxilic Solvent organic D
Acid acetic C4-C8 0,63-0,14
Acid lactic Dietileter 0,10
di-izi-propileter 0,04
Metil-izo-butilcetonă 0,14
n-Octanol 0,32
Acid succinic Dietileter 1,50
Metil-izo-butilcetonă 0,19
n-Butanol 1,20
Acid malic Dietileter 0,02
Metil-izo-butilcetonă 0,04
Acid tartric Dietileter 0,03
Metil-izo-butilcetonă 0,02
Acid citric Dietileter 0,009
Metil-izo-butilcetonă 0,09

TABELUL V.3. VALORILE COEFICIENȚILOR DE DISTRIBUȚIE (D) AI UNOR AICIZ CARBOXILICI ÎNTRE APĂ ȘI
DIFERIȚI SOLVENȚI ORGANICI
 Creșterea randamentului de extracție a biomoleculelor în
astfel de sisteme soluție apoasă – solvent organic se poate
face prin:
 creșterea masei moleculare a acestor compuși – ceea ce
reduce solubilitatea lor în faza apoasă a sistemului de
extracție, dar mărește tendința de formare a unor emulsii
stabile și greu de separat;
 ajustarea condițiilor experimentale astfel încât
biomoleculele să existe predominant sub formă nedisociată
(deci ușor extractibile în faza organică). De exemplu,
pentru extracția compușilor cu caracter acid se corectează
pH-ul soluției apoase la o valoare mai mică decât pK a, iar
pentru cei cu caracter bazic la o valoare mai mare decât
pKb, cu aproximativ 2 unități (pKa; pKb – exponentul
constantei de aicditate și respectiv bazicitate), când se
transformă în specii nedisociate. Un exemplu în acest sens
îl reprezintă extracția fizică a unor antibiotice din lichide de
fermentație (tabelul V.4), procedeu aplicat la scară
industrială.
TABELUL V.4. CONDIȚIILE EXPERIMENTALE DE EXTRACȚIE FIZICĂ
A UNOR ANTIBIOTICE

Antibiotic Solvent organic pH-ul soluției apoase

Acid clavulanic n-Butanol 2,0
Acid fuzidic Metil-izo-butilcetonă 6,8
Nizină Cloroform + s-octanol 4,5
Actinomicină Metanol + clorură de 2,5
metilen
Antibiotice macrolide Metil-izo-butilcetonă Alcalin
Salomicină Acetat de butil 9,0

 Dar în aceste condiții (mediu acid sau bazic)

majoritatea biomoleculelor sunt puțin stabile,
ceea ce impune ca procesul de extracție să fie
realizat într-un timp relativ scurt.
 adăugarea unei sări anorganice în concentrații
foarte mari (uneori până la saturație), care
determină precipitarea biomoleculelor, deci
formarea unor compuși greu solubili în soluții
apoase, care vor prefera faza organică. Este cazul
acizilor carboxilici, când pentru extracția acestora
se procedează la precipitarea lor sub formă de
săruri greu solubile în soluții apoase.
 În concluzie, se poate spune că extracția fizică
necesită utilizarea unui solvent organic cu o
miscibilitate cât mai redusă cu apa, care să ofere
o selectivitate ridicată și o inerție chimică față de
solut, pentru a diminua pierderile de recuperare.
 V.3. EXTRACȚIA REACTIVĂ LICHID-
LICHID

 Termenul de extracție reactivă a fost introdus

pentru prima dată de Cașcaval (2000) și definește
acele procese de extracție în care, pe lânga
solvent, este necesară adaugarea și a unui agent
extractant (definiție – vezi paragraful V.1.1.),
capabil să reacționeze cu solutul și să formeze un
compus cu un caracter hidrofob pronunțat, care
să prefere faza organică a sistemului de extracție.
Practic, extracția reactivă reprezintă o îmbinare
între procesele chimice (care implică interacțiunea
chimică dintre solut și agentul de extracție) și
procesele fizice de difuzie și solubilizare a
compusului format (care sunt răspunzătoare de
transferul acestuia în faza organică a sistemului).
 Deși a fost inițial folosită numai pentru extracția
ionilor metalici, studiile asupra extracției reactive s-au
orientat de la mijlocul anilor 60 într-o măsura din ce in
ce mai mare spre stabilirea condițiilor de extracție și
separare a compușilor organici, în special a celor cu
importanța biochimică (acizi carboxilici, aminoacizi
etc.), datorită avantajelor oferite, comparativ cu alte
tehnici de separare.

 În prezent, un deosebit interes este acordat extracției

reactive a biomoleculelor, principalele direcții de
cercetare fiind orientate spre:
• sinteza unor noi compuși potențial extractanți cu
eficiența ridicată, pe baza proprietaților fizico-chimice
a unui solut dat („molecular design”);
• alegerea metodei de extracție in funcție de avantajele
oferite pentru un anumit solut;
• stabilirea mecanismului de extracție și condițiile
optime de lucru.
V.3.1. MECANISMUL EXTRACȚIEI
REACTIVE

 În tratarea teoretică a procesului de extracție

reactivă se consideră că specia moleculară
(biomolecula) ce urmează a fi extrasă se
găsește inițial numai în soluție apoasă
(solubilitatea ei in fază organică este nulă), și
că aceasta poate reacționa cu agentul
extractant dizolvat în faza organică a
sistemului de extracție, formând o specie
extractibilă (figura V.3).
 FIGURA V.3. MECANISMUL GENERAL AL EXTRACȚIEI REACTIVE

 (X – agent de extracție; M – biomolecula sau solutul;

indicele (i) denotă speciile aflate la interfață; indicele (aq)
– speciile aflate in soluția apoasă; indicele (o) – speciile
aflate în faza organică).
 În unele cazuri, în funcție de solubilitatea
agentului extractant in faza apoasă a sistemului
de extracție, locul de desfașurare a reacției dintre
solut și agentul extractant poate fi situat in
vecinătatea interfeței sau chiar în soluția apoasă.
 Trecerea solutului din faza apoasă în cea organică
cu ajutorul agentului extractant, presupune
parcurgerea următoarelor etape elementare:
 difuzia agentului de extracție din faza organică la
interfața de separare a celor două faze;
 difuzia solutului din faza apoasă la interfața de
separare dintre cele două faze;
 formarea speciei extractibile, ca urmare a reacției
dintre solut si agentul extractant;
 difuzia speciei extractibile în faza organică.
 Plecând de la etapele elementare care intervin în
procesul de extracție, viteza procesului global poate fi
controlată fie de un proces elementar de difuzie, fie de
reacția chimică. Stabilirea importanței relative a celor
două etape determinante de viteză se face prin studiul
influenței vitezei de agitare a celor două faze asupra
gradului de extracție a solutului (figura V.4).

FIGURA V.4 MODIFICAREA NATURII ETAPELOR DETERMINANTE DE

VITEZĂ ÎN FUNCȚIE DE INTENSITATEA DE AGITARE A FAZELOR
 În domeniul difuzional, viteza procesului de
extracție este limitată de difuzia
componenților sistemului spre și dinspre
interfață, și corespunde unei creșteri
continue a gradului de extracție a solutului
odată cu creșterea vitezei de agitare a
fazelor. Atingerea palierului constant de
variație a gradului de extracție indică
trecerea în domeniul cinetic de desfașurare a
procesului de extracție, unde etapa
determinantă de viteză este reacția chimică.
 Din punct de vedere al reacției chimice, extracția
reactivă a biomoleculelor în prezența unui agent
extractant se poate realiza prin formare de
combinații complexe, asocieri ionice sau specii
solvatate.

a)Sisteme de extracție a combinațiilor

complexe: sunt destul de reduse ca număr, în
majoritatea studiilor din literatură moleculele
organice (inclusiv biomoleculele) sunt utilizați ca
agenți de extracție pentru un anumit ion metalic.
Foarte rare sunt cazurile în care un ion metalic dat
este folosit pentru a extrage o moleculă de natură
organică, acest lucru fiind datorat hidrofilicității
avansate (referința lor pentru soluțiile apoase) a
ionilor metalici și caracterului hidrofob manifestat de
majoritatea moleculelor de natură organică.
b) Sisteme de extracție a asociațiilor
ionice: apar în cazul biomoleculelor care
prezintă un grad avansat de ionizare în soluție
apoasă (au în molecula lor grupări funcționale
ușor ionizabile), și care genereaza cationi sau
anioni de dimensiuni mari. Aceștia se pot
cupla cu ioni de sarcină opusă formând săruri
cu o solubilitate redusă în apă, denumite
perechi (asociații) ionice. Asociațiile ionice nu
se armonizează cu structura moleculară a
apei, au un grad de hidratare redus și, în
consecință, sunt ușor solubile în solvenți
organici putând fi separate prin extracție.
 Echilibrul de extracție în acest caz (figura V.5),
poate fi reprezentat prin două situații limită:
 Asociația ionică se formează în faza apoasă
(A), ca urmare a interacțiunii ionilor M+ și X- ,
urmată de tranferul asociației ionice obținute
în faza organică (O), unde poate participa la
echilibre secundare de asociere – disociere
(cazul a);
 Ionii M+ și X- sunt transferați individual din faza
apoasă în faza organică, în proporții
stoichiometrice pentru a asigura
electroneutralitatea fazelor, iar asociația ionică
se formează direct în faza organică (cazul b).
FIGURA V.5. MECANISMUL DE EXTRACȚIE AL ASOCIAȚIILOR
IONICE
 Ponderea celor două cazuri limită în mecanismul
real de extracție va depinde de dimensiunile și
sarcinile ionilor care se extrag, de proprietațile
extractantului organic, și de natura diluantului
folosit. În general, rolul solventului este unul
pasiv, el nu se coordinează la specia extrasă, dar
valoarea constantei sale dielectrice influențează
proesele secundare de asociere sau disociere din
faza organică.
 Trebuie menționat că descrierea comportării
sistemelor de extracție a asociațiilor ionice cu
ajutorul unor expresii matematice generale, care
să arate dependența gradului de extracție de
parametrii experimentali, este de cele mai multe
ori dificilă, datorită numărului mare de etape
elementare care au loc în aceste sisteme.
c) Sisteme de extracție a speciilor
solvatate: Atunci când specia formată în
urma reacției cu agentul extractant este
nesaturată coordinativ, aceasta are tendința
de a-și ocupa pozițiile libere, cu moleculele
de solvent din sistem. Se formează o specie
chimică nouă – specia solvatată, mult mai
stabilă și cu un caracter hidrofob mai
accentuat.

 Procesul de solvatare poate fi privit ca o

competiție între moleculele de solvent și cele
ale agentului de extracție pentru solutul din
faza apoasă și se poate realiza prin legături
covalente, legături ce implică electroni , sau
prin legături cu dipolii solvenților polari.
 Procesul de extracție în acest caz poate fi descris cu ajutorul echilibrelor
elementare prezentate în tabelul V.5, iar procesul de solvatare a speciei
extractibile poate avea loc simultan cu formarea acesteia, sau abia după
ce acesta ajunge la interfața dintre cele două faze.
TABELUL V.5. PRINCIPALELE ECHILIBRE CHIMICE ELEMENTARE
CE POT AVEA LOC ÎN SISTEMELE IDEALE DE EXTRACȚIE A
SPECIILOR SOLVATATE

Tipul echilibrului Reacția de echilibru Constanta de echilibru

Formarea speciei M + nX MXn

extractibile în faza apoasă

Repartiția speciei MXn (MXn)0

extractibile

Solvatarea în faza (MXn)0 + p (S)0 (MXnSp)0

organică
 Extractanții obișnuiți care conduc la produși de solvatare
includ în molecula lor un atom de oxigen legat fie de un
atom de carbon, fie de un atom de fosfor. Deosebirea
dintre cele două categorii de extractanți este atribuită
prezenței moleculelor de apă. Astfel, în sistemele de
extracție cu esteri organo-fosforici moleculele de apă
sunt eliminate din complexul extras în faza organică, în
sistemele de extracție cu eteri sau cetone, apa face
parte din specia extrasă.
 Principalele avantaje ale utilizării acestor sisteme de
extracție sunt determinate, pe de o parte de rapiditatea
extracției, iar pe de altă parte de selectivitatea destul de
ridicată a acestora (în majoritatea cazurilor se obțin
factori de separare de ordinul 102 ÷ 103 unități).
 Mult mai eficiente, în procesele de extracție a
speciilor solvatate sunt sistemele în care faza
organică este formată dintr-un amestec de doi
sau mai mulți agenți extractanți, în care unul
duce la formarea speciei extractibile, iar celălalt
solvatează complexul format.
 Un caz partiular al sistemelor de extracție a
speciilor solvatate, a căror fază organică este
alcătuită din anumite combinații de extractanți
sunt sistemele sinergetice. În aceste sisteme
puterea de extracție manifestată de amestecul de
agenți extractanți este mult mai mare decât în
cazul utilizării lor, separat.
 Apariția unui efect sinergetic este posibil
atunci când:
 Unul dintre extractanți formează cu solutul o
specie extractibilă, neutră din punct de
vedere electric;
 Al doilea extractant deplasează apa reziduală
din molecula acesteia;
 Cel de-al doilea extractant să nu fie hidrofil și
să fie mai slab legat;
 Numărul de coordinaare al solutului să
permită legarea celor doi extractanți;
 Extractanții să nu aibă forme structurale care
să genereze împiedicări sterice.
Din păcate, numărul relativ mic de studii existente în
literatură asupra extracției sinergetice a moleculelor
organice cu acțiune biologică, nu permit formularea unor
concluzii definitorii, referitoare la aceste sisteme.
 V.3.2 SISTEME DE EXTRACȚIE CU
DERIVAȚI ORGANOFOSFORICI
 Derivații organofosforici (tabelul V.6) au fost intens
studiați în ultimele decenii, datorită capacității lor
de a realiza extracții cu viteze și randamente
ridicate. Acești extractanți pot fi folosiți fie
individual, fie în amestec (extracșia sinergetică), și
permit separarea rapidă și cantitatvă a unor ioni
metalici (mai ales cei transuranieni), dar și a unor
compuși minerali sau organici.
 Dintre derivații organofosforici, cel mai utilizat este
tri-n-butilfosfatul; dar în literatura de specialitate
sunt menționat și sisteme de extracție în care
agenții extractanți sunt derivați ai acizilor fosfonici
sau fosfinici, însă numărul aplicațiilor acestora
este mult mai redus.
 În funcție de structura lor chimică, sistemele
de extracție cu derivați organofosforici pot
decurge prin mecanisme diferite. Astfel, în
sisteme cu acizi organofsforici extracția are
loc predominant printr-un mecanism cu
formare de asociații ionice, în timp ce la
utilizarea esterilor neutri sau fosfinoxizilor,
extracția decurge prin intermediul unui
mecanism cu formare de specii solvatate.
TABELUL V.6. PRINCIPALII DERIVAȚI ORGANOFOSFORICI UTILIZAȚI ÎN
SISTEMELE DE EXTRACȚIE LICHID-LICHID A BIOMOLECULELOR
 În cazul biomoleculelor, sistemele cu derivați
organofosforici și-au găsit largi aplicații la
extracția și separarea aminoacizilor și a
acizilor carboxilici. Mecanismul de extracție
este unul cu formare de asociații ionice sau
chiar specii solvatate, similar cu cazul general,
însă prezintă o serie de particularități, în
funcție de natura extractantului și a solutului.
 Aminoacizii se găsesc în soluție apoasă sub
formă de specii ionice, în funcție de valoarea
pH - ului (figura V.6), motiv pentru care
solubilitatea acestora în solvenți organici este
foarte redusă.
 În consecință, extracția acestor compuși este
posibilă numai prin adăugarea în faza organică a
sistemului de extracție a unor agenți extractanți.
În acest sens, se folosesc acizii organofosforici,
cele mai importante aplicații avându-le D2EHPA
(acid di(2-etilenhexil)fosforic). Studiile
experimentale au arătat că în aceste sisteme,
extracția are loc numai dacă aminoacidul se
găsește în soluția apoasă sub formă cationică,
conform echilibrului:
 (Aminoacid+) + HX(0) (Aminoacid)X(0) + H+

(V.3)
 Un rol deosebit în desfășurarea acestor procese de
reacție îl are pH-ul soluției apoase. Stabilirea valorii
acestuia se face în funcție de natura aminoacidului
supus extracției. Astfel, dacă valoarea pH-ului nu
este suficient de acidă, aminoacidul nu se găsește în
soluție sub formă cationică, iar echilibrul VI.3 nu are
loc. Pe de altă parte, o valoare prea mică a pH-ului
determină protonarea extractantului (H2X+ ), acesta
devenind incapabil de a lega cationul aminoacidului.
 Din păcate, utilizarea acidului di(2-etilenhexil)fosforic
(D2EHPA) ca agent extractant nu permite o separare
netă a aminoacizilor din amestec, ci doar o extracție
selectivă a unui grup de aminoacizi cu proprietăți și
caracteristici asemănătoare.
 Folosirea esterilor organofosforici neutri sau
fosfinoxizilor pentru extracția compușilor organici
modifică semnificativ doar mecanismul de
extracție, nu și performanțele acestor sisteme.
Astefl, extracția se realizează în acest caz, prin
solvatarea aminoacidului în faza apoasă, ceea ce
impune ca valoarea pH-ului soluțiilor apoase să fie
adecvată existenței moleculelor neutre de
aminoacizi
 Esterii organofosforici neutri sunt mult mai eficienți
în cazul extracției acizilor carboxilici. În acest caz,
mecanismul de extracție decurge prin formarea
unor specii solvatate, conform echilibrului:
R-COOH + nTOPO(0) (R-COOH * nTOPO) (0) V.4
unde: n – numărul de solvatare,
TOPO-tributilfosfinoxidul.
 Rezultatele experimentale au arătat că eficiența
extracției acizilor carboxilici cu astfelde derivați
organofosforici depinde de:
 Bazicitatea agentului de extracție – eficiența extracției
fiind cu atât mai mare cu cât agentul extractant are un
caracter bazic mai pronunțat; în cazul derivaților
organofsforici neutri urmând ordinea:
tributilfosfat < dibutilfosfat < tributifosfinoxidul;
 pH-ul soluției apoase – eficiența extracției fiind maximă
pentru soluțiile apoase a căror pH permite existența
moleculelor de acid carboxilic sub formă neutră;
 Caracterul hidrofob al acidului carboxilic – cu cât acidul
carboxilic are un caracter hidrofob mai puternic, cu atât
extracția lui în prezența derivaților organofosforici sunt
utilizate cu succes la separarea acizilor carboxilici cu
mai mult de 5 atomi de carbon în moleculă.
TABELUL V.7. COEFICIENȚII DE REPARTIȚIE AI UNOR ACIZI
CARBOXILICI, ÎN SISTEME DE EXTRACȚIE CU TOPO ÎN HEXAN
Acid carboxilic D
Acid acetic 5,32
Acid propionic 37,9
Acid lactic 1,19
Acid piruvic 1,67
Acid succinic 21,2
Acid fumaric 174,5
Acid maleic 33,5
Acid itaconic 80,8
Acid tartric 2,19
Acid citric 19,61
Acid izocitric 32,7
 Dar, utilizarea esterilor derivaților organofosforici ca
agenți de extracție prezintă ănsă și unele dezavantaje,
datorită faptului că au o vâscozitate ridicată, ceea ce
face ca manipularea lor să fie destul de greoaie, și au o
tendință pronunțată de a hidroliza (fiind esteri), ceea ce
afectează eficiența sistemelor de extracție.
V.3.3. SISTEME DE EXTRACȚIE CU
AMINE ÎNALT MOLECULARE
 Sistemele de extracție cu amine alifatice înalt
moleculare și cu săruri ale acestora reprezintă
una dintre cele mai studiate categorii de sisteme
de extracție, principalele motive care au generat
interesul mărit pentru acești extractanți sunt:
 eficiența superioară a extracșiei în acest tip de
sisteme;
 posibilitatea utilizăriilor pentru o gamă foarte
variată de compuși chimici (ioni metalici;
molecule organice, biomolecule);
 extracția decurge în majoritatea cazurilor rintr-un
mecanism cu formare de asociații ionice, ceea ce
face posibilă prevederea comportării sistemului
de extracție.
 Aminele utilizate în extracția lichid-lichid trebuie să se
caracterizeze prin următoarele proprietăți:
 Capacitate ridicată de extracție;
 Solubilitate redusă în faza apoasă (conferită de
existența unei catene de cel puțin 6-8 atomi de carbon;
 Solubilitate ridicată în solvenți organici;
 Stabilitate chimică ridicată (rezistenșă la agenți oxidanți
și radiații), necesară în cazul utilizărilor repetate;
 Să formeze cu solutul compuși puternic hidrofobi;
 Să permită separarea rapidă a fazelor.

În general, aceste condiții sunt îndeplinite de aminele cu

masă moleculară mare, care au în molecula lor atomul
de N saturat, legat de mai multe lanțuri hidrocarbonate,
denumite generic – amine înalt moleculare.
 V.3.3-1. Clasificarea agenţilor de extracţie
din clasa aminelor înalt moleculare
În funcţie de structura lor chimică, aminele
înalt moleculare utilizate în sistemele de
extracţie se împart în mai multe
categorii(tabelul V.8).

Tabelul V.8. Clasificarea aminelor înalt

moleculare
 Tipul aminei Formula generală Exemple
    n-octilamina, n-decilamina;
Amine primare R-NH₂ n-dodecilamina; trialchilmetilamina;
Adogen 115-D
    di-n-octilamina; di-laurilamina (Amberlite LA-1);
Amine secundare R-NH-R₁ di-tridecilamina (Adogen 283)

    Tri-n-hexilamina; tri-n-octilamina(TOA);
Amine terţiare R-N-R₂ Tri-i-octilamina(Adogen 281); tri-n-decilamina;
ˡ Tridodecilamina; tri-n-(C8-C10) amma (Alamine 336,
R₁ Adogen 364)

     
     
Amine aromatice n-octil-aminopiridina

  R₃ Clorură de metil-tri-n-octilamoniu (TOMAC, Adogen

  ˡ 464); clorură de metil-tri-n-(C8-C10) amoniu (Aliquat
Săruri cuaternare R-N⁺-R₂x⁻ 336)
de amoniu ˡ
R₁
 
 Datorită bazicităţii pronunţate a atomului de azot din molecula lor,
aminele formează cu uşurinţă cationi cu o stoichiometrie bine
definită: (RnNH₄₋n), unde n=1-4, care pot participa la formarea
asociaţiilor ionice [ (Rn NH₄-n)⁺ ; A⁻] atât în soluţii apoase, cât şi
în solvenţi organici. În aceste sisteme, extracţia se realizează numai
in mediu acid,deoarece în mediu neutru sau bazic este posibilă
hidroliza cationului aminoalchil. Dintre amine bazicitate maximă
au aminele secundare, aceşti extractanţi fiind adecvaţi pentru
extracţia compuşilor cu caracter acid.
 Capacitatea de extracţie creşte odată cu masa moleculară a
aminelor şi depinde de asemenea şi de aranjarea structurală a
moleculei. Astfel, compuşii simetrici oferă o eficienţă sporită a
extracţiei, în comparaţie cu cei asimetrici, iar înlocuirea unei
catene alifatice cu un radical aromatic măreşte, de cele mai multe
ori, capacitatea de extracţie a aminei. Pe de altă parte, aminele au
un caracter hidrofob mai pronunţat decât sărurile cuaternare de
amoniu, şi prin urmare sunt mult mai eficiente în procesele de
extracţie.
 Cu toate acestea, utilizarea aminelor şi a sărurilor cuaternare
de amoniu ca agenţi de extracţie prezintă un dezavantaj
major: au tendinţa de a forma emulsii, mai mult sau mai
puţin stabile, în timpul procesului de extracţie, deoarece
aminele cu masă moleculară mare şi sărurile acestora sunt
agenţi tensioactivi. Acest dezavantaj poate fi evitat prin
alegerea parametrilor caracteristici fazei apoase( pH,
adăugarea unor electroliţi indiferenţi, etc.).

V.3.3-2. Extracţia acizilor carboxilici cu amine înalt moleculare

 În general, extracţia acizilor carboxilici, în absenţa unui agent
extractant adecvat are o eficienţă scăzută (vezi paragraful
V.1). Adăugarea în faza organică a sistemului de extracţie a
unui extractant din categoria aminelor înalt moleculare
determină o creştere semnificativă a coeficienţilor de
distribuţie a acestor compuşi, comparativ cu extracţia fizică.
Studiile existente în literatură au arătat că extracţia
acizilor carboxilici cu amine înalt moleculare implică
următoarele echilibre elementare:

 Disocierea acidului carboxilic, în faza apoasă:

R′-COOH R′-COO⁻+H⁺ (V.5)

 Distribuţia fizică a acidului carboxilic nedisociat între

fazele sistemului de extracţie:
R′-COOH (R′-COOH)₍₀₎ (V.6)

 Formarea cationului de aminoalchil, în mediu acid:

(RN)₀+H⁺+A⁻ (RNH⁺;A⁻)₀ (V.7)
 Cationul aminoalchil poate extrage acidul carboxilic astfel:
• printr-un proces de schimb ionic:
R′-COOH⁻+H⁺+(RNH⁺;A⁻)₀
( (RNH⁺);R′-COO⁻)₀+A⁻+H⁺ (V.8)
motiv pentru care aminele înalt moleculare se mai numesc şi
schimbători de ioni lichizi.
• printr-un proces de asociere ionică în faza organică:
R′-COO⁻+H⁺+(RNH⁺;A⁻)₀ ( (RNH⁺); R′-COO)₀+A⁻+H⁺ (V.9)
• printr-un proces de formare a asociaţiilor ionice
complexe în faza organică, atunci când în faza apoasă există
numai molecule neutre:
R′-COOH+ (RNH⁺;A⁻)₀ ( (RNH⁺) ∙R′-COOH)₀
(V.10)
Stabilirea mecanismului după care are loc extracţia presupune
cunoaşterea naturii speciilor predominante în cele două faze, în
condiţii experimentale bine definite.
În cazul acizilor policarboxilici, în funcţie de raportul dintre componenţii
sistemului de extracţie(acidul organic şi amina înalt moleculară), mecanismul
de extracţie poate avea loc prin una din cele trei tipuri de echilibre elementare
interfazice:

atunci când raportul molar dintre acidul policarboxilic şi amină este mult
mai mic decât 1-extracţia decurge cu formarea în faza organică a unor săruri
de forma R′(COOH)n(RN)n:
R′(COOH)n+n(RN)₍₀₎ (R′(COOH)n∙n(RN))₍₀₎ (v.11)
în condiţiile unui raport apropiat de valoarea 1, la formarea aductului de
extracţie vor participa acidul şi extractantul în proporţie echimolară:
R′(COOH)n+(RN)₍₀₎ (R′(COOH)n∙(RN))₍₀₎ (v.12)
dacă în faza organică a sistemului de extracţie se folosesc solvenţi nepolari, iar
concentraţia acizilor carboxilici din faza apoasă este mare, atunci există
posibilitatea apariţiei aşa-numitei a treia fază- o emulsie stabilă cu un
conţinut ridicat de complecşi acizi, care sunt insolubili atât în faza apoasă, cât
şi în cea organică:
m R′(COOH)n+(RN)₍₀₎ ((R′(COOH)n)m ∙ (RN))₍₀₎ (v.13)
 Pentru separarea rapidă a emulsiei create datorită apariţiei celei
de-a treia faze, în solventul organic se adaugă un modificator de
fază, care este de cele mai multe ori un alcool alifatic cu catenă
lungă(de ex. n-octanol sau izo-octanol), şi care are rolul de a mări
solubilitatea complexului de emulsie în faza organică. În cazul în
care solventul din faza este un compus nepolar, adăugarea unui
astfel de alcool nu este întotdeauna necesară, deoarece acesta
poate acţiona el însuşi ca modificator de fază.
 Structura moleculelor de acizi determină formarea diferiţilor
aducţi între molecula de acid şi cea de extractant, fiind principalul
parametru răspunzător de eficienţa extracţiei în astfel de sisteme.
Astfel, dacă molecula acizilor carboxilici este voluminoasă, în faza
organică se vor forma cu precădere săruri de amoniu, prin legarea
parţială sau în totalitate a gupărilor –COOH de către extractanţi.
În aceste cazuri eficienţa extracţiei este cu atât mai ridicată cu cât
grupările voluminoase exercită un efect atrăgător de electroni mai
pronunţat (care va favoriza ionizarea grupărilor carboxilice) şi cu
solventul organic folosit are o polaritate mai mare (tabelul V.9).
Acid carboxilic Agent extractant Solvent organic D

Acid acetic Amberlite LA-1 Cloroform 4,48

Amberlite LA-2 Cloroform 9,86
Andogen 283-D Cloroform 32,11
Alamine 366 Cloroform 9,68
Andogen 364 Cloroform 9,69
Acid oxalic Amberlite LA-2 Acetat de butil 0,93
Acid malonic Amberlite LA-2 Acetat de butil 0,58
Acid succinic Amberlite LA-2 Acetat de butil 1,51
Acid glutaric Amberlite LA-2 Acetat de butil 0,83
Acid adipic Amberlite LA-2 Acetat de butil 6,61
Acid citric Alamine 336 n-hexan 2,90
  Toluen 10,80
  Acetat de etil 23,00
  n-butanol 168,30
Toluen 6,00
Tri-dodecilamină Metil-izo-butilcetonă 34,00
Cloroform 136,00
2-etilhexanol 177,00
 Aceste caracteristici ale sistemelor de extracţie cu amine înalt moleculare,
precum şi influenţa manifestată de raportul molar dintre acizi şi agenţii
extractanţi stau la baza elaborării strategiilor de extracţie selectivă a acizilor
din amestecuri.
 În unele cazuri în mediile de cultură se adaugă o serie de acizi carboxilici în
scopul creşterii productivităţii tulpinii, acizi carboxilici care ulterior
trebuiesc separaţi. Un exemplu concret îl reprezintă mediul de cultură al
Lactobacillus salivarius, unde adăugarea de acid citric şi acetic duce la
creşterea concentraţiei de acid lactic obţinute. Separarea acidului lactic în
acest caz se face prin extracţie cu tri-octilamină, care permite trecerea
cantitativă a acestuia în faza organică; sistemul de extracţie nefiind afectat
de prezenţa biomasei.
 Dacă pentru extracţia acizilor carboxilici se utilizează ca agenţi extractanţi
săruri(cloruri) cuaternare de amoniu, mecanismul de extracţie decurge
printr-un proces elementar de asociere ionică la interfaţă:
R′-COO⁻+(R₃N⁺; Cl⁻)₀ ((R₃N⁺); R′-COO⁻)₀+Cl⁻ (V.14)
 iar pentru regenerarea extractantului este suficientă tratarea fazei organice
cu o soluţie de HCl.
 Studiile experimentale au arătat că în astfel de sisteme, randamentul de
extracţie a acizilor carboxilici depinde de pH-ul soluţiei apoase(valorile mari
de pH favorizează disocierea moleculei de acid carboxilic), concentraţia
iniţială a componenţilor din sistem şi de dimensiunea radicalilor din
molecula de sare cuarternară de amoniu (care controlează hidrofobicitatea
aductului format).
 V.3.3-3. Extracţia aminoacizilor cu amine înalt moleculare
 Prezenţa în molecula de aminoacid a grupărilor aminice, alături de gruparea carboxil,
modifică semnificativ mecanismul de extracţie. În cazul aminoaizilor, extracţia are loc
cu formarea, la interfaţă a unor perechi ionice cu un caracter hidrofob pronunţat, la
care participă aminoacidul protonat(prin urmare pH-ul fazei apoase trebuie să fie mai
mic decât pH-ul punctului izoelectric al aminoacidului respectiv) şi agentul extractant:
R-CH-COOH+ A⁻ +(RNH⁺)₍₀₎ R-CH-COOH.(RNH⁺)₍₀₎ (v.15)
ˡ ˡ
NH₃⁺ NH₃⁺.A⁻
 Atunci când pentru extracţia aminoacizilor se folosesc ca extractanţi săruri cuaternare
de amoniu, este necesar ca aminoacidul să existe în formă amonică în soluţie apoasă(la
un pH mai mare decât pH-ul la punctul izolectric al aminoacidului), iar în sistem au loc
următoarele echilibre:
 disocierea aminoacidului în faza apoasă:

R-CH-COOH R-CH-COO⁻+ H⁺ (V.16)

ˡ ˡ
NH₂ NH₂
 formarea de perechi ionice la interfaţa dintre cele două faze:

R-CH-COO⁻+(R₃N⁺Cl⁻)₍₀₎ R-CH-COO⁻.R₃N⁺₍₀₎+Cl⁻ (V.17)

ˡ ˡ
NH₂ NH₂
 coextracţia grupărilor hidroxil sau a altui anion anorganic, prezent în faza apoasă a
sistemului de extracţie:
A⁻+(R₃N⁺A⁻)₍₀₎ (R₃N⁺A⁻)₍₀₎+ Cl⁻ (V.18)
 Aşa cum se poate observa, indiferent de tipul agentului extractant
utilizat(amină înalt moleculară sau sare cuaternară de amoniu), un
rol esenţial asupra randamentului de extracţie îl are pH-ul soluţiei
apoase. Valoarea acestuia determină forma ionică a amnoacidului în
faza apoasă şi deci eficienţa extracţiei cu un anumit tip de
extractant (figura V.7).
 Astfel, la valori mai mici ale pH-ului decât pH-ul punctului
izoelectric eficientă este extracţia cu amine înalt moleculare,
în timp ce la valori ale pH-ului fazei apoase mai mari decât
pH-ul punctului izoelectric, mult mai eficientă este extracţia
cu săruri cuaternare de amoniu. Se poate observa însă că
valori maxime ale randamentului de extracţie se obţine
atunci când diferenţa dintre valoarea pH-ului fazei apoase şi
cea a punctului izoelectric este de cel puţin două unităţi de
pH.
 V.3.4. Extracţia biomoleculelor cu liganzi macrociclici
 În metodologia extracţiei cu solvenţi, este bine cunoscut rolul
cheie pe care îl are agentul de extracţie la separarea
biomoleculelor; alegerea extractantului adecvat decide cel
mai adesea, succesul unui astfel de proces. Din această cauză,
importanţa găsirii unui agent de extracţie eficient pentru
astfel de procese de separare a făcut ca o parte din studiile
din ultima vreme să fie îndreptate spre sistemele de extracţie
cu liganzi macrociclici.
 Termenul de „liganzi macrociclici” desemnează acei liganzi
polifuncţionali, de dimensiuni mari, în care solutul este coordinat în
interiorul unei cavităţi, iar complexul obţinut este puţin solubil în
apă. Deşi, iniţial au fost utilizaţi la extracţia cationilor
voluminoşi(cationii din grupele Iᴀ şi IIᴀ), selectivitatea mare de care
au dat dovadă, a încurajat folosirea lor şi pentru alte tipuri de ioni
şi chiar pentru biomolecule.
Extractibilitatea şi selectivitatea mare a liganzilor macrociclici, faţă
de monomerii analogi, se datorează, în principal:
• efectului de chelatizare multiplu-determinat de
numărul, natura şi poziţia atomilor donori din moleculă;
• mărimea cavităţii macrociclului-eficienţa extracţiei
este mult mai mare atunci când dimensiunea cavităţii ligandului
corespunde cu dimensiunea solutului;
• structura generală a moleculei- prezenţa unor lanţuri
flexibile capabile să împiedice sau să stimuleze formarea
complexului extractabil, rigiditatea moleculei, etc.
 Din categoria ligazilor macrociclici, utilizaţi ca agenţi
extractanţi, fac parte derivaţi de tipul eterilor-coronă şi
derivaţi ai calixarenelor. Structurile macrociclice ale
acestora delimitează cavităţi intramoleculare de forme şi
dimensiuni diverse (figura V.8).
 În aceste cavităţi pot fi reţinute prin legături chimice
specii ionice sau moleculare, formându-se combinaţii
complexe cu o stabilitate ridicată (determinată în
principal de raportul dintre mărimea ciclului şi cea a
speciei chimice) şi un caracter hidrofob accentuat.
Pentru accentuarea caracterului hidrofob, ceea ce
implică şi creşterea eficienţei la extracţie, acestor
derivaţi macrociclici li se pot ataşa diferiţi substituenţi
(figura V.9).
 Sistemele de extrcţie cu liganzi macrocilclici şi-au găsit o largă
aplicabilitate la extracţia şi separarea ionilor metalici şi
aminoacizilor. În cazul extracţiei aminoacizilor, aceştia sunt
extraşi din soluţii apoase acide, unde se găsesc sub formă cationică
(p H-ul fazei apoase trebuie să fie mai mic decât pH-ul punctului
izoelectric), prin formare de asociaţii ionice în faza apoasă, urmată
de trecerea acesteia în faza organică. Succesiunea etapelor
elementare care intervin în mecanismul de extracţie sunt:
 reparaţia ligandului macrociclic din faza organică în cea apoasă a
sistemului de extracţie:
(LM)₍₀₎ LM (V.19)
LM-ligand macrociclic

 asocierea extractantului macrociclic cu aminoacidul în faza

apoasă:
R-CH-COOH R-CH-COOH.LM (V.20)
ˡ
NH₃⁺
 neutralizarea cationuli format cu un contraion (A⁻
-provenit de la un compus acid, ales astfel încât constanta
sa de aciditate să fie apropiată ca valoare de cea a
aminoacidului), prezent în faza apoasă:
R-CH-COOH.LM + A⁻ R-CH-COOH.LM

ˡ ˡ (V.21)
NH₃.A⁻ NH₃.A⁻
 repartiţia asociaţiei ionice formate, în faza organică:

 R-CH-COOH.LM R-CH-COOH.LM₍₀₎

ˡ ˡ (V.22)
NH₃⁺.A⁻ NH₃⁺A⁻
 Valorile constantelor de extracţie obţinute pentru unii
aminoacizi, la extracţie cu eterul 18-coronă-6 în 1,2-
dicloretan, sunt prezente în tabelul V.11.
 Tabelul V.11. Constantele de extracţie a unor aminoacizi
în sisteme cu eterul 18-coronă-6 şi 1,2-dicloretan.
Aşa cum se poate observa din tabelul V.11, valoarea constantei de
extracţie în astfel de sisteme depinde de masa moleculară a
aminoacidului, datorită creşterii caracterului hidrofob al acestuia
odată cu creşterea masei moleculare, dacă complexul format are
aceeaşi compoziţie molară. Cu toate acestea, diferenţele dintre
constantele de extracţie datorate modificării caracterului hidrofob nu
sunt suficiente pentru a permite separarea selectivă a aminoacizilor
din amestec. Mult mai eficient în acest scop este modificarea pH-ului
fazei apoase.
V.3.5. Extracţia sinergetică
Studiile experimentale au arătat că atunci când faza organică a unui
sistem de extracţie conţine anumite combinaţii de doi sau mai mulţi
extractanţi, puterea de extracţie manifestată este mult mai mare,
decât în cazul utilizării extractanţilor luaţi separat. Acest fenomen,
materializat prin creşterea accentuată a puterii de extracţie, se
numeşte sinergism şi a fost introdus pentru prima dată de
Colemann(1956), prin similitudine cu noţiunea din biologie, observată
la administrarea medicamentelor şi defineşte acţiunea combinată a
doi sau mai mulţi agenţi de extracţie, care este superioară sumei
acţiunilor lor individuale.
 În cazul sistemelor de extracţie cu solvenţi pentru fenomenul de
sinergism au fost formulate mai multe definiţii. Astfel, Baes
consideră că „un efect sinergetic este de aşteptat dacă doi agenţi de
extracţie A şi B, care nu reacţionează între ei şi care extrag separat
dintr-o fază apoasă solutul, prin formarea de MAₐ şi MB b, pot
forma un complex mixt MacBd”. Taube şi Siekieski(1961) încearcă
să contureze o tratare cantitativă a extracţiei sinergetice şi arată
că: „un efect sinergetic are loc atunci când coeficientul de
distribuţie pentru un amestec de doi sau mai mulţi extractanţi este
mai mare sau mai mic, decât coeficientul de distribuţie calculat pe
baza aditivităţii simple”. Ei denumesc creşterea coeficientului de
sinergism pozitiv, iar scăderea coeficientului de distribuţie
sinergism negativ sau antagonist (deşi impropriu, pentru a
desemna diminuarea marcantă a unui efect sinergetic pozitiv, se
mai utilizează şi termenul de antisinergism).
Sistemele de extracţie sinergetică se bazează pe folosirea, în
principal a patru tipuri de combinaţii de agenţi de extracţie, şi
anume:

 agent de chelatizare+ ligand neutru;

acid organofosforic+ligand neutru;
doi agenţi de extracţie neutrii;
doi agenţi de extracţie cu caracter acid.
Sistemele de extracţie cu doi extractanţi neutri permit
obţinerea unor coeficienţi sinergetici cu valori cuprinse între 2
şi 5. Cele mai utilizate astfel de sisteme sunt cele ca eteri,
cetone şi alcooli, iar efectul sinergetic manifestat în acest caz
este unul destul de slab. Mult mai eficiente sunt sistemele
sinergetice formate dintr-un acid organofosforic (D2EHPA) şi
un ligand neutru (derivat organo-fosforic neutru, amine înalt
moleculare, eteri coronă, derivaţi fenolici sau acizi graşi).
Efectul sinergetic este accentuat odată cu creşterea
caracterului acid al derivaţilor organofosforici, şi sunt
utilizate pentru extracţia compuşilor biochimici cu caracter
acid.
V.4. Extracţia prin membrane lichide

Noţiunea de extracţie printr-o membrană lichidă (pertracţie) a fost

introdusă de Li (1966), şi această tehnică constă în principiu în
interpunerea unui strat de solvent, de grosimi diferite, între faza
apoasă iniţială, din care se face extracţia şi faza apoasă finală, în care
se face ulterior re-extracţia. Stratul de solvent se comportă în acest
caz ca şi o membrană lichidă, care poate fi stabilizată fie prin
utilizarea unor substanţe tensioactive, fie printr-o construcţie
adecvată a echipamentului de separare.
Membranele lichide folosite în acest caz se pot obţine prin
următoarele procedee:
 emulsionare- care presupune formarea unor emulsii
prin amestecarea intensă a solvetului organic cu soluţia
apoasă din care are loc re-extracţia (centrifugare 5000-10
000 rpm), urmată apoi de dispersia acestei emulsii, în
condiţii blânde de agitare (200-400 rpm) în faza apoasă
din care se extrage solutul (figura V.10a);
 înglobarea solventului organic în porii unui material
polimeric hidrofob(sau în interiorul unui material
fibros) (figura V.10b);
 utilizarea unor echipamente de extracţie de construcţie
specială- cu cilindrii concentrici, în formă de „U”- când
se obţin aşa numitele membrane lichide libere.
În practica de laborator, cele mai utilizate sunt
membranele obţinute pe suporturi solide, datorită
avantajelor pe care le oferă:
• sunt uşor de obţinut;
• elimină practic total pericolul amestecării solventului ca
fazele apoase;
• suprafaţa dintre fazele sistemului de extracţie este mare
şi poate fi controlată;
• nu necesită existenţa unei diferenţe de densitate în faze.
Modelul sistemelor de extracţie cu membrane lichide l-a constituit
sistemele biologice, unde ionii ionofori naturali au capacitatea de a
transporta anumiţi ioni prin membranele celulare. Plecând de la
această reprezentare, studii experimentale au arătat că adăugarea în
membrana lichidă a unor extractanţi, denumiţi în acest caz agenţi
purtători, determină creşterea gradului de extracţie a solutului din
faza apoasă iniţială către faza apoasă finală, iar mecanismul de
extracţie (figura V.11) decurge, de cele mai multe ori, prin intermediul
unor etape elementare similare cu cele evidenţiate în cazul extracţiei
reactive.
Eficienţa separării în astfel de sisteme depinde în principal de trei factori:
(i) pH-ul celor două faze apoase (determină forma, disociată sau nu, sub
care se găseşte solutul)- şi permite obţinerea unei eficienţe mari a separării
pentru diferenţe mici ale valorilor pH-ului celor două soluţii apoase;
(ii)tipul agentului purtător –(facilitează transportul solutului prin
membrana lichidă) şi (iii) concentraţia agentului purtător – selectivitatea
separării poate fi îmbunătăţită prin utilizarea unor concentraţii mici de
agent purtător, în condiţiile unei agitări intense a soluţiilor apoase iniţiale
şi finale.
 Extracţia prin membrane lichide poate fi utilizată pentru
separarea unor acizi carboxilici şi aminoacizi, dar poate facilita şi
unele reacţii enzimatice. Astfel, cu ajutorul membranelor lichide
au fost separaţi o serie de acizi carboxilici (acid formic, acid
acetic, acid propionic, acid n-butiric, acid lactic, acid fenilacetic,
acid citric, etc.), utilizându-se agenţi purtători de tipul derivaţilor
organofosforici şi aminelor înalt moleculare (de ex. TOPO,
alamine 336, Amberlite LA-2). Mecanismul de extracţie este redat
schematic în figura V.12.
 Gradul de extracţie al acidului carboxilic va depinde de pH-ul
celor două faze apoase (faza apoasă iniţială trebuie să fie acidă,
pentru a asigura ionizarea acidului carboxilic, în timp ce faza
apoasă finală trebuie să fie bazică, pentru a permite recuperarea
acidului carboxilic extras), şi de bazicitatea aminei înalt
moleculare utilizate ca agent purtător.
 În cazul extracţiei aminoacizilor în astfel de sisteme cei mai
utilizaţi agenţi purtători sunt cei de tipul eterilor-coronă, atunci
mecanismul de extracţie decurge prin formarea unui aduct în
membrana lichidă, proces ce este însoţit de transportul unui
contrion (figura V.13).
 Contraionul ce însoţeşte aminoacidul în procesul de transport prin
membrană este ales astfel încât aciditatea acestuia să fie de acelaşi
ordin de mărime cu cea a aminoacidului extras (cel mai utilizat
fiind ionul picrat).
 Pentru ca extracţia în aceste sisteme să decurgă cu o eficienţă
maximă este necesar ca pH-ul soluţiei apoase iniţiale să fie acid şi
mai mic decât pH-ul punctului izoelectric al aminoacidului (iniţial
aminoacidul să fie sub formă cationică), iar pH-ul soluţiei apoase
finale să fie bazic şi mai mare decât pH-ul punctului izoelectric
(aminoacidul să fie sub formă anionică).
V.5. Extracţia prin micele inverse
O micelă inversă reprezintă o asociaţie sferică de molecule de compuşi
tensioactivi formată într-un solvent nepolar şi care incorporează un mediu
apos (figura V.14). Grupările polare (ionizabile) ale compuşilor tensioactivi
sunt orientate către interiorul asociaţiei sferice, formând un „miez” polar, în
timp ce catena alifatică este orientată către solventul organic. O astfel de
orientare este inversă faţă de orientarea micelelor formate de compuşi
tensioactivi în apă, de aici şi denumirea de micele inverse.
Aceste sisteme sunt omogene şi stabile din punct de vedere termodinamic, şi
datorită polarităţii mediului intern al acestor asociaţii, micelele inverse pot
solubiliza compuşi polari într-un mediu cu polaritate redusă. Acesta este
motivul pentru care sistemele de extracţie prin micele inverse sunt utilizate
pentru extracţia unor compuşi insolubili şi instabili în solvenţi organici
(de ex. aminoacizii, proteine, enzime).
 După cum se ştie, adăugarea unor cantităţi mici de compuşi
tensioactivi în apă determină o scădere a tensiunii superficiale a
soluţiei până la o anumită valoare, după care tensiunea
superficială rămâne constantă (figura V.15).
Această valoare corespunde concentraţiei critice a micelelor, care
precede formarea acestora. Din această cauză, pentru obţinerea
unui sistem de extracţie prin micele inverse, concentraţia agentului
tensioactiv trebuie să fie mai mare decât concentraţia critică. Pe de
altă parte, în formarea micelelor inverse, compuşii tensioactivi
utilizaţi trebuie să fie compatibili cu sistemele biochimice în care
urmează a se face extracţia. Din acest punct de vedere cei mai des
folosiţi compuşi tensioactivi sunt prezentaţi în tabelul V.12.
Micelele au o formă cilindrică sau elipsoidală, iar procesul de
formare a acestor asociaţii se poate scrie:
mS Sm (V.25)

unde: S- agentul tensioactiv; m-numărul mediu de agenţi

tensioactivi dintr-o asociaţie micelară.
V.5.1. Mecanismul extracţie prin micele inverse

Procesul de extracţie a unui solut (aminoacizi, proteine, enzime) în

sisteme cu micele inverse are loc prin intermediul a trei etape
elementare succesive, în funcţie de natura sistemului, fiecare dintre
acestea putând fi etapa determinată de viteză:
 formarea micelelor inverse şi includerea solutului;
 difuzia solutului către interfaţa de separare dintre faza
apoasă şi cea organică;
 difuzia micelelor inverse în interiorul fazei organice.

Schematic, mecanismul unui proces de extracţie prin micele inverse

este redat în figura V.16.
 Tabelul V.12. Principalii agenţi tensioactivi utilizaţi pentru
extracţia compuşilor biochimici în sisteme cu micele
inverse.
Studiile experimentale au arătat că mai ales în cazul moleculelor proteice
extracţia şi transportul acestora în faza organică are loc prin intermediul
interacţiunilor electrostatice puternice care se stabilesc între solut şi
micelele inverse formate în sistem. Pe baza acestor considerente, este de
aşteptat ca coeficientul de distribuţie al solutului în astfel de sisteme să
depindă atât de pH-ul fazei apoase, cât şi de tăria ionică a soluţiei. Mai
mult, condiţiile de extracţie trebuiesc alese astfel încât micelele formate în
sistem să izoleze molecule individuale de solut, evitând astfel formarea în
faza apoasă a unor „agregate” (datorită interacţiunilor intermoleculare),
care duc la scăderea eficienţei de extracţie.
În cazul aminoacizilor şi al proteinelor, alegerea valorii pH-ului
soluţiei apoase se face astfel încât sarcina netă a acestor
compuşi să fie contrară celei a grupărilor ionizabile ale
compusului tensioactiv. Diferenţa dintre pH-ul la care extracţia
este posibilă şi pH-ul punctului izoelectric depinde de mărimea
biomoleculei respective.
 Pe de altă parte, creşterea tăriei ionice a fazei apoase( prin
adăugarea unui electrolit indiferent în concentraţie mare, de ex.
NaCl) determină reducerea eficienţei de extracţie a biomoleculelor,
datorită diminuării tăriei interacţiunilor dintre moleculele proteice
şi grupările ionizabile ale compusului tensioactiv, care intră în
alcătuirea micelelor.
 Un alt factor important pentru obţinerea unor randamente de
extracţie mari este caracterul hidrofob sau hidrofil al
biomoleculelor extrase. Astfel, moleculele cu structură hidrofilă sunt
încorporate cu uşurinţă în interiorul micelelor inverse(fiind astfel
mai uşor de transportat), pe când cele cu structura hidrofobă,
rămân de cele mai multe ori la interfaţa micelelor.
 Cu toate acestea, procesul de separareprin extreacţie în sisteme cu
micele inverse are ca scop final, obţinerea solutului într-o fază
accesibilă, de preferinţă apoasă. Acest lucru se realizează prin re-
extracţie.
 Re-extracţia în sisteme cu micele inverse, este un proces relativ lent,
datorită rezistenţei interfazice mari. Din această cauză trecerea
biomoleculelor din faza micelelor inverse într-o soluţie apoasă
adecvată se poate realiza prin:
 creşterea temperaturii- când are loc distrugerea fazelor organice
care conţin micele inverse, şi se formează o fază apoasă distinctă în
care sunt concentrate biomoleculele (proteine, enzime) extrase, care
poate fi ulterior separată prin centrifugare. Utilizarea acestui
procedeu depinde de structura compusului extras şi trebuie corelat
cu labilitatea termică a acestuia.
 modificarea pH-ului –valoarea pH-ului are o influenţă deosebită
asupra rezistenţei interfazice, deoarece acest parametru
controlează numărul grupărilor ionizabile ale biomoleculei şi
implicit viteza de re-extracţie. Cu toate acestea, modificarea pH-
ului poate cauza degradarea moleculelor proteice sau pierderea
activităţii enzimelor extrase.
 adăugarea unor cantităţi mari dintr-un solvent organic( cel mai
des utilizat este acetat de etil), care duce la distrugerea fazei
micelelor inverse şi astfel la eliberarea moleculelor de solut.
 adăugarea unei soluţii care conţine ioni ce Ca²⁺ -aceştia înlocuiesc
ionii de Na⁺ din structura compusului tensioactiv şi formează un
complex hidrofob cu molecula compusului tensioactiv.
 deshidratarea fazei de micele inverse cu ajutorul unor materiale
absorbante( de ex.site moleculare).
Pentru creşterea randamentului de separare sau pentru stabilizarea
dintre faza apoasă şi cea organică care conţine micele de extracţie
prin micele inverse, membranele solide pot fi utilizate pentru
mobilizarea interfeţei între două soluţii lichide diferite, sau chiar
pentru adăugarea unui strat de solvent organic între două faze
apoase (figura V.17).
Utilizarea membranelor în aceste sisteme combinate permit obţinerea
unor interfeţe cu arii mult mai mari (10⁴ m²/m³) şi împiedică dispersia
soluţiilor lichide. Stabilizarea şi localizarea interfeţei de separare dintre
faza apoasă şi cea a micelelor inverse depinde semnificativ de diferenţa
de presiune dintre cele două faze şi de depunerea pe suprafaţa
membranei a unor compuşi insolubili(care pot bloca difuzia solutului).
Eliminarea acestor depuneri şi reînnoirea suprafeţei de contact dintre
faze se poate face prin creşterea presiunii fazei care nu umezeşte
membrana.
 În funcţie de natura membranei, aceasta poate fi
umectată fie de soluţia apoasă, fie de solventul organic.
Dacă de exemplu, membrana este hidrofobă(este
umezită de solventul organic) pentru a evita trecerea
acestuia prin membrană trebuie ca presiunea
exercitată de soluţia apoasă să fie mare. Dar o presiune
prea ridicată poate favoriza intrarea soluţiei apoase în
porii membranei umeziţi cu solvent organic, iar
eficienţa de extracţie a sistemului considerat scade.
 Datorită dificultăţilor de ordin practic în obţinerea
diferenţei de presiune adecvată, sistemele de extracţie
combinate micele inverse- membrane solide, sunt
puţin folosite în procesele de separare a
biomoleculelor.
 V.6.Extracţia cu fluide supercritice
Alegerea proceselor de extractie utilizare pentru separarea biomoleculelor trebuie să ţină cont, în special , de
stabilitatea termică şi chimică a acestora.Astfel,existenta în sistemul de extracţie a unor condiţii experimentale
agresive(temperature ridicată,mediu puternic acid sau basic,etc.), care pot denature caracteristicile biochimice ale
moleculelor ,nu sunt adecvate pentru astfel de separări.În acelaşi timp ,tehnicile de separare utilizate
trebuie să permită utilizarea ulterioară a compusului util separate, respectând de exemplu
,condiţiile unei purităţi avansate (mai ales când este utilizat în industia farmaceutică,alimentară sau medicină). 
În acest context, extracţia cu fluide supercritice s-a impus ca o alternativa la procesele convenţionale de
separare , în scopul de a obţine produse de înalta calitate, utilizândtehnologii
ecologice şi eficiente.Solvenţii utilizaţi în astfel de sisteme,au proprietăţi de solvatare a unui lichid şi carteristicile
de transport ale unui gaz. 

V.6.1. Fluidele supercritice

Fluidele supercritice sunt substanţe care există într-o stare intermediară gaz-lichid, în condiţii bine pecizate
de presiune şi temperature. 
Aşa cum se ştie, orice substanţă chimică poate există în una dintre ce le 3 stări de agregare : solid,
lichid sau gaz, în funcţie de valoarea temperaturii şi presiunii la care se află.Modificarea
unuia dintre aceşti parametrii( de ex: a presiunii )atrage după sine modificarea şi a celuilalt( de ex: a
temperaturii la care compusul chimic respective se topeşte saufierbe ), lucu ce poate fi uşor urmărit cu ajutorul
diagramelor de bază (figura V.18). 
Figura V.18.Diagramă de fază
 Astfel , dacă substanţă solidă se află în stare solidă, creşterea
temperaturiiduce la topirea acesteia, iar în sistemul considerat cele două stări
de agregare, solidă şi lichidă, se află în echilibru. Dacă temperature continuă să
crească, o parte din lichidul format trece în stare de vapori, iar coexistenţa celor
stări de agregare este marcat în diagram de faza(fig.V.18) prin intermediul
punctului triplu(A). În acest punct, pentru majoritatea substanţelor chimice care
se gasesct la presiuni normale aproape de presiunea normal, proprietăţile fizice
ale stărilor lichide şi gazoase(densitate , vâscozitate,etc.),diferă semnificativ.
Odată cu creşterea presiunii, aceste diferenţe devin treptat din ce în ce mai
mici, până la atingerea punctului critic(B),când practice deosebirile dintre starea
lichidă şi cea gazoasă dispar,acestea contopindu-se într-o singură stare – starea
de fluid supercritic.
Punctul critic(B) este caracterizat de: presiunea critică, temperature
critică,densitatea critică, parametrii care sunt specifici fiecărei
substanţe( tabelul V.14). Atunci când substanţele se găsesc la presiuni şi
temperaturi mai mari decât cele corespunzătoare punctului critic ,ele se află în
stare de lichid supercritic.
 Tabelul V.14.Parametrii punctului critic pentru unele substante chimice

Deaorece starea de fluid supercritit este considerată că fiind intermediară între starea lichidă şi cea gazoasă,
vâscozitatea acestor fluide sunt mult mai mici decât ale lichidelor, ceea ce permite difuzia mult mai rapidă a
solutului şi realizarea mult mai eficientă (timp scurt,consum de energie redus) a procesului de extractive. Pe de
altă parte , datorită faptului că temperature critică pentru unele substanţe usuale(tabelul V.14) este mică, extracţia
cu fluide supercritice este adecvată pentru separarea biomeculelor a căror stabilitate termică este redusă.
V.6.2. Factori care influienţează eficienţa extracţiei în sisteme cu fluide
supercritice
Tăria unui solvent că lichid supercritic poate fi uşor controlată prin modificarea presiuniisi/sau a temperaturii.
Din această cauza,eficientă extracţiei în sisteme cu fluide supercritice depinde, în principal de presiune, de
densitatea solventului (acest parametru fiind o măsură e distanţei medii dintre molecule) şi de temperatura.
Astfel,solubilitatea unui solute într-un fluid supercritic dat este direct proporţional cu densitatea acestuia.La
temperatura costantă , în apropierea presiunii critice, solubilitatea solutului creşte brusc cu creşterea presiunii
(densităţii).În aceste condiţii la temperatura constanţa, extracţia la presiune mică va permite separarea solutilor
mai puţin polari, în timp ce extracţia la presiuni ridicare va favoriza separarea solutilor cu polaritate ridicată şi
a celor cu mase moleculare foarte mari.
Pe de altă parte, la presiune constanţa , solubilitatea solutului scade cu creşterea temperaturiii, totodată cu
scăderea densităţii.În aceste condiţii, creşterea temperaturii poate duce la precipitarea solutului în faza lichidă,
fără a se mai realiza extracţia.Din această cauza majoritatea proceselor de extractive cu fluide supercritice se
realizează la temperature relative mici, preferându-se varierea presiunii pentru a mari eficientă procesului.
Principalele avantaje ale utilizării fluidelor supercritice în procesele de exctractie sunt următoarele:
• Consum redus de energie;
•Temperatura mică a procesului de extratie;
•Vâscozitate redusă;
•Prezenţa gazului în extractor protejează solutul împotriva proceselor secundare de oxidare;
•“solvenţii” utilizaţi nu sunt toxici;
•Regenerearea acestora este uşoară;
•Costul procesului de extractive este redus.
 Principalele avantaje ale utilizării fluidelor supercritice în procesele de exctractie
sunt următoarele:
• Consum redus de energie;
•Temperatura mică a procesului de extratie;
•Vâscozitate redusă;
•Prezenţa gazului în extractor protejează solutul împotriva proceselor secundare de
oxidare;
•“solvenţii” utilizaţi nu sunt toxici;
•Regenerearea acestora este uşoară;
•Costul procesului de extractive este redus
Totuşi solvenţii din această categorie au o capacitate de extracţie redusă, mai ales
pentru compuşii polari.De asemenea instalaţiile de extractive trebuie să funcţioneze
la presiuni ridicate, iar acest lucru nu este la îndemână oricărui laborator.Toate aceste
dezavantaje nu au diminuat însă, interesul acordat acestei metode de extracţii.
V.6.3 Echipamente utilizate pentru extracţia cu fluide supercritice

Datorită modului de obţinere a fluidelor supercritice, aplicarea acestor metode de

extractive impune utilizarea unor echipamente de constructive specială.În figura V.19 este
prezentată schemă unei instalaţii utilizate pentru extracţia cu fluide supercritice.Principiul de
funcţionare a unei instalaţii de acest gen poate fi descries astfel: solutul este extras din
amestec în extractul(3), process ce se realizează cu ajutorul fluidului supercritic; extractul
rezultat este separate în separatoarele(4) şi (5), prin modificarea corespunzătoare a presiunii
sau a temperaturii.
Din punc de vedere practice, extracţia cu fluidesupercritice se poate realiza într-una sau
mai multe etape, în regim continuu sau discontinuu,în echicurent sau contracurent.De
asemenea, extracţia se poate realiza utizandand atât probe solide cât şi lichide(soluţii).
Deşi,cel mai des caz întâlnit, este cel în care procesul de extractive decurge într-o singură
etapă, continuu sau discontinuu(de ex: extracţia din material solide a alcaloizilor,a leiurilor
comestibile,a uleiurilor volatile,etc.), atunci când factorul de separare nu are valori sufficient
de marin, se prefer realizarea extracţiei în mai multe etape.
Echipamentele utilizate în aceaste situaţii permit modificarea condiţiile de
extractive(presiune,temperatura) în fiecare etapă de extractive, în funcţie de caracteristicile
solutului ce urmează a fi separat.Astfel de metode pot fi utilizate pentru rafinarea uleiurilor,
când în prima etapă are loc separarea uleiului de impurităţile solide, prezente uminente în
amestec.Din extractul obţinut, prin reducerea succesivaa presiunii şi creşterii tempreraturii,
sunt separate fracţiuni din ulei, în funcţie de volatilitatea acestora.
Figura.V.19.Reprezentarea schematic a unei instalaţii de extractive cu fluide
supercritice: (1) rezervor de gaz; (2) rezervor suplimentar;(3)extractor; (4) şi
(5) separatoare; (6)Colector de gaz; (7) şi (8) băi termostatate; (9) pompă
V.6.4.Aplicaţii ale extracţiei cu fluide supercritice
Principalele caracteristici ale fluidelor supercritice sunt: (i)caracterul lor nepolar, şi (îi)capacitatea de a solubiza
doar compuşi nepolari şi slab polarizaţi.
Din această cauza, metodele de extractive a fluidelor supercritice pot fi utilizate cu success la extracţia
parafinelor, a eterilor, a esterilor, a lactonelor şi a unor gliceride.
Mai mult, prin extracţia cu fluide supercritice s-a reuşit separarea unor compuşi biochimici cu structura
complexă,cum sunt: unii alcaloizi (nicotină,cofeină), vitamin E,unii steroizi direct din probe solide.
Astfel, extracţia cu fluide supercritice a uleiurilor din seminţe diferite proviniente permite obţinerea unor
randamente de extractive comparabile cu cele ale metodelor de extractive cu solvent organici uzuali
(tabelui.V.15), fără a folosi solvent toxici şi temperature ridicate

Tabelul V.15. Valorile randamentului de extractive a uleiurilor din seminte cu fluide supercritice CO2 si hexan.

Randamentul de extractie %
Timpul semintei
CO2 supercritic Hexan

Germeni de grau 9.6 10.1

Soia 16.4-19.9 20.0

Orez 22.0 23.0

Floarea-soarelui 36.0 38.0

struguri 6.9-39.3 7.5-40.1

 Uleiurile obţinute sunt bogate în acizi graşi , în special nesăturaţi(acizi palmatic,stearic,linoleic,plamitoleic,linolenic), iar
rezultatele experimentale au arătat că pentru realizarea unei extractiicantitative(randamentul de extractive ~90%) sunt necesare
temperature relative mici (până la 50°C) şi presiuni de până la 300 atm (tabelul V.16).

Tabelul V.16. Compozitia uleiului obtinut din seminte de struguri,prin extractive cu CO2 supercritic si extractive hexan.

Compozitie acizi grasi ,(w/w) %

Acid gras
Hexan CO2 supercritic
T=69°C; p=20 atm
T= 40°C;p=250 atm; 3h
Acid palmitic 8.12 8.03

Acid palmitoleic 0.15 0.15

Acid stearic 5.60 5.07

Acid oleic 19.59 19.06

Acid linoleic 66.16 67.39

Acid linolenic 0.37 0.30

 Randamentul de extractive în acest caz depinde de temperatura şi presiunea fluidului
supercriric,dar şi de umeditatea seminţelor utilizare la extractive şi dimensiunile
acestora. Din această cauza, în procesele deextractie se folosesc seminţe bine
mărunţite( dimensiunile acestora fiind de maxim 5 mm) şi cu un grad de umiditate
ridicat. Reducerea umidităţii seminţelor duce la scăderea randamentului de extractive
datorită pierderii, prin evaporare, a unui component ai uleiului.
Majoritatea compusilor chimici cu actiuniune bioloica care au în structura lor grupări
ionizabile sau sunt uşor polarizabile, nu pot fi separate prin extractive cu fluide
supercritice datorită faprului că au o solubilitate mult mai mică în fluidele sepercritice
decât în solventiilichizi uzuali.Astfel, acizii carboxilici, aminoacizii,proteinele,acizii
nucleici,azici şi săruri minerale,etc., sunt insolubile în fluidele supercritice şi practice nu
pot şi extrase prin această metodă,Există însă unele explicaţii.Este cazul unor steroizi
tetraciclici care pot fi extrazi utilizând CO2 supercritic dar în condiţii experimentale mult
mai agresive.Rezultatele experimentale au arătat că în acest caz,extracţia decurge la
presiuni cu atât mai mari cu cât numărul de grupări ionizabile din structura molecule
extrase este mai mare (tabelil V.17).
 Tabel V.17. Valorile presiunii de extractive a unor derivaţi cu structura steroidă tetraciclica, cu CO2
supercritic.

Derivat steroidic tetraciclic Grupari ionizabile Presiune de extractive,atm

Numar natura

Sitesterol 1 --OH 80

Androsteron 2 -OH; =O 90

Pregnandiol 2 -OH 120

Pregnantriol 3 -OH 150

Hidrocortihor 5 -OH; =O Nu se pot extrage

Glicozide 5 -OH; =O Nu se pot extrage

 Mai mult ,Schuegerl(1993) arată că pentru extracţia derivaţilor aromatic care
conţin în moleculă lor peste 3 grupări-OH sau două grupări _ON şi o grupare –
COOH, presiunea necesară trebuiesă fie mai mare de 100 atm, în timp ce glucidele
şi aminoacizii pot fi extraşi la presiuni mai mici de 500atm.
Utilizarea unor astfel de condiţii experimentale agresive sunt o consecinţă directă
a solbilitatii reduse pe care compuşii cu grupări ionizabile sau uşor polarizate o au
în fluidele supercritice.În anumite situaţii, este posibilă mărirea solubilităţii acestor
compuşi , şi implicit crestearea randamentului de extractive prin adăugarea unor
cantităţi mici de modificatori.
Modificatorii sunt substanţe capabile să interacţioneze fizic (prin legături de
hidrogen) sau chimic(de cele ai multe ori acido-bazic) cu solutul, blocând astfel
ionizareagrupelor funcţionale ale acestuia. Aductul astfel format,între modificator şi
solute, are o solubilitate mai mare în fluidul supercritic şi paote fi efficient extras
prin această metodă, numai dacă volatilitatea modificatorului este intermediară
între cea a solutului şi cea a fluidului supercrititc.
Cele mai elocvente exemple de modificatori utilizaţi în extracţia cu fluide
supercritice ,sunt prezentate în tabelulV.18.
 Tabelul V.18.Exemple de modificator şi aplicaţiile acestora în extracţia cu fluide supercritice a unor compuşi
chimici cu importantă biologică.

Solut Modificator Andament de extractive,%

In abs. modificatorulu In prez. modificatorului

Acid acetic 12%dimetiletir 0.05 0.17

Acid propionic 12%dimetiletir 0.15 0.45

Acid butyric 12%dimetiletir 0.80 1.55

trigliceride 20%hexan - -

Pe de altă parte, prin utilizarea modificatorilor se accentuează dependent solubilităţii în

solvent a compusilor extraşi de temperatura, ceea ce face posibilă separarea acestora
prin precipitaea şi recuperarea solventului.
V.7.Extracţia în sisteme cu două faze apoase

Deşi extracţia cu solvent tradiţională este recunoscută că fiind una dintre cele mai
importante metode de separare şi concentrare, domeniul de aplicabilitate ale acestei
metode, în separarea mai ales a moleculelor de protein, este restrâns. Acest lucru este
datorat atât solubilităţii scăzute a proteinelor în solvenţii organici uzuali, cât şi altor
dezavantaje(tabelul V.19).
Tabelul V.19.Principalele avantaje si dezavantaje ale metodelor extractiei cu solvent traditionale.

Avantaje Dezavantaje

-aparatura simpla; -solventii organici folositi sunt, in majoritatea lor toxici,

-timp scurt de lucru;
-cinetica simpla a proceselor de extractive;
-adaptabilitate la un nr.mare de solutii;
-utilizare intr-un domeniu lard de concentratie a solutului;
-eficienta si selectivitate;
inflamabili si volatile-creaza numeroase problem legate de
poluarea mediului;
-atunci candeste necesar un agent extractant cu selectivitaea
ridicata-creste costul procesului de separare;
-utilizarea unor volume mari de solvent organic,care nu
intotdeauna pot fi recuperate.
 Ca o alternativă în ultimul timp, a fost propusă utilizarea apoase(ABS), în care pentru obţinerea fazelor
nemiscibile nu sunt folosiţi compuşi organici volatile şi care s-au demonstrate a fi la fel de eficiente în procesele de
separere că şi sintemele de estracţie tradiţionale.
Extracţia în sisteme cu două faze apoase, resprecta definiţia extracţiei cu solvent, considerate în paragraful V.!,
singură deosebire fiind că cele două faze nemiscibile sunt de natură apoase,care implică existent unui mediu
denaturant, aceste sisteme au fost utilizare cu success la separarea materialelor biologice(protein, enzyme,acizi
nucleici, mitocondrii), de mai binde de 40 de ani , iar în ultimul timo sipentru separarea coloranţilor, a moleculelor
organice mici şi a unor ioni metalici.
Sistemele de extractive cu două faze apoase sunt alcătuite din două faze nemiscibile, formate dintr-uncompus
organic macromolecular, solubil în papa şi unpolimer hidrofil sau o sare anorganică corespunzătoare.Deoarece,
fiecare component este utilizat sub formă de soluţie apoasă, se poate spune că în aceste sisteme, predominantă în
fiecare cele două sisteme, este apă.
Din mulţimea polimerilor solubili în apă, polietilenglicolul(PEG) a fost cel mai frecvent utilizat la obinerea
acestor sisteme de extractive, deaorece: nu aeste toxic, imflamabil sau volatile, este stabil, biodegradabil, şi destul
de ieftin,elimimandu-se astfel o bună parte din problemele legate de poluarea mediului, problem ce apar frecvent
în cazul utilizării sistemelor de extractive tradiţionale datorită prezenţei solventilor organici.
Sistemele de extractive cu două faze apoase pe baze de PEG, prezintă toate avantajele practice ale sistemelor de
extractive tradiţionale, dar au şi o serie de avantaje unice datorită naturii lor predominante apoase.
Eliminarea compusilor organici colatili din sistemele de extractive deschide o nouă perspectiva pentru multe
procese industrial de separare, deaorece reduce în mare măsură dificultăţile legate de protecţia mediului.Mai
mult, anumite procese de separare, unde metodele de extracţie tradiţionale nu pot fi alicate, datorită
performanţelor lor slabe, pot avea success prin utilizarea sistemelor de extractive cu două faze apoase.
V.7.1.Formare sistemelor cu două faze apoase pe baze de
PEG
În aceste sisteme, cele două faze apoase sunt create dintr-o singură fază
omogenă, prin adăugarea unuia sau a mai mulţi compuşi, iar separarea fazelor
apare atunci când între componenţii amestecului există o incompatibilitate
structurală.Astfel, prin amestecarea unei soluţii apoase de PEG cu o soluţie
apoasă de polimer organic hidrofil sau de sare anorganică corespunzătoare
(tabelul V.20), se separă două faze nemiscibile,de natură apoasă: una
superioară- bogată în PEG,care se comportă similar cu faza organică din
sistemele de exctractie tradiţionale şi una inferioară- cu un conţinut ridicat în
sarea anorganică sau polimerul organic hidrofil folosit(figura V.20).Aceşti
compuşi se numesc componenţi generatori de fază.
Faza superioara—bogata in
PEG

+
Sistem cu doua faze Faza inferioara-bogata in sare
+ apoase anorganica sau polimer
Sare anorganica sau polimer hidrofil organic
 Tabelul.V.20.Exemple de saruri anorganice so polimeri organici hidrofili,utilizati la obtinerea sistemelor cu doua faze
apoase.

a.Saruri anorganice
Cu anioni monovalenti Cu anioni divalenti Cu anioni trivalenti Cu anioni tetravalenti
NaOH Na2CO3 Na3PO4 Na4SiO4
KOH
RbOH MgSO4 K3PO4 Na4(D2EHPA)
NaF
Formiat de sodiu K2CO3 Na2 (sucinat) Na3(citrat)
Na2SO4 Na2 (maleat)
(NH4)2CO3
Na2 (tartrat)
(NH4)2SO4
b.Polimeri organici hidrofili
Alcool poli(vinilic)
Poli(vinil-piralidona)
Dextran
Ficoll

D2EPHA-acid di-2-etilenhexil fosforic.

 În fucţie de proprietăţile solutului şi de condiţiile experimentale alese, acesta se poate
repartiza cantitativ în una din fazele de extracţie,permiţând astfel realizarea procesului de
extracţie.
Sistemele cu două faze apoase formate din PEG şi un polimer organic hidrofil(dextran) au
fost iniţial utilizate în procesele de separare a proteinelor,dar studiile ulterioare au arătat că
aceste sisteme au un un timp de viaţă relativ scurt (cel mai mult o luna), iar eficientă lor este
comparabilă cu cele obţinute prin utilizarea sărurilor anorganice.Din această cauza, pentru
obţinerea sistemelor de extracţie cu două faze apoase se preferă utilizarea sărurilor
anorganice,care sunt mai ieftine decât polimerii organici hidrofili.
Deşi incomplet elucidată până în prezent, formarea şi separarea fazelor în sistemele cu
două faze apoase PEG- sare anorganică,pare să aibă la baza competiţia pentru hidratare
pentru polimer şi sarea anorganică, competiţie care determina o creştere a deshidratării
lanţurilor polimere şi astfel are loc separarea fazelor.Deoarece, în aceste sisteme componetul
principal este apă (70-80%), se poate spune că o prima condiţie pentru obţinerea sistemelor
cu două faze apoaseo reprezintă afinitatea mare pentru apă a componenţilor formatori de
fază.
 În cazul PEG, unităţile de etilenoxid sunt puternic hidratate cu 2-3 molecule de
apă/unitate, ceea ce explică solubilitatea mare a acestuia în apă.Pe de altă
parte, speciile ionice ale sării anorganice prezente în soluţie sunt şi ele
hidratate,gradul hidratarii lor depinde în principal , de natură şi concentraţia
acestora.
Prin urmare,atunci când cele două soluţii apoase (cea de PEG şi cea de sarea
norganica)sunt puse în contact, ionii sării anorganice tind să se hidrateze
corespunzător, ordonând în jurul lor,cât mai multe molecule de apă ceea ce
determina deshidratarea lanţurilor de polimer şi formarea celor două faze.
Formarea sistemelor cu două faze apoase implică clar excluderea mutuală
dintre PEG şi sarea anorganică,precum şi afinităţile lor mari pentru apă.Este
posibil că, chiar în sistemul omogen ionii anorganici să fie excluşi din regiunea
aproape de suprafaţă soluţiei de polimer.Cu creşterea concentraţiei polimerului
sao a sării anorganice, aria de excluziune creşte, astfel că sistemul poate atinge
starea unde, din motive entropice, formarea celor două faze să devină
favorabilă.
 În literatură există numeroase modele teoretice, bazate pe noţiuni şi interpretări ale
termodinamicii clasice, care explică formarea sistemelor cu două faze apoase.Din
păcate, aceste modele au un aparat matematic laborios şi sunt mai greu de utilizat în
practică de laborator.Totuşi, plecând de la ipoteza unanim acceptată, bazată pe
competiţia pentru hidratare a celor doi componenţi ,este evident că formarea
sistemelor cu două faze apoase va depinde de :
masă moleculară şi concentraţia soluţiei de PEg;
tipul sării anorganice(atât natură cationului cât şi a anionului) şi concentraţia soluţiei
acesteia;
factori indirecţi (pH,temperatura,prezenţa în sistem a unor săruri neutre sau încărcate
electric), care pot determina o modaficare a comportării componenţilor formatori de
faza în sistem.
Dacă în cazulPEG, datorită solubilităţii lui ridicate în apă, creşterea concentraţiei
acestuia nu afectează semnificativ echilibrele ce au loc în procesele de extracţie, în
cazul sării anorganice acest lucru poate genere unele procese secundare ( de ex:
solubilitatea sării anorganice să nu permită creşterea concentraţiei [este o anumită
valoare; modificarea echilibrelor de extracţie datorită sefectului salin,etc.) În
consecinţă, alegerea corespunzătoare a componenţilor formatori de faza (PEG i sare
anorganică), cât so a concentraţiilor acestora, asigura formarea unui sistem cu două
faze apoase stabil, cu caracteristici rezonabile de separare a fazelor( timp de separare a
fazelor mic, interfaţă net distinctă,etc), care pot fi utilizate în procesele de extracţie.
V.7.3. Factorii care influenţează formarea sistemelor cu două
faze apoase
V.7.3-1. Influenţa sării anorganice formatoare de fază
În linii generale se poate spune că abilitatea unei sări anorganice de a forma în
contact cu o soluţie de PEG, sisteme cu două faze apoase, depinde de tăria
efectului salting-out al sării, şi implicit de concentraţia acesteia din sistem.
Efectul de salting-out al unei sări anorganice este direct determinat de capacitatea
acesteia de a lega moleculele de apă din sistem, ceea ce duce la scăderea
concentraţiei moleculelor de apă libere, şi permite separarea fazelor.
Deoarece în aceste sistem, sarea anorganică se află sub formă de specii ionice
hidratate, iar gradul de hidratare a sării determină tăria efectului ei de salting-
out, evaluarea acestuia se poate face, cel puţin calitativ, utilizând următoarele
corelaţii:
 valenţa ionilor componenţi - cu cât valenţa anionului sării este mai mare, cu
atât efectul de salting-out exercitate este mai mare, şi deci concentraţia minimă
necesară pentru formarea celor faze este mai mică. Astfel, eficienţa anionului
sării anorganice la formarea sistemelor cu două faze apoase respectă ordinea
PO4 3- > CO3 2- > SO4 2- > HO- .
Interesant este faptul că această corelaţie directă între valenţa ionilor şi tăria
efectului de salting-out nu se respectă şi în cazul cationilor. Studiile
experimentale au arătat că ionul de Na+ este mult mai eficient decât Mg2+ sau
NH4+ , la formarea sistemelor cu două faze apoase.
Acest lucru poate fi explicat dacă se admite că ionii metalici, mai ales cei
multivalenţi, pot interacţiona cu oxigenul eteric din PEG, şi induc astfel mai
degrabă un efect de salting-in, decât de salting-out, asupra PEG.
 numărul liotropic al anionului sării (sau poziţia acestuia în seria
Hofmeister, care redă "abilitatea ionilor de a stabiliza structura proteinelor")
- este direct corelat cu existenţa unui grad de hidratare redus.

Astfel, ionii anorganici cu un număr liotropic relativ mic pot forma sisteme cu
două faze apoase, în combinaţie cu PEG, în timp ce ionii al căror număr
liotropic are o valoare mare, nu formează astfel de sisteme (tabelul V. 21).
 Tabelul V. 21. Valorile numărului liotropic pentru unii
anioni anorganici
Ion SO42- PO43- F- HO- Cl- Br- NO3- I- SCN-

Nr. liotropic 2,0 3,2 4,8 5,8 10,0 11,3 11,6 12,5 13,3

Formare da da da da nu nu - nu Nu
ABS

•energia liberă de hidratare Gibbs (ΔGhidr.) - permite o evaluare mult mai exactă a
tăriei efectului de salting-out al sării anorganice. Cu cât valoarea energiei de
hidratare a sării anorganice este mai mare şi negativă, cu atât efectul de salting-out
exercitat asupra PEG este mai mare (tabelul V. 22.).
Se poate observa că, separarea fazelor este puternic promovată de anionii care au
valori ale energiilor Gibbs de hidratare mari şi negative (au o densitate mare de
sarcină), care determină o "ordonare" a moleculelor de apă, ceea ce creează o
incompatibilitate între cele două faze. Efectul cationilor asupra formării şi
separării fazelor este, în general, mult mai mic decât al anionilor.
 Tabelul V. 22. Valorile ΔGhidr. pentru unii anioni şi cationi
anorganici, utilizaţi la obţinerea sistemelor cu două faze apoase
Ion PO43- SO42- CO32- HO- Cl- Br- I- Na+ Mg2+ NH4+

ΔGhidr. -2773 -1090 -1300 -345 -270 -250 -220 -385 -1830 -285
Kj/mol
Valorile mărimilor caracteristice ale diagramelor de fază (tabelul V. 23), arată că, cu cât
hidratarea ionului anorganic formator de fază este mai puternică, cu atât concentraţia sării
anorganice necesară pentru formarea sistemelor cu două faze apoase este mai mică.
Tabelul V. 23. Valorile mărimilor caracteristice ale diagramelor de fază,
pentru unele sisteme cu două faze apoase PEG - sare anorganică .

Sare ΔG0hidr. ; Csare,c , W % R Stabilitatea TLL

anorganică sistemului
Kj/mol
MgSO4 -3085 6,4 11,2071 1,3863 30,1060
Na2SO4 -1945 7,1 16,0638 0,6671 18,0315
(NH4)2SO4 -1715 8,9 17,9673 0,9013 -
NaNO3 -675 32,24 36,2196 0,1351 -
 V.7.3-2. Influenţa masei moleculare a polietilenglicolului (PEG)
Din punct de vedere al comportării lor, soluţiile de polimer pot fi tratate în două cazuri limită:
 soluţii diluate de polimer - aici moleculele de polimer sunt separate între ele de mai multe
straturi de solvent, între care nu se exercită interacţiuni sau repulsii sterice (sau acestea pot
fi neglijate). În astfel de soluţii, lanţurile polimere sunt hidratate şi accesibile, ceea ce le
conferă, o oarecare mobilitate.
 soluţii concentrate de polimer - când volumele ocupate de moleculele individuale de
polimer încep să se suprapună, iar lanţurile polimerice încep să se atingă. În astfel de
soluţii interacţiunile dintre lanţurile polimerice sunt mult mai mari, apare o "coagulare" a
macromoleculelor, ceea ce duce la o scădere a gradului acestora de hidratare şi sistemul
poate colapsa.
Pentru obţinerea sistemelor cu două faze apoase, soluţiile de PEG utilizate trebuie să fie
situate în domeniul soluţiilor diluate, unde moleculele de polimer sunt hidratate şi
accesibile, iar interacţiunile dintre lanţuri pot fi neglijate.
 
În figura V.22 este redată curba teoretică concentraţiei - masă moleculară pentru PEG, din
care se poate estima concentraţia maximă în polimer, pentru o masă molecură dată, pentru
care soluţia obţinută se situează în domeniul soluţiilor diluate.
Se poate observa, din figura V.22, că pentru obţinerea sistemelor cu două faze apoase PEG-ul
utilizat trebuie să aibă o masă moleculară medie de cel puţin 600, la valori mai mici a
masei moleculare medii, obţinerea sistemelor cu două faze apoase necesită concentraţii de
polimer infinit de mari. Pe de altă parte, cu cât masa moleculară a PEG-ului este mai mare
cu atât concentraţia soluţiei de polimer, necesară pentru obţinerea celor două faze apoase
este mai mică, dependenţă ce poate fi uşor observată în diagramele de fază (figura V.23).
Dar, creşterea masei moleculare polimerului, duce la scăderea domeniului de
concentraţii în care soluţia de polimer poate fi considerată diluată, şi prin urmare
aplicabilitatea analitică a sistemului scade. Din această cauză, pentru obţinerea
sistemelor cu două faze apoase ce sunt folosite ulterior pentru extracţie, masa
moleculară medie a polimerului nu trebuie sa fie mai mare de 8000
 V.7.3-3. Influenţa temperaturii
Creşterea temperaturii sistemului, determină o scădere a miscibilităţii între faza
de polimer şi cea de sare şi, prin urmare, se observă o deplasare a curbelor din
diagramele de fază spre origine (figura V.24).
V.7.3-4. Influenţa pH-ului
Din păcate, în literatură există un număr redus de astfel de studii,
majoritatea fiind alocate sistemelor cu două faze apoase PEG -
fosfat. În aceste sisteme, se poate observa că deplasarea pH-
ului spre valori mai mari (mediu bazic) duce la o deplasare a
curbei, din diagrama de fază, spre concentraţii mai mici de
PEG şi sare anorganică, ceea ce determină domeniului de
existenţă a sistemelor cu două faze apoase (figura V.25).
În cazul sistemului considerat, deplasarea pH-ului spre valori
mai bazice face ca forma predominantă în sistem să fie HPO42-
care exercită asupra PEG, un efect de salting-out mai puternic
decât ionul H2PO4- , datorită sarcinii mai mari.
Datorită naturii lor predominant apoase, care implică
existenţa unui mediu de extracţie nedenaturant, sistemele cu
două faze apoase sunt utilizate cu succes pentru separarea
celulelor, organelor celulare, proteinelor, enzimelor
intracelulare (după distrugerea biomasei), a unor antibiotice,
etc.
 
V.7.4. Extracţia biomoleculelor în sisteme cu
două faze apoase
Extracţia selectivă a moleculelor de proteine utilizând sisteme
cu două faze apoase PEG - polimer hidrofil (sau sare
anorganică), este de departe cea mai importantă transpunere
practică a acestui procedeu de extracţie.
Extracţia proteinelor (figura V.26) în astfel de sisteme se
realizează predominant, prin stabilirea unor interacţiuni de
tip van der Waals între molecula proteică şi componenţii
formatori de fază din sistem, ceea ce duce la creşterea
solubilităţii acestor molecule într-o anumită fază.
Deoarece un rol important în solubilizarea proteinelor îl are
hidrofobicitatea polimerului component formator de fază,
eficienţa extracţiei proteinelor va fi semnificativ influenţată de
tipul şi masa moleculară a acestuia.
Astfel, în sistemele cu două faze apoase PEG/sare anorganică (sau
dextran) se poate obţine o concentraţie mai mare a proteinei în
faza bogată în PEG dacă masa moleculară a acestuia este mică
sau o concentraţie mai mare în faza bogată în sare, dacă PEG-ul
utilizat are masa moleculară mare.
Distribuţia proteinelor între cele două faze apoase ale sistemului de
extracţie este descrisă cu ajutorul coeficientului de distribuţie
(D), definit în acest caz de relaţia:
unde: Cfaza superioară ; Cfaza inferioară - reprezintă concentraţia proteinei în cele
două faze care arată că, pentru un sistem cu două faze apoase dat,
valoarea coeficientului de distribuţie depinde doar de concentraţia
iniţială a proteinei.
Pentru a putea compara rezultatele obţinute în diferite condiţii
experimentale, Albertson (1982) propune o relaţie mai extinsă de calcul
a coeficientului de distribuţie, în care ţine cont de sarcina electrică,
proprietăţile superficiale ale celor două faze, configuraţia moleculei
proteice şi natura interacţiunilor acesteia cu solventul:

ln D = ln Del + ln Dhidrofob + ln Dhidrofil + ln Dconformaţie + ln Dinteracţiune

(V.29) unde: Di - cuantificarea factorilor consideraţi.

Astfel, variaţia tăriei ionice a soluţiilor componenţilor formatori de fază

sau a pH-ului acestora, influenţează predominant primii trei termeni din
relaţia (V. 29).
Din păcate, pentru majoritatea sistemelor, stabilirea unei relaţii cantitative
între coeficientul de distribuţie şi factorii menţionaţi este practic
imposibilă, şi prin urmare obţinerea unui randament maxim de extracţie
se face prin încercări experimentale.
Un alt factor care influenţează extracţia proteinelor în sisteme cu două faze
apoase este tăria ionică a fazelor sistemului de extracţie. În timpul
extracţiei, de o parte şi de cealaltă a interfeţei de separare apare un
potenţial electric, ca urmare a migrării ionilor din fazele apoase.
Apariţia acestui potenţial de interfaţă este un fenomen general, iar
existenţa lui este considerată decisivă în repartiţia macromoleculelor
încărcate electric, cum sunt proteinele şi acizii nucleici.
Astfel, potenţialul electric al fazei bogate în PEG este mai mare decât cel
al fazei bogate în sare (faza inferioară) şi ,în consecinţă, moleculele
proteice încărcate negativ vor trece în faza polimerică (bogată în PEG),
iar cele încărcate pozitiv vor rămâne în faza bogată în sare.
Adăugarea în sistemul de extracţie a unor săruri anorganice "adiţionale"
(de ex. KSCN, KCl, K2SO4, etc.) modifică compoziţia celor două faze
apoase (datorită modificării tăriei ionice), şi au efecte directe asupra
solubilităţii proteinelor şi implicit asupra randamentului de extracţie a
acestora (figura V.27).
Gibbs de hidratare mică şi negativă (cum sunt ionii Cl- sau SCN- ), aceştia trec
cantitativ în faza bogată în PEG şi permit extracţia mult mai eficientă a
moleculelor proteice încărcate pozitiv. În cazul în care ionii sării anorganice
"adiţionale" au o energie Gibbs de hidratare mare şi negativă (cazul ionilor
sulfat), eficienţa extracţiei scade odată cu creşterea numărului de sarcini pozitive
din molecula proteinei. Cu ajutorul acestui efect este posibilă atingerea unor
selectivităţi ridicate în procesele de separare a proteinelor şi enzimelor din
amestec; metoda fiind deja aplicată pentru separarea şi purificarea fumarazei şi
formatdehidrogenazei.Astfel, dacă în sistemul de extracţie se adaugă săruri
anorganice a căror anioni au o energie
Concentraţia iniţială a proteinelor nu manifestă nici un efect asupra
randamentului de extracţie, în domeniul concentraţiilor mici ale
acestora (mai mici de 1g/l).
Creşterea concentraţiei proteinelor peste această limită duce la
apariţia unor abateri de la comportarea ideală, datorită interacţiunilor
puternice dintre molecule.
Atunci când valoarea concentraţiei proteinelor este apropiată de
limita de solubilitate, la interfaţa de separare dintre cele două faze
apare un precipitat, iar extracţia nu mai are loc conform prognozelor.
Valoarea pH-ului controlează disocierea grupelor funcţionale ale
proteinelor şi deci, implicit va influenţa şi distribuţia acestor
molecule între cele două faze.
Astfel, în cazul sistemelor cu două faze apoase a căror ioni
componenţi formatori de fază nu sunt influenţaţi de variaţia pH-ului
(cazul ionului sulfat), coeficienţii de repartiţie pot varia, în funcţie de
natura proteinelor, cu 2-3 ordine de mărime pentru intervale înguste
de pH.
Datorită faptului că distribuţia proteinelor este influenţată de o multitudine de
parametrii experimentali, separarea acestora prin extracţie în sisteme cu două
faze apoase este dificilă şi se realizează prin 2-4 etape succesive. Un astfel de
proces de separare a proteinelor prin extracţie în sisteme cu două faze apoase,
dintr-un amestec rezultat prin distrugerea celulelor este prezentat în figura V.28.
Componenţii secundari din lichidul intracelular (proteine,
acizi nucleici, polizaharide) se pot găsi în faza bogată în
sare (dacă sunt hidrofili) sau în faza bogată în PEG (dacă au
caracter hidrofob).
Dacă după prima etapă de extracţie în faza bogată în PEG,
componenţii secundari trec într-o cantitate însemnată,
atunci această fază se supune din nou extracţiei,
adăugându-se din nou o soluţie apoasă de sare anorganică.
De asemenea, numeroase enzime provenite din diverse surse
biologice, pot fi cu succes extrase prin acest procedeu
(tabelul V.24); extracţia cantitatiă a acestor biomolecule
fiind direct dependentă de natura sistemului cu două faze
apoase utilizat.
Parametrii experimentali care influenţează extracţia
moleculelor proteice pot fi selectaţi astfel încât să se atingă
selectivităţi ridicate, în unele cazuri valorile factorului de
separare fiind mai mare de 4000.
Tabelul V.24. Eficienţa de extracţie a unor enzime din
lichide intracelulare, în sisteme cu două faze apoase.
Recent, sistemele cu două faze apoase au fost folosite ca medii de
desfăşurare a unor reacţii enzimatice.
Cel mai elocvent exemplu îl reprezintă transformarea amidonului
în glucoză, în prezenţa glucoamilazei, în sistemul cu două faze
apoase PEG(20000) - dextran.
În aceste sisteme, enzima este imobilizată în una din fazele
apoase ale sistemului, iar principalele avantaje ale acestui
procedeu (denumit conversie enzimatică extractivă) sunt:
imobilizarea reversibilă a biocatalizatorului şi eliminarea
continuă a produşilor formaţi prin extracţie în cealaltă fază a
sistemului.
 V. 8. Extracţia solid-lichid

Extracţia solid-lichid este o metodă de separare larg utilizată în practica

analitică şi industrială. Deşi nu respectă întocmai definiţia extracţiei
cu solvenţi (vezi paragraful V. 1), tratarea metodelor de extracţie
solid-lichid în acest capitol este datorată faptului că procesele
elementare ce au loc în acest caz sunt similare cu cele evidenţiate în
cadrul metodelor de extracţie cu solvenţi. Principala deosebire dintre
cele două categorii de metode o constituie starea de agregare a uneia
dintre faze.
Astfel, dacă în cazul metodelor de extracţie cu solvenţi prezentate până
acum, cele două faze ale sistemului de extracţie erau lichide şi
nemiscibile, în cazul metodelor de extracţie solid-lichid una dintre
faze este solidă şi cealaltă este lichidă, iar condiţia de nemiscibilitate
a fazelor este respectată.
În funcţie de faza sistemului de extracţie a cărei stare de agregare este
solidă, metodele de extracţie solid-lichid pot fi:
metode în care solutul este solid
metode în care solventul este imobilizat pe un suport solid.
 V.8.1. Metode de extracţie solid-lichid în care solutul este solid

Acest procedeu este frecvent utilizat în separarea produselor naturale şi are numeroase
aplicaţii în industria alimentară (obţinerea zahărului, obţinerea uleiurilor vegetale şi
animale, a unor vitamine şi enzime) şi în industria farmaceutică.
În acest caz, peste solutul care se găseşte dispersat într-un material solid inert, se
adaugă un solvent corespunzător (care nu întotdeauna este de natură organică), în
care acesta se extrage, nefiind necesară solubilizarea completă a probei. Extracţia
solutului prin această metodă se bazează pe diferenţa de solubilitate a
componenţilor materialului solid faţă de solventul utilizat şi presupune parcurgerea
următoarelor etape:
 realizarea unui contact intim între materialul solid supus extracţiei şi solvent -
granulaţia probelor solide supuse extracţiei trebuie să fie cât mai mică;
 solubilizarea solutului (compusului util) - se face prin alegerea unui solvent
adecvat;
 separarea fazelor sistemului de extracţie - în majoritatea cazurilor se face prin
centrifugare la viteze mai mari de 5000 rpm;
 regenerarea solventului;
Materialul solid supus extracţiei se comportă ca o membrană
semipermeabilă şi opune rezistenţă mai mică sau mai mare atât la difuzia
solventului în interiorul său, cât şi la dizolvarea şi difuzia solutului în faza
lichidă. Mai mult, după realizarea extracţiei, reziduul solid înglobează o
anumită cantitate de solvent, iar extractul conţine şi particule solide, ceea
ce complică procesele de recuperare a solventului şi de prelucrare a
extractului.
Extracţia compuşilor utili din materiale solide este un proces complex,
care este influenţat de o varietate de factori experimentali, grupaţi în trei
categorii:
materialul supus extracţiei:tratamentele
preliminare;umiditatea;temperatura;cantitatea de probă;
solventul:natura acestuia;capacitatea de a solubiliza solutul;capacitatea de
umectare a materialului solid; selectivitatea; densitatea;
vâscozitatea;volatilitatea;stabilitatea termică; reactivitate chimică;
toxicitatea; corozivitatea; inflamabilitatea;
condiţiile de lucru:temperatura; presiunea şi durata procesului de extracţie.
 Tabelul V.25. Sisteme de extracţie solid-lichid utilizate pentru
separarea unor biomolecule
Biomoleculă Materie primă Solvent
Atropina Material vegetal: rădăcini de 10% Na2CO3 benzen
Hyoscyamus niger;Atropa
belladona
Scopolamina Material vegetal: Soluţie diluată la H2SO4 la
Herba datura innoxiae uşoară încălzire
Morfina Material vegetal: H2O 50o C/CaCl2 pre-cipitare
Papaver somniferum cu NH3 şi KOH
Ergotamina Ciuperci parazite: Diclormetan;benzen;eter 2-3
Claviceps purpurea ore;
T=20-40oC
Insulina Material animal:pancreas de Alcool etilic 82% + HCl
porc
Enzime proteolitice Material animal:pancreas de Soluţii apoase acide (acid
porc acetic);
Proaspăt soluţii alcoolice acide sau soluţii
Acizi biliari Material animal:fiere bovină de săruri ((NH4)2SO4, 1-3 ore,
Heparina Material animal:mucoasă termperaturi scăzute
intestinală
de porc
V.8.2. Metode de extracţie solid-lichid în care solventul este
imobilizat pe un suport solid
 În cazul acestor metode, solvenţii - compuşi organici hidrofobi cu grupări
funcţionale sunt legaţi chimic pe o suprafaţă solidă, cel mai adesea silice
pulbere. Astfel, faza organică a sistemului de extracţie devine un solid
funcţionalizat, care interacţionează cu moleculele de solut, din faza apoasă a
sistemului prin intermediul legăturilor van der Waals, legăturilor de
hidrogen sau chiar a legăturilor electrostatice (figura V.29).
Condiţia necesară pentru obţinerea unui start solid
funcţionalizat este ca solventul organic utilizat să aibe un
lanţ hidrocarbonat mare (cel puţin de 10 atomi de carbon).
Se obţine astfel o fază organică cu un puternic caracter
hidrofob, care trebuie condiţionată pentru a putea
interacţiona cu solutul din faza apoasă.
Condiţionarea fazei organice se face trecând metanol sau un
alt solvent organic similar prin stratul solid. Moleculele
acestuia pătrund în stratul hidrofob şi permit difuzia
ulterioară a moleculelor de apă şi solut.
După condiţionare, stratul solid se spală cu apă pentru a
elimina excesul de metanol, înainte de adăugarea probei.
În figura V. 30 sunt prezentate principalele patru etape ce
trebuie parcurse la realizarea unei extracţii solid-lichid.
Din punct de vedere experimental, într-o astfel de extracţie silicea pulbere
funcţionalizată este pusă într-un tub (similar cu cel al unei seringi), iar peste acesta se
adaugă proba care este forţată să treacă prin stratul solid. La contactul intim, dintre
cele două componente are loc extracţia solutului, care ulterior este eluat.
Extracţia solid-lichid permite separarea proteinelor, enzimelor şi aminoacizilor din
amestecuri, mai ales când concentraţia acestora este mică. Principalul dezavantaj al
acestei metode este legat de dificultatea de a obţine un strat solid funcţionalizat care
să asigure o selectivitate ridicată a procesului de separare
V. 9. Bibliografie
 I. Sârghie, Metode de separare în chimia analitică, Editura "Gh. Asachi", Iaşi, (2001).
 A. Bold, Metode de separare şi concetrare, vol. I, Editura Univ. "Al. I. Cuza", Iaşi, (1974).
 N. E. Perescu, Chimia extracţiei cu solvenţi şi aplicaţii, Editura Academiei R.S.R., Bucureşti, (1985).
 E. Jercan, Metode de separare în chimia analitică, Editura Tehnică, Bucureşti, (1983).
 G. Morrison, H. Freiser, Solvent extraction in analytical chemistry, Willey, New York, (1957).
 D. Caşcaval, Tehnici de separare şi concentrare specifice în industria biochimică, Editura Univ. "Gh. Asachi",
Iaşi, (2000).
 M. Răileanu, Influenţa mediului asupra reactivităţii chimice, Editura Scrisul Românesc, Craiova (1981), p.
401.
 V. Kislik, http://preprint.chemweb.com, din 21 iulie (2002).
 D. Caşcaval, C. Oniscu, A. I. Galaction, Inginerie biochimică şi biotehnologie.3. Procese de separare, Editura
Performantica, Iaşi, (2004).
 M.T.H. Baird, Can.J.Chem. Eng. 69(2), (1991), 1287.
 C.H. Lee, S.K. Tsang, R. Urakabe, C.K. Rha, Biothechnol. Bioeng.,21, (1979), 1.
 C. Luca, L. Mutihac, T. Constantinescu, Rev. Chimie, 39(12), (1988), 1141.
 C. Luca, L. Mutihac, T. Constantinescu, Rev. Roum. Chim., 34 (11-12), (1989), 2039.
 C. Luca, L. Mutihac, T. Constantinescu, , Rev. Roum. Chim., 35(3), (1990), 467.
 N. B. Devi, K.C. Nathsaruna, V. Charavortly, Hydrometallurgy, 45 (1997), 869.
 T. Wang, Y. Nagaosa, J. Chem. Technol. Biotechnol., 77 (2002), 1316.
 J. Dupont, C.S. Causorti, J. Spencer, J. Braz. Chem. Soc., 11(4) (2000), 337.
 J. A. Dean, Analytical Chemistry Hanbook, vol. 4, McGraw-Hill Inc., New York, (1985).
 M. A. Rodrigues, J. Li, A. J. Almeido, H. A. Mats, E. Gomez de Azevedo, Braz. J. Chem. Eng. 23(2), 2006,
205.
 L. L.B Santana ,L .A.Carodos , J.I Drezian,V.F. Sanza ,T. A. A. Costa ,D .A , Nobrega,S.V.A Hathemwger , E S
Velaza ,Braz,J . Chem . Eng.,23(4), (2006) ,526.
 Nobrega,S.V.A Hathemwger , E S Velaza ,Braz,J . Chem . Eng.,23(4), (2006) ,526.
 E. Steffani, A .C .Atti-Santos, L. Atti-Serafini, L. T. Pinto, Braz J. Chem. Eng., 23(2) , (2006) ,259
 K. A . Anathapadmanabhan ,E .D. Goddard, Langmuri ,3(1987),25.
 H. Cabezas Je., J .Chrmatogr. B,680(1996),3
 M. Li, Z.Q. Zhu, Y. T .Wu, D ,Q . Lui, Chem. Eng ,Sci.,53(15) (1998),2765.
 Y. T. Wu, D. Q. Liu, Z. Q. Zhu , L.H .Mei, Fluid Phase Equilib., 124(1996),67.
 M C. Meler , J. F, Carpenter, T. W .Radolph, Arch. Biochem.Biophys., 363(2) (1999) ,67.
 Y . Marcus,J. Chem. Soc. Faraday Trans., 87(18) (1987) 2995.
 Y . Xu, M. A. Sanzo, M. Z.R. Pantes, M. Vitalo, A . Pessoa Jr., Braz
 P. Lutwyche, R. Morris- Jones, D. E. Brooks, Appl. Environm. Microbiolog .,61(9) (1995) , 3251.
 M. E da Silvia ,T. T. Franco, J Chromatogr .B, 743 (2001),287.
 J. Persson, H. O. Johanss, F. Tjerneld, Ind. Eng. Chem. Res., 39 (2000),2788.
 C. Li. Bai, W. Li, Z . Wei, X.Y. Cao, Y. Q. Liu, Z. T. Yuan, J. Chem. Techonl. Biotechnol. Prog.,17
(2001) ,366.
 J. H. Zhu, D. Z. Wei, X.Y Cao,Y .Q. Liu, Z. Y.Yuan, J. Chem. Techonl. Biotechnol.,76(2001) ,1174.
 A .Berman M. Cohen,O Regev, Langmuir, 18 (2002) ,5681.
 M .Rico-Palomares, L .Nunez, D .Amador , J .Chem. Techonl. Bioctechnol.,76(2001),1194.
 M.Rico-Palomares ,A. P . J Middelberg, J. Chem. Tech. Biothech,.77(2002),1025.
 M .Rico-Palomares, L .Nunez, D .Amador , J .Chem. Tech. Biothech.,76,(2001) 1273.
 K. Berngren,H . O Johonsson,T. Tjerneld, J. Chromatogr. A,718 (1995),67.
 A.E Visser, S T. Griffin,D H. Hartman, R. D. Rogers, J. Chromatogr. B,743(2000),107.
 J. A Henderson , R . W . Richards, J . Penfold , R . K. Thomas, J. R.Lu, Marcomolecules, 26( 1993) ,
4591
 N .L Abbott, D Blankschtei ,T A. Hatton, Marcomolecules 24( 1991) ,4334.
 G.D. Christian, Analytical Chemistry, Fifth Edition, John, Willey &Sons Inc.,New York , (1994 ),p
23-53.
 VI.1. Considerații generale
VI.2. Electroforeza pe coloane de lichid

Cap. VI. METODE VI.3. Electroforeza zonală

VI.4. Electroforeza pe gel
ELECTROFORETICE VI.5. Izotacoforeza
DE ANALIZĂ VI.6. Variante imunoelectroforetice
VI.7. Electroforeza bidimensională
VI.8. Electrocromatografia
VI.9. Bibliografie
VI.1. Considerații generale

Prin electroforeză se înțelege migrarea unor ioni sau particule încărcate (celule,
ioni macromoleculari, molecule organice, etc.) în soluție sau în suspensie, sub
influența unui curent electric. Separarea în acest caz depinde de mobilitățile
relative ale particulelor încărcate și are loc într-o singură fază.

În cazul cel mai general, un sistem electroforetic este alcătuit din:

● o fază lichidă – un electrolit în soluție;
● o fază solidă – aflată în contact cu faza lichidă, ce poate fi: pereții unei coloane
de separare, medii stabilizante poroase etc.;
● atunci când sunt folosite suporturi poroase, poate fi prezentă și o a treia fază – o
fază gazoasă, aflată în echilibru cu faza lichidă.
VI. 1.1. Clasificarea metodelor electroforetice

Clasificarea metodelor electroforetice se poate face considerând următoarele criterii:

1. După mărimea particulelor din faza lichidă:
● Ionoforeza – migrarea particulelor ionice mici într-un câmp electric;
● Electrodializa – îndepărtarea ionilor mici de molecule și particule mari;
● Electroforeza – migrarea diferențială a moleculelor mari în suspensie sau coloidale într-
un câmp electric, fără ca acestea să sufere reacții la electrozi.
 
2. După modul de realizare:
● Electroforeza liberă, în coloana de lichid;
● Electroforeza zonală, în care migrarea are loc pe un suport poros inert (hârtie, acetat de
celuloză, geluri de amidon sau poliacrilamidă);
● Electroforeza cu focalizare;
● Izotacoforeza.
 
 3. În funcție de tensiunea aplicată:
● Electroforeza la tensiune joasă;
● Electroforeza la tensiune mare.
 
4. În funcție de natura principiului de separare:
● Electroforeza în care are loc numai migrarea componenților;
● Electroforeza în care are loc atât migrarea cât și interacția cu purtătorul;
● Electroforeza în care are loc migrarea, interacția cu purtătorul și difuzia.

Un aspect important al electroforezei în abilitatea sa de a separa materialele pe baza

mobilității lor diferite în câmp electric este imunoelectroforeza. În această tehnică se
folosesc reacțiile imunochimice cunoscute între antigen și anticorp pentru identificarea
proteinelor separate pe cale electroforetică.
VI.1.2. Migrarea ionilor în procesul de electroforeză

Separarea componenților unui amestec prin metode electroforetice are la bază vitezele de
migrare diferite ale componenților, sub acțiunea curentului electric. Acestea sunt influențate
de mai mulți factori, cum ar fi:
- factori legați de proprietățile ionului (sarcină, formă, tendința de disociere);
- factori privind mediul în care se studiază ionul (concentrația electrolitului, tăria ionică,
vâscozitatea, pH, temperatură);
- factori legați de caracteristicile câmpului aplicat (intensitate, tensiune);
- factori determinați de proprietățile mediului poros (adsorbția, potențial de curgere).

Dacă o particulă încărcată electric este dizolvată sau suspendată într-un mediu lichid care
se găsește sub influența unui câmp electric uniform, aceasta se deplasează cu o viteză de
migrare constantă. Speciile încărcate pozitiv se vor deplasa către catod, iar speciile încărcate
negativ către anod. Viteza de migrare a speciilor implicate în procesul de electroforeză este
determinată de forțele care acționează asupra lor.
VI.2. Electroforeza pe coloană de lichid (Tiselius)

Acest tip de electroforeză are loc într-un mediu liber-nelegat și este utilizată în principal
pentru separarea proteinelor și pentru determinarea mobilității absolute a unor proteine
solubile.
În acest caz, drept coloană de separare se utilizează un tub în formă de „U”, cu diametru
mic, din sticlă sau cuarț (figura VI.1.). Coloana este alcătuită din trei părți: părțile laterale
conțin soluția de electrolit (conținut în părțile laterale). La aplicarea unei diferențe de
potențial la capetele coloanei, componentele amestecului vor migra cu viteze diferite, în
funcție de mobilitățile lor, ceea ce duce la separarea acestora. Aceasta determină formarea
unor fronturi mobile între componenții din amestec, care nu sunt separate distinct, ci doar
parțial (figura VI.1.).
 Pentru realizarea electroforezei pe coloană de lichid se stabilesc în prealabil condițiile
de lucru în așa fel încât sub acțiunea curentului electric toate proteinele din amestec să
migreze în aceeași direcție, dar cu viteze diferite. În final vor apare o serie de suprafețe de
separare în care variația gradientului de concentrație are valoarea maximă.
Deoarece soluția amestecului de proteine are o densitate mare, aceasta va conduce la o
stabilizare a suprafețelor de separare, și va împiedica amestecarea lor prin convecție cu
soluția electrolitului inert, dar și spararea completă a componenților din amestec.
Componenții coloidali rămân deci parțial neseparați, suprapuși.
VI.3. Electroforeza zonală

Metoda electroforezei zonale cuprinde mai multe tehnici înrudite, care se bazează pe
separarea componenților în zone izolate, într-un mediu lichid fixat pe un suport poros,
dispus fie sub formă plană, fie sub forma unui cilindru. În ultimul caz, zonele separate în
urma procesului de electroforeză au forma unor discuri, iar metoda se numește
electroforeza în disc.
Ca suport al electrolitului se poate utiliza:
- hârtie pentru electroforeză (Whatman 3MM 2 x 28 cm);
- membrane de celuloză, care în comparație cu hârtia au o porozitate mai uniformă și deci o
rezoluție mai bună, permit reducerea timpului de migrare, sunt complet transparente după
identificarea componenților și permit o determinare cantitativă mai precisă. Membranele de
celuloză sunt fragile, când sunt uscate și devin flexibile în stare umedă.
 Tehnicile zonale sunt cele mai utilizate atât pentru scopurile analitice cât și preparative, pot fi
aplicate la toate substanțele solubile și încărcate și prezintă numeroase avantaje: viteză ridicată,
echipament și tehnică simplă, posibilitatea separării mai multor probe simultan, identificarea
specifică a componenților.
În funcție de tensiunea aplicată celulei electroforetice, electroforeza zonală poate fi realizată
la:
- tensiune joasă;
- tensiune înaltă.

Electroforeza la tensiune joasă: Principalul avantaj al acestei tehnici este acela că necesită o
aparatură foarte simplă, alcătuită dintr-o cameră de electroforeză și un redresor de curent
continuu stabilizat. Camera de electroforeză este prevăzută cu două celule pentru soluția de
electrolit (tampon), care sunt reunite printr-o punte centrală. În interiorul celulelor se află
montați doi electrozi de platină și un dispozitiv pentru susținerea benzilor de hârtie sau
membranelor (figura VI.2.). Proba de analizat se aplică la unul din capetele suportului (hârtie
sau membrană), iar sub acțiunea curentului electric aceștea migrează diferit, realizându-se astfel
separarea lor.
 După separare, o etapă importantă este vizualizarea componenților separați din amestec.
În acest scop se utilizează diferiți reactivi analitici care dau reacții de culoare cu
componenții separați. De exemplu: pentru proteine se poate utiliza soluții de albastru de
bromfenol.

Electroforeza la tensiune înaltă: Pentru a scurta timpul de lucru și a mări eficiența de

separare a componenților din amestec, este de preferat utilizarea metodelor electroforetice
la tensiune înaltă. Principalul dezavantaj al utilizării electroforezei la tensiune înaltă pentru
separarea componenților biochimici este datorat faptului că odată cu creșterea gradientului
de potențial are loc și creșterea cantității de căldură generate, ceea ce poate duce la
degradarea probei în timpul procesului de separare. Acest dezavantaj poate fi mult
minimalizat prin stabilirea riguroasă a condițiilor de lucru.
 Metodele electroforetice zonale sunt frecvent utilizate pentru separarea proteinelor,
aminoacizilor, monozaharidelor, etc., cu ajutorul soluțiilor tampon de borax (pH=7,0 – 9,7),
glicoli, ortofenoli, alcaloizi, ioni anorganici și complecși (tabelul VI.1.).

Tabelul VI.1. Raportul distanțelor de migrare a unor aminoacizi în raport cu alanina

(tensiune = 100V, suport: hârtie, soluție electrolit: acid formic 2,5% + acid acetic 7,8%;
pH=1,83, timp = 200 min.).

Aminoacid Raport Aminoacid Raport

Alanină 1,00 Leucină 0,77
Β-alanină 1,45 Metionină 0,71
Arginină 1,31 Ornitină 1,52
Acid aspargic 0,61 Serină 0,69
Cisteină 0,59 Taurină 0,03
Glutamină 0,69 Valină 0,81
 VI.4. Electroforeza pe gel

În acest caz, migrarea componenților din proba de analizat se realizează pe un suport

semisolid, care este un gel polimeric. Separarea componenților din amestec se realizează ca
urmare a deplasării diferite a acestora pe suportul de gel, aflat în contact cu o soluție de
electrolit (soluție tampon), sub acțiunea curentului electric. Din punct de vedere
experimental, realizarea unei separări electroforetice pe gel presupune în principiu,
parcurgerea următoarelor etape:
-Prepararea gelului și pregătirea suportului pentru electroforeză;
-Aplicarea probei ce urmeză a fi separată;
-Migrarea componenților probei, sub acțiunea curentului electric;
-Vizualizarea spoturilor obținute în urma separării;
-Analiza calitativă și cantitativă a componenților din amestec.
 
VI.4-1. Prepararea gelurilor

Gelurile utilizate în electroforeză se obțin prin polimerizare directă urmată de cele mai
multe ori de reticularea lanțurilor polimerice. Pentru a putea fi utilizat în separările
electroforetice, gelul trebuie să îndeplinească condițiile:
-Să fie inert în cursul procesului de separare;
-Să permită eliminarea curenților de convecție și difuzie – astfel încât zonele separate să
rămână net delimitate;
-Să poată fi preparat repede;
-Să aibă proprietăți uniforme;
-Să fie reproductibil.
Aceste condiții sunt practic total satisfăcute de gelul de poliacrilamidă, gelul de amidon și
de gelul de agaroză; aceste trei tipuri de gel fiind cel mai frecvent folosite în aceste separări
electroforetice.
 În medii gelificate, trecerea oricărei particule este întârziată de însăși structura suportului
de gel, întârziere ce este direct proporțională cu dimensiunea porilor din rețeaua gelului. Din
acest motiv, eficiența procesului de separare electroforetică depinde atât de dimensiunile cât
și de sarcina moleculelor din proba de analizat. De exemplu: în gelurile de agaroză,
dimensiunea porilor este mare, astfel încât influența dimensiunii porilor este pentru cele mai
multe proteine, mai puțin evidentă decât în cazul gelurilor de amidon sau poliacrilamidă.

Pentru obținerea unor geluri cu dimensiuni controlate a porilor și reproductibile din punct
de vedere analitic se utilizează agenți de reticulare. Agenții de reticulare sunt monomeri
organici, care pot conține în molecula lor grupări funcționale și care în timpul procesului de
polimerizare despart practic lanțurile polimerice, formând cavități cu dimensiuni mari.
Astfel, prin introducerea unui agent reticulant în procesul de obținere a gelului de
poliacrilamidă, cum este N, N'-metilen-bis-acrilamida (Bis), dimensiunile porilor pot crește
de la 20 nm la 500-600 nm, pentru geluri cu grad înalt de reticulare.
 Un alt factor care influențează eficiența separării este temperatura la care are loc
polimerizarea gelului. Polimerizarea acestora la temperaturi mici (0-4ᵒC) duce la
obținerea unor geluri neomogene si nereproductibile. Temperaturile ridicate (peste
50ᵒC) sunt și ele inadecvate, deoarece generează lanțuri polimerice scurte și
neelastice, care influențează migrarea componenților din proba de analizat. Din
această cauză în electroforeza pe gel, gelul este obținut prin polimerizare la
temperaturi cuprinse între 25-30ᵒC.
În această metodă electroforetică, gelul poate fi dispus sub trei forme geometrice:
plăci orizontale, plăci verticale și cilindrii verticali, fiecare cu avantajele și
dezavantajele sale.
 1.Electroforeza cu geluri plate orizontale: în acest caz obținerea gelului are
loc într-o matriță (figura VI. 3 a), a cărei grosime este exact stabilită în funcție
de natura probei. Pe placa de gel astfel obținută, se decupează șănțulețe în care
se pun volume cunoscute de probă de analizat, cu ajutorul unei microseringi.
Placa de gel astfel pregătită se montează într-un tanc obișnuit de electroforeză
(figura VI. 3 b), iar contactul electric între gelul-placă și soluția tampon se face
cu ajutorul unor bucățele de vată sau hârtie de filtru.
  Principalele avantaje ale unui astfel de montaj sunt:
-aplicarea probei se poate face în orice punct de pe placă, nefiind necesară
cunoașterea direcției de migrare a componenților (dacă proba de analizat se
plasează la mijloc);
-aparatura necesară este necostisitoare, și poate fi utilizată și în alte sisteme
electroforetice plane.
 
 2.Electroforeza cu geluri plate verticale: în cadrul acestei metode, plăcile
de gel sunt prinse între două plăci de sticlă (sau plexiglas). Acestea sunt
montate în aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc (figura VI. 4) și
introduse în soluția tampon corespunzătoare.
Avantajele utilizării unei astfel de tehnici sunt:
-aparatura are o concepție deosebit de simplă;
-pot fi montate simultan mai multe plăci cu gel, permițând astfel analiza
simultană a mai multor probe;
-montarea plăcilor de gel verticale poate fi lesne modificată, în funcție de
natura probelor de analizat.
 3.Electroforeza cu geluri cilindrice: în această variantă, polimerizarea
monomerului se face în tuburi de sticlă (cu diametrul de 4-5mm și o
lungime de 7-11 cm), iar cilindrii cu gel astfel obținuți sunt montați
vertical între două compartimente cu tampon care conțin electrozi (figura
VI. 5). Cilindrii cu gel preparați în acest mod pot fi utilizați în separările
electroforetice imediat sau după un anumit interval de timp (caz în care se
impune conversarea lor).
Pentru a obține o separare eficientă și reproductibilă în acest caz este
necesar ca toate tuburile să aibă dimensiuni identice, să fie absolut
verticale, să conțină aceeași cantitate de gel, iar suprafața gelului să fie
perfect plană.
 VI.4-2. Alegerea tamponului electroforetic

În metodele electroforetice, tamponul electroforetic este soluția

care asigură transportul curentului electric de la sursă, la placa de
gel pe care este depusă proba de analizat. Deoarece migrarea
componeților din probă are loc numai când aceștia posedă sarcină
electrică, este evident că tamponul electroforetic trebuie să asigure
prezența componenților din probă în formă ionică.
 Deși nu există un algoritm general valabil, pentru alegerea unui tampon
electroforetic adecvat, trebuie avut în vedere următoarele:
-dacă unele dintre componentele probei sunt instabile sau precipită la o anumită valoare
de pH, acea valoare trebuie evitată în cursul separării;
-în soluții libere, mobilitatea biomoleculelor crește cu cât pH-ul tampoului electroforetic
este mai diferit de pH-ul punctului izoelectric. De aceea la analiza unui amestec
necunoscut este de preferat utilizarea unui tampon cu pH extrem, care va permite
deplasarea tuturor componenților în același sens;
-în general, biomoleculele cu caracter bazic se separă optim la pH acid, unde au
mobilitate maximă; în timp ce biomoleculele cu caracter slab acid (cu pH-ul izoelectric
cuprins între 4 și 7,5) se pot separa în tampoane cu caracter bazic (8 și 9).
-tampoanele electroforetice trebuie să aibe o tărie ionică suficientă pentru a menține
proba în soluție și a asigura o capacitate de tamponare optimă. În majoritatea soluțiilor
tampon, tăria ionică are valori cuprinse între 0,05-0,1 M, dar se pot folosi și concentrații
mai scăzute până la 0,025 M, sau mai mari de până la 0,5 M (caracteristice tampoanelor
puternic acide). Plecând de la aceste considerații cele mai frecvent folosite tampoane
electroforetice sunt prezentate în tabelul VI.2
 Tabelul VI.2. Tampoane de largă utilizare în electroforeza cu gel .
Interval aproximativ de pH Compoziția primară a tamponului Ajustarea pH-ului

2,4-6,0 Adic citric 0,1M NaOH 1 M

2,8-3,8 Acid formic 0,05 M NaOH 1 M
4,0-5,5 Acid acetic 0,05 M NaOH 1 M sau Tris
5,2-7,0 Acid maleic 0,05 M NaOH 1 M sau Tris
6,0-8,0 KH2PO4 sau NaH2PO4 NaOH 1 M
7,0-8,5 Na dietil-barbiturat 0,05 M HCl 1 M
7,2-9,0 Tris 0,05 M HCl 1M sau glicină
8,5-10,0 Na2B4O7 0,015 M HCl sau NaOH 1 M
9,0-10,5 Glicină 0,05 M NaOH 1 M
9,0-11,0 NaHCO3 0,025 M NaOH 1 M
 Atunci când gradul de separare a componenților din amestec nu este
satisfăcător, eficiența separării poate fi îmbunătățită prin utilizarea
tampoanelor multifazice. Tampoanele multifazice sunt preferate mai ales când
se supun analizei amestecuri complexe. Deși utilizarea lor experimentală este
ceva mai complicată, tampoanele multifazice sunt utilizate cu succes atunci
când:
(1) în timpul separării pH-ul trebuie menținut constant în limite foarte stricte;
(2) când trebuie evitată inactivarea probei;
(3) pentru separarea selectivă a unui anumit component din probă;
(4) pentru experimente preparative.
VI.4-3. Aplicarea probei și electroforeza

Atunci când se folosesc geluri și tampoane electroforetice omogene, în primele

etape ale electroforezei nu are loc concentrarea componenților din proba de analizat. Din
această cauză este importantă utilizarea unor volume foarte mici (20-25µl) de probă,
care trebuie aplicată în straturi subțiri (pentru a obține o rezoluție bună a benzilor).
Dacă în cazul tehnicilor orizontale aplicarea probei se face în spațiile special
construite, în cazul tehnicilor verticale (cu geluri cilindrice sau plate) proba se aplică
prin tamponul electroforetic în incinta superioară a electrodului cu ajutorul unei
microseringi sau a unei micropipete, astfel încât proba să aibă o densitate mai mare a
tamponului. Atunci când densitatea probei nu este comparabilă cu cea a tamponului
electroforetic, pentru a evita deplasarea diferențiată a componenților din probă față de
cei ai tamponului se poate adăuga sucroză, uree (2-10%) sau glicerol (5-10%).
 Totodată cu aplicarea probei, pe suportul de gel se pun și cantități
foarte mici de colorant trasor. Acest colorant se alege în funcție de pH-ul
tamponului electroforetic (pentru mediul bazic: albastru de bromfenol; pentru
mediul acid: verde de metilen, albastru de metilen),care are menirea de a
migra în timpul electroforezei cu o viteză mult mai mare decât oricare dintre
componenții probei de analizat și de a arăta momentul de sfârșit al separării
(cel mai adesea atunci când colorantul ajunge la 5 cm de marginea superioară
a gelului). Poziția inițială a colorantului trasor reprezintă punctul de referință,
față de care se măsoară deplasarea componenților din probă.
Imediat după aplicarea probei, electroforeza trebuie să înceapă
imediat, pentru a evita difuzia componenților din probă în masa gelului.
VI.4-4. Colorarea gelului după electroforeză

După terminare electroforezei,curentul electric este întrerupt iar

gelul este îndepărtat din aparat pentru localizarea componentelor
separate. Localizarea și vizualizarea componentelor se face prin
colorare, folosind un colorant adecvat. Acesta este reprezentat, de cele
mai multe ori, de amestecuri ce conțin o substanță organică, care
formează cu anumite componente din probă produși colorați, ușor de
identificat.
Pentru aceasta, gelurile sunt imersate în băi ce conțin amestecul de
colorare pentru cel mult 24 de ore, timp în care pot fi necesare mai
multe schimbări ale colorantului.
 Cele mai uzuale amestecuri de colorare a gelurilor utilizate în cazul
separării proteinelor sunt prezentate în tabelul VI.3.
În practica experimentală sunt preferate acele metode care
colorează doar zonele din gel în care se află componenții separați în urma
electroforezei, și mai puțin cele care colorează întreg gelul. Cu toate
acestea, indiferent de metoda de colorare folosită apare o adsorbție
nespecifică de fond, care trebuie ulterior redusă printr-o etapă de
decolorare, astfel încât benzile de pe placa de gel să poată fi vizualizate și
eventual cuantificate.
Tabelul VI.3. Metode de vizualizare a proteinelor separate prin electroforeză pe gel .
Amestec colorant Timp de colorare Amestec decolorant Observații
Amido Black 10B 1-10 g dizolvat în 0,5-2,0 h Acid acetic 10% Metodă foarte simplă
25 ml metanol; se adaugă 100 ml
acid acetic+650 ml apă

Coomassie Blue R250 1 g dizolvat în 1,0 h 500 ml metanol+ 100 ml acid Metodă foarte sensibilă
500 ml metanol; se adaugă 100 ml acetic+400 ml apă
acid acetic+ 400 ml apă

Xylene Cyanine Briliant G 2,5 g 0,5-1,0 h TCA 5% timp de 10-60 min Metodă foarte simplă experimental
dizolvate în 500 ml metanol; se
adaugă 500 ml TCA 25%

Sulfonat de anilinonaftalenă 30 mg 0,05 h - Marcare fluorescentă, metoda este

în 100 ml fosfat de sodiu 0,1 N mai puțin sensibilă
(pH=6,8)

o-Ftaldehidă: gelurile sunt înmuiate 25 min - Colorație sensibilă fluorescentă;

10 min în soluție de 2- păstrează activitatea enzimatică
mercaptoetanol, barbiturat sau
bicarbonat 0,1 N
 Decolorarea gelurilor se poate face prin spălare sau printr-o
electroforare ulterioară. Metoda spălării constă în îndepărtarea excesului
de colorant prin imersarea gelului într-un volum mare de solvent adecvat
(pentru cel puțin 24 ore); viteza de difuzie a moleculelor de colorant în
solventul de spălare fiind adesea mărită prin agitare sau prin schimbarea
frecventă a solventului utilizat.
În cazul decolorării electroforetice este necesară plasarea gelului
între 2 electrozi, astfel încât potențialul electric să se aplice prin geluri.
Această procedură reduce timpul necesar decolorării și este aplicată
numai când componentele separate din proba de analizat sunt ușor și
complet fixate în etapa de colorare.
 VI.4-5.Analiza cantitativă a componentelor separate

Analiza cantitativă a componenetelor separate prin electroforeză pe gel are la bază

măsurarea intensității de colorare (densitometria) a zonelor de gel corespunzătoare,
folosind cel mai adesea densitometre. Intensitatea colorației poate fi măsurată direct,
prin scanarea gelurilor colorate sau chiar necolorate, sau indirect, scanând negativele
fotografiilor gelurilor.
Cel mai frecvent utilizată este densitometria gelurilor colorate, unde pentru
determinarea cantitativă a componentelor separate, se pot utiliza densitometre relativ
ieftine, cu o rezoluție medie. Calitatea măsurătorilor cantitative în acest caz depinde în
principal de rigurozitatea preparării și fixării suportului de gel, precum și de gradul de
separare a benzilor obținute în urma electroforezei.
 În urma scanării gelului detensitometrul măsoară insensitatea
colorației în fiecare punct, semnalul obținut este înregistrat și cuantificat
prin măsurarea suprafețelor corespunzătoare fiecărui pic (figura VI.6).
Pentru a mări acuratețea determinărilor cantitative se preferă
includerea unui standard intern în fiecare probă necunoscută. Aceasta se
amestecă, într-o proporție cunoscută, cu proba de analizat, iar
măsurătorile se fac în comparație cu acest standard. În tabelul VI.4, sunt
prezentate câteva dintre cele mai utilizate standarde interne, pentru
analiza proteinelor.
 Densitometria negativelor fotografice este utilizată la analiaza cantitativă a benzilor
fluorescente, mai ales atunci când fluorescența are un timp de viață scurt. În acest caz
aparatul trebuie prevăzut cu anexe suplimentare pentru fluorescență, iar acuratețea
măsurătorilor depinde într-o mare măsură de condițiile de fotografiere a gelurilor.
Tabelul VI.4. Standarde interne utilizate în analiza cantitativă a proteinelor

Proteină pH izoelectric Masă moleculară

Lizozim 10,0 14,000
Citocrom c 9,3 12,256
Ribonuclează A (vacă) 8,9 13,500
Mioglobină(cal) 7,3 17,500
Eritroaglutinină 6,5 130,000
Insulină (bovină) 5,7 11,100
B-Lactolobulină B 5,3 36,552
b-Lactoglobulină A 5,1 36,724
Albumină serică bovină 5,1 67,000
Ovalbumină 4,7 45,000
 Electroforeza pe gel este o metodă larg răspândită în analiza
biomoleculelor încărcate electric, care necesită cantități foarte mici de
probă pentru analiză și care poate fi aplicată pentru amestecuri de proteine,
lipoproteine, glicoproteine, peptide și acizi nucleici. Aceste avantaje,
precum și variantele multiple de lucru oferite, atât prin modalitățile de
preparare a gelului, cât și prin posibilitățile de montare experimentale, fac
practic ca această metodă să poată fi universal aplicată pentru separarea
amestecurilor de biomolecule.
VI.5. Izotacoforeza

Denumită și electroforeză de deplasare, izotacoforeza separă

componenții unei probe de analizat pe baza mobilităților lor
electroforetice, în zone distincte, cu grosimi de ordinul micronilor.
Aceste zone sunt cuprinse între două soluții electrolitice, dintre care
prima conține un ion conducător, iar cea de a doua un ion terminal. În
raport cu mobilitatea oricăruia dintre ionii amestecului de separat,
mobilitatea ionului conducător trebuie să fie mai mare, iar cea a
ionului terminal mai mică. Concentrația fiecărei specii ionice este
determinată de concentrația ionului conducător.
 Izotacoforeza se particularizează în gama tehnicilor electroforetice
prin capacitatea de a permite separarea simultană a unor substanțe
purtătoare de sarcini pozitive și negative.
Sistemele de separare prin izotacoforeză sunt formate din trei
unități. De exemplu, în cazul unui amestec ternar al anionilor A, B și C
(figura VI.7), în componența sistemului de separare izotacoforetică intră:
-compartimentul anodic, în care se găsește tamponul cu elecrolitul prin a
cărui disociere se formează ionul conducător (F);
-compartimentul în care se introduce amestecul analizat;
-compartimentul catodic, care conține tamponul cu electrolitul generator
al anionului terminal (T).
 Procesul de separare prin izotacoforeză, reprezentat schematic în figura VI.7, se
desfășoară în următoarea succesiune: introducerea probei→aplicarea unui câmp electric
între cei 2 electrozi→migrarea electroforetică a componenților de separat cu viteze
diferite→atingerea stării de echilibru.
 În condiții de echilibru, constituienții amestecului migrează în zone
învecinate distincte, cu aceeași viteză. Această stare de echilibru care dă
și denumirea metodei este definitorie pentru izotacoforeză. Necesitatea
respectării condiției de egalitate între toate vitezele cu care se deplasează
speciile ionice (caracterizate prin mobilități electroforetice diferite) în
același câmp electric impune ca pentru fiecare zonă în care se mișcă un
anumit grup de ioni să existe un gradient diferit de potențial. Acești
gradienți se formează spontan pe parcursul procesului de migrare
electroforetică.
 Pentru punerea în evidență a zonelor astfel separate se pot utiliza
următoarele tipuri de detectoare :
Universali
-înregistrează o proprietate care este în
corelație directă cu mobilitățile efective ale
speciilor ionice separate (conductibilitatea
specifică, gradientul de potențial, gradienți
termici);
-izotacoferograma se prezintă sub forma
unor trepte crescătoare cu următoarele
caracteristici analitice: calitativă-înălțimea;
cantitativă-lățimea lor.
Specifici
-se bazează pe măsurarea unor proprietăți
necorelate cu mobilitățile efective ale ionilor
separați, cum ar fi de exemplu absorbția în
UV;
-izotacoferograma are aspectul unor trepte
a căror înălțime depinde de absorbtivitățile
molare ale speciilor ionice separate.
 Detecția frecvent utilizată implică absorbția în UV – VIS sau fluorescentă
indusă prin laser. Îmbunătățirea sensibilității și specificității detecției
presupune echiparea sistemelor de elecroforeză cu spectrometrie de
masă sau cu biosenzori.
Cuplarea electroforezei capilare cu un biosenzor conduce la sisteme
caracterizate prin: versatilitate,aplicarea unor probe mici,rapiditate,
eficiență ridicată,excelentă selectivitate de detecție.
Performanțele separărilor izotacoforetice depind de o multitudine de
factori între care prioritari sunt:pH-ul,tăria ionică,mobilitățile ionilor
conducători și terminali,contraionii selectați,capacitatea de
tamponare,compoziția probei,capaciatatea de încărcare,tensiunea
aplicată, metoda de detecție.
 VI.5-1. Variante izotacoforetice
Separările prin izotacoforeză se pot efectua în scopuri analitice sau preparative, în tuburi
capilare sau pe medii stabilizante (gel de poliacrilamidă, gel de agaroză).

Izotacoforeza capilară: se realizează în tuburi capilare, cu diametrul intern optim de 0,3 - 0,6
mm și lungimi cuprinse între 200 și 800 mm, confecționate dintr-un material inert (sticlă, teflon sau alte
materiale plastice), la tensiuni înalte sau la tensiuni joase.
Drept ioni conductori se utilizează clorura, sulfatul, fosfatul sau cacodilatul, care au
mobilități mari. Ionii terminali ale căror mobilități trebuie să fie joase provin din acid Ɛ – aminocaproic,
acid γ – aminobutiric, α – alanină și glicină. Cel mai frecvent contraion utilizat este Ammediol (2 –
amino – 2 – metil – 1,2 – propandiol). Literatura de specialitate recomandă și 7 sisteme tampon, potențial
viabile pentru separarea oricărui compus biochimic prin izotacoforeză (tabelul VI.5). Zonele separate
prin izotacoforeză capilară sunt detectate, în general, prin metode termice sau bazate pe absorbția
moleculară în UV.
 Principalele avantaje ale izotacoforezei pe tuburi capilare sunt asociate cu:
1) Timpii scurți de analiză;
2) Posibilitatea efectuării de analize calitative și cantitative pe cantități foarte mici de probă (de
ordinul nanomolilor);
3) Reproductibilitate înaltă;
4) Rezolutia bună;
5) Ușurința determinărilor cantitative;
6) Posibilitatea utilizării de electroliți apoși sau neapoși (alcool metilic, etanol, etc.);
7) Absența etapei de pretratare specială a probelor.
Metoda poate fi aplicată unor biomolecule mici (aminoacizi, nucleotide, metaboliți) care nu pot
fi separate și analizate prin alte variante electroforetice.

Izotacoforeza pe geluri de poliacrilamidă: se aplică pentru separarea amestecurilor proteice.

Deoarece aceste separări se bazează pe dinferențele între sarcini și mobilități ionice, gelurile cu efect
minim de sitare sunt, în multe cazuri, soluții de elecție.
 Tabelul VI.5. Constituenții sistemelor tampon cu aplicabilitate izotacoforetică.
Denumire Ionul conducător Ionul terminal Contraion Aplicații
A Clorură (10 mM) β – alanină (10mM) + Ba(OH) 2 pH = Ammediol, la Separarea la pH înalt a unor
10 pH = 8,5 – 9,7 aminoacizi (neutri sau acizi) sub
formă de anioni

B Clorură (5 mM) Acid cacodilic (10mM) Ester metilic al Separări ale aminoacizilor și
histidinei, pepride
pH = 5,3
C Ba2+ (5 mM) Tris (20mM) + HCl, pH = 8 Valină, pH = 9,9 Separări ale aminoacizilor și
pepride
D K+ (5 mM) β – alanină (5mM) + acetat, Acetat, pH = 5 Separări cationice la pH scăzut
pH = 5,1
E Clorură (5 – 10 mM) β – alanină (pH = 3,55) sau acid 6 – Tris, pH = 8,3 Separarea unor acizi nucleici la
hexa-aminohexanoic pH = 3,0 – 4,5 sau la pH = 7,5 –
(pH = 4,37) 8,5
F Clorură (2,5 – 10 mM) β – alanină (20mM) + Ba(OH)2 pH = 10 Ammediol (10mM) Separarea unor acizi nucleici la
pH = 3,0 – 4,5 sau la pH = 7,5 –
8,5
G Clorură Acid 6 – hexa-aminohexanoic Ammediol (10mM) Separarea proteinelor și
(10mM) + Ba(OH)2 pH = 10,8 enzimelor hepatice

Pentru a se îmbunătăți posibilitățile de interpretare a configurațiilor de separare, se recurge la

folosirea de ”spațiatori”, în special sub forma unui număr mare de Ampholine. Ampholinele sunt sisteme
complexe care conțin minimum 500 de componente, astfel încât utilizarea acestora întârzie atingerea stării
de echilibru și are ca rezultat separarea exclusivă a unor zone mixte.
 VI.5-2. Aplicații biochimice
Chiar dacă nu a atins încă popularitatea, dezvoltarea sau aplicabilitatea altor
tehnici electroforetice, izotacoforeza are deosebită importanță în separarea de compuși
biochimici din clase foarte diferite: proteine, peptide, aminoacizi, nucleotide, acizi tari
și slabi precum și sărurile acestora.
Printre aplicațiile izotacoforezei se numără separarea unor proteine serice,
urinare sau sudorale, a ATP – ului, ADP – ului și AMP – ului din extracte musculare,
izolarea unor imunoglobuline din mieloame, fracționarea anticorpilor, studiul
interacțiunilor proteină – substanțe medicamentoase.
Izotacoforeza furnizează informații extrem de valoroase în cazul probelor
care conțin molecule de dimensiuni mici sau constituie amestecuri de molecule mici și
mari.
 VI.6. Variante imunoelectroforetice
Tehnicile imunoelectroforetice sunt o combinație de etape de electroforeză unidimensională
și bidimensională, bazate pe migrarea antigenelor prin sau în interiorul unui gel care conține anticorpi.
Prin alegerea riguroasă a sistemelor tampon și a valorilor pH – ului de operare se creează condiții care
asigură numai migrarea antigenului. În aceste condiții, pe toată durata desfășurării imunoelectroforezei,
anticorpii (care rămân imobili sau migrează cu o viteză foarte mică) se distribuie uniform în masa
gelului.
 Imunoelectroforeza „în rachetă” sau „coadă de rachetă”
Imunoelectroforeza în „rachetă” de precipitat (figura VI.8) are largă aplicabilitate pentru
proteinele serice a căror sarcină moleculară este net diferită de cea a proteinelor din anticorpi. Metoda se
realizează la un pH la care proteinele din antigene migrează electroforetic printr-o placă (cu dimensiuni
uzuale de 70 mm x 10 mm sau 200 mm x 100 mm) de gel de agaroză care conține anticorpi imobili.

Figura VI.8. Tehnica imunolectroforetică „în

rachetă”
 Această tehnică electroforetică este de impact pentru deteminarea concentrației soluțiilor de
antigene, care este în relație de dependență liniară cu înălțimea (aria) maximului de precipitat de
complex antigen – anticorp.
De exemplu, pentru separarea și dozarea unor componente serice se parcurg următoarele
etape:
PREPAPAREA PLĂCII
Cu grosimea de 1,5 mm din gel de agaroză 1% care conține o anumită cantitate de antiser sau alți anticorpi într-un tampon de pH=8,6

TĂIEREA DE GODEURI
Pe o linie situată la aproximativ 20 mm de la marginea gelului

MICROPIPETAREA PROBELOR
În volume corelate cu diametrul godeurilor, astfel: 3 – 4µl → 2mm; 6 – 10µl → 3mm; 10 – 15µl → 4mm

ELECTROFOREZA
La circa 10 V/cm, timp de 24 ore

PRESAREA, SPĂLAREA ȘI USCAREA GELULUI

COLORAREA GELULUI

MĂSURAREA ÎNĂLȚIMILOR RACHETELOR

 În acest mod se pot determina concentrații de antigen de până la 0,1 mg/l din volume de probă de 1 – 4
µl. Pentru rezultate exacte și precise, înălțimile rachetelor ar trebui să aibă valori cuprinse între 10 și 50 mm.
Prin varierea condițiilor experimentale din metoda de bază, se poate realiza imunoelectroforeza în
„rachetă fuzionată” care este utilă în atestarea prezenței unor impurități sau în identificarea fracțiunilor separate
prin filtrare pe gel sau cromatografie de schimb ionic.
Imunoelectroforeza „în rachetă” are ca principal dezavantaj imposibilitatea aplicării sale cu rapiditate
pe amestecuri complexe.

 Imunoelectroforeza încrucișată
Denumită și imunoelectroforeză bidimensională, această tehnică este rezultatul cuplării tehnicilor
imunoelectroforetice unidimensionale și „în rachetă”. Spectrul său de aplicații vizează obținerea de informații
calitative și cantitative asupra antigenelor.
 Introdusă de Laurell (1965) și modificată de Clarke și Freemen (1968), imunoelectroforeza
încrucișată se particularizează prin următoarea succesiune de operații:
• se prepară o placă de gel cu suprafața de 80 sau 100 mm2 și grosimea de 1,5 mm;
• se taie un godeu cu diametrul de 2 – 5 mm la o distanță de aproximativ 15 mm de la marginea
godeului;
• godeul astfel realizat se umple cu circa 30 µl de amestec de antigene. În cazul serului sanguin,
pentru colorarea albuminei serice se pot adăuga și câteva picături de albastru de bromfenol;
• se efectuează o electroforeză unidimensională, la 8 – 10 V/cm, timp de o oră;
• se decupează de pe placă fâșia care cuprinde componentele separate;
• se toarnă apoi pe restul plăcii gelurile care conțin anticorpii și se realizează o solidificare;
• se efectuează electroforeza în a doua dimensiune, perpendiculară pe prima, la 1 – 2 V/cm;
• gelul se presează, se spală, se usucă și se colorează.
Configurațiile corespunzătoare imunoelectroforezei încrucișate sunt maxime caracteristice
fiecărui antigen. În cazul fiecărui maxim, cantitatea de antigen este proporțională cu aria sa. Ariile
maximelor pot fi mărite prin creșterea volumului de probă luat în lucru sau prin reducerea cantității de
anticorp din gel. Imunoelctroforeza încrucișată are avantajul unei sensibilități deosebite, ale cărei limite pot
ajunge, în cazul majorității proteinelor, până la 0,1 – 1 mg/l.
  Imunoelectroforeza liniară

Imunoelectroforeza liniară constă în următoarele etape: inserarea unor dreptunghiuri de gel

care conțin probe de antigen intr-o placă de gel fără antigen → decuparea plăcii pe linia probelor și
înlocuirea celei mai mari părți din ea cu gel ce conține antiser → efectuarea electroforezei.
Electroforeza se soldează cu formarea unor linii de precipitare caracteristice fiecărui antigen
pentru care antiserul conține anticorpul corespunzător. Aceste linii de precipitare sunt paralele cu
originea la o distanță proporțională cu raportul antigen – anticorp (figura V1.9).

Figura VI.9. Separarea prin imunoelectroforeză

liniară a patru antigene a, b, c și d.
 Sub aspect calitativ, continuitatea liniilor de precipitare între configurațiile
adiacente atestă identitatea antigenelor. Poziționarea liniilor de precipitare permite o
estimare cantitativă. Astfel, dacă una dintre probe reprezintă un standard, poziția
liniilor poate constitui o măsură a proporțiilor cantitative ale constituenților
arnestecului de analizat.
Imunoelectroforeza liniară este deosebit de valoroasă în următoarele situații:
 compararea unor amestecuri complexe de antigene în raport cu un ser polivalent;
 izolarea suprafețelor de gel care conțin o bandă de precipitare, în raport cu un ser
polivalent;
 compararea calitativă și cantitativă a unor antiseruri diferite, prin aplicarea unei
benzi unice (în locul dreptunghiurilor menționate mai sus) de gel ce conține
antigenul și realizarea electroforezei pe suprafețe de gel în a caror constituție
intră antiseruri diferite.
 Contraimunoelectroforeza
Realizată pe gel de agaroză în flux electroendoosmotic puternic,
contraimunolelectroforeza (electroforeza supraîncrucișată) diferă fundamental de toate
celelalte tehnici imunoelectroforetice. Condițiile experimentale sunt astfel selectate
încât antigenele să migreze către anod, iar anticorpii y – globulină spre catod.
Procedura experimentală specifică contraimunoelectroforezei implică:
 prepararea plăcilor de gel intr-o soluție tampon cu pH = 8,5;
 tăierea unui numar par de godeuri cu diametrul de 1,5 – 2 mm, la o distanță de
circa 5 mm de la marginea gelului;
 introducerea antigenelor în godeurile de pe partea catodică a plăcii;
 umplerea godeurllor din partea anodică a plăcii de gel cu anticorpi (antiser);
 efectuarea electroforezei la 5V/cm.
 Din primele momente ale electroforezei, anticorpul și antigenul se deplasează unul către
celălalt, iar întâlnirea lor se soldează cu o bandă de precipitină (figura VI. 10).

Figura VI.10. Contraimunoelectroforeza

Contraimunoelectroforeza este o metodă extrem de rapidă (durata uzuală a procesării este

de 15 – 20 minute), care necesită cantități foarte mici de antigen și anticorp. Avantajul asociat cu
posibilitatea investigării unui număr foarte mare de probe pe o singură placă de gel este valorificat
în screening-ul pacienților cu anumite stări patologice sau reacții alergice și în medicină legală.
  Afin – electraforeza
Afin – electroforeza este o tehnică înrudită cu metodele imunoelectroforetice între care se particularizează
prin înlocuirea anticorpului sau antiserului cu lectine adecvate. Lectinele (fitohemaglutine) sunt proteine sau
glicoproteine ale căror interacțiuni cu alte glicoproteine prezintă un grad înalt de similitudine cu reacțiile antigen –
anticorp. Spectrul de specificitate al interacțiunilor este extrem de larg, putându-se ajunge până la lectine capabile să se
combine numai cu glicoproteine purtătoare ale unei anumite grupări oligozaharidice.
În esență, afin – electroforeza este guvernată de principiile de bază ale celorlalte variante
imunoelectroforetice. Acest fapt este atestat de exemplu, de rezultatele calitative și cantitative foarte asemănătoare,
pentru același nivel de sensibilitate, obținute în cazurile în care probe similare au fost supuse unei imunoelectroforeze
„în rachetă” și, respectiv, unei afin – electroforeze „rachetă”. Pentru realizarea tehnicilor afin - electroforetice se
apelează, în multe cazuri, la concanavalina A. Însă, spre deosebire de maximele imunoelectroforetice, maximele
caracteristice afin – electroforezei sunt mai puțin distincte.
Formarea benzilor de precipitat care prezintă identitatea aparentă între două specii distincte din punct de
vedere electroforetic este un indiciu asupra situsurilor, identice sau diferite, accesibile pentru legarea lectinelor. De
exemplu, concanavalina A se poate lega atât la resturile nereducătoare terminale nanopiranozil și glucopiranozil, cât și la
fragmentele interioare 2 – 0, cuplate α - D nanopiranozil. Din această cauză pot apărea dificultăți la identificarea
componenților separați prin afin – electroforeză pe amestecuri complexe.
 Beneficiile utilizării afin – electroforezei rezultă, în principal, din neafectarea informațiilor furnizate de
denaturarea termică, acidă sau cu detergenți a antigenului.
Rapiditatea, sensibilitatea, ușurința cuantificării și capacitatea de a identifica și doza componente specifice
dintr-un amestec complex (ser sanguin, extracte tisulare, etc.), fără o purificare prealabilă, au condus la o aplicabilitate
largă și în continuă extindere a imunoelectroforezei.
Metodele imunoelectroforetice au fost aplicate, cel mai frecvent, pe proteine și glicoproteine, dar există și
rezultate spectaculoase obținute la separarea lipoproteinelor. Astfel, variantele imunoelectroforezei au avut un impact
deosebit în taxonomia și studiul relațiilor evolutive dintre proteine. Demonstrarea prezenței sau absenței unor grade de
inrudire prin intermediul identității imunologice sau al reactivității încrucișate s-a dovedit extrem de valoroasă pentru
studiile comparative între componentele membranelor și proteinelor normale și mutante sau ale celulelor normale și
patologice.
O aplicație deosebit de importantă a imunoelectroforezei vizează domeniul medicinii legale și se referă la
identificarea urmelor de sânge sau alte lichide și țesuturi biologice și detecția unor toxine.
Tehnicile imunoelectroforetice s-au dovedit extrem de utile și pentru analizele de impact clinic (clasificarea și
compararea unor țesuturi) sau alimentar (în scopul demonstrării falsificării produselor din carne, cu proteine din lapte sau
de origine vegetală sau al indicării prezenței cazeinei în alimentele prelucrate termic).
 VI.7. Electroforeza bidimensională
Hărțile (amprentele) peptidice bidimensionale (2D) utilizate în studiile referitoare la structura și
modificările proteinelor care au fost unanim acceptate în ultimele decenii. În mod similar, hărțile
macromoleculare ale unor proteine, acizi nucleici sau polizaharide sunt extrem de utile – sau potențial
utile – în scopuri, precum:
Caracterizarea țesuturilor, lichidelor biologice, extractelor de țesuturi și organe;
Studii taxonomice;
Studiul variantelor genetice, a legăturilor de rudenie și a ciclurilor de creștere;
Depistarea stadiilor de diferențiere celulară;
Investigarea stărilor patologice și diagnosticarea unor boli.

Pentru soluționarea acestei diversități mari de probleme, există numeroase procedee electroforetice
bidimensionale (2D) prin care proteinele, glicoproteinele sau fragmentele mari de peptide sunt separate
pe baza diferențelor între anumiți parametri (dimensiuni, sarcină, hidrofobicitate).
În fapt, termenul 2D se referă strict la separarea electroforetică a probelor proteice pe plăci de formă
aproximativ pătrată, confecționate (în majoritatea cazurilor) din gel de poliacrilamidă. Hărțile 2D se pot
obține în condiții denaturante sau nedenaturante, cu rezoluție înaltă sau joasă.
Se impune precizarea faptului că, la granița dintre procedeele uni-dimensionale și cele 2D
există și diferite tipuri de separări electroforetice în care între cele două stadii de electroforeză
unidimensională se interpun etape intermediare de tratare chimică sau enzimatică a probelor
supuse analizei (tabelul VI.6).

VI.7-1. Procedee de electroforeză bidimensională

Din punct de vedere teoretic, hărțile bidimensionale se pot obține prin cuplarea oricăror variante
electroforetice. Pentru o uniformitate crescută în distribuția componenților pe suprafața unei hărți ar trebui ca
separarea electroforetică să se realizeze în funcție de mărimea într-o dimensiune și de sarcina moleculară în
cealaltă dimensiune. Fracționarea pe baza diferențelor între sarcinile moleculare se poate realiza prin
focalizare izoelectrică sau izotacoforeză în medii relativ nerestrictive (hârtie, acetat de celuloză, geluri de
agaroză, geluri compozite de poliacrilamidă – agaroză, geluri de poliacrilamidă cu grad înalt de reticulare.
Etapa inițială de separare
Electroforeză pe gel de
poliacrilamidă
Focalizare izoelectrică în
poliacrilamidă sau agaroză
Electroforeză pe gel de
poliacrilamidă, în prezență de
dodecisulfat de sodiu
Tabelul VI.6. Combinarea electroforezei unidimensionale cu etape intermediare de tratare a
Tratamentul intermediar Etapa finală de separare Aplicații
- Decuparea cilindrilor de Electroforeză pe gel de Probe proteice
gel în benzi cu lățimea de piliacrilamidă, în prezență de
5mm; dodecisulfat de sodiu
- Omogenizarea benzilor de
gel cu tampon 2-amino-2-
hidroximetilpropan-1,3-
diol (tris) + HCl, uree,
dodecilsulfat de sodiu,
glicerol și albastru de
bromfenol;
- Aplicarea lor în godeurile
tăiate pe o altă placă de gel
- Incubarea plăcii de gel cu o Focalizare izoelectrică (4ºC; Studiul rolului acidului sialic în
soluție de neuramidază (60µl 3h; 1000V) inducerea microheterogenității
de enzimă Sigma, tip IX, care globulinei serice care leagă
conține 21 unități de activitate tiroxina
per ml) în tampon acetat
50mM, pH=5,0.
Incubarea unei benzi de gel cu Electroforeză pe gel de Cartea simultană a mai multor
lățimea de 2-10 mm în tampon piloacrilamidă, în prezență de peptide din amestecuri
HCl – tris 0,125M, pH=8,6 dodecisulfat de sodiu complexe
probelor.
Frecvent, pentru întocmiea hărților 2D se poate recurge la două moduri de abordare:
-Se efectuează electroforeza în prima dimensiune pe geluri cilindrice, cu diametre de 3-6 mm. Apoi
cilindrul de gel se dispune deasupra unei plăci de gel pe care se realizează electroforeza in cea de-a doua
dimensiune. Intre grosimea placilor de gel si diametrele sistemelor cilindrice n-ar trebui să fie diferențe
semnificative;
-Se utilizează aceeași configurație de placă pentru realizarea separării electroforetice atât în prima cât și
în a doua dimensiune. Pentru prima dimensiune se taie benzi de gel care se inserează deasupra plăcii
pentru a doua dimensiune, într-un mod aproximativ similar cu cel folosit în cazul cilindrilor. Banda și
placa de gel trebuie să fie de aceeași grosime.

Procedee bidimensionale de rezoluție înaltă

Pornind de la ideea de mai sus menționată că distribuția componenților unei probe proteice pe
suprafața unei hărți 2D este mult mai uniformă atunci când bazele de separare sunt diferite, este evident
faptul că pentru fiecare dimensiune ar trebui aleasă metoda electroforetică de maximă rezoluție totală.
În procedeul bidimensional de înaltă rezoluție cu cea mai largă utilizare electroforeza pe gel de
piliacrilamidă (inclusiv în prezență de dodecilsulfat de sodiu) s-a cuplat cu focalizarea izoelectrică pe gel
de poliacrilamidă sau agaroză. Potențialul acestei combinații a fost valorificat de O´Farrell, care a reușit
separarea a peste 1100 de proteine diferite din lizatul celular de E. Coli pe o singură hartă (figura VI.11)
și a sugerat că la rezoluție maimă s-ar putea ajunge până la 5000 de proteine.
 Figura VI.11. Aplicarea metodei O´Farrell pentru
cartarea 2D a proteinelor din E. coli.
În prima dimensiune proteinele au fost separate prin
focalizare izoelectrică, iar în a doua dimensiune prin
electroforeză în gel de poliacrilamidă, în prezență de
dodecilsulfat de sodiu și în gradient exponențial de
concentrație.

În cadrul metodei O´Farrell, proteinele sunt separate în funcție de sarcina lor moleculară prin focalizarea
izoelectrică efectuată în prima dimensiune. Se utilizează geluri cilindrice în a căror compoziție intră uree, soluție de
acrilamidă 30% , acrilamidă 28,38% + N,N´-metilenbidsacrilamidă 0,62% în apă, Nonidet P-40, Ampholine de pH
5-7, Ampholine de pH 3-10, persulfat de amoniu și N,N´, N,N´-tetrametiletilendiamină. Gelurile sunt procesate timp
de 12 ore la 400V, apoi la 800V 1 oră. În a doua dimensiune se realizează separarea ăe baza a diferențelor între
mărimile moleculelor, prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă, în prezență de dodecilsulfat de sodiu și în
gradient exponențial concav de concentrație. Compozițiile tampoanelor și gelurilor utilizate în această etapă sunt
asemănătoare celor descrise în cadrul metodei Laemmli. Pentru plăci cu lățimea de 134mm, lungimea de 146mm și
grosimea de 0,8mm, O´Farrell a folosit un curent constant de 20mA, durata electroforezei fiind de circa 5h.
De la elaborarea ei în 1975, metoda O´Farrell a fost intens utilizată și semnificativ îmbunătățită, în scopul
compatibilizării sale cu probele de analizat (tabelul VI.7).
Principalele probleme create prin aplicarea metodei O´Farrell sunt asociate cu:
•Complexitatea hărților (număr foarte mare de spoturi multiple sau suprapuse), accentuată și de variația genetică și
microheterogenitatea naturală (a cărei cauză frecventă este modificarea proporției de hidrați de carbon din glicoproteine, de
exemplu);
•Migrarea slabă a proteinelor bazice;
•Gradul redus de recuperare a proteinelor mari (cu mase moleculare ˃105 ).

Procedee bidimensionale de rezoluție redusă

În metoda de cartare bidimensională a lui O´Farrell, separarea în prima dimensiune prin focalizare
izoelectrică sau electrolocalizarea gradientului de pH în condiții de neechilibru se realizează în condiții puternic
denaturante în care toate proteinele multisubunitare se scindează în subunitățile constitutive. Această comportare
poate genera un număr mare de zone de separare pe harta finală, mai ales dacă subunitățile sunt diferite sau
probele biologice ??? sunt foarte complexe.
Conceptul de cartare proteică 2D de rezoluție redusă a apărut din necesitatea simplificării configurațiilor
zonale, dar și ca un auxiliar al interpretării lor. Sub această denumire sunt cuprinse procedee bidimensionale în
care se combină:
-o metodă de rezoluție relativ scăzută (electroforeza pe gel de agaroză, gel de amidon, hârtie etc.) cu o tehnică electroforetică de
rezoluție relativ înaltă în cealaltă dimensiune (electroforeza pe gel de poliacrilamidă, focalizarea izoelectrică pe gel de agaroză,
electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezență de dodecilsulfat de sodiu);
-două variante electroforetice de rezoluție relativ scăzută.
 Tabelul VI.7. Variante îmbunătățite ale metodei de cartare bidimensională O´Farrell

Varianta Comentarii
Se bazează pe înlocuirea detergentului neionic Nonidet P-40 cu detergentul - Se reduce strierea;
zwitterionic 3-[(cloroamidopropil)dimetil amino-] 1-propan sulfonat în - Se ameliorează claritatea hărților proteice
compoziția gelului pe care se efectuează, în prima dimensiune, focalizarea rezultate
izoelectrică
Aplicarea focalizării izoelectrice cu gradienți de pH, strict definiți și - Rezoluția este superioară;
calculați (pe geluri cu imobiline), pentru cartarea 2D în prima dimensiune - Gradienții de pH sunt reproductibili;
- Capacitatea de încărcare cu probă este mai
bună
- Procesarea prin focalizare izoelectrică în prima dimensiune se realizează Metoda a fost aplicată în analiza proteinelor:
pe geluri introduse în tuburi capilare mici; -Din celule izolate (neuronii giganți ai moluștelor);
- În a doua dimensiune se efectuează o electroforeză pe plăci de gel de -De la nematodele parazite vegetale
poliacrilamidă de mărimea unui timbru, în prezență de dodecilsulfat de
sodiu
- În prima dimensiune se utilizează tehnica electrofocalizării gradientului S-au realizat separări de proteine bazice (histone)
de pH la neechilibru care se deosebește de focalizarea izoelectrică prin:
inversarea electrozilor; aplicarea probelor în extremitatea acidă a
gelurilor; scurtarea duratei de aplicare a tensiunii;
- În a doua dimensiune se practică electroforeza pe gel de poliacrilamidă
În prezent, pentru limita inferioară a spectrului de rezoluție se apelează, doar în puține cazuri, la combinații între
electroforeza pe hârtie, gel de amidon, acetat de celuloză sau gel de agaroză. Sistemele în care în ambele dimensiuni se
folosește electroforeza în gel de poliacrilamidă au aplicabilitate limitată. Aceasta corespunde cazurilor în care se
operează cu tampoane de pH-uri foarte diferite sau când într-una dintre dimensiune este prezent un agent denaturant de
tipul ureei.
Deși deficitare la capitolul cantității de informație care poate fi extrasă din rezultate, metodele 2D de joasă rezoluție
joacă, încă, un rol a cărui importanță derivă din avantajele pe care le oferă: simplitate operațională; rapiditatea care
permite un rulaj deosebit al probelor; ușurința de interpretare a datelor furnizate; echipamente mai puțin sofisticate și
costisitoare. Astfel, aceste procedee bidimensionale au avut un impact deosebit în studiile asupra proteinelor
hidrosolubile din membrana eritrocitară sau privind activitatea nucleazică. De asemenea, prin aplicarea unei metode 2D
de joasă rezoluție au putut fi separate și detectate circa 60 de proteine plasmatice și s-au putut urmări modificările
produse de leucaferază, plachetoferază sau sub acțiunea mușcăturilor de șarpe.

VI.8. Electrocromatografia (tehnica fingerprint)

Electrocromatografia este o metodă de separare și analiză rezultată prin asocierea
electroforezei cu cromatografia pe hârtie sau în strat subțire. Reușita separărilor
electrocromatografice este condiționată de respectarea următoarelor cerințe esențiale: a)
volatilitatea sistemului tampon electroforetic; b) capacitatea cât mai mare de separare a
fazei mobile cromatografice.
Procesele de separare electroforetică și cromatigrafică se pot desfășura succesiv sau
simultan, pe direcții perpendiculare.
• Desfășurarea succesivă a celor două procese presupune parcurgerea următoarelor etape:
- Separarea amestecului de analizat, în grupe de compuși, prin electroforeză într-un mediu tampon de pH bine determinat;
- Separarea cromatografică a grupelor de compuși în constituenți individuali, cu ajutorul unor solvenți riguros aleși.

În cazul în care cele două etape au loc simultan, se poate realiza un proces continuu de separare (figura VI.12). În instalația din figura VI.12, amestecul de analizat este introdus în mod continuu într-un punct situat în partea superioară a suportului cromatografic.
Componentele amestecului vor fi simultan antrenate în jos de faza mobilă și deplasate lateral de câmpul electric aplicat. Drept rezultat, un compus se deplasează pe o direcție înclinată cu un anumit unghi față de verticală. De asemenea, neomognitatea câmpului
electric aplicat are drept consecință faptul că traiectoriile pe care le parcurg componentele separate sunt curbe și diferite între ele. În final, acești componenți se regăsesc la partea inferioară a plăcii sau hârtiei cromatografice sub forma unor spoturi bine delimitate.
Lichidul care antrenează constituenții amestecului poate acționa ca o fază mobilă într-un proces de separare prin cromatografie plană sau poate fi o soluție tampon care nu îndeplinește acest rol, astfel încât separarea cromatografică nu mai poate avea loc.
 Figura VI.12. Reprezentarea schematică a unei instalații de separare continuă bazată pe asocierea cromatografiei descendente
pe hârtie cu electroforeza.

Însă, în ambele cazuri se realizează procese continue de separare, prin electrocromatografie sau electroforeză
cu flux de curgere continuu.
Electrocromatografia este eficientă în separarea unor amestecuri complexe de aminoacizi, peptide și
nucleotide și în diferențierea unor peptide și polinucleotide foarte asemănătoare. Deoarece fiecare
amestec astfel separat este caracterizat printr-o amprentă (figura VI.13), această tehnică a fost denumită
fingerprint.

Figura VI.13. Separarea prin tehnica fingerprint a peptidelor rezultate prin hidroliza hemoglobinei umane. 1)
electroforeză pe hârtie la tensiune înaltă și pH=6,4; 2) cromatografie ascendentă în amestecul n-butanol-acid
acetic-apă.

Utilizarea electrocromatografiei în scopuri preparative permite obținerea de compuși foarte puri.

 VI.9. Bibliografie

1. A. T. Andrews, Electroforeza, Editura Tehnică, București, 1996.

2. A. Bold, Metode de separare și concentrare, Institutul Politehnic Iași (curs litografiat), 1977.
3. R. L. Cunico, K. M. Gooding, Basic HPLC and CE of Biomolecules, Richmond CA, 1998.
4. F, Dăneț, Metode instrumentale de analiză chimică, Editura Științifică, București, 1995.
5. Enciclopedia de chimie, vol. 6., Editura Științifică și Enciclopedică, București, 1989.
6. V. Gorduza, L. Tofan, D. Șuteu, E. V. Gorduza, Biomateriale – Biotehnologii – Biocontrol,
Editura CERMI, Iași, 2002.
7. C. Liteanu, S. Gocan, A. Bold, Separatologie analitică, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1981.
8. P. C. Righetti, Cappillary Electrophoresis in Analytical Biotechnology, CRC Press, Boca
Raton, 1996.
9. T. Tsuda, Electric Field Applications in Cromatography, VCH Publishers, 1995.
 VII.1. Definirea şi clasificarea metodelor
Cap. VII. METODE cromatografice
CROMATOGRAFICE VII.2. Cromatografia pe coloană
VII.3. Cromatografia plană
VII.4. Bibliografie

VII.1. Definirea şi clasificarea metodelor cromatografice

Pentru sistemele biochimice ale căror componenţi au proprietăţi asemănătoare coefienţi de distribuţie
apropiaţi) se recomandă crearea condiţiilor dinamice de separare-concentrare (procedee cromatografice).
Denumirea de cromatografie provine din limba greacă (înseamnă "scriere culori") şi este datorată primelor
separări efectuate, la începutul secolului XX, de Tvet, care trecând o soluţie depigmenţi vegetali printr-o
coloană umplută cu alumină a observat formarea de inele colorate.
Esenţa procesului cromatografic constă în distribuţia diferenţiată a constituenţilor unui amestec între o fază
fixă (STAŢIONARĂ) şi o fază MOBILĂ, exercită asupra lor efecte antagonice (tabelul VIl.I)
Tabelul VIl.I. Caracterizarea fazelor
Între care se realizează procesul de separare crornatografică

Faza Natura fazei Descriere Efectul execitat

STATIONARĂ Solid;lichid depus pe un − Poate umple o coloană De reţinere a

suport inert închisă; componenţilor în funcţie de
− Poate fi întinsă pe o afinitatea lor
suprafata plana

MOBILĂ Lichid;gaz Contine sau constitue proba De antrenare a

de analizat; componenţilor de-a lungul
fazei stationare
 Procesul de separare cromatografică a unei probe bicomponente, prnin distribuţia diferenţiată a
componenţilor A şi B intre o fază mobilă şi o fază staţionară este redat schematic în figura VII.1.
Separarea cromatografică este asigurată de diferenţele între vitezele de deplasare a componenţilor şi viteza
fazei mobile. Astfel, deplasarea unui component va fi cu atât mai lentă cu cât între acesta şi faza staţionară se
stabilesc interacţiuni mai putemice, care determină reţinerea preferenţială. Cele mai reprezentati ve criterii de
clasificare şi metodele cromatografice diferenţiate pe baza lor sunt redate în tabelul VII.2.

Figura VlI.1 Reprezentarea schematică a procesului de separare

cromatografică a unei probe compusă din componenţii A şi B
 Tabelul Vll.3. Importanţa aplicativă a metodelor crornatografice în analiza biochimică

Îmbinarea caracteristici lor esenţiale ale procesului cromatografic - existenţa unei suprafeţe interfazice
suficient de mari şi deplasarea unei faze în raport cu cealaltă conferă o înaltă eficienţă metodelor
cromatografice. Prin utilizarea acestora devine posibilă:
- separarea componenţilor din cele mai complexe amestecuri, Într-un timp relativ scuti şi cu o exactitate
suficient de bună;
- separarea unor substanţe cu proprietăţi foarte asemănătoare/ cum sunt de exemplu,izomerii optic activi);
- concentrarea avansată a unor microcomponenţi, ca rezultat al numeroaselor
contacte succesive ale soluţiei cu straturi proaspete de fază staţionară.
 În acest context, este incontestabil faptul că, tehnicile cromatografice, care au cunoscut de-a lungul
timpului, o dezvoltare şi o diversificare continuă, au devenit astăzi practic indispensabile tuturor
laboratoarelor din domeniul biochimiei analitice (tabelul VII.3.).
Tabelul Vll.3. Importanţa aplicati vă a metodelor crornatografice În analiza biochimică.

Tehnica cromatografică Analitul Matricea

Cromatografia de lichide 8-isoprostaglandina Plasma umană
Cromatografie pe coloane capilare Nucleozide modificate Ser și urină
Cromatografia de lichide de înaltă Fenitoina și metaboliții săi  Plasma umană
performanță
Cromatografia de gaze Pesticide organoclorurate și
organofosforice Fluide biologice
Cromatografia de lichide de înaltă Corticosteroizi (prednisolonă, metil  Plasmă, saliva, urină
performanță și cromatografie pe prednisolonă și succinat de
strat subțire prednisolonă)
Cromatografia de gaze Medicamente de tip benzodiazepină Sânge, urină

Cromatografia de lichide Fenitoina Plasma umană

Cromatografia de lichide de înaltă Medicamente nesteroide  
performanță pe coloane capilare antiinflamatoare și metaboliții lor Urină
VI1.2. Cromatografia pe coloană
VI1.2.1. Principiul cromatografiei pe coloană
Pentru o cât mai bună înţelegere a principiilor cromatografice, în figura VII.2. este prezentată schema bloc a
aparatului în care se realizează separarea, denumit cromatograf. Elementele constitutive fundamentale ale
unui cromatograf sunt: coloana şi detectorul. Coloana (tub care conţine o umplutură judicios aleasă- faza
staţionară) este sediul procesului de separare cromatografică a cărui desfăşurare este monitorizată cu ajutorul
detectorului.
 Figura VII.2. Schema bloc a unui cromatograf.
(1 _ coloana cromatografică; 2- detector; 3- sursa de eluent; 4 - dispozitiv de măsurare şi reglare
a debirului; 5 - dispozitiv de introducere a probei; 6 -termostat;
7 - dispozitiv de înregistrare a semnalului furnizat de detector; 8 - integrator).

La acestea se adaugă următoarele piese anexe: sursa de eluent, dispozitivul de măsurare şi reglare a
debitului, dispozitivul de introducere a probei, înregistratorul.
Separarea unei probe într-un cromatograf se realizează astfel:
• faza mobilă (eluentul) trece prin dispozitivul de introducere a probei;
• din acesta, eluentul preia proba de analizat pe care o introduce sub forma unei benzi sau a unei zone
înguste în coloana cromatografică;
• componentele probei de analizat sunt transportare, cu ajutorul eluentului, de-a lungul fazei staţionare
din coloana cromatografică, realizându-se echilibre succesive de distribuţie.
 Separarea a 2 cornponenţi A şi B se realizează numai dacă diferenţa între coeficienţii lor de distribuţie
(KA ≠ KB) este suficient de mare. În final, componenţii separaţi părăsesc coloana şi sunt purtaţi de eluent in
detector. Detectorul indică, din punct de vedere calitativ şi cantitativ, prezenţa componenţilor separaţi, la
ieşirea din coloană.prin transformarea unei proprietăţi fizica-chimice a acestora, intr-un semnal, de regulă,
electric. Semnalul derectorului este proporţional cu concentraţia fiecărui component în eluentul care părăseşte
coloana.

VIl.2.2. Cromatograma şi caracteristicile ei

Reprezentarea grafică a semnalului dat de detector în funcţie de timpul de eluţie sau volumul de eluent pentr
toţi componenţii separaţi se numeşte cromatogramă (figura VII.3).

Figura VII.3. Cromatogramă de gaze pentru acizi graşi:

1- miristic;
2- palmitic;
3- stearic;
4- oleic;
5- linoleic.
Semnalul analitic înregistrat pentru un singur component poartă numele de pic cromatografic (figura VIl. 4).

Figura VIl.4. Picul crornatografic şi elementele sale.

Forma picului cromatografic poate fi descrisă prin intermediul unei curbe normale Gauss (figura VII.5)

Figura VIl.5.Forma gaussiană a picului cromatografic.

 Curba cromatografică este caracterizată de valorile unor parametri specifici, prezentaţi în tabelul Vll.4.
Tabelul VII.4. Parametri specifici curbei cromatografice din figurile VII.4. şi VII.5.

VlI.2.3. Mărimi cromatografice

▪ Marimi de retinere(retentie)
Componenţii probei de analizat petrec timpi diferiţi în coloana cromatografică (figura VI1.6), datorită
specificităţii interacţiunilor pe care le stabilesc în faza staţionară:
 Figura VII.6. Forma crornatogramei la separarea
cornponenţilor (1), (2) şi (3).

• TIMPUL DE RETINERE (retenţie), tR, este timpul scurs din momentul preluării probei de către faza
mobilă până la cel al apariţiei picului pentru componenta considerată.
• Timpul în care un anumit component se găseşte în faza staţionară reprezintă TIMPUL DE RETINERE
(retenţie) CORECTAT, tR‘,se exprimă prin relaţia:
tR'=tR-tM (VI1.2.)
în care tM timpul mort.Corespunde intervalului de timp in care componentul se află în faza mobilă.
Dacă Dm este debitul de fază mobilă, pentru un anumit component se pot defini şi:
• volumul de reţinere(retenţie), VR = Dm tR;
• volumul de reţinere(retenţie) corectat, V R' = DmtR'.
Rezoluţia cromatografică - parametru care estimează calitatea separării
Rezoluţia, Rs caracterizează gradul de separare a 2 cornponenţi, de exemplu, 1 şi 2 (figura VII.7.) cu
ajutorul relaţiei:
 Figura VII.7.Evaluarea rezoluţiei pe o cromatogramă.

Dacă:
Rs<1, separările au eficienţă scăzută;
Rs=1, separarea este de 85 ;
Rs>1 ,gradul de separare a celor 2 componenţi este de 99,7;
Valori ale rezoluţiei mai mari de 1,5 nu sunt necesare.
Interpretare: Obţinerea unor valori optime ale rezoluţiei În metodele cromatografice impune o alegere
judicioasă a fazei staţionare şi afazei mobile.
• Parametri care exprimă eficienţa separării
Pentru aprecierea eficienţei separării, se consideră că în alcătuirea unei coloane cromatografice de lungime
L, intră N talere teoretice care sunt dispuse succesiv şi au înălţimea echivalentă H. Semnificaţia şi relaţiile de
calcul pentru N şi H sunt prezentate În tabelul VII.5.
 Vll.2.4. Tehnici cromatografice analitice şi preparative

Din punct de vedere al scopului separării componentelor dintr-o probă, metodelecromatografice pot fi
clasificate în analitice şi preparative.
Cromatagrafla analitică se utilizează în scopul obţinerii de informaţii calitative şi cantitative.
1. ANALIZA CALITATIVĂ
Stabilirea naturii(identităţii) unor separaţi prin cromatografie pe coloană se poate realiza prin caracterizarea
picurilor cu ajutorul mărimi lor de reţinere sau a unor teste chimice sau instrumentale specifice.
În cazul metodei comparaţi ei, se înregistrează, în aceleaşi condiţii (control riguros al parametrilor de lucru
ai coloanei cromatografice), cromatogramele pentru proba necunoscută şi pentru o serie de standarde. Apoi,'
din fiecare pic de identificat, se determină timpul (sau volumul) de reţinere al unui necunoscut, care se
compară cu timpii de reţinere (volumele de reţinere)caracteristici unei serii de standarde. Rezultatele obţinute
prin metoda comparaţiei pot fi confinnate ulterior prin evaluarea fiecărui pic identificat cu ajutorul altor
metode instrumentale (de exemplu spectrometria IR sau spectrometria de masă).
Tabelul VII.5. Exprimarea eficienţei unei separări cromatografice.
 2. ANALIZA CANTITATIVĂ
Luând în consideraţie faptul că aria (înălţimea) picului caracteristic (tabelul VII.4.) este proporţională cu
concentraţia componentului respectiv, analiza cantitativă a compuşilor separaţi prin procedee cromatografice
pe coloană presupune 2 etape:
- determinarea ariei sau inălţimii picurilor;
- corelarea acesteia cu concentraţia componenţilor din proba de analizat.
1. Metode de determinare a ariei picurilor
Calculul ariei picurilor se poate face numai pe baza unor mărimi caracteristice
evidenţiate în figura VII.8.
Metodele uzuale de determinare a ariei picurilor sunt prezentate sistematizat in tabelul Vll.6 . .

Figura VII.8. Mărimi caracteristice

in calcularea ariei unui pic cromatografic.

2. Metode de corelare a arici cu concentraţia componenţilor

Pentru determinarea concentraţiei unui component i, Ci se pot aplica mai multe metode (tabelul VIl.7
Aceste metode se bazează pe diferite forme ale dependenţei dintre concentraţia Ci şi aria picului respectiv, A
anterior determinată.
 Tabelul VI1.6. Metode de determinare a ariei picurilor (A).

2. Metode de corelare a ariei cu concentraţia componenţilor

Pentru determinarea concentraţiei unui component i, Ci se pot aplica mai multe metode (tabelul VIl.7).
Aceste metode se bazează pe diferite forme ale dependenţei dintre concentraţia Ci şi aria picului respectiv, Ai,
anterior determinată.
 Tabelul VII.7. Metode de determinare a concentraţiei componenţilor

Cromatografia preparativă este utilizată pentru izolarea şi/sau purificarea unor compuşi din amestecuri
multicomponente. Se deosebeşte de cromatografia analitică prin faptul că operează cu mari cantităţi de probă,
fapt care implică dimensionarea corespunzătoare a coloanei cromatografice. Cromatografia preparativă
utilizează colectoare de fracţiuni cuplate cu cromatograful. Are largă aplicabilitate in purificări şi izolări de
compuşi utili. Se apelează la variantele preparative atunci când nu sunt utilizabilealte metode de separare, de
exemplu în izolarea unor compuşi naturali din extracte vegetale sau animale,separare de aminoacizi,enzime
etc.
 VII.2.5. Cromatografia de gaze
La baza separărilor (de regulă de substanţe gazoase sau volatile şi stabile termic) stă distribuţia
componenţilor intre o fază staţionară solidă sau Iichidă şi o fază mobilă gazoasă (care se mai numeşte şi gaz
purtător).
Dacă faza staţionară este solidă, separarea se realizează prin mecanism de adsorbţie. În cazul În care faza
staţionară constă dintr-un lichid nevolatil depus pe un suport inert poros,separarea se bazează pe un mecanism
de repartitie.
Aşadar, în funcţie de mecanismul care stă la baza separării, cromatografia de gaze poate fi:
- de adsorbţie gaz - solid (COS);
- de repartiţie gaz - lichid (COL).

FAZE STAŢIONARE ŞI FAZE MOBILE-FAZE STAŢIONARE

Fazele staţionare utilizate în cromatografia de gaze se subdivid în:
- adsorbanţi pentru cromatografia gaz - solid;
lichide de repartiţie depuse pe un suport inert în cromatografia gaz - lichid.

A.l Adsorbanţi
Adsorbanţii folosiţi drept faze staţionare solide active în cromatografia gaz
- solid trebuie să răspundă următoarelor cerinţe:
- să aibă suprafeţe specifice mari;
- să prezinte porozitate ridicată;
- să se caracterizeze prin stabilitate mecanică şi termică.
 În analiza compuşi lor biochimici au importanţă aplicativă deosebită adsorbanţii pe bază de polimeri
organici poroşi, a căror suprafaţă specifică depinde de procesul de polimerizare în suspensie. Cei mai utilizaţi
sunt copolimerii stirenului cu divinilbenzen, cunoscuţi sub denumirea comercială de POROPAK (de tip P, Q,
R, S şi T) şi CHROMOSORB, pe care s-au realizat separarea unor biomolecule, cum ar fi:
• acizi graşi CI - C9 şi CI -CI8;
• alcooli CI - C5;
• alcaloizi;
• esenţe - uleiuri.

A.2.Faze staţionare lichide

Fazele staţionare lichide sunt depuse pe suporturi care trebuie să fie inerte şi rezistente mecanic şi să posede
suprafaţă specifică mare şi porozitate uniformă.

Tabelul VII.8. Tipuri de faze staţionare lichide în CG

Condiții de îndeplinit Exemple Aplicații

1.Putere ridicată de solvatare   Separări de hidrocarburi
pentru toți componenții ADIPONITRIL
2.Selectivitate ridicată CEARĂ DE ALBINE Analiza uleiurilor esențiale
3.Presiune de vapori foarte scăzută CARBOWAX 200 Separarea aldehidelor și cetonelor
4.Stabilitate termică   Alcooli, compuși biliari și de urină,
CAUCIUC SILICONIC SE 30 medicamente, gaze, pesticide,
zaharuri, vitamine
5.Inerție chimică față de proba    
analizată
6.Accesibilitate și reproductibilitate    
 B) FAZE MOBILE

În majoritatea cazurilor, drept fază mobilă se utilizează unul din următoarele gaze: azot; argon; heliu; dioxid
de carbon. Utilizarea lor este datorată faptului că ele îndeplinesc următoarele condiţii impuse fazei mobile în
cromatografia de gaze:
- inerţie chimică;
- puritate(din punct de vedere cromatografic, aceasta înseamnă să aibă un conţinut de oxigen sub 0,08, iar
componentele de analizat să nu fie prezente nici în urme);
- preţ de cost scăzut;
-să permită detectorului dă răspundă în mod adecvat.

COLOANE CROMATOGRAFICE

Coloana ce conţine faza staţionară pe care se realizează separarea este componenta cea mai importantă a
unui cromatograf de gaze (figura Vl1.9.).
În CG se utilizează coloane confecţionate din tuburi de metal (cupru,
aluminiu, alamă, oţel inoxidabil), materiale plastice (policlorură de vinil, nylon,
teflon) sau sticlă şi care pot fi: cu umplutură (convenţionale), sau capilare.
Coloanele cu umplutură constituită dintr-un adsorbant solid sau dintr-un suport solid inert acoperit cu un
strat de lichid,au diametrul interior de 4-8 mm şi lungimea uzuală de 2-4 m. După umplere, coloanele se pot
îndoi sub diferite forme: U, W, spirală.
 Figura VII.9. Schema de principiu a unui cromatograf de gaze

Coloanele capilare utilizate frecvent numai pentru probe mici au diarnetrul interior de 0,1-0,5 mm şi
lungimea de 30-200 ).UTI. Au formă de spirală, nu sunt umplute, dar pereţii interiori fiind acoperiţi cu un strat
de lichid, sunt folosite numai pentru cromatografia de repartiţie gaz - lichid.
Eficacitatea de separare depinde de factori core laţi cu:
- parametrii coloanei (lungime, diametru, temperatură);
- faza staţionară (tipul, cantitatea, granulaţia, suprafaţa specifică);
- gazul purtător (debit, viteză de curgere).

DETECTORI
În construcţia unui cromatograf de gaze (figura Vll.9), detectorul joacă un rol esenţial, şi anume de
evidenţiere, prin diferite metode a compuşi lor separaţi. În principiu, o metodă de detecţie se poate baza pe orice
proprietate fizico-chimică prin care cornponenţii de analizat se deosebesc de gazul purtător.
În funcţie de modul de reprezentare a semnalului analitic, detectoarelepot fi:
- integrale, când se obţine o curbă de eluţie în trepte corespunzătoare unei însumări a masei totale
componenţilor;
-diferenţiale,care dau picuri de eluţie a căror înălţime este proporţională cu concentraţia
fiecăruicomponent separat în curentul de fază mobilă.
 După selectivitatea lor, detectoarele se diferenţiază în:
- universale,care decelează prezenţa tuturor componenţilor din probă. Un exemplu de detector universal
este CATAROMETRUL.
- selective, al căror răspuns este selectiv(specific) pentru anumite clase de compuşi. De exemplu,
detectorul cu captură de electroni este preferenţial pentru substanţele care conţin atomi e1ectronegativi
(oxigen, sulf, azot, halogeni).
Detectorul care îndeplineşte simultan şi În egală niăsură toate cerinţele sistematizate în tabelul VII.9. este un
detector ideal universal. În practica cromatografiei de gaze se utilizează însă, în funcţie de complexitatea
amestecului de analizat, detectori universali sau selectivi (tabelul VII.9.)
Tabelul V.9. Detectori utilizaţi În cromatografia de gaze.

Caracteristica Detectorul Tipul Aplicații

Sensiblitate cât mai MARE, pentru     Datorită simplității,
a se putea detecta conținuturi cât mai De conductibilitate termică  Universal catarometrul este cel
mici de component din cantități (CATAROMETRUL) Nedistructiv mai utilizat tip de
rezonabile de probă detector
Viteză de răspuns (timpul scurs din     Separarea compușilor
momentul în care proba ajunge în    Selectiv organici
detector până la transmiterea De ionizare în flacără Distructiv
semnalului) cât mai RIDICATĂ
Liniaritate (semnalul detectorului    Selectiv Analiza compușilor
să fie o funcție simplă (liniară) de   Nedistructiv conținând O, N și
concentrația componentului) Cu captură de electroni halogeni
Stabilitatea (reproductibilitatea)     Analiza pesticidelor;
excelentă a semnalului Flamfotometric Selectiv Analiza poluanților
Distructiv din aer.
 APLICAŢII DE IMPACT BIOCHIMIC

Aplicabilitatea cromatografiei de gaze În separarea/analiza biomoleculelor este limitată datorită labilităţii

termice a compuşilor cu mase moleculare mari (peptide şi proteine), Moleculele mai mici (aminoacizi, acizi
graşi şi anumiţi carbohidraţi) pot fi separate prin cromatografie de gaze numai dacă sunt în prealabil
modificate chimic, În scopul creşterii volatilităţii lor. Pe de altă parte, diferite culturi de celule produc
metaboliţi volatili (alcooli, aldehide, cetone) care pot fi uşor analizaţi prin cromatografie de gaze.
Dacă pe faze staţionare solide pot fi separaţi.în special, produşi uşor volatili sau care prezintă polarităţi
moderate, când se utilizează lichi de staţionare, domeniul de aplicaţii este mult mai larg, cu condiţia stabilităţii
termice a probei.
În cele ce urmează se vor prezenta câteva exemple ilustrative ale aplicaţiilor crornatografiei de gaze În
bioanalize şi biocontrol:

Aminoacizi (enantiomeri, izomeri proteici etc.)

Prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă s-au obţinut performanţe spectaculoase în
domeniul separării şi identificării aminoacizilor, inclusiv enantiomeri şi izomeri proteici.

Lipide
Prin CLG s-au analizat, în special, esterii metilici ai acizilor graşi, esterii acizilor CIO - CI8 sarturaţi şi
nesaturaţi liniari sau ramificaţi, obţinându-se indicaţii şi asupra geometriei izomerilor etc. Acizii graşi comuni
pot fi determinati cantitativ,cu mare precizie,câteva minute.
 Carbohidraţi
Separarea şi estimarea cantitativă a derivaţilor carbohidraţilor volatili prin CLG au devenit au devenit
indispensabile în studiile degradărilor structurale ale polizaharidelor.

Steroide
Cromatografia de gaze şi-a dovedit viabilitatea şi în domeniul substanţelor din clasa steroidelor, de origine
vegetală sau animală, hormoni, eteri ai acizilor biliari, sapogenine şi numeroase steroide sintetice.

Biomarkeri
Cromatografia de gaze computerizată de înaltă rezoluţie este deosebit de utilă în analiza markerilor biologici
(fosile moleculare - compuşi organici complecşi), de interes pentru clarificarea fenomenelor biologice şi a
răspunsurilor organismului uman la acţiunea agenţilor xenobiotici.

Aplicaţii biomedicale
Cromatografia în fază gazoasă a devenit extrem de utilă şi pentru stabilirea de diagnostice, studii de
metabolism, detecţia unor medicamente sau a alcoolului cu acţiune stimulativă asupra sistemului nervos
central.
 VII.2.6. Cromatografia de lichide pe coloană
VII.2.6-1. Aspecte specifice
 
Cromatografia în fază lichidă pe coloană se particularizează în gama vastă a tehnicilor
cromatografice prin migrarea diferențiată a componenților unui amestec de analizat între o fază
staționară solidă sau lichidă care acoperă un suport solid, inert, fin divizat și o fază mobilă lichidă.
În contextul în care se elimină condițiile restrictive impuse de stabilitatea termică a
componenților, iar faza mobilă este participantă activă la procesul de separare, se poate afirma că
metoda cromatografiei de lichide este mult mai selectivă și mai eficientă decât cea în fază gazoasă.
Astfel, cromatografia de lichide cu detecție prin fluorescență este o metodă de mare sensibilitate și
selectivitate pentru analiza fluidelor biologice, a medicamentelor și a metaboliților acestora. Sunt
disponibile proceduri sigure, automatizate, care utilizează derivatizarea într-o precoloană pentru analiza
aminoacizilor și a aminelor. Sistemele care utilizează coloane scurte, cu faze staționare constituite din
particule cu dimensiuni reduse, prevăzute cu ultramicrodetectoare, asigură analiza rapidă a unor
volume foarte mici de probă.
Atenția noastră se va concentra în continuare asupra următoarelor variante ale
cromatografiei de lichide, diferențiate în funcție de mecanismul predominat de separare și de natura
fazelor implicate:
cromatografia de adsorbție (solid – lichid (CSL));
cromatografia de repartiție (lichid – lichid (CLL));
cromatografia de schimb ionic;
cromatografia de permeație pe gel;
 În sistemele cromatografice în fază lichidă sunt operaționale mai multe
tehnici de separare, prezentate succint în tabelul VII.10.
Aparatul în care se realizează o separare cromatografică pe coloană în fază lichidă
(cromatograf de lichide) este format din următoarele unități constitutive, descrise sumar,
în ordinea localizării lor în fluxul de lichid:
 
Sistemul de alimentare cu fază mobilă, în a cărui componență intră:
-rezervor (serie de rezervoare) cu solvent (solvenți de polarități diferite) – faza mobilă;
-dispozitiv de degazare necesar îndepărtării gazelor din faza mobilă;
-dispozitiv de omogenizare a fazei mobile - pentru cazurile în care se aplică eluția cu
gradient;
-pompe pentru accelerarea fluxului fazei mobile, la o presiune corespunzătoare;
-precoloana, care apare numai în cazul cromatografiei lichid-lichid și are rolul de a asigura
saturarea fazei mobile cu faza staționară.
 
Dispozitivul pentru introducerea probei
Necesitatea obținerii unor performanțe înalte de separare impune acordarea unei
atenții sporite modului de introducere a probelor în cromatografia de lichide. În acest scop,
în funcție de presiunea la care se operează, se pot folosi: pipete, micropipete, microseringi
sau seringi micrometrice de tip Hamilton, ventile sau injectoare.
 Tabelul V.10. Procedee de separare aplicabile în CL pe coloană.
Tehnica Descriere succintă
PRIN ELUȚIE -Este un procedeu de separare cromatografică de importanță majoră în care
- normală (izocratică) aplicarea probei este urmată de adăugarea – în flux continuu – a fazei mobile
  (agent de eluare sau eluent), până la separarea completă a componenților care
părăsesc coloana.
- în etape (pas cu pas) -Utilizează o fază mobilă lichidă de compoziție și viteză invariabile;
- cu gradient -Se bazează pe schimbarea succesivă a tăriei eluentului, soldată cu obținerea
  unor rezoluții bune;
-Se caracterizează prin schimbarea continuă a compoziției fazei mobile în
timpul eluării;
- cu debit programat -Presupune modificarea continuă a vitezei de curgere a eluentului, în timpul
  procesului de separare;
- cu temperatură programată -Procedeu în care temperatura coloanei cromatografice este modificată în
mod continuu în timpul unei părți a duratei separării.
FRONTALĂ Este o tehnică de separare cromatografică în care soluția de probă este
introdusă continuu prin coloană, până la saturarea acesteia.
PRIN DEPLASARE Metodă hibridă între tehnica eluției și cea frontală în care se parcurg
următoarele etape: aplicarea probei (cantități mici) → introducerea soluției
unei substanțe care manifestă pentru faza staționară afinitate mai pronunțată
decât oricare dintre componenții probei și se numește deplasant (volum mare)
→ migrarea componenților constituenți ai probei, prin coloană, în fața
deplasantului → separarea lor, în ordinea corespunzătoare descreșterii tăriei
sorbției pe faza staționară.
 Coloana cromatografică
În cromatografia în fază lichidă, se preferă coloane drepte, confecționate din
materiale, precum: metale (aluminiu, cupru), oțeluri speciale, sticlă sau materiale plastice.
Dimensiunile coloanelor cromatografice sunt variabile, în funcție de scopul în care se
realizează separarea. Astfel, diametrele variază, după cum urmează:

scopul separării diametrul recomandat al coloanei

analitic 0,2 – 1 cm
preparativ mai mare, putând ajunge până la 5 cm

Uzual, lungimea acestor coloane este cuprinsă între 20-100 cm. Dacă gradul dorit de
separare nu poate fi atins în coloane lungi de 100 cm, este recomandată cuplarea în serie a mai
multor coloane, cu diametre descrescătoare.
 
Detectorul
Spre deosebire de cromatografia de gaze, în CL, monitorizarea concentrației
componenților în efluent este dificilă, din cauza insensibilității variațiilor caracteristicilor fizice
ale fazei mobile lichide la apariția unui dintre compușii separați. În acest context, în CL se obțin
rezultate satisfăcătoare cu următoarele tipuri de detectoare:

-fotometrice – bazate pe variația absorbanțelor în vizibil, ultraviolet sau chiar

infraroșu. Cel mai utilizat este detectorul de absorbanță în ultraviolet, particularizat prin:
 Caracteristica Descrierea ei
Sensibilitate 10-2 g/mL
Aplicabilitate Substanțe care absorb în UV (compuși organici nesaturați,
aromatici sau cu funcțiuni de tipul:>C=O; >C=S; -N=O;
-N=N; -NO2; -NH2)
Compatibilitate cu solvenții Cu excepția solvenților care absorb în UV, este compatibil
cu toți solvenții uzuali
Influența la variațiile de flux și Moderată
temperatură
Compatibilitate cu tehnica eluției cu Cu restricții la alegerea solvenților
gradient

- refractometrici, care se bazează pe măsurarea variației indicelui de refracție,

provocată de prezența componenților în fază mobilă. Sunt detectoare de tip universal, sensibili și
stabili, a căror aplicabilitate vizează substanțele cu indici de refracție diferiți de cel al
solventului.
-cu transport de solut (cu ionizare în flacără pentru CL), al cărui principiu de
funcționare este: antrenarea unei porțiuni din efluentul coloanei într-un evaporator de solvent,
prin intermediul unui fir metalic sensibil, a unei benzi sau a unui disc; pirolizarea reziduului de
solut rămas pe transportor și măsurarea produșilor volatili cu detectoare de ionizare în flacără
similare cu cele folosite în CG. Evaluarea lor poate fi prezentată succint astfel:
 Avantaje Dezavantaje
-sunt universal pentru substanțele -sensibilitate relative mica;
nevolatile; -condiții restrictive la utilizarea solvenților (improprii
-insensibili la variațiile de flux; pentru apă);
-sunt compatibili cu tehnica eluției cu -dimensiuni mari;
gradient. -probleme mecanice.
VII.2.6-2. Cromatografia de adsorbție (CSL)
 
Separarea prin cromatografie de adsorbție în fază lichidă (CSL) se bazează, în principal, pe
diferența între afinitățile de adsorbție a componenților față de suprafața unui solid active numit adsorbant.
 
FAZE SOLIDE – ADSORBANȚI
Adsorbanții sunt material solide, cu suprafață specifică mare și potential de a reține prin adsorbție
fluide sau particule solide.
Materialele adsorbante se particularizează prin:
-suprafața specifică mare;
-prezența pozițiilor polare utile;
-posibilitatea de reproducere a gradului de activare;
-rezistență mecanică adecvată;
-viteză de adsorbție ridicată;
-rapiditatea și facilitatea desorbției;
-reținerea reziduală (după desorbție) scăzută a speciei adsorbite, în cazul în care adsorbantul este
reutilizat.
 Suprafața adsorbanților este eterogenă și prezintă activitate (cantitatea de substanță adsorbită
raportată la o anumită concentrație) variabilă. În majoritatea cazurilor, procesul de adsorbție se
desfășoară după izoterme curbe, a căror liniarizare se realizează prin reducerea suprafeței specifice,
adică prin dezactivare. Suprimarea pozițiilor active sau acoperirea lor parțială se efectuează cu ajutorul
dezactivatorilor (apă, glicol, glicerină) și se soldează cu creșterea capacității de reținere.
Un anumit tip de adsorbant poate prezenta variații mari ale suprafeței specifice și a energiei
superficiale, în funcție de modul său de preparare și de activare, realizată prin încălzire pentru a se
produce deshidratarea. Astfel, argilele de tip bentonitic au suprafețe specifice de 10-500 m²/g, iar
silicagelul și cărbunii activi de ordinul a 10² - 10³ m²/g.
În ordinea crescătoare a puterii lor de adsorbție, cei mai uzuali adsorbanți sunt: zaharoza <
celuloza < amidonul < carbonatul de calciu < sulfatul de calciu < fosfatul de calciu < carbonatul de
magneziu < oxidul de calciu < silicagelul < cărbunele de lemn (mangalul) < oxidul de magneziu <
oxidul de aluminiu.
Dintre adsorbanții cuprinși în această listă, cei mai utilizați sunt alumina și silicagelul. De
asemenea, se impune precizarea faptului că, date relativ recente de literatură atestă activitatea
adsorbantă deosebită a unor polimeri organici sintetici, între care polistirenul ocupă un loc aparte.
Combinarea efectelor generate prin modificarea suprafeței specifice și a energiei superficiale
are un impact major asupra reglării activității adsorbanților. Cel mai utilizat procedeu prin care se
asigură prepararea unui adsorbant cu o anumită activitate presupune parcurgerea etapelor prezentate
schematic în figura VII.10.
 Selectarea tipului de adsorbant

│
Îndepărtarea apei prin încălzire în aer

│
Răcirea

│
Echilibrarea completă prin contactul adsorbantului cu o
anumită cantitate de apă, riguros măsurată timp de 8-16 ore

Figura VII.10. Reprezentarea schematică a procedeului cu cea mai frecventă

aplicabilitate în prepararea unui adsorbant cu o anumită activitate.
 Adsorbanții se pot prezenta sub formă de granule poroase neregulate sau de sfere
solide compacte acoperite cu un strat subțire (1μ) de adsorbant poros numite particule cu strat
superficial poros sau de adsorbanți peliculari.
Materialele adsorbante poroase asigură o suprafață specifică de 100-400 m²/g și pot fi:
de înaltă performanță;
de performanță medie.
Adsorbanții peliculari sunt, în general, de înaltă performanță și au suprafețe specifice
ale căror valori nu depășesc 5-15 m²/g.
Cele mai reprezentative tipuri de adsorbanți poroși de înaltă și medie performanță și
de adsorbanți peliculari de performanță înaltă sunt sistematizate în tabelul VII.11.
Adsorbanții se pot clasifica și în polari și nepolari, acizi și bazici.
 
Adsorbanții polari (oxizi anorganici: silicea, alumina, magnezia) rețin în mod
preferențial compușii mai polari în ordinea: hidrocarburi saturate < hidrocarburi aromatice ≈
derivați halogenați < eteri < esteri ≈ aldehide ≈ cetone < amine ≈ alcooli < acizi carboxilici.
Adsorbanții nepolari (cărbunele) manifestă preferință pentru compușii mai
polarizabili, cum sunt substanțele aromatice sau compușii care posedă substituenți precum: -S-,
-Br-, -I-.
 Tabelul VII.11. Tipuri reprezentative de adsorbanți performanți.
Denumirea Diametrul Suprafața Forma granulelor Domenii de
particulelor specifică (m2/g) utilizare

Poroși de performanță înaltă

Silicagelul        
Porasil A 37-75 350-500 sferică  
Porasil B 37-75 125-250 sferică  
Porasil C 37-75 50-100 sferică  
Porasil D 37-75 25-45 sferică pentru probele de
Porasil E 37-75 10-20 sferică dimensiuni mari
Porasil F 37-75 2-6 sferică
Porasil T 37-75 300 neregulată
Sil X      
Spherosi 20-44 300 neregulată
Biosil 20-44 -  
LiChrosorb 10-40 200
Zorbax – Sil 6-8 300

Alumina       în scopuri
Wohlm alumina 18-30 200 preparative
Bio-Rad AG 74 200
Poroși de performanță medie
Silicagelul        
Davlson Code 12 150 800 neregulată purificări de
Davlson Code 62 150 350 neregulată solvenți

Alumina       separări la scară

Alcon F - 20 150 200 neregulată mare a unor
amestecuri
simple
Poroși de performanță înaltă
Silicagel        
Corasil H 37-50 14 sferică  
Pellosil HC 37-44 8 sferică  
Perisorb-A 30-40 10 sferică separări
Vyduc 30-44 12 sferică cromatografice
Alumină       cu eficiență
Pellumina HC 37-44 8 sferică crescută
Cărbune activ  
Pellicarb sferică
 
 FAZE MOBILE LICHIDE

În condițiile în care faza mobilă lichidă este activă și are o contribuție egală cu cea a fazei
staționare în procesul de separare, pot îndeplini acest rol numai solvenții care satisfac următoarele
condiții principale:
polaritate corespunzătoare pentru a fi selectivi;
puritate înaltă;
compatibilitate cu faza staționară și cu detectorul;
acțiune dizolvantă asupra probei;
să fie ușor volatili, pentru recuperarea probei.
 
Prin caracteristicile lor cromatografice, sunt compatibili cu aceste cerințe, solvenții
organici din clasa: alcanilor (n-pentan, n-hexan, n-octan), hidrocarburilor aromatice (benzen, toluen),
derivaților halogenați (cloroform, tetraclorură de carbon, bromură de etil, bromură de izopropil,
clorobenzen), alcoolilor (metanol, etanol, propanol, izopropanol), eterilor (eter, eter n-butil, eter n-
propil), cetonelor (acetonă, metiletilcetonă), acizilor carboxilici (acidul acetic).
În CSL alegerea lichidelor utilizate ca fază mobilă (de regulă amestecuri binare de
solvenți) se face pe baza respectării unor reguli conform cărora valorile unor parametri
cromatografici definitorii trebuie să se situeze în intervale bine precizate.
 APLICAȚII ÎN ANALIZA COMPUȘILOR BIOCHIMICI
 
Cromatografia solid-lichid este aplicată, în mod deosebit, substanțelor nevolatile,
neionice, cu mase moleculare medii (<100), solubile în solvenți organici (figura VII.11). Este
deosebit de selectivă pentru anumite tipuri de izomeri și pentru compuși care conțin grupe
funcționale diferite ca număr și natură.
Silicagelul modificat chimic cu acid humic a fost utilizat ca fază staționară în coloane ale
cromatografiei de adsorbție în fază lichidă, aplicabilă pentru sorbția unor compuși aromatici
policondensați, unii fiind potențial cancerigeni.
Pe suprafața aluminei activate, Al2O3∙3H2O, se adsorb compuși polari în situsurile formate
de Al(III), Al(OH)2+ și AlO2+. Se practică o adsorbție fracționată prin introducerea în soluția
amestecului proteic a unei cantități mici de alumină, urmată de îndepărtarea prin centrifugare a
solidului. Pe primele porțiuni de adsorbant se fixează compușii proteici mai polari. Se realizează o
eluție fracționată prin spălare cu apă distilată, soluție de sulfat de amoniu 10% sau soluții tampon.

Figura VII.11. Separarea unor

acizi aromatici din urină prin CSL.
 Gelul de hidroxiapatită, Ca10(PO4)6(OH)2, frecvent utilizat pentru separarea enzimelor este
păstrat după activare în soluție de tampon fosfat la pH=6,8. Este un adsorbant ieftin, care prezintă
avantajul că adsorbția nu este afectată de sărurile (clorură de sodiu, clorură de potasiu, clorură de
calciu) prezente în amestecurile de separat.
De dată recentă este sistemul “colecție de rășini”, compus din mai multe rășini, care
constituie umplutura unor coloane, utilizabile în tehnici cromatografice alternative. Aplicarea acestor
rășini adsorbante este condiționată de menținerea constantă și diferențiată a selectivității, precum și de
disponibilitatea pentru configurații alternative ale aceluiași produs în diferite etape ale procesului.
 
VII.2.6-3. Cromatografia de repartiție (CLL)

Cromatografia de repartiție, numită și cromatografie lichid-lichid, se bazează pe diferențele

dintre solubilitățile componenților în faza mobilă lichidă și în faza staționară tot lichidă, depusă pe un
support inert. Lichidele care îndeplinesc rolul celor două faze în sistemul cromatografic prin repartiție
trebuie să fie nemiscibile și să aibă proprietăți particulare interdependente.
În funcție de polaritatea fazelor, cromatografia lichid-lichid se subdivide în:
cromatografie “normală” sau directă, propice pentru separarea substanțelor polare între o fază
staționară polară și o fază mobile nepolară;
cromatografie cu faze inversate (inverse), în care faza staționară este nepolară, iar faza mobile
este polară, astfel încât se impune separarea compușilor nepolari.
Spectrul extrem de larg al posibilităților de selecționare a celor 2 faze implicate în separare
conferă cromatografiei de repartiție adaptabilitate ușoară la orice tip de amestec de analizat.
 SUPORTUL FAZEI STAȚIONARE
Principalele tipuri de material solide și inerte care pot funcționa ca suport la fazele staționare
lichide în cromatografia de repartiție sunt descrise în tabelul VII.12.

Tabelul VII.12. Tipuri de suporturi în CLL.

Tipul EVALUAREA LOR Exemple

Avantaje Dezavantaje
Poroase -suprafață specifică mare; -eficiență redusă;  
-capacitate mare -posibilitatea -pământul
apariției diatomeic;
fenomenelor de granule de silice
difuzie, care duc la poroasă; silicagel
zone dispersate

Superficial (pelicular) -dau umpluturi omogene    

poroase și reproductibile;   silice “activă”
-eficiență înaltă de capacitate redusă silice “inactivă”
separare la viteze mari
 Cel mai important parametru care își pune amprenta asupra eficienței separărilor este
dimensiunea granulelor, care ar trebui să fie situate în domeniul 5 ≤ dp≤ 20µm, pentru a se putea
obține umpluturi omogene.
Cele mai importante procedee prin care se asigură depunerea fazei staționare lichide pe
suportul inert sunt:
evaporarea unei suspensii formate dintr-o soluție 0,5 – 10% de lichid care îndeplinește rolul de
fază staționară într-un solvent volatile și suport;
adăugarea, direct pe coloană, a unor volume mici de lichid staționar în solventul mobil saturat cu
primul.
 
Gradul de încărcare variază între 0,5-2% pentru suporturile peliculare și poate ajunge până la
10% în cazul celor poroase.
Ca suport pentru cromatografia cu faze inverse se utilizează materialele poroase clasice,
precum și diferite spume solide din policlorură de vinil, poliuretan, vâscoză sau cauciuc.

FAZELE DE REPARTIȚIE (STAȚIONARĂ ȘI MOBILĂ)

 
Selectarea cuplului de lichide care constituie fazele staționară și mobilă ale unui sistem
cromatografic prin repartiție este guvernată de necesitatea realizării unei selectivități cât mai ridicate,
dar nu pot fi neglijate nici criteriile legate de prețul de cost, puritatea, toxicitatea și stabilitatea
solvenților.
 De regulă, faza staționară lichidă trebuie să aibă polaritate sau funcționalitate similară cu cea
a probei de separat.
Polaritatea fazei mobile lichide trebuie să fie diferită de cea a lichidului staționar. Alături de
polaritate, în alegerea fazei lichide eluante trebuie să se țină cont și de impactul principalelor
caracteristici fizico-chimice asupra procesului de separare cromatografică: vâscozitatea,
compresibilitatea, presiunea de vapori, indicele de refracție, absorbanța în UV etc.
În tabelul VII.13. sunt indicate câteva sisteme cromatografice larg utilizate în separarea
compușilor biochimici.
Tabelul VII.13. Faze de repartiție cu aplicabilitate biochimică.

Faza staționară Faza mobilă Compuși biochimici separabili

Etilenglicol Heptan + 3% cloroform Steroide

Cianoetilsilicon Apă Cumarine
Poliamidă 5% Hexan + etanol Esteri ai penicilinei
Apă Fenol Aminoacizi
Apă n- Butanol + acid acetic + apă Aminoacizi
(4:1:5 v/v)
ODS – Permaphase Gradient: H2O la alcool metilic cu Vitamine liposolubile
(octadecil legat chimic) 5%/minut
 Fazele staționare lichide impregnate pe un suport inert prezintă dezavantaje majore,
cum ar fi: formarea unor pelicule neuniforme; aglomerări de particule; necesitatea utilizării
precoloanelor sau a presaturării cu fază staționară a fazei mobile.
Necesitatea înlăturării acestor deficiențe a dictat apariția fazelor staționare chimic
legate. În cazul acestora, moleculele de fază staționară sunt fixate cu unul dintre capete pe
suprafața granulelor de suport, ca rezultat al unor reacții de esterificare, de sililare cu
organoclorsilani sau de organoetoxisilanizare. Materialele astfel obținute (eter silicat pelicular și
poros, silicon monostrat pelicular și poros, silicon polimolecular poros) posedă eficiență foarte
bună, permit folosirea de faze mobile puternic polare, sunt termic și în timp stabile. Principalul
dezavantaj asociat cu utilizarea fazelor staționare chimic legate constă în lipsa informațiilor privind
modul de retenție selectivă a componenților, ceea ce induce dificultăți în alegerea solvenților.
 
APLICAȚII BIOCHIMICE
 
Caracteristicile speciale: reproductibilitate, putere deosebită de rezoluție, absența
efectelor de alterare sau de pierdere a unor componenți (cum sunt degradările termice în
cromatografia de gaze sau efectele catalitice în CSL), posibilitatea aplicării la analiza compușilor
labili, ușor reacționabili sau similari din punct de vedere chimic și adaptabilitatea la măsurători de
înaltă precizie din analiza de urme conferă cromatografiei de repartiție o poziție cheie în separarea
compușilor biochimic (tabelul VII.14).
 VII.2.6-4. Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC)
 
Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) a devenit posibilă datorită
progreselor înregistrate în sistemele de transport rapid al fazei mobile prin faze staționare, care au
asigurat și o atingere rapidă a echilibrelor de distribuție interfazică, finalizată cu separări eficiente.
Cromatografia de înaltă performanță este o tehnică care a permis separarea, concentrarea și
purificarea unor produse biochimice, folosind diverse faze staționare, pe baza transportului de masă
prin convecție în interiorul particulelor și transportului prin difuziune.
Față de varianta clasică a cromatografiei de lichide pe coloană, metoda HPLC se
diferențiază prin următoarele particularități:
folosirea de faze staționare noi, caracterizate prin uniformitatea mărimii și formei particulelor;
utilizarea unor materiale cu diametrul particulelor de ordinul a 10-80µm;
practicarea unor procedee îmbunătățite de umplere a coloanelor;
introducerea fazei mobile la presiuni de până la 3000kg/cm2;
reducerea volumelor moarte din sistemul de separare al cromatografului;
utilizarea unor detectori de sensibilitate ridicată;
posibilitatea efectuării analizei direct pe fluxul tehnologic.
 Tabelul VII.14. Aplicabilitatea CLL în separatologia biochimică.
Compuși biochimici Faza staționară Suportul inert Faza mobilă Observații

Acizi grași Apă (tampon) Silicagel Cloroform/ n- CLL cu fază staționară

C2 – C 8 Butanol polară
Acizi biliari Benzen Kieselgur Formamidă CLL cu faze inverse
Aminoacizi Apă Amidon Alcool propilic Faza staționară este
sau BuOH/HCL polară
Acizi grași Metanol Silicagel Izooctan Faza staționară este
C4 - C12 mai puțin polară decât
apa
Proteine Apă Kieselgur Sulfat de CLL cu fază staționară
amoniu/apă polară
Corticosteroizi Apă Celite Alcool Faza staționară este
etilic/diclormetan polară
Acizi grași Ulei de parafină Kieselgur Acetonă/apă CLL cu faze inverse
C8 – C20
Aminoacizi acetilați Apă Kieselgur Cloroform/ n - CLL cu fază staționară
Butanol polară
Lipide - Eter de petrol Kieselgur Etanol/apă (1:1) CLL cu faze inverse
corticosteroizi
 În metoda HPLC sunt aplicate probe mici (de circa 20µl) și diferite faze staționare,
remarcându-se cele stereospecifice, cele micelare de dodecil sulfat de sodiu, fazele staționare inverse
tratate cu diamino-hexadecilsulfonat, precum și umpluturile de tip C - 18, LiChrospher RP – 8 ADS
sau Sepharon SGX – C 18.
Metoda cromatografiei de lichide de înaltă performanță permite estimări calitative și/sau
cantitative, caracterizate prin sensibilitate și selectivitate, aplicabile pentru determinarea conținutului în
component util separat sau direct în mediul de cultură.
Este o metodă care se pretează atât pentru controlul unui proces de biosinteză cât și pentru
studii cinetice sau de stabilitate a compușilor bioactivi, asigurând totodată și selectivitate în separarea
metaboliților lor din fluide biologice (de exemplu, cafeina și 15 metaboliți ai săi, cotinina, metabolitul
nicotinei etc.). Această tehnică este performantă în separarea biopolimerilor prin exploatarea
diferențelor de hidrofobicitate și solubilitate, la punctul izoelectric.
Cromatografia de lichide de înaltă performanță este de interes în separarea unor compuși din
mase de fermentație, din amestecuri multicomponente, pentru verificarea purității preparatelor
farmaceutice și pentru detecția ultrasensibilă (circa 0,02µg/mL plasmă sau 1µg/mL urină) a
componenților unor fluide biologice (plasmă, urină, sânge). Cuplarea HPLC cu un spectrometru de
masă sau în infraroșu permite analiza în flux continuu a componenților separați.
Datorită specificității și acurateței determinărilor, metoda HPLC este utilizată în studiul
antibioticelor, în special a celor β – lactamice. În acest caz, este preferată analiza cu ajutorul sistemelor
cu faze inverse, cele mai utilizate fiind coloanele de tipul RP – 18 sau RP – 8, folosind ca fază
staționară silicagelul impregnat cu o hidrocarbură cu 8 – 18 atomi de carbon. Un exemplu îl reprezintă
controlul biosintezei Penicilinei G prin acilare enzimatică sau a scindării enzimatice .
 Pentru compușii polari (alcooli, acizi) se recomandă cromatografia prin schimb ionic. Pentru
derivații cu polaritate scăzută (cu grupe alchil) este indicată repartiția cu fază inversă, iar pentru
compușii cu polaritate medie – cromatografia de adsorbție sau de repartiție.
În gama largă de aplicații ale cromatografiei de lichide de înaltă performanță se cuprind și
determinarea acizilor grași din uleiul de floarea soarelui, a medicamentelor în forme condiționate și
analiza aminoacizilor, zaharurilor și acizilor carboxilici din alimente.
Metoda HPLC cu faze inverse este folosită pentru determinarea acizilor retinoici, cu detecție
prin fluorescență, separarea chirală a enantiomerilor unor aminoacizi, separarea unor peptide și a
insulinei.
 
VII.2.6-5. Cromatografia de schimb ionic
 
Face parte din cromatografia de lichide pe coloană și are o aplicabilitate largă în separarea și
purificarea compușilor biochimici cu structură de poliamfolit (proteine și enzime).
Sistemul cromatografic este constituit din:
-faza staționară – un material schimbător de ioni;
-faza mobilă – soluții apoase, parțial apoase sau neapoase.
Mecanismul predominant de separare cromatografică presupune un schimb ionic (prezentat
în capitolul IV) reversibil și stoechiometric între ionii din faza mobilă și ionii ce compensează pozițiile
de schimb dinf aza staționară.
Fiabilitatea procesului de schimb ionic în analiza sistemelor biochimice este asigurată prin
alegerea atentă a condițiilor de operare, în special a pH-ului și a concentrației saline.
 SCHIMBĂTORI DE IONI – CLASIFICARE ȘI CARACTERIZARE
 
Schimbătorii de ioni (ioniți) sunt materiale solide insolubile în a căror structură există ioni
capabili de a fi înlocuiți în proporții stoechiometrice cu ionii de aceeași sarcină din soluțiile de
electroliți cu care vin în contact.
În alcătuirea unui schimbător de ioni intră un suport inactiv: matrice polimeră, rețea
cristalină sau substanță naturală modificată (tabelul VII.15.) pe care sunt fixate grupe funcționale
active capabile să disocieze. Grupele funcționale ionogene pot avea caracter acid (sulfonice,
carboxilice), implicate în schimbul de cationi sau bazic (aminice), participante la procese de schimb de
anioni.
Tabelul VII.15. Tipuri reprezentative de materiale cu proprietăți de schimb ionic.

Materiale anorganice Materiale organice

Naturale: aluminosilicați (micele
hidratate, argile, zeoliți), dolomite
Modificate: gelul de silice modificat
chimic
Sintetice: MgO, SiO2, SiO2 – Al2O3,
stibiat de zirconil, seleniat de zirconil,
săruri de amoniu ale unor
heteropoliacizi (fosfomolibdenic,
fosfowolframic, fosfostibic), zeoliți
sintetici
Naturale: cărbuni de pământ tineri (turbă,
lignit), chitosan, cochiliile unor crustacee
Modificate: cărbune natural sulfonat, lemn,
celuloze
Sintetice: matrici de rășini de polimerizare
sau de policondensare care conțin poziții
de schimb cu caracter acid sau bazic
 Particularitățile schimbătorilor de ioni, determinate de complexitatea compoziției,
multitudinea și variabilitatea proprietăților lor îngreunează foarte mult realizarea unei clasificări
complete a ioniților. Cel mai adesea se iau în considerație criterii (tabelul VII.16.) corelate cu:
natura matricii și modul de obținere;
tipul matricii și modul de obținere;
forma fizică;
gradul de dispersie și porozitatea.
 
Cele mai reprezentative proprietăți ale schimbătorilor de ioni sunt:
1. Gradul de reticulare indică rigiditatea structurii, fiind determinat de numărul de
legături transversale dintre lanțurile polimere. Are influență deosebită asupra:
-gradului de îmbibare;
-mărimii porilor;
-vitezei de difuzie a ionilor în interiorul schimbătorului.
 Tabelul VII.16 Clasificarea schimbătorilor de ioni după 5 criterii reprezentative.

Criteriul de clasificare Clasa corespunzătoare de Precizări

schimbători de ioni

  naturali aluminosilicați cristalini, oxizi,

  anorganici fosfați și silicați ai unor metale;
  sintetici zeoliți, ferocianuri, hidroxizi,
  sulfuri
Natura matricei și naturali lignitul, turba, celuloza
modul de obținere organici
produse sintetice macromoleculare
sintetici de policondensare sau de
polimerizare
  schimbători de cationi conțin grupe funcționale cu
  caracter acid
  schimbători de anioni conțin grupe ionogene bazice
Semnul sarcinii
conțin și grupe acide și grupe
contraionilor schimbători amfoteri (bipolari) bazice, astfel încât schimbul se
efectuează în funcție de pH-ul
mediului
   granulari  
Forma exterioară și gradul de pulberi
dispersie poroși

  accesul ionilor se face prin

  microporoși “canale” de dimensiuni
  moleculare
 
izoporoși au rezistență mecanică
 
superioară
Porozitatea
se caracterizează prin strucutura
spongioasă și prezența unor
macroporoși pori de trecere permanenți, cu
diametrul de ordinul a zeci până
la sute de nanometri
Numărul tipurilor de grupe monofuncționali conțin tipuri diferite de grupe
ionogene polifuncționali funcționale
 2. Porozitatea este definită de forma, dimensiunile și distribuția porilor sau canalelor din
structura schimbătorului de ioni. Este determinantă pentru capacitatea de schimb ionic și
accesibilitatea grupelor de schimb.
 
3. Granulația este dată de dimensiunile particulelor, fiind un factor decisiv în viteza de
stabilire a echilibrului interfazic. Ca unitate de măsură pentru granulație se utilizează mesh-ul care
se află în următoarea relație aproximativă cu diametrul particulelor: 16/mesh ≈ diametrul (mm).
 
4. Îmbibarea schimbătorilor de ioni (polimeri organici) își are originea în structura reticulată
a ioniților care permit apei sau fazei lichide cu care sunt în contact să pătrundă în rețea,
modificându-i volumul. Astfel, schimbătorul de ioni în contact cu un solvent polar se umflă, iar
lanțurile polimere se desfac, ceea ce soldează cu formarea unor pasaje de trecere înguste în granula
acestuia.
• cu dicloro-sim-triazină
• Epiclorhidrină
• Carbodiimidă
• De oxidare cu periodat
• De aminoetilare
• De hidroliză alcalină
• Cu agenți silanici

De exemplu, produsul comerciala AH-Sepharoza, utilizat la separarea glutamin-sintetazei din E.

coli, se obține prin tratarea succesiva a dextranului cu bromcian și a iminocarbonatului obținut cu
diaminohexan. Utilizarea acidului 6-aminocapronic conduce la CH – Sepharoza 4B. Albastrul de
dextran, un suport funcționalizat cu o structură aril-amino-antrochinonică sulfonată, poate fi legat la
Sepharoză prin intermediul clorurii de cianuril.
Concentrația ligandului imobilizat influențează eficiența separării cromatografice. Cu mărirea
densității ligandului, cresc tăria legăturilor și intensitatea interacțiunilor nespecifice.
În general, s-a constatat că, datorită problemelor de natură sterică și difuzională, prin imobilizarea
directă a unui ligand pe un suport nu se induc manifestări de afinitate pentru moleculele de solut cu
mase moleculare mari. În acest context, pentru a se asigura o accesibilitate corespunzătoare pentru
moleculele de solut, este recomandat distanțarea ligandului de matrice prin interpunerea unui lanț
lung numit braț sau “grup spațial” (figura VII.17).
 În cromatografia de afinitate se remarcă, prin eficiența utilizărilor, lanțurile de 2-10
atomi de carbon, de regulă hexametilenice, de tipul:
- NH – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – NH2;
- NH – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – CH2 – COOH;
- NH – CH2 – CH2 – CH2 – NH – CH2 – CH2 – CH2 – NH2;
- NH – CH2 – CH2 – CH2 – NH – CH2 – CH2 – CH2 – NH – C – CH2 – CH2 – COOH
||
O
Datele din literatura de specialitate sugerează că cu cât brațul purtător de ligand este
mai lung, cu atât efectele pozitive asociate cu eliminarea restricțiilor de ordin steric, mărirea
flexibilității și creșterea mobilității ligandului sunt mai pronunțate.
 APLICAȚII

Interacțiunile intermoleculare dintre ligandul imobilizat pe suport și un compus biochimic

țintă conferă cromatografiei de afinitate selectivitare deosebită și rezoluție înaltă în separarea și
purificarea proteinelor și enzimelor din amestecuri complexe (tabelul VII.23).
Tabelul VII.23. Separări de compuși biochimici prin cromatografie de afinitate.
Faza staționară Compusul biochimic separat
SUPORT LIGAND
Celuloză granulară Histamină Metahemoglobina
Celuloză granulară ADN ADN-aza
Celuloză granulară Zaharide Lectina
Particule de silice,   Albumina serică bovină
coloidală, monidispersată,
modificată cu polietilenglicol
Celuloză granulară Acid hidroxamic Ureaza
Celuloză granulară Anhidrotetraciclină Anhidrotetraciclina oxigenată
Celuloză granulară IgG anti-umană Imunoglobuline
Silicagel   Analogi de acizi nucleici
Celuloză granulară Bacitracina Proteinaze
Celuloză granulară Inhibator tripsinic Chimotripsina
Particule de silice coloidală,   Albumina serică bovină
modificată prin intermediul
copolimerilor de anhidridă
maleică și stiren sau metacrilat
de metil
Celuloză granulară Aprotimina Kalikreine
Silicagel   Amestec de timină, uracil, adenină,
citozină, guanină, hipoxantină
Celuloză granulară Coloranți reactivi Lactat dehidrogenaza; Albumina serică;
A - amilaza
 Cromatografia de afinitate este singura tehnică cromatografică prin care se poate realiza
concentrarea proteinelor din soluții foarte diluate, cu stabilizarea biomacromoleculelor pe coloană.
În același context poate fi menționată și purificarea unei proteine prin cromatografie de
afinitate pe baza legaturii sale cu produsul natural si marcarea prin afinitate, în care o formă marcată a
ligandului se atașează covalent la o proteină – țintă, facilitând purificarea ei. Pentru a se facilita atașarea
la o matrice de fază solidă, la un agent de reticulare sau la un marker biochimic, se impune însă
modificarea chimica a ligandului.
Proteazele din extractul de pancreas, după fracționare cu o soluție 40-50% de sulfat de
amoniu, dializă și liofilizare se separă pe un adsorbant, care conține inhibitorul chimotripsinei, apoi pe un
al doilea în a cărui compoziție intră și inhibitorul natural al tripsinei și al elastazei, grefată pe dextran.
Eluarea chimotripsinei de pe fenil-butil-amino Sepharosă se efectuează cu acid acetic 1M, iar a celorlalte
două enzime, cu o soluție de citrat la pH=3, elastaza și clorură de potasiu la pH=2, tripsina.
Specificitatea înaltă a metodei permite separarea într-o singură etapă a enzimelor din
preparatele brute. Astfel, prin extractul celular de E. Coli se separă gliceraldehid – 3 fosfat
dehidrogenaza, iar prin două etape de cromatogafie de afinitate se obține β – galactozida pură.
Croamatografie de afinitate valorifică și interacții biologice pentru detecția analiților. O altă
aplicație vizează utilizarea anticorpilor ca liganzi selectori.
Valorificarea bifuncționalității structurale a unor coloranți reactivi și a afinitității lor pentru
biomacromoleculele s-a soldat cu o nouă generație de liganzi stabili si ieftini. Purificarea amestecurilor
multienzimatice presupune utilizarea mai multor coloane, ale căror faze staționare sunt funcționalizate cu
diverși coloranți reactivi.
 Astfel:
au fost separate malat – și 3 – hidroxi butirat – dehidrogenaza din Rhodopseumonas sphacroides
folosnd coloae cu agaroză funcționalizată cu coloranți reactivi.
utilizarea ca ligand al colorantului reactiv Procion Roșu HE – 3B asigură reținerea dehidrogenazelor și
eluție cu clorură de potasiu a hidroxi – butirat – dehidrogenazei, iar cu NADH – FCl a malat
dehidrogenazei. A doua coloană umplută cu agaroză tratată cu Procion Albastru MX – IGD, separă
hidroxibutirat dehidrogenaza, prin eluție cu NADH în prezență de KCl, de malat dehidrogenaza eluată
cu clorură de poatsiu.
pentru separarea a trei enzime: glocokinază, glucoz – 6 – fosfat dehidrogenază și fructokinază din
Zymomonas mobilus s-au utilizat trei coloane succesive umplute cu agaroză modificată cu: Procion
Galben MX-6R.
Factorii limitativi în aplicarea cromatografiei de afinitate sunt: costul mare al mediilor de
afinitate (cofactori și anticorpi) și dificultăți de menținere a acestor medii în stare de stabilitate
operațională, în sistem multiciclic și în condiții apirogene.

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE CU METAL IMOBILIZAT

Matricile solide funcționalizate cu radicali de 8 – hidroxichinolină, acid salicilic, acid

cromotropic și acid etilendiaminotetraacetic sau dietilentriamină pot da complecși metalici rezultând
noi materiale folosite ca fază staționară în cromatografia de afinitate cu metal imobilizat, care
realizează o separare eficientă a biomacromoleculelor din soluții apoase sau din plasma umană (tabelul
VII. 24).
Tabelul VII. 24. Aplicațiile cromatografiei de afinitate cu metal imobilizate în separarea compușilor biochimici
Faza staționară Compușii
biochimici separați

Faze care conțin grupări de iminodiacetat modificate cu ioni de nichel Peptide

Faze care conțin grupări de iminodiacetat modificate cu ioni de zinc Aminoacizi

Faze care conțin grupări de iminodiacetat modificate cu ioni de cupru Proteine

Cationit în forma Ag Etinil steroizi din urină

Pe microsfere unidimensionale de [poli(MMA – HEMA)] modificate covalent cu

Roșu de Congo și în care sunt încorporați ioni de Zn(II) se reține albumina, în timp ce
modificarea cu Cibacron Blue F3GA si ioni de Cu(II) se soldează cu adsorbția lizozimului.
Pe microparticule de poli(etilenglicol dimetilmetacrilat – hidroxietil metacrilat)
[poli(EGDMA – HEMA)] după modificare cu coloranții Roșu de Congo, Cibracon Blue F3GA și
Albastru Alcalin 6B și încorporare de ioni de Zn(II) este favorizată sorbția prin afinitate a
albuminei serice bovine, iar după modificare cu Cibracon Blue F3Ga și ioni de Cu(II) este reținut
lizozimul.
 O metodă rapidă de purificare a lactat dehidrogenazei, într-o singură etapă, folosește un
adsorbant deafinitate obținut prin imobilizarea unor ioni metalici (Ni(II), Zn(II), Co(II)) pe
carbiximetil aspartat-agaroza.
Selectarea ionilor metalici și a liganzilor chelatizanți permite recuperarea proteinei
marcate din diferite extracte naturale.

VII.2.6-8. Cromatografia de imunoafinitate

Prin această tehnică, separarea selective a unui analit se realizează pe baza reacției
anticorp-antigen. Anticorpul se atașează covalent la un suport rigid sau semirigid, care este
introdus, ca suspensie, in coloane. Este indicată utilizarea materialelor care orientează centrii de
legătură ai anticorpului, prin fixarea acestuia în regiunea Fc.
Efectuarea unui separări prin cromatografie de imunoafinitate presupune parcurgerea
următoarelor etape (figura VII.18):
1. prepararea anticorpului matrice prin legarea covalentă reactivilor specifici la granule activate
(agaroză, poliacrilamidă etc.);
2. legarea antigenului la anticorp-matrice și spălarea moleculelor contaminate;
3. eluția antigenului la un anumit pH, tărie ionică mare, detergenți ionici, agenți de disociere (uree,
guanidină, tiocianați), solvenți organici (dioxan, etilenglicol).
 Prin controlul riguros al parametrilor de operare (debit, presiunea) se poate mări durata de
funcționare a coloanei cromatografice. Pentru molecule hidrofile poate fi utilizat un gradient de
cosolvent organic (acetonitril, metanol) în disocierea analitului și regenerarea coloanei.
Separarea prin imunoafinitate este valorificată în purificarea glicoproteinelor terapeutice,
obținute prin biotehnologii de inginerie genetică sau în analiza produselor alimentare. Poate fi aplicată
și în recunoașterea și diferențierea modificărilor conformaționale ale biomolecuulelor.
Optimizarea sistemelor cromatografice de separare prin imunoafinitate implică două faze
distincte: selectarea anticorpului, pe baza afinității și specificității, respectiv alegerea unor soluții
tampon de eluție care să asigure valori maxime ale rezoluției și ale duratei de funcționare a coloanei.

VII. 3. Cromatografia plană

În categoria metodelor cromatografice plane se cuprind: cromatografia pe hârtie ((CH) și

cromatografia pe strat subțire (CSS).
 Elementul definitoriu comun al acestor tehnici cromatografice în fază lichidă este
forma geometrică plană a suportului fazei staționare. Hârtia cromatografică de calități superioare
sau stratul subțire microgranular, întins pe o placă, pe care se realizează separarea componenților
reprezintă echivalentul fizic al coloanei cromatografice închise. În acest context, este sugestivă
asocierea lor cu denumirea de metode cromatografice pe coloane deschise, subțiri.
În cromatografia plană, faza mobilă este lichidă și se numește developant. Operația de
deplasare a componenților unei probe de-a lungul fazei staționare poartă denuminrea de
developare. Cromatograma este reprezentată prin zone caracteristice compușilor separați, dispuse
pe suprafața fazei staționare.

VII.3.1. Cromatografia pe hârtie

În cromatografia pe hărtie, separarea se realizează predominant printr-un mecanism de

REPARTIȚIE diferită a componenților unui amestec între o fază staționară lichidă și o fază mobilă
lichidă.
Cromatografiei pe hârtie îi sunt caracteristice următoarele tipuri de fază staționară
lichidă:
- sisteme apoase: apa, soluții apoase;
- sisteme hidrofile: solvenți organici hidrofili: alcool metilic, formamidă, glicoli;
- sisteme hidrofobe: dimetilformamidă, hidrocarburi aromatice și alifatice.
  Faza staționară lichidă are ca suport hârtia cromatografică. Hârtia cromatografică este,
de obicei, din celuloză pură și trebuie sa îndeplinească anummite condiții de:
- puritate;
- porozitate;
- omogenitate;
- rezistență;
- stabilitate relativ mare
 În prezent, se produc multe tipuri de hârtie denumite standard, disponibile sub diferite
forme: benzi, discuri, etc. Cele mai utlizate tipuri de hârtie cromatografică sunt: WHATMAN 1,
WHATMAN 2, Ederol 202, MUNKELL CHR 100.
În cazul unor separări speciale, bazate pe mecanisme de adsobție, scjimb ionic, formare
de precipitate, se impune utilizarea unor hârtii cromatografice ale căror proprietăți au fost
modificate în diferite moduri, cum ar fi:
- impregnarea hârtiei cu adsorbanți (alumina, silicagel), rășini schimbătoare de ioni,
săruri sau reactivi de precipitare;
- mărirea numărului de grupe carboxil (formarea de oxiceluloză);
- acetilarea (transformarea grupelor hidroxil în grupe acetilice);
- fixarea pe celuloză a unor grupe funcționale care pot ioniza.
  Faza mobile lichidă este reprezentată, de regulă, de solvenți de natură diferită sau
amestecuri ale acestora (tabelul VII.25).
Tabelul VII.25 Principalele sisteme de solvenți care permit aproape orice separare prin CH
izopropanol – amoniac – apă formamidă – benzen
n-butanol – acid acetic – apă formamidă – benzem – ciclohexan
apă- fenol saturat
dimetilformamidă – ciclohexan
formamidă – cloroform
cherosen – izopropanol 70%
formamidă – benzen - cloroform
ulei de parafină – dimetilformamidă – metanol - apă

Principalele criterii de selecție a celui mai potrivit developant pentru o anumită

separare sunt proba de analizat și natura fazei staționare.
 VII.3.3 Cromatografia pe strat subțire
La baza separărilor cromatografice pe strat subțire stau mecanisme de adsorbție,
repartiție, schimb ionic, excludere. Dintre acestea, procesele de adsorbție și repartiție au cea mai
largă gamă de aplicații.
Stratul subțire este un amestec al cărui componente caracteristice sunt: faza
staționară, liantul și dizolvantul (tabelul VII.26).
Tabelul VII.26 Compoziția stratului subțire
Faza staționară Liantul Dizolvantul
Substanțe anorganice: lpsos; Apa sau un alt solvent
silicagel; Amidon;
oxid de aluminiu Alcool polivinilic;
Substanțe organice: Pulbere de sticlă;
-amidon; Gelatină
-celuloze  
-poliamide;

În selectarea celei mai potrivite faze staționare au prioritate structura chimică și

proprietățile compușilor supuși separării.
Separarea realizată pe o fază staționară riguros aleasă este cu atât mai performantă cu
cât dimensiunile particulelor substanței care îndeplinește acest rol sunt mai mici. 
Această corelație poate fi descrisă succint astfel:
 Dimensiunile particulelor de fază Viteza de deplasare a Calitatea separării
staționară developantului

Mari Mare Nesatisfăcătoare

Mici Redusă Bună

Liantul conferă aderență și rezistență mecanică stratului. Nu poate fi exclusă nici

ipoteza ca evantualele proprietăți adsorbante ale substanței utilizate ca liant să-și pună amprenta
asupra comportării stratului subțire în procesul cromatografic.
În realizarea practică a stratului subțire se parcurg următoarele etape:
amestecarea liantului cu faza staționară, sub forma unei emulsii apoase;
întinderea manuală (cu ajutorul unei baghete de sticlă) sau mecanică (cu dispozitive mecanice
speciale) a acestei emulsii pe o placă plană și curate, confecționată din sticlă, plastic sau metal;
verificarea uniformității (din punct de vedere al grosimii și cantității de fază staționară per unitatea
de suprafață) stratului;
Straturile subțiri comercializate pot fi furnizate în mărimi variate, impregnate în diverse
moduri și despuse pe sticlă, aluminiu sau plastic.
Rolul de fază mobilă este îndeplinit de dizolvanții sau amestecurile de solvenți care se
utilizează și în cromatografia pe hârtie.
 VII.3.3 Cromatograma în cromatografia plană

Proba de analizat (o picătură de soluție) se introduce sub forma unei pete inițiale (SPOT)
pe hârtia cromatografică preparată cu faza staționara sau pe o cromatoplacă, într-un loc în prealabil
delimitat și denumit linie de start.
Se aduce hârtia (placa) cromatografică pe care s-a aplicat proba în contact cu solventul
fazei mobile.
În funcție de sensul de migrare a developantului de-a lungul fazei staționare depuse pe
hârtie, se diferențiază:
-cromatografia ascendentă – faza mobilă urcă datorită fenomenului de capilaritate;
- cromatografia descendentă – faza mobilă coboară fenomenului de gravitație;
- cromatografia radială – proba se aplică în mijlocul hârtiei, iar faza mobilă migrează de
la centru către periferia hârtiei.
În urma distribuțiilor selective între cele 2 faze, rezultă migrarea diferențială a
componenților, și în final separarea. În acest caz, componentele separate nu părăsesc faza
staționară. De aceea, cromatograma este reprezentată prin zone ale compușilor separați dispuse
pe suprafața fazei staționare (figura VII.19).
 Parametrul caracteristic pentru CH și CSS - R F
  Parametrul carateristic care descrie separarea prin metodele cromatografiei plane este
RF – ul, definit ca migrarea unui component din proba analizată raportată la migrarea
developantului.
Valoarea RF, se calculează ca raportul dintre distanța parcursă de centrul unui spot (hx
– figura VII.20) și distanța parcursă de developant (hf – figura VII.20), ambele măsurate de la linia
de start.

Condiția impusă pentru o bună separare a 2 componenți este ca valorile RF ale acestora
să fie cât mai diferite între ele și, dacă este posibil, diferite de 0 și 1. Reproductibilitatea valorilor
RF depinde de 4 grupe de factori care trebuie cunoscuți și menținuți, pe cât posibil, constanți:
natura, concentrația și mărimea probei de analizat; condițiile de lucru; compoziția și proprietățile
fazei staționare (natura, calitatea); compoziția și proprietățile fizico-chimice ale fazei mobile
(concentrația, pH-ul).
 VII.3.4. Procedee experimentale

Pentru realizarea unei separări prin cromatografie plană se împune parcurgerea a 5 etape
de bază sistematizate în figura VII.21.
TRATAMENTUL PREGĂTITOR

APLICAREA PROBELOR

DEVELOPAREA

VIZUALIZAREA (revelarea)

INTERPRETAREA DATELOR
Figura VII.21. Etapele de bază în separarea unui amestec de componenți prin CH și CSS
 Descrierea succintă a principalelor etape:

Tratamentul pregătitor se efectuează în funcție de mecanismul (de adsorbție sau repartiție)

care guvernează separarea cromatografic:
- în cazul cromatografiei pe hârtie în care sunt dominate fenomenele de repartiție, această
etapă implică prepararea hârtiei cromatografice cu faza staționară lichidă. În acest scop, hârtie
cromatografică se păstrează într-o atmosferă saturate cu faza staționară – apa sau un solvent organic
hidrofil sau hidrofob volatil. Dacă această condiție de volatilitate nu este îndeplinită, hârtia se
imersează într-o soluție preparată prin dizolvarea fazei staționare într-un diluant foarte volatile. În timp,
diluantul se evaporă, iar faza staționară activă rămâne uniform distribuită în hârtie.
- în cromatografia pe strat subțire bazată, în special pe adsorbție, în această etapă se
realizează procesul de activare a stratului, prin evaporarea apei. Parametrii procesului de activare, cu
influență hotărâtoare asupra numărului de poziții active determinant pentru eficactatea plăcii sunt
timpul si temperatura de uscare. Activarea plăcilor se efectuează prin menținerea lor în etuvă, timp de
circa o oră, la temperatura de 1100C pentru silicagel și, respectiv de 130 0C pentru alumină.

Aplicarea probelor se face conform unui procedeu care se alege în funcție de scopul
separării și de mărimea probei. Probele se aplică sub formă de soluții, în volume mici (1-100 µlitri), cu
ajutorul unor tuburi capilare, pipete gradate sau microseringi. Înainte de aplicarea propriu-zisă, se
trasează, de regulă cu creionul, linia de start la o distanță de 2-2,5 cm de una din marginile hârtiei
cromatografice. Pe linia de start astfel trasată, probele se aplică, în mod echidistant, la distanțe de cel
puțin 1cm, sub forma unor zone (spoturi) înguste și compacte, cu diametrul de 1-3 mm.
 
 Developarea se desfășoară într-o cameră numită cameră cromatografică sau cameră de
developare a cărei atmosferă este saturată cu faza mobilă. În principiu, drept cameră cromatografică se
poate folosi un vas acoperit. Condiția impusă este ca pereții vasului să fie transparenți sau translucizi.
După developare, pe hârtia (sau placa), în prealabil uscată pentru îndepărtarea fazei mobile,
se marchează distanța parcursă în timpul curgerii de frontul de solvent. Trebuie precizat că acestă
distanță este limitată:
oîn cazul metodelor ascendente, de proprietățile capilare ale hârtiei și de evaporarea developantului;
oîn metodele descendente, prin lungimea foii.
 
Vizualizarea (revelarea) componenților separate este operația de localzare și evidențiere a
zonelor separate, corespunzătoare diferiților componenți. În practică se recurge cel mai frecvent la
pulverizarea benzilor de hârtie sau a plăcilor cu soluții ale unor reactivi de culoare specifici.

Interpretarea datelor
Analiza calitativă
Identificarea componenților se bazează pe calcularea valorilor R F și compararea acestora cu
cele corespunzătoare substanțelor pure, determinate în condiții similar.
  Analiza cantitativă
Există 2 metode de evaluare cantitativă a cromatogramei din cromatografia plană (tabelul
VII.27).
Exactitatea analizelor cantitative este cuprinsă între 3-10%. Principalii factori generatori de
erori sunt asociați cu variațiile din condițiile de developare și puritatea reactivilor.
 VII.3.5. Aplicații bochimice

Avantajele deosebite datorate raporturilor favorabile dintre numărul de analize și masa

(volumul) aparaturii folosite, timpul de răspuns și costul de amortizare a investițiilor asigură
valorificarea pe scară largă a cromatografiei plane în biochimia analitică (tabelul VII.28).
Tabelul VII.27. Metode de determinare a concentrației prin CH

Nr. crt. Metoda Principiul metodei Observații

1. DIRECTĂ Rădăcina pătrată a ariei spotului Atia spotului poate fi măsurată:
este direct proporțională cu - cu ajutorul unui densito-
logaritmul cantității de metru;
substanță - prin transferarea zonei pe
hârtia milimetrică și însumarea
pătrățelelor corespunzătoare.

2. CU EXTRAGEREA Metoda propriu-zisă de analiză Pentru a se evita erorile

SPOTURILOR ȘI cantitativă se alege în funcție de datorate condițiilor diferite de
ELUAREA nivelul concentrației si de developare, necunoscutul și
COMPONENȚILOR proprietățile fizico-chimice ale standardele se aplică pe aceeași
CORESPUNZĂTORI componentului de determinat. hârtie cromatografică.
 Tabelul VII.28. Importanța aplicativă a cromatografiei plane în biochimia analitică

Varianta Compușii Faza staționară Faza mobilă

cromatografiei planebochimici separați
Cromatografia peAmino-acizi Complex celuloză-apă Solvenți organici apoși
hârtie Acizi grași, steroli Lichid nepolar (ulei de Acid acetic, metanol,
parafină) acetonă
Gliceride, steroli Lichide organice polare Soluții care conțin rectivi
(formamidă) chimic-activi
Steroizi Solvenți cu polaritate mică Solvenți mai polari
Cromatografie pe Acizi biliari Silicagel CHCl3/ Metanol/ Amoniac
strat subțire Poliamida Apă/2-Butanonă/ Amoniac
Carbohidrați Silicagel BuOH/Et2O/H2O
Lipide Silicagel Cloroform/ metanol/ acid
acetic/ apă
Acizi grași Silicagel Eter de petrol/ Et2O
nesaturați
Vitamine    
-A Ulei de parafină/ Silicagel Alcool metilic
  Silicagel  
-K Hexan-metil-etil-cetonă
 VII.Bibliografie
1. A. Bold, Metode de separare și concentrare, Institutul Politehnic Iași (curs litografiat), 1977.
2. R. L. Cunico, K. M. Gooding, Basic HPLC and CE of Biomolecules, Richmond CA, 1998.
3. A. F. Dăneț, Metode instrumentale de analiză chimică, Editura Științifică, București, 1995.
4. Enciclopedia de chimie, vol. 4, Editura Științifică si Enciclopedică. București, 1987.
5. Encyclopedia of Analytical Chemistry, JohnWilley & Sons, Chichester, 2001.
6. V. Gorduza, L. Tofan, D. Șuteu, E. V. Gorduza, Biomateriale- Biotehnologii- Biocontrol, Editura CERMI, Iași, 2002.
7. E. Jercan, Metode de separare în chimia analitică, Editura Tehnică, București, 1983.
8. E. Jercan, Analiza cromatografică, Editura Academiei, București, 1982.
9. C. Liteanu, S. Gocan, A. Bold, Separatologie analitică, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1981.
10. T. Kline, Handbook of Affinity Chromatography, Chromatographic Science Series, vol. 63, Marcel Dekker Inc.,
New York, 1993.
11. O. Mikes, High Performance Liquid Chromatography of Biolpolymers and Biooligomers, Part A. “Materials and
Techniques”, Part. B. “Applications”, Elsevier, Amsterdam, 1998.
12. C. T. Mount, R. S. Hodges (Ed), High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation,
Analysis and Conformation, CRC Press, Boca Raton Fl, 1991.
13. L. E. Osterhoudt, în Progress in Ion Exchange Advances and Aplicatons, the Royal Society of Chemistry, 1997,
eds. A. Deyes, M. J. Hudson, P. A. Williams.
14. D. J. Pietryzk, C. W. Frank, Chimie analitică, Editura tehnică, Bucureșt, 1989.
15. D. L. Pyle, Separation for Botechnology, Ed. Elsevier Science Publishers, Londra, 1990.
16. J. Saint-Blancard, J. M. Kirizin, Affinity Chromatography and Related Techniques, Elsevier Scientific, Amsterdam,
1982.
17. J. Turkova, Bioaffinity Chromatography, J. Chromat. Librarz, vol. 51A, Elsevier, Amsterdam, 1993.
Lista studentilor care au prezentat:
1. ARNĂUTU CLAUDIU
2. ASAFTEI ANDRADA
3. ASANDEIC ANDREEA
4. BOLEA LUIZA
5. BUCUR DIANA
6. BURSUC ISABELA
7. BUTURE CRISTINA
8. CHISĂ C. MĂDĂLlNA
9. DAMASCHIN BOGDAN
10. EL - SABEH AMADA
11. FARCAŞ R.C. IOANA
12. GAVRILITA MARIA
13. GROSU ELENA
14. GURALIUC ALEXANDRA
15. IANCU FLORINA
16. JINGA MIHAELA
17. MANOLACHE CATALINA
18. MARCU ADINA
19. MIHAI ROXANA
20. MÎNDRESCU MADALINA