Biochimia analitică

BIOCHIMIE ANALITICĂ
Principiile generale ale biochimiei analitice

• Selectarea unei metode valide de analiză

ETAPE:
• Determinarea calității datelor
• Producerea unor rezultate corecte

Biochimia analitică implică utilizarea metodelor

de laborator pentru a determina compoziția
probelor biologice și are aplicații în multe
domenii ale științelor biologice, foarte diferite.
Informațiile obținute dintr-o analiză sunt, de
obicei, prezentate ca un raport de laborator,
care poate pur și simplu să spună ce
substanțe sunt prezente (un raport calitativ)
sau poate specifica cantitatea exactă a unei
substanțe din eșantion (raport cantitativ).
Un raport calitativ indică deseori dacă o anumită substanță sau
grup de substanțe este/sunt prezentă/e fără să se comenteze
asupra compoziției complete a eșantionului (probei). În multe
cazuri, raportul va specifica și membrii individuali ai acelui grup de
substanțe. Astfel, raportul calitativ poate, de exemplu, să
menționeze numai carbohidrați diferiți prezenți, deși eșantionul
poate conține și alte substanțe, de ex. lipide și proteine.
Este posibil ca, atunci când se utilizează anumite metode
calitative, să se compare cantitatea de substanță din probă cu
cantitatea dintr-un eșantion de referință și să se constate prezența
cantităților crescute sau reduse.
Un astfel de raport se spune că este semi-cantitativ. Metodele
cromatografice și electroforetice oferă adesea rezultate care pot fi
interpretate în acest fel.
Un raport cantitativ va indica
 Cantitatea unei substanțe particulare
prezente în eșantion și este important ca
unitățile de măsură să fie semnificative și
adecvate pentru a preveni neînțelegerile
ulterioare.
 Atunci când se raportează rezultatele
cantitative, este de dorit să se indice
fiabilitatea acestora, o caracteristică
care poate fi adesea evaluată statistic.
 În practică, este posibil să nu fie necesar
să se prezinte aceste informații cu
fiecare raport, dar ar trebui să fie
disponibil pentru referință.
Pentru a putea alege o metodă analitică adecvată, este esențial să cunoaștem
câte ceva despre proprietățile chimice și fizice ale substanței de testat (Tabelul
următor).
Proteinele sunt principalele componente
în cantitate mare în multe probe
Bazele fizice a metodelor analitice biologice și, prin urmare, cântărirea unei
probe uscate ar trebui să ofere o
estimare a cantității de proteină
prezentă.
În mod similar, soluțiile care conțin
valori ale proteinei arată o greutate
specifică și o tensiune superficială care
sunt într-un fel legate de conținutul de
proteine.
Măsurătorile turbidității rezultate prin
precipitarea proteinelor și absorbția
radiației la lungimi de undă specifice au
fost toate utilizate în metode cantitative.
Conținutul de plumb al probelor
biologice este de obicei foarte mic, ceea
ce face ca metodele gravimetrice să fie
impracticabile, iar metodele utilizate se
bazează adesea pe formarea unor
complexe colorate cu o varietate de
reactivi.
Mai recent, dezvoltarea spectroscopiei
de absorbție utilizând eșantioane
vaporizate a furnizat o metodă
cantitativă sensibilă. Măsurătorile de
oxigen folosind electrozi specifici oferă
un nivel de sensibilitate care nu poate fi
atins prin analiza volumetrică a gazelor.
 Deoarece relația dintre
proprietate și cantitatea de
substanță nu este
întotdeauna una simplă,
unele metode sunt adecvate
numai pentru detectarea
substanței (calitative), în timp
ce altele pot fi cantitative.
 Pentru orice metodă, este
important să se aprecieze
natura relației dintre
măsurarea obținută și
cantitatea de substanță din
probă.
 Cele mai multe metode
analitice implică mai mulți
pași preparativi înainte ca
măsurarea finală să poată fi
realizată și este posibil să se
producă o diagramă de flux
reprezentând o metodă
generalizată de analiză
(tabelul următor).
Nu toate etapele pot fi necesare
în orice metodă particulară și
este posibil să se combine două
sau mai multe prin alegerea
atentă a instrumentelor de
anailză.
Este important atunci când se
selectează o anumită metodă
să se ia în considerare nu
numai validitatea analitică, ci
și costul analizei în ceea ce
privește instrumentația,
reactivii necesari și timpul
necesar analizei.
 Metode instrumentale

Metodele cele mai convenabile sunt acelea care permit identificarea și cuantificarea
simultană a substanței de testat.
Din păcate, acestea sunt relativ puține în număr, dar probabil cele mai bune exemple
sunt în domeniul spectroscopiei de emisie atomică și absorbție, unde lungimea de
undă a radiației poate fi utilizată pentru a identifica elementul și intensitatea radiației
utilizate pentru cuantificarea sa.
Dacă un compus nu prezintă o caracteristică ușor de detectat, este posibil să se
modifice chimic pentru a produce un compus care poate fi măsurat mai ușor.
La începutul acestui secol, această abordare a analizei a condus la dezvoltarea
multor reactivi complecși concepuți pentru a reacționa în mod specific cu anumite
substanțe de testat.
În general, acești reactivi au condus la formarea unor compuși colorați care pot fi
măsurați utilizând comparatoare vizuale.
Majoritatea acestor reactivi au fost înlocuiți de metode instrumentale îmbunătățite,
dar unele dintre acestea sunt încă de încredere.
Aceste metode au fost deseori numite după cercetătorii asociați cu dezvoltarea lor,
de ex. Reactivul Folin și Ciocalteu, descris inițial în 1920 pentru detectarea
compușilor fenolici.
Interferența apare atunci când sunt detectate și alte
substanțe, precum și compusul de testat, rezultând
valori ridicate în mod eronat.
Ocazional, efectele de interferență pot duce la
suprimarea reacției de testare.
Pentru orice metodă, este important să fim conștienți de
substanțele care pot provoca interferențe și de a ști
dacă există probabilitatea de a fi prezente în eșantion.
Dacă interferența este o problemă majoră, eșantionul
trebuie să fie parțial purificat înainte de analiză. Aceasta
face ca analiza să se transforme în etape pregătitoare
și cantitative.
Pentru a reduce dificultățile tehnice care rezultă din
astfel de metode în două etape, s-au dezvoltat o serie
de tehnici analitice, cum ar fi cromatografia în gaz și
lichid, în care separarea și cuantificarea sunt
efectuate secvențial.
 Metode fiziologice

 Deși este posibil să se elaboreze metode cantitative

de analiză pentru mulți compuși biochimici, singura
metodă practică de măsurare a altora este cea de
analiză a efectele lor fiziologice.
 Un biotest implică măsurarea răspunsului unui
organism sau a unui organ țintă la compusul testat și
poate fi efectuată in vivo utilizând animale vii sau in
vitro utilizând preparate de organe sau țesuturi
izolate. Multe bioteste sunt cantitative, dar cele care
dau doar un rezultat pozitiv sau negativ se consideră
a fi mai apropiate de natură.
 Un biotest satisfăcător cere ca răspunsul animalului
la substanță să poată fi măsurat într-un mod destul
de precis, dar trebuie amintit că diferite animale
răspund în mod diferit la același stimul.

În consecință, biotestele trebuie să fie concepute

astfel încât să țină seama de astfel de variații și
trebuie să se realizeze măsurători repetate cu
ajutorul diferitelor specii de animale.
 În toate testele este important ca factorii externi care pot
influența răspunsul să fie standardizați cât mai mult posibil.
Vârsta și greutatea unui animal pot afecta răspunsul acestuia,
precum și condițiile de mediu, calea de injectare și mulți alți factori.
În absența unei identificări chimice absolute, este adesea
necesar să se stabilească faptul că eșantioanele diferite conțin aceeași
substanță activă fiziologic. Acest lucru poate fi obținut prin compararea
relației doză-răspuns pentru două probe.
Aceasta implică măsurarea răspunsului la diferite cantități din
fiecare probă și demonstrarea faptului că panta relației rezultate este
aceeași în ambele cazuri.
În astfel de metode grafice sau statistice, poate fi necesar să se
folosească logaritmul cantității pentru a produce mai degrabă o linie
dreaptă decât o curbă.
Este adesea necesar să se utilizeze o astfel de tehnică pentru a
confirma validitatea utilizării preparatelor sintetice sau purificate ca
standarde în analizele cantitative.
 Utilizarea celulelor din țesuturile specifice cultivate în culturi, mai
degrabă decât țesut proaspăt izolat, oferă o tehnică de biotest care reduce
nevoia de utilizare a animalelor cu toate implicațiile resurselor costisitoare și a
conflictului etic.
Alternativ, există o gamă largă de linii celulare disponibile din țesuturi
diferite (Tabelul de mai jos).
Exemple de bioteste care utilizează linii celulare

 Măsurarea activității catalitice a unei enzime este, de asemenea,

un biotest, în ciuda faptului că se utilizează metode chimice pentru
a măsura cantitatea de substrat de produs.
 Deși utilizarea imunoanalizelor poate permite determinarea
concentrației moleculare a unei enzime, rămâne problema relației
dintre concentrația molară și efectele fiziologice.
Kituri de analize

În ultimii ani, au fost dezvoltate de producătorii de reactivi sau de

instrumente multe metode pentru o mare varietate de analiti și ele sunt
comercializați ca "truse".
Acestea variază de la testele colorimetrice relativ simple, care necesită
doar adăugarea soluțiilor chimice furnizate eșantionului de testare, la
proceduri mai sofisticate care implică reactivi complexi cum ar fi anticorpi
marcati sau acizi nucleici.
Kiturile includ toate standardele necesare și componentele testului.
Ele sunt proiectate pentru a fi utilizate într-o procedură manuală sau, mai
frecvent, pe un instrument automatizat.
Kiturile cuprind protocoale complete de testare, împreună cu detalii privind
compoziția tuturor reactivilor, orice date privind pericolele asociate și
condițiile de depozitare specificate.
 Creșterea disponibilității kit-urilor a
redus considerabil necesitatea ca
laboratoarele individuale să-și dezvolte
propriile metode.
 Este o cerință ca toate kiturile să fie
validate înainte de a putea fi vândute și
că detaliile performanței analitice
așteptate sunt incluse împreună cu
produsul.
 Cu toate acestea, fiecare laborator este
responsabil pentru propriile rezultate, iar
personalul trebuie să se asigure că
instrucțiunile producătorului sunt
respectate și că sunt mulțumiți de toate
aspectele legate de orice kit pe care îl
utilizează.
 Acest proces poate necesita verificarea
performanței analitice citate.
METODE DE SEPARARE
• Principiile tehnicilor de separare
• Metode bazate pe polaritate
• Metode bazate pe natura ionică
• Metode bazate pe mărime
• Metode bazate pe formă
Toate procedurile de separare depind în
primul rând de anumite caracteristici fizice
ale compușilor.
Este relativ ușor să se separeze substanțe
care au caracteristici fizice semnificativ
diferite prin tehnici simple, cum ar fi
extracția cu solvent.
Cu toate acestea, dacă diferiții compuși
sunt asemănători unul cu celălalt, este
esențial ca orice ușoară diferență între ele
să fie exploatată pentru a obține o
separare.
Tabelele prezintă proprietățile fizice majore care formează baza procedurilor de
separare.
Precipitanți ai proteinelor
Clasificarea tehnicilor de separare
 Metodele generale de separare

Mișcarea analitului este o

caracteristică esențială a
tehnicilor de separare și este
posibilă definirea în termeni
generali a forțelor care determină
o astfel de mișcare (Figura de
mai jos).
Dacă se aplică o forță unei
molecule, mișcarea acesteia va fi
împiedicată de o forță de
întârziere/fricțiune de un anumit
fel.
 Acest lucru poate fi explicat simplu prin
efectul de fricțiune al deplasării
moleculelor de solvent/analit sau poate
fi datorat efectului de adsorbție la o fază
solidă.
 În multe metode, forța folosită nu este
importantă, dar variațiile forței nete
rezultate pentru diferite molecule oferă
baza pentru separare.
 În unele cazuri, totuși, intensitatea forței
aplicate este importantă recum în
tehnicile de ultracentrifugare proces
care conduce la separarea
componentelor la forțe centrifugale
deosebit de mari
 Prezența acestor forțe sunt cele mai
ușor descrise în ceea ce privește
cromatografia, dar ele sunt, de
asemenea, relevante pentru alte
metode, cum ar fi electroforeza și
ultracentrifugarea.
PREGĂTIREA PROBEI
 Metode de separare și analiză

cromatografice Centrifugarea/ultracentrifugarea

electroforetice
Medode imunochimice de analiză
 Metode de separare

de atingere a s tarii de echilibru

Cromatografia Elec tro foreza (steady state, displacement electrophoresis)
frontalã, liberã, de migrare î n s olutii (tampon)
moving boundary electrophoresis is otachophoreza
focus are (focalizare) is oelectrica
î n medii s tabilizate, zonalãisoelectric focusing
(zone electrophoresis)
suportul stabilizeazã zonele de migrare
si permite o mai bunã separare
suporturi chimic active
medii suport cu structurã capilarã
medii suport cu structurã reticularã imunoelectroforeza
pe hârtie pe strat subtire electroforeza de afinitate
pe folii de acetat de celulozã pe poliacrilamidã
pe agar, agarozã
pe amidon
 Cromatografia
covalentă
de afinitate

Cromatografia de partiţie Cromatografia de adsorpţie

schimb ionic
cu perechi de ioni
pe hidroxiapatită
cu fază
de interacţie hidrofobă
inversă pe coloană
cu fază legată Excluziune adsorbţie tiofilică
moleculară Planară
lichid-lichid
 Cromatografia

În 1906 Tswett a publicat un articol,

în revista de specialitate Berichte
der deutschen botanischen
Gesellschaft în care descrie
separarea unor pigmenţi vegetali pe
un tub îngust de sticlă, umplut cu
carbonat de calciu. Pigmenţii de
diferite culori au fost astfel separaţi
de pe carbonat prin eluţie cu eter de
petrol.

Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)

 Istoric

• Plinius cel Bătrân (23-79 după Cristos) în

Historia Naturalis, descrie un proces
egiptean (ca. 500 înainte de Cristos) de
separare a unor pigmenţi prin depunerea
soluţiei lor pe un material celulozic,
precum papirusul. Această tehnică poate fi
considerată a fi foarte aproape de
cromatografia pe hârtie.
• În 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hârtie şi include
ilustraţii ale cromatogramelor în lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.
• Richard Kuhn şi Edgar Lederer (1931, separarea a două componente din
carotenul cristalizat, privit până în acel moment drept un singur compus chimic,
prin cromatografie de adsorbţie.
• Martin şi Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiţie)
• Consden, Gordon, şi Martin (descrierea cromatografiei pe hârtie).
• 1950 dezvoltarea cromatografiei gaz-lichide (GLC), prin care se separă
compuşi gazoşi sau volatili pe o coloană îngustă umplută cu un adsorbent.
• Cromatografia în strat subţire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se
separă compuşi prin trecerea unui solvent printr-un strat subţire de o grosime
submilimetrică, întins pe un suport precum placa de sticlă a fost dezvoltată în
anii ‘60.
 Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (high performance
liquid chromatography, HPLC), tehnică care se separă compuşi prin
introducerea probei într-o coloană îngustă încărcată cu adsorbent şi
forţarea eluţiei sale prin presiune a fost dezvoltată în deceniul al şaptelea.

Cromatografia pe hârtie şi mai ales cea în

strat subţire sunt încă utilizate, fiind deseori
preferate cromatografiei gaz-lichid şi
cromatografiei lichide de înaltă
performanţă din cauza marii lor puteri în
separarea efectivă, cu echipamente ieftine
şi costuri scăzute.
• Principala aplicaţie a cromatografiei este cea de
separare a unor amestecuri de compuşi în scopuri
analitice sau preparative.
• Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la
identificarea, izolarea, purificarea şi cuantificarea
unor compuşi individual separaţi.
• În plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate în
determinarea omogenităţii unor substanţe chimice,
determinarea structurii moleculare, determinarea
produşilor de reacţie şi a proceselor care le
însoţesc.
Cromatografia cuprinde un grup important şi
diversificat de metode care permit
cercetătorului separarea unor componenţi
foarte apropiaţi (înrudiţi) dintr-un amestec
complex de substanţe (de componente),
multe dintre aceste separări nefiind posibile
prin alte tehnici.
În toate separările cromatografice proba
este transportată într-o fază mobilă, care poate fi
un gaz, un lichid sau un fluid în stare
supercritică. Această fază mobilă este forţată să
traverseze o fază nemiscibilă, fază staţionară, care
se găseşte într-o coloană sau pe o suprafaţă solidă.
Cele două faze sunt alese în aşa fel încât
proba să se distribuie între faza mobilă şi cea
staţionară în proporţii diferite.
Componentele care sunt mai puternic reţinute de către
faza staţionară se vor mişca şi vor curge mai lent cu faza
mobilă. Din contră, componentele mai uşor (mai puțin)
legate de către faza staţionară o vor traversa (pe această
fază) mai rapid. Drept consecinţă a acestor diferenţe în
mobilitate, componentele probei se vor separa în
benzi ori zone discrete, care pot fi analizate calitativ
şi/sau cantitativ.

Termenul de migrare utilizat în

cromatografie reprezintă o descriere
generică a mişcării moleculelor în
cromatografie şi el nu trebuie
confundat cu migrarea unei specii
ionice sub acţiunea unui câmp electric.
 Clasificarea metodelor de cromatografie pe coloană
• Metodele cromatografice pot fi clasificate ţinând cont de două
criterii.
– Prima clasificare este bazată pe metoda fizică prin care fazele
mobilă şi staţionară vin în contact.
• Astfel, în cromatografia pe coloană, faza staţionară este
reţinută într-un tub îngust, prin care faza mobilă este forţată
să treacă.
• În cromatografia planară, faza staţionară este depusă pe un
suport, în interstiţiile unui material poros (de tipul hârtiei de
filtru, ca exemplu). În acest caz, faza mobilă se mişcă prin
faza staţionară datorită forţei capilare, sub influenţa forţei
gravitaţionale.
 Se poate remarca că echilibrele care apar în cazul celor
două tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate,
teoriile dezvoltate în cazul uneia dintre cele două metode
putând fi formalizate asemănător şi uşor adaptate la cealaltă
tehnică cromatografică.
O clasificare mult mai specifică (mai fundamentată) a metodelor cromatografice se
bazează pe TIPUL FAZELOR MOBILE ŞI STAŢIONARE şi TIPUL DE
ECHILIBRU stabilit în transferul soluturilor între cele două faze.
 ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUŢIE PE COLOANĂ

• Prezentarea schematică a
modului prin care două
substanţe, notate A şi B
sunt separate prin
cromatografie de eluţie pe
o coloană, cu fază mobilă
lichidă. Eluţia implică
spălarea, trecerea
speciilor (substanţelor A
şi B, în speţă) prin
coloană, la adăugarea
continuă de solvent (fază
mobilă) proaspăt (a).
O porţiune unică de probă este
introdusă la capătul superior al coloanei
(timpul to), după care componentele probei
se distribuie independent, între cele două
faze.
(b) Semnalul înregistrat de către un detector în funcţie de evoluţia eluţiei
prin coloana prezentată în (a).
Introducerea unui volum adiţional
de fază mobilă (de eluent) forţează
volumul de solvent care conţine o
parte a probei să coboare prin
coloană, unde, se stabileşte o
nouă partiţie între faza mobilă şi
cea staţionară (timpul t1). Simultan
cu aceasta se stabileşte un nou
echilibru și o nouă partiţie între
solventul proaspăt (faza mobilă nou
adăugată) şi faza staţionară la locul
iniţial de adăugare a probei.
Adăugarea unor noi volume de solvent
va avea ca efect coborârea moleculelor
de solut spre capătul de jos al coloanei
printr-o serie continuă de transferuri
între faza mobilă şi cea staţionară.
Cum mişcarea solutului se poate
realiza numai prin intermediul fazei
mobile, viteza medie cu care zona
(banda) solutului migrează în josul
coloanei depinde de fracţia de timp în
care solutul este reţinut de către
această fază. Această fracţie este mică
pentru componenta mai puternic
reţinută de către faza staţionară
(compusul B, din figură) şi este mare în
cazul în care retenţia în faza mobilă
este mai adecvată (componenta A).
În mod ideal, diferenţele rezultate în
vitezele diferite conduc la separarea
componentelor dintr-un amestec în benzi
sau zone localizate de-a lungul coloanei
(timpul t3 din figură).

Izolarea şi deci separarea speciilor A şi

B este urmarea trecerii unei cantităţi
suficiente de fază mobilă prin coloană şi
care conduce la o separare individuală
de zone clar distribuite ce pot fi
colectate ori detectate (timpii t3 şi t4 din
figură).
 DILUŢIA ANALITULUI

•Figura alăturată ilustrează o

caracteristică importantă a procesului de
separare, denumită diluţia analitului
fenomen care însoţeşte aproape
întotdeauna separările cromatografice.
Astfel, mărimea zonei originale care
conţine analiţii din figură este notabil mai
mică decât cele două zone care conţin
componentele A şi B şi care ajung în
zona detectorului. Acest fenomen
semnificativ de diluare se manifestă
odată cu separarea componentelor şi
din această cauză, detectorii utilizaţi
pentru separarea analiţilor trebuie
adesea să prezinte o sensibilitate mai
mare decât cea care ar fi dorită dacă
procesul de separare nu ar fi necesar.
 CROMATOGRAMELE
• Dacă un detector care răspunde la o modificare
de concentraţie a solutului este plasat la capătul
terminal al coloanei iar semnalul său este
reprezentat grafic în funcţie de timp (sau de
volumul de fază mobilă adăugat) se obţin o serie
de peak-uri, prezentate în figură (b).
– Asemenea reprezentări grafice poartă
numele de cromatograme, care sunt
utilizate atât în cromatografia analitică cât
şi în cea preparativă.

• Poziţia peak-urilor pe axa timpului poate servi

la identificarea componentelor din probă, aria
fiecăruia conducând la determinarea
cantitativă a fiecărui component.
 EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE ŞI A LĂȚIMII ZONEI ASUPRA
REZOLUŢIEI CROMATOGRAFICE

• Figura alăturată prezintă

profilurile concentraţiilor
soluţilor A şi B la două etape
diferite de eluţie: o etapă timpurie
(momentul t1) şi o etapă spre final
(momentul t2).

Se poate spune ca specia B este mai puternic reţinută şi din această

cauză componentul B întârzie mai mult pe coloană pe parcursul migrării.
Această întârziere în coborâre conduce la creşterea distanţei dintre cele două
zone. La acelaşi interval de timp, are loc lărgirea zonelor celor două
componente, fenomen ce scade eficienţa coloanei cromatografice. Cum
lărgirea zonei este inevitabilă, se pot alege condiţiile în aşa fel ca acest
fenomen să se manifeste cât mai lent odată cu separarea benzilor. Astfel,
o separare completă şi de aici o rezoluţie bună, se realizează adesea în
condiţiile în care lungimea coloanei este suficient de mare.
 • două metode de îmbunătăţire a separării în cazul unui amestec
ipotetic de două componente (figură, panel a).

• În figura alăturată (b)

condiţiile au fost modificate
astfel încât primul component
se deplasează mai repede în
josul coloanei cu viteză mai
mare în timp ce al doilea se
deplasează mai încet.
(c): vitezele de împrăştiere a celor două
zone au fost micşorate. Ambele metode
conduc la o separare mai distinctă a celor
două componente
(a) cromatograma originală cu cele
Ambele metode conduc la o separare mai două peak-uri suprapuse;
distinctă a celor două componente îmbunătăţirea separării prin (b)
creşterea separării benzilor
cromatografice şi (c) prin scăderea
împrăştierii benzii cromatografice.
 Viteza de migrare a soluţilor

• Eficienţa unei coloane cromatografice

în separarea a doi soluţi depinde, în parte,
de vitezele relative cu care cei doi
compuşi sunt eluaţi. Aceste viteze sunt
determinate de magnitudinea
constantelor de echilibru ale procesului
prin care soluţii se distribuie independent
între faza mobilă şi cea staţionară.
 CONSTANTELE DE DISTRIBUŢIE

Adeseori, echilibrele de distribuţie implicate în cromatografie sunt descrise prin

ecuaţii care implică transferul unui analit între fazele mobilă şi staţionară. Astfel,
pentru speciile A de solut se poate scrie următorul echilibru al procesului de
adsorbţie-desorbţie:

Constanta de echilibru, K, pentru această reacţie este numită constantă

de distribuţie, raport de partiţie sau coeficient de partiţie Comisia de
Nomenclatură Analitică a IUPAC pentru cromatografie recomandă utilizarea
termenului de constantă de distribuţie, Kc în loc de vechiul termen în loc de
vechiul termen de coeficient de partiţie sau raport de partiţie, K. Totuși, în
literatura de specialitate ambii termeni sunt încă utilizaţi. Constanta K este
definită conform formulei:
MP= faza mobilă
SP= faza staționară
 CS reprezintă concentraţia
molară a solutului din faza
staţionară iar CM este concentraţia
molară din faza mobilă; în mod
ideal, K este constantă în tot
domeniul de concentraţii a
solutului, iar CS este proporţională
cu CM.
Tipul de cromatografie în care
se aplică ecuaţia poartă denumirea
de cromatografie lineară iar
rezultanta ei este caracterizată
printr-o simetrie de tip Gauss a
peak-urilor şi a timpilor de retenţie,
parametrii care sunt independenţi
de cantitatea de analit supusă
analizei.
În general, studiile teoretice se
limitează la o astfel de
cromatografie lineară.
 TIMPUL DE RETENŢIE
Figura alăturată reprezintă
generic o cromatogramă pentru o
probă ce conţine un singur analit.
Timpul necesar probei pentru
a parcurge distanţa dintre
momentul inoculării (injectării)
până la evidențierea
semnalului său de către
detector este numit timp de
retenţie, fiind simbolizat prin
tR.
Peak-ul prezentat în partea
din stânga cromatogramei
(primul peak) este dat de speciile
care nu sunt reţinute de către
coloană.
Adesea, proba sau faza
mobilă conţine specii ce nu sunt
reţinute pe parcursul migrării pe
coloană. Astfel de specii care nu
interacţionează cu faza
staţionară sunt de real folos în
identificarea peak-ului analitului
de interes.
Peak-ul mic din stânga reprezintă o specie care nu este reţinută pe
coloană şi a cărei semnal apare la detector aproape imediat după ce
eluţia a fost începută. Astfel, timpul său de eluţie (tM) este
aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile să treacă prin
coloană.

Timpul necesar speciilor nereţinute să ajungă la detector se

notează cu tM şi se numeşte timp mort. Viteza de migrare a
speciilor nereţinute este în acelaşi domeniu cu viteza de mişcare
a moleculelor fazei mobile.
• De exemplu, dacă o coloană are un volum total de 100
ml iar faza staţionară ocupă 40 ml, rezultă că faza
mobilă ocupă un volum de 60 ml. Dacă faza mobilă
curge cu o viteză de 5 ml/min, se poate calcula că sunt
necesare 12 minute pentru ca faza mobilă să traverseze
coloana, de la injector la detectorul situat la capătul
terminal al coloanei.
 Uneori, tM poate fi determinat prin
identificarea unui mic peak la
începutul cromatogramei, rezultat
dintr-o uşoară diferenţă dată de
solventul care provine din faza
mobilă ce conţine proba adăugată.
 De asemenea tM poate fi determinat
prin măsurarea timpului de eluţie a
unei probe care nu este reţinută
absolut de loc de către faza
staţionară.
 În cazul unei răşini schimbătoare de
ioni cationice, pentru a se determina
tM, se poate utiliza o proteină cu
sarcină negativă.
• Există şi alţi factori precum
lungimea şi diametrul tubului
care conectează injectorul şi
detectorul la coloană care pot
afecta valorile tM.
• Practic, considerând o coloană
împachetată de 25 cm lungime,
cu un diametru interior de 1 cm,
volumul total al coloanei este de
19,6 ml (V= •r2 •L = 3,14 •0,52
•25cm).
Dacă faza mobilă ocupă 60% din
volumul coloanei, volumul
spaţiului gol, care defineşte
«timpul mort» este egal cu 11,8
ml și este denumit „void volume”
= V0
 RELAŢIA DINTRE TIMPUL DE RETENŢIE ŞI CONSTANTA DE
DISTRIBUŢIE
Viteza lineară medie de migrare a
solutului/analitului ( u ) este dată de
relaţia:

unde tM reprezintă timpul mort, timpul

necesar pentru ca o moleculă medie de
fază mobilă să treacă prin coloană.
 În mod similar, viteza medie lineară de
mişcare a unei molecule de fază mobilă (ν)
este dată de relaţia:

unde L este lungimea coloanei

împachetate.
 În scopul prezentării relaţiei dintre timpul de retenţie al solutului şi
constanta sa de distribuţie, se poate exprima viteza de migrare drept o
fracţie a vitezei fazei mobile:

Această fracţie este egală cu numărul mediu de moli de solut din

faza mobilă, la un moment dat, raportat la numărul de moli totali de solut
din coloană, conform următoarei relaţii:
 Numărul total de moli de solut din faza mobilă este egal cu
concentraţia molară a solutului din faza mobilă, cM, multiplicată cu
volumul acestei faze, VM.
În mod similar, numărul de moli de solut din faza staţionară este
dat de produsul concentraţiei cS de solut din faza staţionară, multiplicat
cu volumul său din aceeaşi fază, VS.
Astfel se poate scrie:
 Prin substituirea ecuaţiei constantei
de distribuție în această ecuaţie se obţine
viteza de migrare a solutului ca funcţie de
constanta de distribuţie şi ca funcţie de
volumele fazelor staţionare şi mobile:

Cele două volume pot fi estimate prin metode specifice fiecărui tip
de cromatografie.
 VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENŢIE

Factorul de retenţie, sau factorul de capacitate reprezintă un

parametru important care este general utilizat în descrierea vitezelor
de migrare a soluturilor pe coloană. Pentru un solut A, factorul de
retenţie k’A este definit ca:

unde KA reprezintă constanta de distribuţie a speciei A.

Comisia IUPAC de Nomenclatură Analitică recomandă denumirea de

factor de retenţie k', însă denumirea de factor de capacitate este încă
utilizat în literatura de specialitate.

Prin substituţia ecuaţiei 5 în ecuaţia 4 rezultă:

 În scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina k’A dintr-o
cromatogramă, se vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6,

= L
tR (2 )

ceea ce conduce la:

 rearanjarea acestei ecuaţii
Ideal, separarea se efectuează în condiţiile
unor factori de retenţie cuprinşi între 2 şi
10.
După cum se observă în figură,
tR şi tM sunt uşor de obţinut dintr-o
cromatogramă. În condiţiile unui
factor de retenţie pentru un solut
mult mai mic decât unitatea, eluţia
se realizează mai rapid şi din
această este dificil a se determina
timpii de retenţie cu acurateţe. În
condiţiile în care factorul de retenţie
este de ordinul zecilor (de exemplu
20 sau 30), timpii de eluţie devin
anormal de mari.
 VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE
SELECTIVITATE

Factorul de selectivitate (9)

al unei coloane () pentru
două specii, A şi B este
definit prin formula:
unde KB reprezintă constanta de
distribuţie a speciei B, mai puternic
reţinută pe coloană, în timp ce KA
reprezintă constanta de distribuţie a
speciei A, mai puţin reţinută pe coloană, şi
astfel mai rapid eluată de pe aceasta.

Prin definiţie,  este întotdeauna mai mare

decât unitatea.
• Prin substituirea ecuaţiei 5 şi a
ecuaţiei analoage pentru
solutul B în ecuaţia 9 se
obţine, după la rearanjare,
relaţia de legătură între (10)
factorul de selectivitate
pentru cei doi soluţi şi factorii
unde k'B şi k'A reprezintă factorii de retenţie
lor de retenţie: ai solutului B, respectiv A.

Substituţia în ecuaţia 8 pentru cei doi soluţi din ecuaţia 10 conduce la o

expresie ce permite determinarea experimentală lui  dintr-o
cromatogramă:

factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la

rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea
unei coloane cromatografice
 Împrăştierea zonei şi eficienţa
coloanei

• Teoria dinamică, sau teoria cinetică a cromatografiei explică cu succes în

termeni cantitativi formele peak-urilor cromatografice şi efectele diverselor
variabile implicate în lăţirea acestor peak-uri. O discuţie detailată a
acestei teorii se bazează pe mecanismul de repartiţie aleatorie, putându-
se da o imagine calitativă a zonelor cromatografice şi care conduce la
analiza modului de împrăştiere a zonelor în condiţiile deplasării
moleculelor de solut de-a lungul unei coloane. Înţelegerea acestor
fenomene au ca rezultat identificarea variabilelor ce conduc la
creşterea eficienţei coloanei şi la reducerea împrăştierii zonelor
cromatografice.
 FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE

Figura 4

Figura 1 Figura 2
• Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogramă sau a benzilor pe
coloană (figurile de mai jos) relevă o similaritate a erorilor normale,
repartiţia realizându-se după un profil Gaussian, care sunt obţinute
în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de
frecvenţa repartiţiei a acestora.
 În unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare,
manifestând o coadă (trenă) sau un front.
În alte cazuri, trena peak-ului care apare în dreapta cromatogramei
este prelungă, în timp ce frontul acestuia este abrupt, în timp ce în alte
cazuri forma cromatogramei este inversată, adică frontul este prelung în
timp ce trena este extrem de scurtă (figura de mai jos).
Cauza comună a apariţiei frontului sau a trenei o reprezintă
existenţa unei constante de distribuţie (KA,B ) neliniare.
Frontul apare de asemenea în cazul eluării unei
cantităţi mari de probă pe coloană. Distorsiunile
de acest fel sunt nedorite deoarece conduc la
separări de proastă calitate şi la timpi de eluţie cu
reproductibilitate scăzută.
De altfel, în abordarea teoretică, se
consideră ca fenomenul de front sau coadă
cromatografică este absent sau minim.

În abordarea statistică, curbele de erori

normale pot fi raţionalizate prin asumarea
faptului că incertitudinea asociată cu orice
măsurătoare singulară reprezintă
însumarea unui număr mult mai mare de
erori mici, individuale nedetectabile şi de
repartiţii întâmplătoare, fiecare dintre
acesta având o probabilitate egală, pozitivă
sau negativă.
• Cea mai comună manifestare a acestor incertitudini este
reprezentată de anularea uneia de către cealaltă, ceea
ce conduce la o valoare medie. Cu o mică probabilitate,
însumarea poate conduce la un rezultat mai mare sau
mai mic decât media. Drept consecinţă, distribuţia
valorilor este simetrică, în jurul valorii medii.
• În mod similar, forma Gaussiană a unei zone
cromatografice ideale poate fi atribuită combinării aditive
a mişcărilor întâmplătoare a moleculelor de solut în zona
cromatografică.
 Să considerăm comportamentul
unei molecule de solut, care în timpul
migrării, trece prin mii de transferuri
între faza staţionară şi cea mobilă.
Timpul petrecut în fiecare fază de
transfer este deosebit de neuniform,
depinzând de câştigul accidental de
energie termică din mediul înconjurător
pentru a realiza un transfer reversibil,
în cealaltă fază.
Astfel, în unele cazuri, timpul de şedere
într-o fază dată, poate fi tranzitoriu, în timp
ce în alte faze perioada poate fi relativ mai
lungă. Cum molecula este eluată numai în
timpul şederii sale în faza mobilă, are ca
rezultat, migrarea sa total neuniformă în
josul coloanei.
Din cauza timpilor variabili de şedere,
viteza medie cu care moleculele
individuale se mişcă relativ în faza mobilă
variază în mod considerabil. Anumite
particule individuale traversează mai rapid
în virtutea includerii lor accidentale în faza
mobilă, majoritatea timpului de eluţie.
Altele, din contră, pot prezenta întârzieri
datorită includerii lor în faza staţionară,
timp mai îndelungat decât timpul mediu de
eluţie.
 Consecinţa acestor procese aleatoare este o
împrăştiere simetrică a vitezelor în jurul valorii
medii, iar acesta reprezintă comportamentul
mediu al moleculei.
Lăţimea benzii componentului separat
creşte odată cu coborârea lui de-a lungul
coloanei, datorită faptului că o amplificare a
timpului de eluţie permite manifestarea unei
mai mari împrăştieri.

Astfel, lăţimea zonei este în relaţie directă cu timpul

de şedere în coloană şi în relaţie inversă cu viteza de
curgere a fazei mobile.
 Dispersia zonei cromatografice poate fi exprimata
cantitativ cu ajutorul parametrilor statistici legati de procesul
de migrare. Cel mai important asemenea parametru este
abaterea standard σ, care se poate exprima cu ajutorul
relatiei:

unde l reprezinta lungimea medii a unei trepte ce constituie distanta dintre

doua sorbtii, iar n este numarul treptelor de sorbtie. Semnificatia acestei
relatii este ca un numar mare de molecule individuale, care pornesc în acelasi
timp sa strabata sistemul cromatografic, vor da nastere unei zone de migrare
din ce in ce mai difuze pe masura ce are loc migrarea. Aceasta dispersare a
zonei, exprimata ca si concentratia moleculor componentei respective in
functie de distanta strabatuta, se va înscrie pe o curba de distributie de tip
Gauss
 Un alt parametru important pentru
caracterizarea dipersiei zonei cromatografice este
înaltimea echivalenta a talerului teoretic H.
Se poate considera ca pentru o coloana
uniforma H este identic cu lungimea unei trepte de
sorbtie l, iar distanta de migrare pe directia de
curgere, echivalenta cu lungimea coloanei L, va fi
egala cu produsul (l x n). Pe baza ecuatiei din
slide-ul anterior, rezultă

deci

(13)
H find proportional cu σ2, rezulta ca înaltimea
echivalenta a talerului teoretic va depinde de
contributia fiecarui element care determina dispersia
zonei cromatografice. Aceasta dispersie depinde la
rândul ei de cele trei procese difuzionale care au fost
mentionate: difuziunea turbulenta, difuziunea
moleculara si rezistenta la transferul de masa.
Disperia totala poate fi considerata suma dispersiilor
individuale, pe baza regulii de aditivitate, deoarece
ele nu se influenteaza reciproc:
 METODE DE DESCRIERE A EFICIENŢEI COLOANEI
În măsurarea cantitativă a
eficienţei unei coloane
N = L/H (1.12)
L, lungimea coloanei împachetate
cromatografice în general
(dată de obicei în centimetrii)
sunt utilizaţi doi termeni
înrudiţi:
(1) înălţimea talerului
teoretic, H şi
(2) numărul de talere
teoretice, N. Cei doi
parametrii sunt asociaţi
prin ecuaţia:
 Eficienţa coloanelor cromatografice creşte
cu numărul de talere teoretice: cu cât numărul de
talere teoretice este mai mare şi înălţimea
talerului teoretic devine mai mică.
Sunt întâlnite diferenţe enorme în eficienţa
unei coloane, datorită diferenţelor dintre tipul de
coloană şi fazele mobilă, respectiv staţionară,
utilizate.

În mod curent, eficienţa unei coloane în

termen de număr de talere teoretice,
poate varia între câteva sute până la mii,
iar domeniul înălţimii talerelor să varieze
între zecimi până la miimi de centimetrii
sau mai mici.
 Introducerea termenilor de înălţime a talerului şi a
numărului de talere este datorată studiilor teoretice ale
lui Martin şi Synge care au tratat coloana
cromatografică similar coloanei de distilare, unde au loc
o multitudine de procese discrete dar continue, în
straturi înguste, denumite talere teoretice.
 S-a considerat că la nivelul fiecărui taler, are loc un
echilibru între faza mobilă şi cea staţionară.
 Mişcarea solutului în josul coloanei a fost apoi tratată
ca o treaptă de transfer între faza mobilă în echilibru
şi următorul taler situat mai jos.
 Teoria talerului teoretic a fost aplicată cu succes la
forma Gaussiană a peak-urilor cromatografice şi la viteza
de migrare a solutului de-a lungul coloanei
cromatografice.
 Ea a fost în final abandonată totuşi, deoarece nu a
reuşit sa răspundă în totalitate la explicarea modului
de împrăştiere a zonei.
 Cu toate acestea, termenii originali utilizaţi la
descrierea eficienţei unei coloane au fost păstraţi în teoria
vitezei de migrare. Această nomenclatură este uneori
neadecvată din cauza tendinţei de a perpetua mitul
prezenţei unor talere în coloana cromatografică, la nivelul
cărora se realizează echilibrul între faze.
 De fapt, starea de echilibru, nu se realizează
niciodată deoarece faza mobilă este într-o
permanentă şi constantă mişcare.
Numărul de talere reprezinta una dintre cele mai importante
caracteristici ale unui sistem cromatografic, exprimând
eficienta de separare a coloanei. Tebuie însa menționat
ca nu exista un singur asemenea numar care să
caracterizeze o anumita coloana ci el va avea o valoare
diferita pentru fiecare compus separat, chiar daca aceste
valori nu sunt mult diferite. Numarul de talere teoretice
se defineste prin raportul dintre lungimea coloanei si
înaltimea echivalenta a unui taler teoretic
 DEFINIŢIA ÎNĂLȚIMII
TALERULUI
După cum se cunoaşte, lăţimea curbei Gaussiene este într-o
relaţie directă cu varianţa 2, sau cu deviaţia standard , a unei
măsurători. Cum benzile cromatografice sunt în general
considerate a avea astfel de formă, este convenabil să definim
eficienţa unei coloane în termen de varianţă pe unitate de
lungime a coloanei. Astfel, înălţimea talerului, H, este dată de
relaţia:
 DEFINIŢIA ÎNĂLŢIMII TALERULUI

Definiţia talerului teoretic. H =  2/ L

 EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N
Varianţa peak-
ului de solut
poate fi obţinută
printr-un
procedeu grafic
simplu, şi are ca
unitate de
măsură secunde
la pătrat, fiind în
mod uzual
notată cu 2,
pentru a o
distinge de 2,
care are ca
unitate de
măsură
centimetrii Determinarea deviaţiei standard 2 din peak-ul cromatografic:
pătraţi. W = 4 (= deviaţia standard a timpului).
 Această definiţie a înălţimii talerului este ilustrată în figura de mai jos. După
cum se observă, coloana este împachetată pe o distanţă de L centimetrii, în
lungime (panelul a).

Reprezentarea
grafică a definiţiei
talerului teoretic.
H =  2/ L

În partea superioară a figurii (panelul b) este reprezentată schematic, distribuţia

moleculelor de-a lungul colanei cromatografice împachetate, în momentul în care
analitul părăseşte coloana (acesta este din punct de vedere al timpului, timpul de
retenţie, tR). Modelul curbei este Gaussian, iar localizările parametrilor L-l şi L + l
sunt indicate prin linie punctată verticală.
  Înălţimea talerului poate fi
 De notat faptul că L este dat
în centimetrii, iar varianţa, 2, este
explicitată în centimetrii pătraţi;
 H reprezintă o distanţă
lineară, exprimată în centimetrii
(ecuaţia din slide-ul anterior).
gândită ca o porţiune de
coloană, situată la capătul
terminal care conţine fracţia de
analit situată între L-1 şi L.
Cum aria, în domeniul normal
de eroare a curbei este limitată
de ±, fiind de aproximativ
68% din aria totală, înălţimea
talerului prin definiţie conţine
aproximativ 32% din analit.
 Evaluarea experimentală a lui H şi N

Figura alăturată
reprezintă o cromatogramă
obișnuită în funcţie de timp.
Varianţa peak-ului de solut poate
fi obţinută printr-un procedeu
grafic simplu, şi are ca unitate de
măsură secunde la pătrat, fiind în
mod uzual notată cu 2, pentru a
o distinge de 2, care are ca
unitate de măsură centimetrii
pătraţi. Cele două deviaţii unde L/tR reprezintă viteza lineară medie a
standard,  şi  sunt legate prin solutului, exprimată în centimetrii pe
relaţia: secundă
Determinarea deviaţiei standard, ,
din peak-ul cromatografic: W = 4.

N = L/H (1.12)
 Figura ilustrează modul simplu de
aproximare al lui  şi  dintr-o
cromatogramă obţinută experimental.
Tangentele punctelor de inflexiune de pe
cele două părţi ale peak-ului
cromatografic sunt prelungite până la
intersectarea lor şi se formează astfel un
triunghi cu baza pe axa timpului a
cromatogramei. Aria acestui triunghi
reprezintă aproximativ 96% din aria
totală a peak-ului.
În evaluarea statistică, se consideră că aproximativ
96% din aria peak-ului Gaussian este inclusă în interiorul
suprafeţei cu o aproximaţie de plus sau minus două deviaţii
standard (±2) din valoarea sa maximă. Astfel, intercepţiile
arătate în figură se manifestă la aproximativ ±2 din
maximum, iar W = 4, unde W este mărimea bazei
triunghiului. Substituind această relaţie în ecuaţia 1.14 şi
rearanjând termenii, rezultă:

Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie

standard () în ecuaţia înălţimii talerului
(ecuaţia 1.13 ) conduce la:
 formula de calcul al numărului
de talere teoretice, N:
Prin substituţia formulei 1.16 în formula 1.12 urmată de rearanjarea termenilor,
se obţine formula de calcul al numărului de talere teoretice, N:

N = L/H (1.12)

În continuare, N
poate fi calculat din
măsurarea, la două
momente de timp, tR şi W;
iar pentru a obţine H,
lungimea coloanei
împachetate trebuie să fie
de asemenea cunoscută.
 O altă metodă de aproximare a lui N, şi care este
considerată de către unii practicieni mai sigură, necesită
determinarea a W1/2 (jumătate din lăţimea bazei peak-ului),
Iar numărul de talere este dat de formula:

Numărul de talere şi înălţimea talerului sunt general

utilizate în literatură şi în caracterizarea unor coloane
produse de către firmele de specialitate, ca măsură a
performanţei acestora. Din cauza faptului că aceşti
parametrii sunt semnificativi în compararea a două coloane,
este esenţial ca ei să fie determinaţi pentru acelaşi compus.
 VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZĂ ÎMPRĂŞTIEREA ZONEI
CROMATOGRAFICE

împrăştierea zonei cromatografice este consecinţa unei rate finite de procese de

transfer de masă care se produc în timpul migrării solutului, de-a lungul unei
coloane cromatografice. O parte dintre aceste viteze sunt controlabile, prin
ajustarea unor variabile experimentale, care permit astfel creşterea calităţii
separării.

Tabelul prezintă parametrii cei mai importanţi care concură la rezoluţia cromatografică.
 EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI
MOBILE

Magnitudinea efectelor cinetice

asupra eficienţei coloanei depinde în
mod clar de lungimea timpului în care
faza mobilă este în contact cu faza
staţionară, care, la rândul ei, este
depinde de viteza de curgere a fazei
mobile. Din această cauză, studiile
referitoare la eficienţa unor coloane
sunt în general axate pe
determinarea lui H ca funcţie de
viteza fazei mobile, u. Aceste date
sunt exemplificate de cele două
curbe din figura alăturată, una
caracterizând cromatografia de
lichide, în timp ce a doua este
reprezentativă cromatografiei de
gaze.
 Ambele curbe prezintă un
minim al înălţimii talerului
teoretic, H (ceea ce semnifică o
eficienţă maximă) la viteze mici
de curgere. Această valoare
minimă din cromatografia lichidă
se manifestă în general la viteze
de curgere care sunt
asemănătoare celei de
cromatografie de gaze şi Efectul vitezei de curgere a fazei
deseori sunt atât de mici încât mobile asupra înălţimii talerului
teoretic în cazul
nu sunt sesizabile în condiţiile (a) cromatografiei de lichide şi (b)
normale de operare. gaz cromatografiei.
 Teoria vitezei de împrăştiere a zonei cromatografice descrie cu acurateţe şi
predicţionează forma diagramei H în funcţie de u, grafic denumit adesea diagrama van
Deemter după numele descoperitorului ei. După cum se observă în figura alăturată,
vitezele de curgere pentru cromatografia lichidă sunt semnificativ mai mici decât cele
utilizate în cazul celei gazoase.
Din această cauză, separările în gaz cromatografie sunt mai rapide decât cele de
cromatografie lichidă. Mai mult, după cum arată figura, înălţimea talerului teoretic a unei
coloane de cromatografie lichidă are un alt ordin de magnitudine fiind mult mai mică faţă de
cel întâlnit în cazul coloanelor utilizate în cromatografia de gaze. Din această cauză, nu
este practic a se utiliza coloane de cromatografie lichidă care sunt mai lungi de 25-50 cm
(datorată presiunii picăturilor), în timp ce coloanele de gaz cromatografie pot fi de 50 de
metrii sau mai lungi.
• În consecinţă, numărul total de talere şi
astfel eficienţa totală a coloanei sunt în
general superioare în cazul coloanelor de
gaz cromatografie. În acest fel, o primă
comparaţie între gaz cromatografie şi cea
lichidă arată că prima metodă este
capabilă de separări mai rapide şi de mai
mare eficienţă.
 Analit, analiți
Cromatografie cromatogramă
Solut, soluți
Migrare a descriere generică a mişcării moleculelor

Cromatografie pe coloană Peak, peak-uri

Cromatografie planară Împachetarea coloanei, procesul de..

faza mobilă (solvent) - se mişcă

Pat de gel
faza staţionară
Eluţie - trecerea analiților prin coloană, la adăugarea continuă de solvent
FENOMENUL DE DILUŢIE A ANALITULUI TIMPUL DE RETENŢIE
TIMP MORT
Constanta de echilibru, K, constantă de distribuţie, raport de partiţie,
coeficient de partiţie

FACTOR DE RETENŢIE FACTOR DE SELECTIVITATE

taler teoretic numărul de talere teoretice

 RELAŢIA DINTRE ÎNĂLŢIMEA TALERULUI ŞI VARIABILELE
COLOANEI

• În cursul ultimilor ani, au fost elaborate nenumărate

studii teoretice şi experimentale având ca scop
dezvoltarea relaţiilor cantitative care descriu efectul
variabilelor prezentate în tabel, asupra înălţimii talerului
pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel elaborate o
serie de expresii matematice referitoare la relaţia dintre
înălţimea talerului şi parametrii variabili ai coloanei care,
aplicate practic, au avut grade diferite de succes.
Aparent nici una dintre ele nu a rezolvat în totalitate şi nu
au putut să explice interacţiile fizice complexe care
conduc la lăţirea zonei cromatografice. O serie dintre
aceste teorii, cu toată imperfecţiunile lor au fost des
utilizate şi au condus la creşterea performanţei
coloanelor cromatografice.
 O astfel aproximare matematică a comportamentului coloanelor
cromatografice este ecuaţia van Deemter, care poate fi scrisă în
forma:

H = A + B/u + Cu = A + B/u + (CS + CM)u (1. 19)

unde:

H este înălţimea talerului dată în centimetrii,

u este viteza lineară a fazei mobile dată în centimetrii pe
secundă, în timp ce
A, B, şi C sunt coeficienţi referitori la fenomenele de
curgere pe multiple căi,
difuzie longitudinală şi
transfer de masă între faze.
 – După cum se observă în ecuaţia 1.19, coeficientul C
poate fi desfăcut în doi coeficienţi: unul (CS), în
relaţie cu faza staţionară, iar celălalt, (CM), relativ la
faza mobilă.
• Studii teoretice au arătat că ecuaţia van Deemter este
destul de exactă în explicarea eficienţei coloanei
cromatografice.
• Ecuaţia van Deemter conţine termeni direct şi invers
proporţionali precum şi termeni independenţi faţă de
viteza fazei mobile.
 TERMENUL (A)

Împrăştierea zonei se manifestă în

parte datorită multitudinii de căi de
curgere pe care moleculele (sau ionii) le
pot găsi şi urma prin coloana împachetată.
După cum se observă în figura alăturată,
lungimea acestor căi pot diferi
semnificativ, astfel, timpul de rezidenţă în
coloană pentru moleculele aceleaşi specii
este de asemenea variabil. Moleculele de
solut pot astfel atinge capătul colanei într-
un interval de timp care conduce la
împrăştierea zonei. Acest efect, denumit
în acelaşi timp difuzie în vârtej este direct
proporţional cu diametrul particulelor cu
care se împachetează coloana
cromatografică şi este prezentat în Modalitatea de eluţie a două molecule printr-o
coloana a treia din tabelul de mai sus. coloană cromatografică. Se poate nota că distanţa
parcursă de molecula 2 este mai mare decât cea
parcursă de către molecula 1. Astfel, molecula 2 va
ajunge la punctul B mai târziu decât molecula 1.
 Împrăştierea prin curgere pe canale multiple poate fi parţial
compensată de difuziunea ordinară, care rezultă în condiţiile în care
moleculele sunt transferate printr-un curent ce urmează o cale sau alta.
Dacă viteza de curgere este foarte mică, un număr mare de asemenea
transferuri se realizează iar fiecare moleculă în mişcarea sa în josul
coloanei urmează o altă cale de curgere, pierzând timpi diferiţi pe fiecare
direcţie de curgere.
Drept consecinţă, viteza cu care fiecare dintre molecule se mişcă în
josul coloanei tinde să se apropie de medie. Se poate spune că, la viteze
mici ale fazei mobile, moleculele nu sunt semnificativ dispersate prin
natura căilor multiple a împachetării.

La viteze moderate sau mari, nu este timp

suficient pentru ca difuzia medie să se realizeze iar
împrăştierea zonei se manifestă datorită lungimilor
diferite ale căilor de curgere.
 TERMENUL DE DIFUZIE LONGITUDINALĂ (B/u)
Difuzia longitudinală în cromatografia pe coloană este
un proces de împrăştiere a benzii în care soluţii difuzează
dintr-un centru de concentrare spre zone mai diluate, în
faţa şi în spatele zonei cromatografice, unde se manifestă
în sensul şi în contra direcţiei de curgere a fazei mobile.
După cum se observă în a doua ecuaţie din tabelul 1.3,
termenul de difuzie longitudinală este direct proporţional
cu coeficientul fazei mobile DM, constantă egală cu viteza
de migrare sub un gradient egal cu o unitate. Constanta 
este denumită factor obstructiv fiind în relaţie cu
împiedicarea difuziei longitudinale de către modul de
împachetare al coloanei. Astfel, în cazul coloanelor
împachetate valoarea aceste constante este de aproximativ
0,6 în timp ce pentru coloane neîmpachetate valoarea sa
este egală cu unitatea.
Contribuţia difuziei longitudinale
este invers proporţională cu viteza
fazei mobile.
Această relaţie nu este surprinzătoare dacă
avem în vedere că analitul este în coloană pentru
o perioadă mai mică la viteze de curgere înalte. În
cazul unor viteze mari de curgere, difuzia de la
centru bandei spre margini se manifestă mai redus
cu cât timpul de staţionare este mai mic. Pantele
negative la viteze de curgere scăzute prezentate în
cele două grafice din figura alăturată şi sunt
consecinţe ale difuziei longitudinale. Se poate
nota că efectul este mai puţin pronunţat în
cromatografia de lichide din cauza faptului că
aceşti coeficienţi de difuzie în lichide au ordine de
magnitudine mai mici decât cei găsiţi în cazul
gazelor. De fapt, pentru cele mai multe lichide,
factorul B/u se apropie de zero în relaţie cu ceilalţi
termeni din ecuaţia 1.19. Astfel, minimul arătat în
figura alăturată nu este uneori observat.
 COEFICIENŢII DE TRANSFER DE MASĂ (CS şi CM)

Necesitatea celor doi coeficienţi de transfer de masă CS şi CM din ecuaţia

1.19 apare datorită faptului că echilibrul dintre fazele mobilă şi staţionară se
stabileşte deosebit de lent în coloana cromatografică deoarece ea operează
întotdeauna în condiţii de neechilibru. În consecinţă, moleculele de analit aflate în
partea frontală a benzii cromatografice sunt preluate în faţă, înainte de a avea
timp pentru a se echilibra în faza staţionară şi astfel să fie reţinute de această
fază. În mod similar echilibrul nu se stabileşte la marginea situată la trena benzii
iar moleculele de analit sunt părăsite îndărătul fazei staţionare, datorită mişcării
rapide a fazei mobile.
 Împrăştierea benzii din cauza efectelor de transfer de
masa se manifestă din cauza faptului că o multitudine de
curenţi de curgere ai fazei mobile din coloană şi stratul
care înconjoară faza staţionară au dimensiuni finite. În
consecinţă, este necesar un timp pentru ca moleculele
de solut aflate la interfaţă să difuzeze dintr-o fază în
interiorul celelalte faze. Acest timp „de lag” rezultă din
persistenţa condiţiilor de neechilibru de-a lungul coloanei
cromatografice. De altfel, dacă vitezele de transfer de
masă dintre cele două faze ar fi infinite, fenomenul de
împrăştiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta.
 Se poate nota că
 extensia benzii cromatografice produsă atât de
împrăştierea longitudinală cât şi de transferul de masă
depinde de viteza de difuzie a moleculelor de analit în
timp ce
 direcţia difuziei în cele două cazuri este diferită.
 Împrăştierea longitudinală apare din tendinţa
moleculelor de a se îndrepta într-o direcţie paralelă
curgerii, în timp ce împrăştierea datorată transferului de
masă se manifestă din tendinţa moleculelor de a difuza
într-un plan perpendicular cu direcţia de curgere.
 Drept consecinţă, gradul de împrăştiere longitudinală
este în relaţie inversă cu viteza de curgere.
Pentru împrăştierea datorată
transferului de masă, din contră,
cu cât faza mobilă se mişcă mai
repede, cu atât timpul necesar
ajungerii la echilibru este mai
redus. Astfel, după cum arată
ultimii doi termeni ai ecuaţiei
1.19, efectul transferului de
masă asupra înălţimii talerului
este direct proporţional cu
viteza lineară, u, de mişcare a
fazei mobile.
 •TERMENUL DE TRANSFER DE MASĂ ÎN FAZA STAŢIONARĂ (CSU).

Ecuaţia a treia din tabelul 1.3, arată că în condiţiile în care faza staţionară este un lichid imobilizat,
coeficientul de transfer de masă este proporţional cu o funcţie complexă, fs(k') a factorului de retenţie k', este
direct proporţională cu pătratul grosimii filmului de pe particulele suport df şi este invers proporţională cu
coeficientul de difuzie, DS a solutului în film.
Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin
imaginarea modului prin care aceşti factori
influenţează frecvenţa medie prin care
moleculele de analit care ajung la interfaţă
sunt transferate în faza mobilă. De
exemplu, în funcţie de grosimea filmelor,
moleculele trebuie să traverseze în medie
o distanţă mai mare sau mai mică pentru a
atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de
difuzie mai mici, ele vor traversa mai încet.
Consecinţa ambilor factori este o viteză
scăzută de transfer de masă şi o creştere a
înălţimii talerului.
 Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin
imaginarea modului prin care aceşti factori
influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de
analit care ajung la interfaţă sunt transferate în faza
mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea filmelor,
moleculele trebuie să traverseze în medie o distanţă
mai mare sau mai mică pentru a atinge suprafaţa; în
cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor traversa
mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză
scăzută de transfer de masă şi o creştere a
înălţimii talerului.
 Termenul de transfer de masă în faza mobilă (CMu).

După cum arată ecuaţia a patra din tabelul 1.3, coeficientul de

transfer din faza mobilă CM este o funcţie complexă, f(k') a factorilor
de retenţie k', fiind proporţional cu pătratul diametrului particulelor din
coloana împachetată dp şi invers proporţional cu coeficientul de
difuzie din faza mobilă, DM.
 EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAŢIEI
VAN DEEMTER

În figura alăturată este înfăţişat modul de

reprezentare a ecuaţiei van Deemter în cazul unui
set de date experimentale. În acest experiment,
analitul eluat a fost reprezentat de acetatul de
benzil aflat într-o soluţie de hexan, care conţine
acetat de etil. Punctele situate pe curba de
deasupra reprezintă valorile experimentale în timp
ce curba cu linie continuă este reprezentarea
grafică a ecuaţiei van Deemter.
Diagrama van Deemter pentru o coloană de
cromatografie lichidă, împachetată. Punctele de pe
curba superioară sunt date experimentale.
Contribuţiile diverşilor termeni de viteze sunt arătaţi
pe curbele situate mai jos:
 A, efectul datorat căilor multicanal de curgere;
 B/u, difuzia longitudinală;
 Cu, transferul de masă dintre cele două faze.

Curbele de sub această reprezentare arată contribuţia

efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinală şi
efectele combinate ale transferului de masă.
 METODE DE REDUCERE A ÎMPRĂŞTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE
Diametrul particulelor care compun coloana şi
diametrul coloanei reprezintă două variabile
importante controlabile care afectează eficienţa
unei coloane cromatografice. EFECTUL
DIAMETRULUI PARTICULELOR este demonstrat
prin datele experimentale prezentate în figura
alăturată în timp ce pentru a beneficia de avantajul
datorat diametrului coloanei, în ultimii ani au fost
introduse în practica cromatografică coloane din ce
în ce mai înguste.
În condiţiile în care faza mobilă este gazoasă,
viteza de difuziune laterală poate fi redusă
apreciabil prin scăderea temperaturii şi astfel a
coeficientului de difuzie DM. În consecinţă,
scăderea înălţimii talerului este dependentă de
temperaturi joase.
Acest efect este în general nesemnificativ în
cazul cromatografiei lichide din cauza faptului că La fazele staţionare lichide,
difuzia este lentă, astfel că termenul de difuzie grosimea stratului de lichid adsorbit poate
longitudinală are un efect mic asupra înălţimii fi minimalizată deoarece CS din ecuaţia
talerului. 1.19 este proporţional cu pătratul acestei
variabile, df (ecuaţia a treia din tabelul
1.3).
 OPTIMIZAREA PERFORMANŢELOR COLOANEI CROMATOGRAFICE

O coloană cromatografică este optimizată prin variaţia experimentală

a condiţiilor, până când componentele amestecului sunt separate în
mod clar, într-un timp minim.
Optimizarea experimentelor are ca scop
(1) reducerea împrăştierii zonei cromatografice ori
(2) alterarea vitezelor de migrare ale componentelor din amestecul
de separat.
După cum s-a arătat, împrăştierea zonei este crescută prin aceleaşi
variabile cinetice care conduc la creşterea înălţimii talerelor coloanei
cromatografice. Pe de altă parte, vitezele de migrare, pot fi modificate prin
schimbarea acelor variabile care afectează factorii de retenţie şi selectivitate
ai soluţilor.
 1. REZOLUŢIA COLOANEI

Rezoluţia, RS a unei coloane

cromatografice conduce la
măsurarea cantitativă a abilităţii
sale în separarea a doi analiţi.
Semnificaţia acestui termen este
ilustrat în figura alăturată, care
prezintă cromatogramele a două
specii moleculare, A şi B, pe trei
coloane ce posedă rezoluţii
diferite. Rezoluţia unei coloane
este definită ca:
o rezoluţie de 1,5 conduce la o
separare practic completă a
celor două componente, în timp
ce o rezoluţie de 0,75 nu. La o
rezoluţie de 1, zona A conţine
aproximativ 4% din specia B,
iar zona B conţine o cantitate
similară din solutul A. La o
rezoluţie de 1,5, suprapunerea
este de aproximativ 0,3%.

Rezoluţia pentru o fază

staţionară dată poate fi crescută
prin lungirea coloanei, astfel
crescând numărul de talere.
Consecinţa nefavorabilă la
adăugarea de talere o
reprezintă creşterea timpului
necesar separării
cromatografice.
 Efectul factorilor de retenţie şi selectivitate asupra rezoluţiei cromatografice

Este foarte util a se dezvolta o relaţie matematică între rezoluţia unei coloane şi
factorii de retenţie, k’A şi k’B, a factorului de selectivitate , şi numărul de talere, N,
care alcătuiesc o coloană cromatografică în cazul a doi soluţi.
Considerând că cei doi soluţi, A şi B au timpi de retenţie apropiaţi unul de celălalt,
se poate aproxima că:
WA = WB  W

ecuaţia 1.20 poate fi

scrisă sub forma:

Ecuaţia 1.17 permite

exprimarea lui W în termeni de
(tR)B şi N, care pot astfel
substituiţi în ecuaţia anterioară,
rezultând:
 Substituind ecuaţia 1.8 şi rearanjând-o, se obţine exprimarea lui RS în termeni de factori de
retenţie pentru A şi B, după cum urmează:

În continuare prin eliminarea k’A din această ecuaţie prin

substituţia ecuaţiei 1.10, rezultă:

Adesea este necesar a se calcula numărul de talere teoretice necesare pentru a

atinge o rezoluţie dorită. O exprimare a acestei cantităţi este obţinută prin
rearanjarea ecuaţiei 1.21 ceea ce conduce la:
 Formele simplificate ale ecuaţiilor 1.21 şi 1.22 sunt uneori întâlnite în
condiţiile în care acestea se aplică unor perechi de soluţi ale căror constante
de distribuţie sunt aproape similare

unde k' reprezintă media dintre k’A şi k’B.

 Efectul rezoluţiei asupra timpului de retenţie
Înainte de a considera în detaliu semnificaţia ecuaţiilor derivate mai sus, este util să
se dezvolte o ecuaţie care să prezinte caracteristicile de performanţă a unei coloane,
adică timpul necesar pentru o completă separare a solutului A de solutul B.
În mod clar, ceea ce este dorit în cromatografie este o rezoluţie posibilă înaltă în cel
mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste două proprietăţi nu pot fi maximalizate în
aceleaşi condiţii, motiv pentru care totdeauna trebuie găsit un compromis.
Timpul pentru desăvârşirea separării este determinat de viteza vB
a solutului care se mişcă mai lent este dată de ecuaţia 2.
Aceasta este:

Combinând această expresie cu ecuaţiile

1.6 şi 1.12, rezultă, după rearanjare: N = L/H (1.12)

unde (tR)B este timpul necesar pentru a aduce peak-

ul B la capătul coloanei în condiţiile în care viteza
fazei mobile este u.
În cazul în care ecuaţia de mai sus este
combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii,
rezultă:
Variabilele care afectează performanţele unei coloane cromatografice

Ecuaţiile alăturate sunt

semnificative deoarece servesc drept
ghid în alegerea condiţiilor care sunt
potrivite pentru a fi urmate de
utilizatorul cromatografiei pentru a
atinge într-un timp determinat scopul
propus cu rezultate clare.

În cercetarea condiţiilor optime pentru o separare dorită trebuie

avut în vedere că parametrii fundamentali, , k' şi N (sau H) pot fi
ajustaţi mai mult sau mai puţin independent. Astfel, parametrii  şi
k' pot fi variaţi mai simplu prin varierea temperaturii sau a
compoziţiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de împachetare a
coloanei reprezintă o modalitate mai puţin convenabilă.
Este posibil a se modifica N prin schimbarea lungimii coloanei
ori
de a modifica H prin:
 modificarea vitezei de curgere a fazei mobile,
 a mărimii dimensiunilor particulelor de împachetare,
 a vâscozităţii fazei mobile (prin modificarea DM sau DS), şi
 a grosimii filmului de lichid adsorbit conţinut în faza staţionară.
 Variaţia în numărul de talere, N

O cale evidentă de creştere a rezoluţiei o reprezintă

creşterea numărului de talere din coloană (ecuaţia 1.21).

Totuși urmând această cale, metoda este

mai puţin economică din punct de vedere
al timpului necesar pentru a finaliza
separarea în afara cazului în care
creşterea în N este realizată mai degrabă
prin reducerea în H decât prin lungirea
coloanei.
 Variaţia în înălţimea talerului, H

O îmbunătăţire semnificativă a rezoluţiei poate fi realizată

fără nici un cost de timp suplimentar dacă înălţimea talerului
se reduce.
Se poate nota că scăderea mărimii particulelor de
împachetare a coloanei conduce la o îmbunătăţire
marcantă a lui H.
Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil,
reducerea înălţimii talerului poate fi de asemenea realizată
prin reducerea vâscozităţii solventului, mărindu-se astfel
coeficientul fazei mobile.
 Variaţia în factorul de retenţie
Adesea, o separare poate fi îmbunătăţită semnificativ prin manipularea
factorului de retenţie, k’B. Creşterea lui k’B creşte în general rezoluţia
(crescând însă timpul de eluţie). Pentru a determina domeniul optim al
valorilor pentru k’B, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și
în forma:

unde Q şi Q' conţin restul de termeni

ai celor două ecuaţii.
Figura alăturată este o
reprezentare grafică RS/Q ori
(tR)B/Q' în funcţie de k’B,
considerând că Q şi Q' rămân
aproximativ constante. Se
vede clar că valorile lui k’B
mai mari de 10 nu trebuie
alese deoarece ele conduc la
o mică creştere în rezoluţie
dar cu o creştere marcantă a
timpului necesar separării.
Valoarea minimă a timpului
de eluţie se manifestă la o
valoare a k’B de aproximativ
2. Astfel, în multe cazuri,
valoarea optimă a k’B se
stabileşte luând în calcul atât
rezoluţia cât şi timpul necesar
separării, adică într-un Efectul factorului de retenție k’B asupra rezoluţiei
domeniu cuprins între 1 până RS şi a timpului de eluţie (tR)B. Se consideră că Q
la 5. şi Q’ rămân constante la variaţia factorului k’B.
 În mod uzual, cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei de separare o
reprezintă optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut
prin creşterea temperaturii.
Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziţiei solventului permite
deseori manipularea lui k' obţinându-se astfel separări superioare. Efectele
dramatice produse prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul
prezentat în figura de mai jos.

Efectul variaţiei solventului asupra separării

cromatografice. Analiţi: (1) 9,10-antraquinonă;
(2) 2-metil-9,10-antraquinonă; (3) 2-etil-9,10-
antraquinonă; (4) 1,4-dimetil-9,10-
antraquinonă; (5) 2-t-butil-9,10-antraquinonă.

Se observă că o mică modificare a

rapoartelor metanol/apă conduce de la
separări cromatografice nesatisfăcătoare
(a şi b) la separări unde fiecare peak al
oricărui component este bine separat (c şi
d). În multe scopuri, Cromatograma
arătată în (c) pare a fi cea mai bună după
cum arată raportul dintre rezoluţia
adecvată în intervalul de timp.
 Variaţia în factorul de selectivitate

În condiţiile în care  atinge unitatea, optimizarea lui k' şi creşterea lui N nu

sunt suficiente pentru a produce o separare satisfăcătoare a doi soluţi, într-un timp
rezonabil. Sub aceste circumstanţe, trebuie identificată o posibilitate de
creştere a factorului de selectivitate , cu menţinerea factorului de retenție
(k‘) într-un domeniu optim de 1-10. În acest context sunt posibile o serie de
opţiuni de lucru. Astfel, scăderea oportunităţii în perspectiva şi avantajul
(comodităţii) aceste opţiuni includ:
(1) schimbarea compoziţiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului;
(2) schimbarea temperaturii coloanei;
(3) schimbarea compoziţiei fazei staţionare;
(4) utilizarea unor efecte specifice, chimice.
Un exemplu de utilizare a opţiunii (1) a fost raportat în cazul separării
anisolului (C6H5OCH3), de benzen. Cu o fază mobilă conţinând un amestec
metanol:apă 50%, k' pentru cei doi soluţi a fost raportată de 4,5 şi respectiv 4,7, în
timp ce  a fost egal cu numai 1,04. Modificarea fazei apoase cu una care a
conţinut 37% tetrahidrofuran a condus la k' de 3,9 şi 4,7 şi la o valoare  de 1,20.
Dacă suprapunerea celor două peak-uri a fost semnificativă în primul caz, în cel
de al doilea caz suprapunerea a fost neglijabilă.
 Pentru separări care implică acizi sau baze ionizabile,
modificarea pH-ului fazei mobile conduce deseori la
manipularea valorilor  fără a schimbare majoră în k'
ceea ce conduce la separări mai eficiente.
 O metodă mai puţin convenabilă dar deseori
foarte eficientă în creşterea  simultan cu o
menţinere aproape constantă a valorilor lui k' în
domeniul optim este cea de alterare a compoziţiei
chimice a fazei staţionare. Astfel, cele mai multe
laboratoare care realizează separări cromatografice
frecvente posedă mai multe coloane care pot fi
interschimbate cu un minim de efort.
 O creştere a temperaturii generează deseori o creştere
în k' dar această operaţiune are un efect mic asupra
valorilor lui  în cazul cromatografiei lichid-lichid ori
cromatografiei lichid-solid.
 Mai mult, în cazul cromatografiei de schimb ionic,
efectul temperaturii poate fi suficient în cazul explorării
acestei opţiuni, înainte de schimbarea împachetării
coloanei.
 O altă metodă de creştere a rezoluţiei este încorporarea
în faza staţionară a unor specii care complexează sau
interacţionează cu unul sau mai mulţi componenţi aflaţi în
proba de separat. Un exemplu de utilizare a acestei opţiuni
o reprezintă impregnarea cu săruri de argint a suportului
adsorbent care conduce la o îmbunătăţire a separării
olefinelor ca o consecinţă a formării unor complexe între
ionii de argint şi compuşii organici nesaturaţi.
TRENA CROMATOGRAFICĂ

Formarea trenelor cromatografice reprezintă o

problemă reală şi inevitabilă la majoritatea
separărilor în cromatografia lichidă. Cercetătorii
din domeniu au depus eforturi în dezvoltarea unor
noi materiale (suporturi cromatografice) şi deşi
acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut
elimina acest fenomen. Procesul de formare a
trenei cromatografice poate cauza atât probleme
cantitative cât şi calitative în procedurile de
cromatografie lichidă, fiind importantă o
monitorizare a formării lor astfel încât să nu se
compromită rezultatul analizei.
Analizând în detaliu o cromatogramă se poate
observa că aproape toate peak-urile
cromatografice au o oarecare trenă mai mult sau
mai puţin lungă. Deşi multe dintre coloanele de
cromatografie lichidă actuale sunt mai puţin
problematice decât predecesoarele lor, totuşi
aceasta problemă nu a fost încă eliminată.
 Se consideră că un peak are trena sau ca este asimetric atunci când forma
sa deviază de la cea ideala, Gaussiană. A doua jumătate eluată a peak-ului
este mai largă decât prima, iar lăţimea sa tinde sa se expandeze spre baza.
Deşi pot apărea cozi ale peak-urilor si in jumătatea frontala a acestora, acestea
sunt totuşi rare in comparaţie cu trenele. Deoarece trenele peak-urilor pot
influenta calitatea separării este bine ca panta trenei sa fie cuantificata. Exista
doua mecanisme de măsurare universale a peak-urilor. Lucrătorii din industria
farmaceutica folosesc factorul de trenare, USP Tf (Unided State Pharmacopeea
Tail factor), conform formulei 1.26.

unde a si b reprezintă lăţimea jumătăţii frontale si

respectiv jumătăţii posterioare măsurate la 5% din
înălţimea peak-ului (figura alăturată).
Majoritatea celorlalţi practicieni folosesc factorul
de asimetrie (As).
unde “a” si “b” sunt măsurate la 10% din înălţimea peak-ului cromatografic din figura
alăturată.
 Pentru valori mai mici de 2, As şi USP Tf sunt aproximativ aceleaşi, precum se poate
observa şi in tabelul de mai jos. ce reprezintă măsurătorile factorului de asimetrie şi ale
factorului de trenare USP pentru acelaşi peak, în cazul figurii de mai jos.

Măsurătorile factorului de asimetrie (As)

şi ale factorului de trenare USP (Tf) pentru
acelaşi peak.

Valoarea măsurată
Peak-ul din figura alăturată
As Tf

1,0 1,0 1,0

1,2 1,3 1,2

1,5 1,7 1,4

2,0 2,5 1,9

3,0 3,8 2,9 Exemple de peak-uri asimetrice şi

4,0 5,5 3,5 factorul de asimetrie calculat pentru
fiecare.
În condiţiile în care coloana cromatografică este nouă,
majoritatea producătorilor prezintă criterii de trenare (factorul As)
cuprinse între valorile 0,9 (puţin frontal) şi 1,2 (puţin trenat).
Majoritatea utilizatorilor care folosesc probe reale încearcă să obţină un
factor de asimetrie, nu mai mare de 1,5- 2. În general, când As este mai
mare decât 2, există probleme de separare, şi se cercetează cauza
acestora.
 Figura alăturată ne furnizează o serie de
indicii asupra potenţialelor probleme create de
trena peak-urilor, prin comparaţia unui peak ce are
As = 1 cu un altul ce posedă As = 4. Astfel,
comparând aria peak-urilor, se observă o diferenţă
elocventă; deşi ea este aceeaşi înălţimea peak-ului
cu As = 4 este de trei ori mai mică comparativ cu
înălţimea primului peak. În condiţiile analizelor de
urme, înălţimea peak-ului devine un factor critic în
determinarea limitei minime de cuantificare, iar
trenarea peak-ului conduce la rezultate clar
inferioare.
Formarea trenelor este de asemenea
problematică în cazul in care peak-urile minore se
ascund în cele majore. Acest fenomen este nedorit
în condiţiile analizei unor metaboliţi ori în
identificarea unor impurităţi.
 Modelele de cromatografe lichide folosite pentru analizele de
rutină, trebuie de obicei să asigure o bună rezoluţie a liniei de
bază a tuturor peak-urilor iar timpul de rulare să fie cât mai mic
posibil. Figura de mai jos arată că rezoluţia liniei de baza a
peak-urilor cu trenă necesită un timp mai lung de rulare
comparativ cu peak-urile ce nu au trenă sau care au o trenă
scurtă. Aşadar, peak-urile cu trenă nu doar reduc calitatea
cromatogramei, dar ele reduc de asemenea abilitatea de a
cuantifica componente prezente în probă.
 Cauzele apariţiei trenei cromatografice se datorează
mai ales faptului existenţei mai multor mecanisme de
separare, unul dintre acestea fiind supra-implicat. O serie
dintre practicieni au tendinţa de a considera separările în
fază inversă, pe coloane C18, de exemplu drept
procese pure de retenţie hidrofobă. Această
consideraţie poate fi adevărată dacă faza staţionară ar fi
constituită numai din grupări C18. totuşi, aproximativ
jumătate din suprafaţa de silice este nelegată ceea ce
conduce la permisiunea de expunere a grupărilor silanol
(Si–OH) care pot interacţiona cu proba.
 Particulele de silice care formează suportul
solid sunt realizate din polimer de siliciu şi oxigen.
Ca şi carbonul, siliciul este tetravalent, deci
structura internă a lui cuprinde patru atomi de
oxigen ataşaţi la fiecare atom de siliciu în structura
polimerului tridimensional.
OH OH OH OH
O O O
Si Si Si Si
 La suprafaţă, polimerul se termină cu
grupări de silanol. Figura de mai jos
prezintă diferitele configuraţii posibile ale
grupărilor silanolice.
 Interacţii posibile la suprafaţa suportului de silice

Practicienii descriu în mod curent suprafaţa ca posedând grupări

libere silanolice (a) dar sunt de altfel prezenţi atomi de siliciu cu două
grupări hidroxil în configuraţie geminală (b).
Dacă grupările silanolice sunt poziţionate una, alături de alta, se pot
realiza legături de hidrogen cu o grupare adiacentă (c). Grupările libere de
silanol sunt mai acide decât grupările geminale ori asociate ele
interacţionând mai puternic cu soluţi bazici având ca rezultat formarea unei
trene deseori asociată cu separarea unor soluţi bazici. În alte cazuri, urme
de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel
(d). Ionii metalici pot acţiona ca situsuri schimbătoare de ioni sau, când
grupările silanol libere sunt adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca
silanolul sa fie şi mai acid (e).
 In trecut, coloanele împachetate cu silice tip A conţineau
toate aceste forme de silanol prezentate în figură, totuşi, în
ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obţinere de suporturi
de silice de puritate înaltă (silicea de tip B), ce conţine un
număr redus de grupări silanol libere la suprafaţă şi sunt
lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puţin acide. Astfel
de coloane ce conţin silice de tip B au o tendinţă mult mai
mică de a genera peak-uri cu trenă.
 Reducerea formării trenelor în coloane
de tip A, se realizează de obicei prin
modificarea fazei mobile în sensul
includerii unor componente ce concură la
suprimarea trenei.
 Adăugarea de trietilamină în faza
mobilă reprezintă o metodă curentă în
reducerea formării trenelor cromatografice.
Folosită la o concentraţie de 20mM sau
mai mare în faza mobilă, trietilamina poate
reduce semnificativ trenarea picurilor în
coloane de tip A. În cazul utilizării de silice
de tip B trenarea peak-urilor reprezintă o
problemă mult mai rară.
 În condiţiile utilizării exclusiv de
coloane de tip B, rareori se adaugă
trietilamină la faza mobilă.
 Ca regulă generală, pH-ul scăzut al
fazei mobile (pH < 3) acţionează de
asemenea ca un supresor al ionizării
silanolului, care mai departe conduce la
reducerea formării trenelor cromatografice.
 Problema generală a eluţiei

Figura alăturată ilustrează o

cromatogramă ipotetică a unui amestec de
şase componenţi separaţi teoretic în trei
perechi de componente care au constante de
distribuţie şi factori de retenţie net diferiţi. În
cromatograma (a), condiţiile au fost ajustate
astfel încât factorii de retenţie pentru
componentele 1 şi 2 (k'1 şi k'2 ) sunt în
domeniul optim, de cuprins între 2 şi 5.
Factorii corespunzători ai celorlalte
componente sunt, totuşi, departe de valorile
optime. Astfel, pentru peak-urile 5 şi 6 apar
după un interval de timp extrem de mare fiind
de asemenea difuzate; astfel este dificil de a
le identifica cu certitudine.
După cum se observă în cromatograma (b), schimbarea condiţiilor pentru optimizarea
separării componentelor 5 şi 6, îngrămădesc peak-urile primelor patru componente în zone
cu o rezoluţie nesatisfăcătoare. Totuşi, în acest caz timpul de eluţie este ideal.
În cromatograma (c) este prezentat un al treilea set de condiţii în care valorile lui k'
pentru componentele 3 şi 4 au valori optime. Separarea celorlalte două perechi, din nou, nu
este complet satisfăcătoare.
 Fenomenul ilustrat în figură este întâlnit
aproape permanent, din acest motiv s-a denumit
problema generală a eluţiei. O soluţie comună în
rezolvarea acestei probleme este cea de schimbare a
valorilor ale k' după cum a fost prezentat mai înainte.

Aceste modificări pot fi realizate într-o manieră în trepte ori continuă. Astfel, pentru
amestecul prezentat în figură, condiţiile de la început pot fi cele care conduc la
cromatograma (a). Imediat după eluţia componentelor 1 şi 2, este necesară schimbarea
condiţiilor astfel încât să se ajungă la cele optime pentru separarea compuşilor 3 şi 4 (după
cum se observă în cromatograma c). Odată cu apariţia peak-urilor acestor compuşi, eluţia
poate fi realizată în condiţiile utilizate în cazul cromatogramei (b). Deseori, astfel de
proceduri conduc la rezolvarea satisfăcătoare a peak-urilor tuturor componenţilor din
amestec într-un interval minim de timp.
În cazul cromatografiei lichide, variaţiile în k' sunt produse prin variaţia în compoziţie a
fazei mobile în timpul eluţiei (eluţie în gradient sau programarea solventului).
Pentru gaz cromatografie, creşterea temperaturii (programarea temperaturii) serveşte
la atingerea condiţiilor optime necesare separării.
relaţii de legătură între parametrii de separare cromatografică (1)
relaţii de legătură între parametrii de separare cromatografică (2)
 Analize calitative
O cromatogramă furnizează numai o singură parte de informaţie
cantitativă despre fiecare specie din probă, adică timpul său de retenţie ori
poziţia pe faza staţionară după o anumită perioadă de eluţie. În plus,
datele pot de asemenea să fie derivate din cromatograme proces
implicând faze mobile şi staţionare diferite ori diverse temperaturi de eluţie.
Până acum cantitatea de informaţii oferite de prin cromatografie sunt mici
comparativ cu cea obţinută prin tehnici precum IR, RMN sau spectrometria
de masă. În plus, datele spectrale, lungime de undă sau de frecvenţă pot fi
mult mai înalt specifice care pot reprezenta un omolog al cromatografiei
(tR). Cele mai sus prezentate nu trebuiesc interpretate în sensul că
metodele cromatografice îşi pierd din importanţă în cazul aplicaţiilor
calitative.
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI
Cromatografia a reprezentat şi reprezintă o primă
metodă de separare intim legată de specii moleculare
înrudite chimic, ce poate fi utilizată în identificări
calitative şi determinări cantitative ale speciilor
separate. În continuare vor fi prezentate caracteristicile
generale ale cromatografiei, ca metodă de realizare a
unei analize.
 Cromatografia este o metodă deseori utilizată în
recunoaşterea prezenţei sau absenţei unor componente din
amestecuri care conţin un număr limitat de specii posibile a
căror identitate este cunoscută. De exemplu, 30 sau mai mulţi
aminoacizi dintr-un hidrolizat proteic pot fi detectați cu un mare
grad de certitudine prin metoda cromatografică. Totuşi pentru a
confirma identitatea este necesară o investigaţie chimică sau
spectroscopică a compuşilor izolaţi.
 Se poate nota că totuşi, o identificare pozitivă
spectroscopică a speciei prezente într-un complex de compuşi
nu ar fi posibilă fără o separare cromatografică anterioară.
Astfel, cromatografia este deseori o metodă precursoare în
analizele spectroscopice calitative.
o cromatogramă nu poate conduce la o identificare
pozitivă a speciilor prezente în probe, dar poate da
indicaţii sigure asupra absenţei unei serii de compuşi
din respectivul analit.
Astfel dacă proba nu produce un peak cu un
timp de retenţie asemănător unui standard
analizat în aceleaşi condiţii se poate spune că acel
compus luat în analiză este absent (sau este
prezent la concentraţii sub limita de detecţie a
metodei).
 Analize cantitative
Cromatografia îşi datorează în principal
dezvoltarea de-a lungul timpului, în parte,
 vitezei sale,
 simplicităţii şi
 preţului său relativ scăzut, aplicabilităţii aproape
generalizate ca o metodă de separare.

Nu se poate totuşi afirma că ea va deveni generală

decât în condiţiile în care ar fi utilizată la obţinerea
de informaţii utile cantitative asupra speciilor
separate. Este important totuşi a se discuta despre
o serie de aspecte cantitative care se aplică la toate
tipurile de cromatografie.
 Cromatografia cantitativă pe coloană
se bazează pe
compararea înălţimii sau ariei peak-
ului de analit cu unul sau mai multe
standarde.

În cazul cromatografiei planare, aria

acoperită de speciile separate serveşte
ca şi un parametru analitic iar dacă
condiţiile sunt corect controlate, acest
parametru va varia linear cu concentraţia.
 Analize bazate pe înălţimea peak-ului
Înălţimea peak-ului cromatografic este obţinută
prin măsurarea liniei de bază pe de o parte şi a
perpendicularei peak-ului, coborâtă prin vârf.
Acest tip de măsurare se realizează,într-un timp
rezonabil şi cu o precizie de măsurare bună. Este
important a se nota că, totuşi înălţimile peak-
urilor sunt invers proporţionale cu lăţimile lor.
Astfel, acurateţea rezultatelor obţinute din
măsurarea înălţimii este obţinută numai dacă nu
apar variaţii în condiţiile de eluţie a coloanei, care
să nu altereze lăţimea peak-ului în perioada de
eluţie a probei şi a standardelor.
 Variabilele care trebuiesc urmărite cu
grijă sunt
 temperatura coloanei,
 viteza de curgere a eluentului prin
coloană şi
 viteza de încărcare (injecţie) a probei.
Efectul injecţiei probei este în mod
particular critic în cazul primelor peak-uri
ale cromatogramei. Injecţia neadecvată a
probei conduce la erorile relative de 5%
până la 10%.
 În plus, trebuie avut grijă să se evite a
supraîncărcarea coloanei.
 ANALIZE BAZATE PE ARIA PEAK-ULUI

Ariile peak-urilor sunt independente de efectele de

împrăştiere date de variabilele menţionate mai sus. Din
acest punct de vedere, totuşi, valorile ariilor sunt variabile
analitice mult mai satisfăcătoare comparativ cu înălţimile
peak-urilor. Pe de altă parte, înălţimile peak-urilor sunt mult
mai uşor de măsurat în cazul peak-urilor înguste.
 Majoritatea instrumentelor moderne sunt echipate cu
integratoare electronice digitale care permit estimarea cu
precizie a ariei peak-ului cromatografic. Dacă asemenea
instrumente nu sunt disponibile, se poate apela la metoda
manuală, metodă simplă care permite o bună estimare a
peak-urilor simetrice. Aceasta implică calcularea ariei prin
înmulţirea înălţimii peak-ului cu valoarea lăţimii determinată
la jumătate din înălţimea lui.

Alte metode implică utilizarea unui

planimetru sau decuparea peak-ului
cromatografic şi cântărirea lui, determinând
astfel greutatea lui în relaţie cu o arie
cunoscută de hârtie de înregistrare. În
general, tehnicile de integrare manuală
conduc la erori de 2-5%, pe când
integrările digitale sunt de un ordin de
magnitudine mai precise.
 CALIBRĂRI ŞI
STANDARDE
Cea mai sigură metodă de analiză cromatografică cantitativă implică
prepararea unei serii de standarde prin diluţia unei soluţii stoc ce posedă
o compoziţie (aproximativ) asemănătoare cu cea a probei necunoscute.
Cromatogramele pentru standarde obţinute astfel sunt apoi reprezentate
în funcţie de concentraţia lor. Curba rezultată care obligatoriu trece prin
origine este utilizată la determinările de concentraţie pentru compusul
care se dozează. În mod frecvent se recurge la restandardizare pentru a
obţine rezultate cu o mai mare acurateţe.
Cea mai importantă sursă de erori în analize efectuate prin
metoda mai sus menţionată este dată de incertitudinea legată de
volumul probei; uneori, viteza de injecţie, reprezintă de
asemenea un factor de eroare. În mod curent probele sunt mici
(de aproximativ 1 µl), iar incertitudinile legate de injectarea în
condiţii reproductive a unui volum cu o seringă de aceleaşi
mărime poate conduce la scăderea cu procente semnificative a
erorilor. Această situaţie este des-întâlnită în cromatografia gaz-
lichid, unde proba trebuie sa fie injectată într-un dispozitiv
special încălzit, unde fenomenul de evaporare care apare la
nivelul acului seringii poate fi deosebit de crescut, conducând
astfel la variaţii mari ale volumului injectat. Erorile volumului de
probă pot fi reduse, cu probabil 1-2% din medie, prin utilizarea
unei valve rotative.
 Metoda cu standard intern

Precizia cea mai mare în cromatografia cantitativă este

obţinută prin utilizarea standardelor interne deoarece
incertitudinile introduse prin injectarea probei sunt evitate. În
această procedură, se măsoară cu atenţie o substanţă,
denumită standard intern, care este introdusă în fiecare
standard sau probă, raportul dintre ariile (ori înălţimea) peak-
urilor analitului şi a standardului intern servind drept parametru
analitic. Pentru ca această metodă sa aibă succes, peak-ul
standardului intern trebuie să fie bine separat de peak-urile
celorlalte componente din probă (Rs > 1,25); peak-ul standard
trebuie, pe de altă parte, sa apară în apropierea peak-ului
analitului. Cu un standard intern adecvat, se poate creşte
precizia faţă de alte metode, utilizate frecvent.
 Metoda de normalizare a ariei

O altă abordare care conduce la scăderea incertitudinilor legate

de injectarea probei este metoda de normalizare a ariei. În acest
caz, este necesară eluţia completă a tuturor componentelor probei.
În metoda de normalizare, ariile tuturor peak-urilor sunt calculate,
după corecţia tuturor acestor arii cu diferenţele dintre răspunsul
detectorului la tipurile diferite de compuşi, în timp de concentraţia
analitului este determinată din raportul acestor arii la aria totală a
tuturor peak-urilor.
Din nefericire, adesea nu este practic a aranja condiţiile în aşa
fel ca toţi compuşii din amestec să fie eluaţi din coloană într-o
perioadă de timp rezonabilă, motiv pentru care metoda de
normalizare are aplicaţii limitate.
CROMATOGRAFIA DE
PARTIŢIE
 Dintre toate tipurile de procedee cromatografice
lichide, cromatografia de partiţie este cea mai utilizată
tehnică de separare. Dacă în trecut cele mai multe
aplicaţii se adresau compuşilor neionici, celor polari cu
masă moleculară moderată (de obicei mai mică de
3000) astăzi dezvoltarea unor metode (procedee) noi,
de derivatizare ori a unor tehnicile bazate pe perechi de
ioni) au extins separările prin partiţie la mase moleculare
mari şi la separarea unor compuşi ionici.
 Cromatografia de partiţie poate fi
subdivizată în
-cromatografie lichid-lichid şi
-cromatografie cu fază legată.
Diferenţa între cele două tehnici constau
în metoda prin care faza staţionară intră în
interacţie cu particulele suport,
împachetate.
 În cromatografia lichid-lichid, faza lichidă
staţionară este reţinută pe suprafaţa
particulelor împachetate prin adsorbţie fizică.
 În schimb, în cazul cromatografiei cu fază
legată, faza staţionară este legată chimic la
suprafaţa particulelor de suport.
Primele tipuri de cromatografie de
partiţie au fost exclusiv de tip lichid-lichid;
datorită multor dezavantaje ale
sistemelor lichid-lichid, în prezent metoda
cu fază legată a devenit predominantă.
Unul dintre aceste dezavantaje îl
reprezintă pierderea fazei staţionare prin
disoluţia ei în faza mobilă, care astfel
necesită reacoperirea periodică a
particulelor suport. În plus, problemele de
solubilitate ale fazei staţionare nu permit
utilizarea fazei lichide împachetate în
cazul eluţiei în gradient.
 Cromatografia de partiţie cu
fază legată
Suporturile pentru majoritatea tehnicilor de cromatografie de partiţie cu
fază legată sunt preparate din silice rigidă ori au o compoziţie pe bază de
silice. Aceste solide sunt formate din particule uniforme, poroase, cu
consistenţă mecanică de gel, cu diametru de 3, 5, ori 10 μm. Suprafaţa
acestora este formată din silice total hidrolizată (proces realizat prin fierberea
silicei în HCl, 0,1 M timp de una-două zile, proces prin care rezultă grupări
silanol, chimic reactive, de forma:

OH OH OH OH
O O O
Si Si Si Si

Structura suprafeţei de silice.

 În mod caracteristic, suprafeţele de silice activată, conţin aproximativ 8
μmoli/m2 de grupări hidroxilice. O structură mult utilizată în cromatografia cu
fază legată o reprezintă siloxanii, compuşi rezultaţi prin reacţia dintre suprafaţa
hidroxilată cu un organoclorosilan, după reacţia:

Modalitatea de sinteză a unui siloxan; R reprezintă o grupare

alchil ori o grupare alchil-substituită.
 Din cauza efectelor sterice suprafaţa acoperită prin
silanizare este limitată la cel mult 4 μmoli/m2 după cum se
observă în figura de mai jos.

Structura tridimensională a unui derivat

siloxanic.

Grupările Si-OH nereacţionate

conduc din păcate la o polarizare
nedorită a suprafeţei, care are ca efect
apariţia trenei peak-ului cromatografic,
mai ales în cazul soluţilor bazici.
Scăderea acestui efect se realizează
prin dezactivare cu clortrimetilsilan,
care, având o masă moleculară mai
mică, se poate lega la grupările libere
hidroxilice ale silanolului.
 TIPURI DE SUPORTURI UTILIZATE ÎN CROMATOGRAFIA CU FAZĂ LEGATĂ

În funcţie de polaritatea relativă a fazelor mobilă şi staţionară, se pot distinge două

tipuri de cromatografii cu fază legată. Primele lucrări de cromatografie lichidă s-au bazat
pe faze staţionare puternic polare precum apa ori trietilenglicolul, legate de particule de
silice ori de alumină; în continuare, un solvent relativ nepolar precum hexanul ori iso-
propil eterul, servesc apoi drept fază mobilă. Fiind raportată prima, această tehnică
cromatografică de partiţie a fost denumită cromatografie cu fază normală. În
cromatografia cu fază inversă, faza staţionară este nepolară, deseori o hidrocarbură, în
timp ce faza mobilă este relativ polară (apă, metanol, acetonitril, etc.).

Relaţiile dintre polaritate şi timpii de

eluţie în cazul cromatografiei cu fază
normală (a, b) şi cea cu fază inversă (c,
d) în cazul a trei componenţi. a)
polaritate scăzută a fazei mobile; b)
polaritate medie fazei mobile; c)
polaritate înaltă a fazei mobile; d)
polaritate medie fazei mobile.
 În cromatografia cu fază normală, componentul cel mai puţin
polar este eluat primul, deoarece, în sens relativ, este cel mai solubil
în faza mobilă; creşterea polarităţii fazei mobile va avea ca efect
scăderea timpului de eluţie. În opoziţie, în metoda cu fază inversă,
componentul cel mai polar apare primul, iar creşterea polarităţii fazei
mobile creşte timpul de eluţie. Aceste relaţii sunt ilustrate în de mai
sus.
 Suporturile cromatografice cu fază
legată sunt clasificate drept cu fază
inversă dacă structura de suprafaţă a
suportului are un caracter nepolar, şi
drept cu fază normală în condiţiile în
care suportul conţine grupări funcţionale
polare. În cromatografia de înaltă
presiune cel puţin trei sferturi din
Structura chimică a grupărilor organice
experimente se realizează pe coloane
silil prezente în structura fazelor
împachetate cu fază inversă.
staţionare, utilizate în cromatografia
Structura grupărilor organice silil
planară cu fază legată. Simbolurile sunt
ale fazei staţionare diferă prin mărime,
explicitate mai jos.
rigiditate planaritate şi grad de
nesaturare după cum se observă în
figura alăturată.

Acestea includ trimetilsilil (C1), n-octildimetilsilil (C8), n-octadecildimethilsilil

(C18), 2-ciclohexiletildimetilsilil (CHE), 2-(3-ciclohexenl)etildimetilsilil (CHNE),
fenildimetilsilil (Ph), 2-feniletildimetilsilil (PE), 2-(2-naftil)etildimetilsilil (NE) şi 2-(3-
pirenil)etildimetilsilil (PYE). Cele mai comune grupări radicalice care îmbracă
suportul de siloxan este catena C8 (n-octil) ori catena C18 (n-octildecil).
 DEVELOPAREA ÎN CROMATOGRAFIA DE
PARTIŢIE

Procesul de eluţie a componentelor probei de pe suportul

cromatografic de către faza mobilă (solvent) este denumit
developare. Acest proces este mai complex în cromatografia lichidă
decât în cea gazoasă deoarece în faza mobilă lichidă componentele
interacţionează atât cu faza staţionară, cât şi cu cea mobilă, în
contrast cu gaz cromatografia unde faza mobilă se comportă ca şi un
gaz ideal, necontribuind în procesul de separare; ea serveşte numai
transportului componentelor probei prin faza staţionară. Din această
cauză, în gaz-cromatografie, separările nu sunt semnificativ afectate
de către faza mobilă, indiferent dacă aceasta este reprezentată de
heliu, azot, ori hidrogen. În contrast evident cu fenomenul întâlnit în
cazul gaz-cromatografiei, succesul unei separări prin partiţie lichidă
este adesea profund dependent de compoziţia fazei mobile.
 SELECŢIA COLOANEI ÎN SEPARĂRILE PRIN
CROMATOGRAFIE DE PARTIŢIE

Succesul cromatografiei cu fază mobilă lichidă

(interactivă), necesită o balanţă optimă a forţelor
intermoleculare care implică cei trei participanţi activi în
procesul de separare: faza mobilă, faza staţionară şi
solutul. Aceste forţe intermoleculare sunt descrise
calitativ în termeni de polaritate relativă a fiecăruia
dintre cei trei reactanţi.
Polarităţile diverselor grupe funcţionale cresc în
ordinea: hidrocarburi < eteri < esteri < cetone <
aldehide < amide < amine < alcooli. Apa este cel mai
polar compus dintre toţi compuşii care conţin
grupările funcţionale prezentate mai sus.
Deseori, în alegerea unei coloane pentru
separări cromatografice de partiţie,
polaritatea fazei staţionare este aproximativ
aleasă, în concordanţă cu cea a analitului, în
timp ce faza mobilă aleasă pentru eluţie
prezintă o diferenţă considerabilă din punct
de vedere al polarităţii. Această abordare
este în general mai de succes decât cea în
care polarităţile solutului şi a fazei mobile
sunt alese diferit de faza staţionară. În acest
caz, faza staţionară deseori nu poate
competiţiona eficient pentru componentele
probei, timpii de retenţie devenind prea scurţi
în aplicaţiile practice.
 O altă extremă o reprezintă situaţia în care polarităţile
solutului şi a fazei staţionare sunt prea similare şi total diferite
de cea a fazei mobile. În această situaţie timpii de eluţie
devin deosebit de mari.
Se poate concluziona că polarităţile solutului, fazei mobile
şi fazei staţionare trebuiesc cunoscute şi selectate cu grijă
pentru a conduce la o separare de partiţie eficientă, într-un
interval de timp rezonabil. Din nefericire, teoriile interacţiilor
dintre faza mobilă şi cea staţionară pentru oricare component
sunt imperfecte motiv pentru care acestea pot doar ghida
analistul în alegerea fazei staţionare pentru un tip general,
după care, este necesar a se realiza o serie de experimente
preliminarii, de identificare a fazei optime până la obţinerea
unei separări satisfăcătoare. Dacă se constată că rezoluţia
tuturor componentelor ale amestecului este imposibilă, se
alege un alt tip de coloană.
 Selecţia fazei mobile în cromatografia de partiţie

În prezentarea teoretică au fost descrise trei metode de creştere a

rezoluţiei de separare în cromatografia pe coloană, fiecare fiind bazată pe
varierea unuia dintre cei trei parametrii (N, k', şi α) prezentaţi în ecuaţia
1.21. În cromatografia lichidă, factorul de retenţie, k', este experimental, cel
mai uşor de manipulat dintre toţi aceşti trei factori deoarece există o
dependenţă puternică între a acestei constante funcţie de compoziţia fazei
mobile. Performanţele optime ale factorului de retenţie, k', trebuie să fie
cuprinse într-un domeniu ideal cuprins între 2 şi 5, totuşi, pentru
amestecuri complexe acest domeniu este extins la 0,5 - 20 în scopul de a
furniza timp suficient oricărui component din amestec să fie eluat.
Uneori, ajustarea lui k' singură, nu este
suficientă pentru a produce o separare clară a
peak-urilor, fără suprapunere; în acest caz
trebuie să se recurgă la variaţia factorilor de
selectivitate α. În acest caz modul cel mai
simplu de modificare a factorului de
selectivitate α îl reprezintă alterarea cu grijă a
compoziţiei fazei mobile, pentru a păstra
factorul de retenţie, k' într-un domeniu
rezonabil. Un alt mod alternativ de schimbare
a factorului de selectivitate α îl reprezintă
alegerea unui suport cromatografic diferit.
 EFECTUL TĂRIEI SOLVENTULUI ASUPRA
FACTORILOR DE RETENŢIE

Solvenţii care interacţionează puternic cu soluţii sunt deseori numiţi

solvenţi „tari” ori solvenţi polari. În scopul descrierii cantitative a polarităţii
solvenţilor au fost introduşi o serie de indecşi.
Dintre aceştia, cel mai utilizat index în cromatografia de partiţie îl
reprezintă P', indexul de polaritate, introdus de către Snyder în 1978.
Parametrul P' se bazează pe măsurători de solubilitate a substanţei de
interes în trei solvenţi: dioxan (un dipol proton acceptor slab), nitrometan
(un dipol proton acceptor tare) şi alcool etilic (un dipol proton donor
foarte tare). Indexul de polaritate este o măsură numerică a polarităţii
relative a unui număr divers de solvenţi. Tabelul următor prezintă o listă
de indecşi de polaritate, alături de alte proprietăţi fizico-chimice pentru
un număr de solvenţi care sunt utilizaţi în cromatografia de partiţie.
 Se poate nota că acest index poate varia
de la 10,2 pentru solventul cel mai polar,
apa, la -2 pentru compuşii înalt nepolari de
tipul fluoroalcanilor. Orice alt index de
polaritate dorit se va încadra între aceste
limite, fiind realizat prin amestecul a doi
solvenţi adecvaţi. În acest fel se obţine
indexul de polaritate P'AB a amestecului
format din solvenţii A şi B. Acesta este dat
de relaţia:

P'AB = ΦAP'A +ΦB P'B

unde P'A şi P'B reprezintă indecşii de polaritate ai celor doi solvenţi, iar Φ, fracţia
volumetrică a fiecărui solvent.
 Proprietăţile celor mai utilizate faze mobile în cromatografie.
Punct de
Index de Vâscozitate Index de Tăria eluentului c,
Solvent fierbere
refracţie a [cP] b polaritate, P' [εo]
[oC]
Fluoroalcani 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 <-2 -0,25
Ciclohexan 1,423 0,90 81 0,04 -0,2
n-Hexan 1,372 0,30 69 0,1 0,01
1-Clorbutan 1,400 0,42 78 1,0 0,26
Tetraclorură de 1,457 0,90 77 1,6 0,18
carbon
Eter i-propilic 1,365 0,38 68 2,4 0,28
Toluen 1,494 0,55 110 2,4 0,29
Eter etilic 1,350 0,24 35 2,8 0,38
Tetrahdrofuran 1,405 0,46 66 4,0 0,57
Cloroform 1,443 0,53 61 4,1 0,40
Etanol 1,359 1,08 78 4,3 0,88
Acetat de etil 1,370 0,43 77 4,4 0,58
Dioxan 1,420 1,2 101 4,8 0,56
Metanol 1,326 0,54 65 5,1 0,95
Acetonitril 1,341 0,34 82 5,8 0,65
Nitrometan 1,380 0,61 101 6,0 0,64
Etilenglicol 1,431 16,5 182 6,9 1,11
Apă 1,333 0,89 100 10,2 mare
a valoarea este calculată la o temperatură de 25oC
b centipoid-ul este unitatea de măsură, comună, a vâscozităţii în sistem internaţional, 1 cP = 1 mN·· s ··m-2.
c valorile tăriei solventului sunt calculate pe suport de alumină, Al 0 ; pentru silice, SiO valoarea εo se multiplică
2 3 2
cu un factor de 0.8.
 S-a arătat anterior că cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei
cromatografice a două specii o reprezintă manipularea factorului de retenţie
k', care poate fi variat prin schimbarea indexului de polaritate a solventului.
În cazul prezentat mai sus, ajustarea lui P' este realizată prin utilizarea unei
faze mobile ce conţine un amestec format din doi solvenţi. De obicei, o
schimbare grosieră cu două unităţi a indexului de polaritate P' conduce la o
creştere de zece ori a factorului de retenţie k'. În cazul separării prin
cromatografie de fază normală se poate scrie relaţia:

unde k'2 şi k'1 reprezintă valorile iniţiale şi finale pentru un solut, în timp ce P'1 şi P'2
sunt valorile corespunzătoare ale lui P'.
În cazul coloanelor cromatografice cu fază inversă relaţia este:

Se poate accentua că deși aceste ecuaţii sunt aproximative, ele pot

fi utilizate cu succes.
 . APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE PARTIŢIE
Suporturile cu fază inversă când se utilizează în conjuncţie cu solvenţii foarte polari (deseori apoşi), se
apropie de sistemul ideal, universal, pentru cromatografia lichidă. Datorită aplicabilităţii mari, avantajoase şi
uşoare, în condiţiile în care factorul de retenţie k' poate fi alterat prin modificarea fazelor apoase mobile, ele sunt
frecvent aplicate înaintea altor separări exploratorii în cazul utilizării unor noi tipuri de probe.
Figura de mai jos ilustrează două dintre miile de aplicaţii ale cromatografiei cu fază legată.

Abordarea sistematică a separării a şase steroizi. (a) şi (b) utilizarea apei pentru a ajusta
valoarea factorului de retenţie k'. Efectele variaţiei factorul de selectivitate α sunt arătate în
(b), (c), (d), şi (e). Coloană: 0,4 x 150 mm împachetată cu suport C8, particule de fază inversă,
5 μm. Temperatura: 50°C. Viteza de curgere: 3.0 cm3/min. Detector: UV 254 nm. Compuşi: (1)
prednisonă, (2) cortizonă (3) hidrocortizonă, (4) dexametazonă, (5) corticosteronă; (6)
cortoexolonă.
Două aplicaţii ale
cromatografiei de partiţie cu
fază legată. a) Analiza unor
aditivi într-o băutură
nealcoolică. Coloană cu suport
polar legat (nitril). Eluţie
izocratică. b) Analiza unor
insecticide organofosforice.
Coloană cu fază legată C8,
eluţie în gradient. Detecţie UV,
254 nm.
 Formarea unor derivaţi ai probei

În unele cazuri este util a se converti componenţii probei în derivaţi înaintea

sau uneori când se întreprinde o separare cromatografică. Acest tratament este
util în condiţiile în care se doreşte
(1) reducerea polarităţii speciilor astfel că se poate utiliza mai degrabă
cromatografia de partiţie decât cea de adsorbţie ori de schimb ionic,
(2) creşterea răspunsului detectorului şi astfel creşterea sensibilităţii pentru
toate ori pentru o serie de componente ale probei şi
(3) intensificarea selectivă a răspunsului la detector pentru o serie de
componente ale probei.

Cromatograma derivaţilor
ortoftalaldehidici ai 30 de
aminoacizi de importanţă
fiziologică. Coloană: C18, 5
m de fază inversă. Solvent
A: Na2HP04, 0,05 M, pH 7,4,
CH30H/Tetrahidrofuran/H20.
Detector de fluorescenţă:
excitaţie 334 nm; emisie 425
nm.
 CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE
MOLECULARĂ

 Cromatografia de excluziune sterică, denumită de asemenea

cromatografie de gel-premeaţie, cromatografie de sitare moleculară sau
gel filtrare reprezintă o tehnică de separare de real folos în laborator, fiind
aplicată în particular la separarea speciilor cu masă moleculară mare.
 Suportul cromatografic împachetat utilizat în cromatografia de
excluziune sterică este alcătuit din particule mici, de aproximativ 10 μm de
silicat ori particule de polimeri care conţin reţele de pori uniformi într-un solut
şi molecule de solvent difuzate în interiorul acestor pori.
 În interiorul porilor moleculele sunt efectiv blocate, fiind mişcate prin
curgerea fazei mobile.
 Domeniul de timp de rezidenţă în interiorul porilor depinde de mărimea
efectivă a moleculelor de analit.
 Moleculele care sunt mai mari decât media
mărimii porilor suportului cromatografic sunt excluse şi
astfel ele nu vor fi reţinute, aceste specii fiind primele
eluate.
Moleculele care au un diametru semnificativ mai
mic decât dimensiunile porilor pot penetra (permea) în
labirintul de pori din interiorul suportului cromatografic,
fiind astfel captate, pentru un timp mult mai îndelungat,
fiind ultimele eluate. Între cele două extreme sunt
moleculele intermediare a căror domeniu de permeare
în pori depinde de diametrele lor. Faţă de acest grup
de molecule are loc fracţionarea, fenomen direct legat
de diametrul lor şi în unele cazuri de forma moleculară
a lor.
Se poate spune că separările prin gel
permeaţie, de excluziune pe baza masei
moleculare diferă de alte procese de
separare prin considerentul că nu există
interacţii directe fizice sau chimice între
analit şi faza staţionară.
Din această cauză, este necesară
eliminarea oricărei interacţii deoarece
acestea conduc la scăderea eficienţei
cromatografice.

De asemenea trebuie notat că în cazul

acestui proces de separare există o limită
superioară a timpului de retenţie din cauza
faptului că nici o specie de analit nu se
reţine mai mult decât cel care permează
total faza staţionară.
 De reţinut că în cazul separării biomoleculelor în sisteme apoase,
cromatografia de excluziune de denumeşte cromatografie de gel
filtrare, în timp ce separarea compuşilor în sisteme neapoase este
denumită cromatografie de gel permeaţie.
Metoda cromatografică de excluziune din gel exploatează masa
moleculară ca proprietatea fizică în scopul realizării separării. Astfel pot fi
separate molecule din domeniul a 100 până la cele de mai multe milioane
de daltoni.
Fiind o tehnică prin care se separă în general molecule cu masă
moleculară cuprinsă între 10000 şi 100000 este deosebit de populară
printre cercetătorii biochimişti.

Gel cromatografia a avut şi are o importanţă majoră în purificarea a mii de

proteine, acizi nucleici, enzime, polizaharide ori a altor biomolecule.

Tehnica poate fi aplicată la determinări

de mase moleculare ori la analize
cantitative ale interacţiilor moleculare.
 Suporturi utilizate în cromatografia de gel filtrare
Faza staţionară este constituită din particule inerte care conţin pori cu
dimensiuni controlate. Examinarea microscopică a acestor particule arată un interior
spongios.
O soluţie care conţine molecule cu diferite mase moleculare este trecută prin
coloană sub influenţa unui solvent în continuă curgere. Moleculele de solut care sunt
mai mari decât porii nu vor putea pătrunde în interiorul sferelor de gel din cauza
împiedicărilor sterice datorate dimensiunii acestora în comparaţie cu spaţiul din interiorul
sferelor.
Volumul coloanei care este accesibil moleculelor foarte mari este astfel semnificativ
redus. Ca rezultat, ele nu vor fi încetinite în curgerea lor prin coloană şi vor fi eluate
astfel ca o singură bandă (zonă). Moleculele mici sunt capabile să difuzeze în şi în afara
sferelor de gel, fiind necesare volume mai mari de solvent pentru a fi eluate, astfel ele
staţionând un timp îndelungat în interiorul sferelor, în consecinţă fiind întârziată eluţia lor
din coloană.

Moleculele cu dimensiuni intermediare

migrează prin coloană cu viteză cuprinsă
între cea a moleculelor mari şi cele mici.
Astfel, ordinea de eluţie a diverselor
molecule de solut este oarecum în relaţie
directă cu dimensiunile lor moleculare.
 În azul separărilor de înaltă performanță/presiune au fost
elaborate două tipuri de suporturi pentru cromatografia de
excluziune pe baza mărimii moleculelor:
 microsfere de polimer şi
 particule ce au la bază silice,

ambele având diametre cuprinse între 5 şi

10 μm. Ultimele au avantajul unei rigidităţi
crescute ceea ce conduce la o
împachetare mai uşoară, permiţând
utilizarea lor la presiuni crescute, stabilitate
deosebit de mare, care permite utilizarea
lor împreună cu un mare număr de
solvenţi, inclusiv cu apa, o echilibrare mai
rapidă într-un nou solvent şi o stabilitate
înaltă la temperaturi ridicate.
 Cele mai timpurii separări efectuate prin tehnica de cromatografie de
excluziune moleculară s-au realizat pe copolimer reticulat de stiren-divinil
benzen, similar în structură cu copolimerii sulfonici ai acestor copolimeri.

Mărimea porilor acestor polimeri e controlată prin cantitatea de agent de

reticulare, în speţă de cantitatea de divinilbenzen utilizată în reacţia de polimerizare.
Drept consecinţă, au fot creaţi o serie de copolimeri cu diferite domenii ale porilor,
sub formă comercială.
 Dacă la început gelurile de stiren-
divinilbenzen erau hidrofobe, şi astfel
neutilizabile în prezenţa unei faze mobile
apoase, astăzi sunt disponibile geluri
hidrofile, ceea ce face posibilă utilizarea lor
în solvenţi apoşi pentru separarea unor
molecule mari, hidrosolubile precum
zaharurile.
Aceste geluri hidrofile sunt derivaţi
sulfonaţi ai divinibenzenului ori sunt
poliacrilamidice.
 În acest moment, în tehnicile de înaltă performanță
(presiune) sunt disponibile comercial suporturi pe bază de
sticlă poroasă ori particulele de silice ce au domeniu de
mărime al porilor cuprins între 40 şi 2500 Å. În scopul
reducerii absorbţiei nespecifice, suprafeţele acestor particule
sunt deseori modificate prin reacţii cu substituenţi organici.
De exemplu, suprafaţa unui suport hidrofil prezintă structura
următoare:

Structura unui suport hidrofil, pe bază de silice

 Proprietăţile unor matrix-uri pe bază de polistiren-divinilbenzen şi silice utilizate în
cromatografia de excluziune pe baza mărimii masei moleculare. Limita de excluziune a
masei moleculare se referă la domeniul la care nu se manifestă nici o reţinere.

Tipul de suport Mărimea Domeniul de limită Limita de excluziune a

cromatografic pariculei, μm al porilor, Å masei moleculare
10 102 700
103 (de la 0,1 la 20) x 104
polistiren-divinilbenzen 104 (de la 1 la 20) x 104
105 (de la 1 la 20) x 105
106 (de la 5 >20) x 106
10 125 (de la 0,2 la 5) x 104
300 (de la 0,03 la 1) x 105
Silice 500 (de la 0,05 la 5) x 105
1000 (de la 5 la 20) x 105

În practica biochimică de separare analitică, sunt utilizate cu

preponderenţă geluri bazate pe patru tipuri de bază: dextran, poliacrilamidă,
agaroză şi amestecuri de poliacrilamidă cu dextran.
 Primele geluri dezvoltate au fost pe bază de dextran, un polizaharid
natural. Dextranul este un polizaharid compus din resturi de glucoză legate
prin legături (α-1 -6) şi legături α-1,3 care conferă legături ramificate. El
este biosintetizat de către o enzimă produsă de către bacteria
Leuconostoc mesenteroides, tulpina B-512F.

Dextranul comercializat sub denumirea de Sephadex este reticulat

la multiplele sale extremităţi printr-o reacţie cu epiclorhidrină, ceea
ce conduce la obţinerea unor sfere de gel cu porozităţi diferite.
 Numărul dat fiecărui tip de gel se referă la
capacitatea de îmbibare cu soluţie apoasă (water
regain) multiplicată cu 10.
 Sephadex-ul este oferit în diverse mărimi ale
particulelor denumite coarse, medium, fine şi superfine.
 Gelurile pe bază de dextran nu pot fi preparate decât
pentru limite de excluziune mai mici de 600000 daltoni,
deoarece mica reticulare existentă în structura lor nu
este suficientă pentru a preveni colapsul particulelor.
 În schimb, prin reticularea dextranului cu NN'-
metilen bisacrilamidă, este posibilă utilizarea acestor
geluri la fracţionări cu domenii mai mari. Aceste geluri
sunt denumite Sephacryl.
 Un pas înainte în tehnologia de gel filtrare s-a realizat în momentul introducerii
gelurilor compozite, prin grefarea unui polimer secundar pe un suport de gel
preformat, precum de exemplu Sephacryl (figura de mai jos), unde reticularea se
realizează între alil dextran şi N,N'-metilen bisacrilamidă ori mai recent,
Superdex.

Structura probabilă a
polimerului Sephacryl HR
 Gelurile pe bază de poliacrilamidă sunt
produse prin copolimerizarea acrilamidei cu NN'-
metilen bisacrilamidă, ultimul fiind şi agent de
reticulare. Denumirea comercială a acestor geluri
este Bio-Gel P. Mediile pe bază de Bio-Gel sunt
media sunt disponibile în 10 limite de excluziune,
în domeniul 1800 la 400000 daltoni.
Gelurile pe bază de agaroză prezintă
avantajul unor deosebit de mari limite de
excluziune. Agaroza, componentul polizaharidic
neutru al agarului, este compusă din unităţi
alternative de galactoză şi anhidro-galactoză
(Figura următoare).
 Agaroza este un material gelifiant a căror mărime a porilor
este mai mare decât cei ai dextranului reticulat ori ai
poliacrilamidei. Agaroza este un polizaharid neutru, fracţie de
agar.
Ea este compusă din polimer linear de D-galactopiranoză
legate β-1→4 la 3,6 anhidro-L-galactopiranoză, care este
legată α -1→3. În condiţiile în care polizaharidul este dizolvat
prin fierbere şi apoi este răcit, el formează legături de
hidrogen inter- şi intramoleculare. Mărimea porilor este
controlată prin concentraţia de agaroză. Structura gelului este
stabilizată mai mult prin legături de hidrogen decât prin
legături încrucişate covalente.
 Gelurile pe bază de agaroză sunt furnizate sub
denumirea comercială de Bio-Gel A şi Sepharose ori
Superose.
Sepharose CL este o sepharose reticulată prin reacţia
dextranului cu 2,3-dibromopropanol în condiţii alcaline,
ceea ce conduce la obţinerea unui gel de agaroză cu o
stabilitate termică şi chimică crescută.
 Structura Superdex-ului

Gelurile combinate de poliacrilamidă şi agaroză sunt furnizate

sub denumirea comercială de Ultragel. Acestea sunt compuse din
poliacrilamidă reticulată în ochiurile căreia se află agaroză. Ca şi în
cazul Superdex, gelul de poliacrilamidă conferă un grad înalt de
separare în timp ce agaroza menţine rigiditatea gelului ceea ce
conduce la marele avantaj al creşterii vitezelor de curgere.
Sephadex LH-20 este un suport special conceput pentru
separările compuşilor naturali care necesită prezenţa unor
solvenţi organici pentru a le menţine solubilitatea. El este
utilizat de asemenea la separarea unor molecule precum
sterolii, terpenoidele, lipidele şi peptidele cu masă
moleculară mică (până la 35 resturi de aminoacizi). Toţi
aceşti compuşi sunt uzual separaţi prin cromatografie de
partiţie lichid-lichid sau prin cromatografie de adsorbţie.
Funcţie de solvenţii aleşi, acest mediu suport poate separa
de asemenea componente prin partiţie între faza staţionară
şi faza mobilă.
Sephadex LH-20 poate prezenta o selectivitate înaltă
pentru compuşi aromatici într-o serie de solvenţi şi
poate fi utilizat atât în scopuri analitice cât şi în cele
industriale la separarea unor specii moleculare
înrudite. Datorită proprietăţilor sale unice acest mediu
suport poate fi utilizat atât în timpul purificării iniţiale
cât şi în ultima fază de finalizare a purificării, de
exemplu la separarea diastereomerilor. Funcţie de
solvenţii aleşi, Sephadex LH-20 poate de asemenea
separa componente prin partiţie între matrix şi solvent
organic. Sephadex LH-20 manifestă atât proprietăţi
hidrofile cât şi hidrofobe, ceea ce-i oferă selectivitate
specială şi astfel are cu o multitudine de aplicaţii.
În definirea performanţelor unui gel şi a comportamentului unui
solut este necesară cunoaşterea unor proprietăţi fizice ale
acestora.
 Limita de excluziune. Ea este definită ca
masa moleculară a celei mai mici molecule
care nu poate difuza în interiorul volumului
de matrix de gel. Toate moleculele mai mari
decât această masă vor fi eluate rapid, într-
o singură zonă. Limita de excluziune a unui
gel tipic, Sephadex G-50, este de 30000 Da.
Toate moleculele din solut care posedă mase
moleculare mai mari de această valoare vor
trece prin coloană direct, fără a fi reţinute în
porii sferelor de gel.
Domeniul de fracţionare. În cazul
Sephadex G-50 domeniul de fracţionare este
cuprins între 1500 şi 30000 Da. Moleculele de
solut din acest domeniu, se vor separa
oarecum într-o relaţie lineară, în funcţie de
masa lor moleculară.
Capacitatea de îmbibare (water regain şi bed volume). Mediile
de gel cromatografie sunt oferite cel mai adesea în formă
deshidratate fiind umflate apoi în solvent, de obicei apă, înainte de
utilizare. Cantitatea de apă necesară obţinerii unui gram de gel este
cunoscută sub denumirea de water regain. În cazul Sephadex G-50,
această valoare este de 5 pentru 0,5 g.
Valoarea nu include apa din jurul particulelor de gel şi astfel nu
poate fi utilizată la o estimare exactă a volumului final al coloanei
împachetate de gel. Cele mai multe companii care comercializează
astfel de produse furnizează, în plus la water regain, valoarea
volumului particulelor, bed volume. Această valoare reprezintă
volumul final de gel în condiţiile umflării (îmbibării) a unui gram de
gel uscat în apă.
Pentru Sephadex G-50, bed volume-ul este de 9 până la 11 ml/g
gel uscat. În seria Sephadex-ului, denumită seria G, numerele G
se referă la cantitatea de apă care este necesară pentru
înmuierea gelului, având grade diferite de reticulare, deci diferite
mărimi ale porilor. Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran,
posedă un water regain de aproximativ 1 ml/g de gel uscat în
timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin dextran reticulat are un
water regain de aproximativ 20 ml/g de gel uscat.
Forma şi mărimea particulei de gel. În condiţii
ideale, particulele de gel sunt sferice, pentru a furniza
un strat uniform de gel, cu o mare densitate a porilor.
Mărimea particulelor este definită prin mărimea
ochiurilor acesteia (mesh) ori prin diametrul sferei
particulei. Gradul de rezoluție oferit de viteza de
curgere prin coloană depinde de dimensiunile
particulelor de gel.
Particulele cele mai mari (50
la100 mesh, 100 la 300 μm) oferă
viteze de curgere înalte dar o
separare cromatografică cu
rezoluţie scăzută.
În caz opus se află particulele de
gel cu dimensiuni foarte mici
("superfine," 400 mesh, 10 la 40
μm).
Cele mai utilizate mărimi de
particule reprezintă un compromis
între rezoluţie şi viteză de curgere
fiind de 100 la 200 mesh (50 la 150
μm).
Volumul spaţiului gol (void volume). Acesta
reprezintă spaţiul total din jurul particulelor de gel într-o
coloană împachetată. Valoarea volumului spaţiului gol
se determină prin măsurarea volumului de solvent
necesar eluării unui solut care este complet exclus din
matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi
calibrate în scopul determinării acestui parametru prin
eluţia a unui colorant, blue dextran 2000, care are o
masă moleculară medie de 2000000 daltoni.
Volumul de eluţie. Acest volum reprezintă volumul
de tampon de eluţie necesar îndepărtării unui anumit
solut, particular, dintr-o coloană împachetată.
 Pentru a realiza o separare prin gel filtrare mediul suportul (mediul) este împachetat într-o
coloană sub formă de perle în strat împachetat (packed bed). Mediul este reprezentat de un matrix
poros în formă de particule sferice care trebuie a fi alese în funcţie de stabilitatea lor chimică şi
fizică ori pe baza proprietăţii de a fi inerte (prin pierderea proprietăţilor de reactivitate sau
adsorptivitate). Coloana împachetată este echilibrată cu tampon cu rolul de a se distribui în porii
matrix-ului şi în spaţiul dintre particule. Lichidul situat în interiorul porilor este uneori definit drept
fază staţionară care se află în echilibru cu lichidul din afara particulelor denumit fază mobilă. Se
poate nota că probele se eluează în condiţii isocratice, nefiind necesară utilizarea tampoanelor
diferite în timpul separării. În mod normal, o treaptă de spălare se realizează prin trecerea unui
tampon la sfârşitul oricărei separări pentru a facilita îndepărtarea oricărei molecule care ar fi putut fi
reţinute pe coloană şi pentru a pregăti coloana pentru o nouă separare. Figura de mai jos prezintă
cei mai utilizaţi termeni utilizaţi în descrierea unei separări cromatografice prin gel filtrare.

Termeni uzuali utilizaţi în gel filtrare.

Ilustrarea termenilor utilizaţi în gel filtrare
 Pentru a caracteriza comportamentul unui solut fără a avea o referinţă la
dimensiunile geometrice ale coloanei sunt utilizate frecvent o serie de variabile.
Ve
• Volumul relativ de eluţie, Vo, unde Vo reprezintă volumul spaţiului gol
(denumit şi volumul mort), reprezintă volumul de eluţie pentru o substanţă
care este complet exclusă din gel Vo este identic cu volumul lichidului
interstiţial dintre sferele de suport cromatografic. În unele cazuri inversul
volumului relativ de eluţie, R, constanta de retenţie este de asemenea
utilizată în caracterizarea unei substanţe. Constanta de retenţie, R este un
parametru interesant, deoarece ea este apropiată de viteza relativă de
migrare utilizată în cromatografia pe strat subţire.

Măsurarea volumului de eluţie, Ve.

 Ve
• Valoarea este uşor de calculat. Ea este oarecum
Vo

dependentă de modul de împachetare al coloanei. O

operare la presiune înaltă care conduce la un void
volume mic poate să crească uneori valoarea acestui
parametru. Această variaţie are totuşi o importanţă
minoră.
Ve
• Raportul Vt (unde Vt reprezintă volumul total al patului de
gel), este de asemenea uşor de determinat.
Măsurătoarea volumului total a patului de gel se
realizează, prin umplerea tubului până la nivelul original
al stratului de gel împachetat cu apă, determinându-se
astfel acest volum. Se poate adăuga că, în comparaţie
cu raportul Ve, variaţia raportului Ve
Vt
este mai mică.
Vo
 Ilustrarea fenomenului de separare prin gel filtrare.

Astfel, după împachetarea coloanei cu mediu

suport ce este alcătuit din particule sferice de gel [1],
proba este aplicată pe coloană [2].
Tamponul (faza mobilă) şi proba se mişcă de-a
lungul coloanei [3]. Moleculele difuzează din şi în
afara porilor matrix-ului (fenomen descris de
asemenea drept partiţia probei între faza mobilă şi
cea staţionară). Moleculele mai mici se vor dispersa
mai mult in interiorul porilor matrix-ului şi vor rămâne
un timp mai îndelungat pe coloană. Cum tamponul
trece continuu prin coloană, moleculele mai mari
decât porii matrix-ului sunt incapabile să difuzeze în
interiorul acestora, trecând astfel prin coloană, fără a
fi reţinute. Moleculele mai mici difuzează în interiorul
porilor şi sunt astfel întârziate în trecerea lor de-a
lungul coloanei [4]. Moleculele mai mari părăsesc
primele coloana, urmate de moleculele mai mici, în
ordinea mărimii lor [5]. Întregul proces de separare
are loc la un volum total al tamponului care trece prin
coloană (echivalent cu volumul de suport
împachetat).
 ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE
EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

În abordarea teoretică a procesului de cromatografie se ia în considerare

faptul că solutul trece printr-un strat cromatografic prin intermediul fazei mobile.
Faza staţionară acţionează în sensul întârzierii deplasării solutului prin strat.
Soluţi diferiţi sunt întârziaţi cu timpi diferiţi. În cromatografia de partiţie, această
întârziere este datorată partiţionării solutului între faza mobilă şi cea staţionară.
Viteza cu care solutul traversează stratul cromatografic este
proporţională cu o fracţie de timp, calculată pe bază statistică, în care
moleculele sunt reţinute în faza mobilă. Această fracţie de timp pierdut în
faza mobilă este determinată ca raportul volumelor de fază mobilă
respectiv staţionară, alături de un coeficient de partiţie.
Coeficientul de partiţie a solutului între faza mobilă şi cea staţionară
guvernează comportamentul cromatografic al solutului, prin ecuaţia
fundamentală a cromatografiei de partiţie. O multitudine de teorii au fost
emise în încercarea de caracterizare a acestui coeficient de partiţie în cazul gel
filtrării.
 Prima abordare teoretică a comportării gelurilor în
cromatografie este cea realizată, în anul 1961 de către P. Flodin.
El a considerat că partiţia moleculelor de solut între particulele de
gel şi lichidul interstiţial este eminamente un efect steric şi a
punctat că în mediul înconjurător imediat apropiat de catene
reticulate de gel suport matrix-ul de gel ocupă cea mai mare
parte a spaţiului. În aceste condiţii, moleculele mari nu pot
penetra în aceste regiuni, în timp ce moleculele mici pot trece
bariera reticulată şi astfel se pot apropia mult mai intim. Aceste
restricţii sterice, după Flodin, împart gelul în regiuni permise şi
regiuni interzise moleculelor de solut. Cu cât moleculele de solut
sunt mai mari în dimensiuni, cu atât numărul de regiuni interzise
din reţeaua matrix-ului este mai mare. În regiunile permise,
concentraţia de solut este considerată a fi identică cu cea din
lichidul interstiţial. Această teorie conduce la definirea constantei
K drept un volum disponibil la o specie moleculară dată.
 CURBELE DE SELECTIVITATE

Utilizarea domeniului de masă moleculară

pentru împachetare în cazul cromatografiei de
excluziune moleculară este convenţional
reprezentată în figura alăturată, unde în panelul (a)
e prezentată o curbă de calibrare.
În acest caz, masa moleculară, care este
într-o relaţie directă cu mărimea moleculelor de
solut, este plotată (reprezentată) în funcţie de
volumul de retenţie VR, unde VR este produsul
dintre timpul de retenţie şi viteza de curgere
volumetrică. Se poate nota că scara este
logaritmică. Limita de excluziune defineşte
masa moleculară a speciilor care depăşesc
domeniul de retenţie şi la care nu se manifestă
nici o reţinere pe coloana cromatografică.
Toate speciile care au o masă moleculară mai
mare decât limita de excluziune nu sunt
reţinute de suport şi vor fi eluate împreună,
rezultând astfel un peak comun, peak-ul A, din Odată cu scăderea masei moleculare comparativ cu
panelul (b). limita de permeaţie reprezintă astfel limita de excluziune, moleculele de solut vor staţiona din
masa moleculară sub care moleculele de solut ce în ce mai mult, în medie, în interiorul porilor şi apoi se
pot penetra complet în interiorul porilor de gel. vor deplasa mai lent. Această situaţie se manifestă în
Totalitatea moleculelor sub această masă regiunea de permeaţie selectivă, unde are loc fracţionarea
moleculară sunt atât de mici încât ele vor fi solutului, ceea ce conduce la separarea pe benzi
individuale a componentelor acestuia. Acest caz este
eluate ca o singură bandă, D, din panelul (b). prezentat în panelul (b), peak-urile B şi C.
 Coeficientul de partiţie (disponibilitate) între faza lichidă şi faza de gel este o
variabilă independentă în ceea ce priveşte compactarea stratului de gel.
În practică valorile Vs (volumul fazei staţionare) ori Vi (volumul de tampon aflat în
interiorul matrix-ului care este disponibil moleculelor mici, mai bine spus volumul de
eluţie a moleculelor care sunt distribuite liber între fazele mobilă şi staţionară minus
volumul spaţiului gol) sunt dificil de determinat, din această cauză este mai
convenabil a se înlocui cu termenul (Vt – Vo). Volumul estimat al fazei staţionare va
include prin urmare volumul de material solid care formează matrix-ul.
Deoarece Kd reprezintă fracţia de fază staţionară disponibilă pentru difuziunea
moleculelor date, faza staţionară poate fi substituită prin termenul (Vt – Vo), în
scopul de a obţine valoarea constantei de disponibilitate, Kav.

Ve - Vo
Kav =
Vt - Vo
 Curbele de calibrare experimentale
similare celei ipotetice prezentate în figură
sunt uşor de obţinut prin utilizarea unor
standarde. Deseori, asemenea curbe sunt
livrate de către producătorii de suporturi
cromatografice.
Coeficientul de partiţie Kav este de
asemenea în relaţie cu mărimea
moleculelor ce urmează a fi separate.
Moleculele cu forme şi densitate similare
demonstrează o relaţie sigmoidă între
valorile Kav şi logaritmul masei lor
moleculare.

Curbele de selectivitate pentru Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade

şi Superdex 200 prep grade.
 REZOLUŢIA DE SEPARARE ÎN CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE
MOLECULARĂ

Succesul unei separări prin cromatografie de excluziune sterică depinde în primul

rând de alegerea condiţiilor care conduc la o selectivitate suficientă şi la o contracarare a
lăţirii peak-ului, fenomen ce se manifestă în timpul separării. După selecţia mediului de
gelfiltrare cu o selectivitate corectă, volumul probei şi dimensiunile coloanei devin
parametrii critici ce afectează rezoluţia de separare.

Rezoluţia finală, gradul de separare între

peak-uri este influenţată de o multitudine
de factori: raportul dintre volumul probei şi
volumul coloanei, viteza de curgere,
dimensiunile coloanei, mărimea particulelor
suportului cromatografic, distribuţia mărimii
particulelor, densitatea de împachetare,
porozitatea particulelor şi vâscozitatea
fazei mobile. Succesul unei separări prin
cromatografie de excluziune moleculară
depinde în cea mai mare măsură de
alegerea condiţiilor care să conducă la o
selectivitate suficientă alături de
contracararea efectelor de împrăştiere a
peak-ului în timpul separării.
 Rezoluţia este funcţie de selectivitatea
mediului suport cromatografic şi de
eficienţa acestuia în producerea unor
peak-uri cât mai înguste (cu o împrăştiere
minimă a peak-ului) după cum este ilustrat
în figura alăturată.
Eficienţa unei coloane împachetate
este definită drept capacitatea acesteia de
a produce peak-uri înguste şi simetrice în
timpul eluţiei. Eficienţa este un parametru
deosebit de important în mod particular în
cromatografia de excluziune moleculară
deoarece separarea are loc numai într-un
volum de tampon egal cu volumul
coloanei, tampon ce traversează coloana.
 VOLUMUL PROBEI ŞI DIMENSIUNILE COLOANEI

Volumul probei este exprimat ca procente din volumul total al coloanei

împachetate. Utilizarea unor probe cât mai mici conduce la evitarea
suprapunerii dacă peak-urile sunt prea apropiate. Figura de mai jos arată cum
influenţează volumul probei în cazul fracţionării de rezoluţie înaltă
 În mod curent, pentru fracţionări este recomandat
un volum de probă egal cu 0,5–4% din volumul total al
coloanei, acesta depinzând de tipul de mediu utilizat. În
cele mai multe aplicaţii, este preferabil ca volumul probei
să nu depăşească 2% pentru a avea o rezoluţie maximă.
Funcţie de specificitatea probei, este posibil să se
introducă un volum mai mare de probă, în particular când
peak-urile de interes sunt bine rezolvate. Din această
cauză, volumul probei poate fi determinat numai pe cale
experimentală.
În cazul separărilor analitice ori în cazul separării
unor probe complexe este avantajos a se începe cu
un volum egal cu 0,5% din volumul total al
coloanei. Un volum al probei mai mic de 0.5% nu
creşte în mod normal rezoluţia. Pentru a creşte
capacitatea de separare prin gel filtrare, proba poate
fi concentrată. Este preferabil a nu utiliza probe cu o
concentraţie mai mare de 70 mg/ml proteină,
datorită efectelor de vâscozitate care în consecință
conduc la interferenţe în separare.
Diluţia probei este inevitabilă datorită fenomenului de
diluţie care se manifestă la trecerea probei prin
coloană. În scopul de a minimaliza diluţia probei,
este preferabil a utiliza maximul volum al acesteia
pentru a obţine rezoluţia maximă necesară între
peak-urile de interes.
 Înălţimea patului cromatografic, împachetat în coloană afectează
atât rezoluţia cât şi timpul necesar eluţiei. Rezoluţia de separare în gel
filtrare creşte cu pătratul rădăcinii înălţimii patului cromatografic. O
dublare a înălţimii stratului cromatografic conduce la o creştere a
rezoluţiei cu un echivalent de = 1,4 (40%).

În cazul fracţionărilor de înaltă rezoluţie, sunt de preferat coloanele

lungi care vor da cele mai bune rezultate în timp ce o înălţime a patului
de gel cuprinsă între 30–60 cm va conduce la rezoluţii satisfăcătoare. O
înălţime suficientă a stratului de gel alături de o viteză scăzută de
curgere dau suficient timp tuturor moleculelor intermediare să
difuzeze în şi în afara porilor matrix-ului cromatografic conducând
astfel la rezoluţii bune.
Dacă este necesară o coloana foarte lungă,
înălţimea efectivă a patului de gel poate fi crescută
prin utilizarea mai multor coloane care conţin
aceleaşi suport cromatografic, cuplate în serie.
 SELECŢIA SUPORTULUI CROMATOGRAFIC

Selecţia corectă a gelului suport reprezintă o etapă critică în

succesul unei separări gel cromatografice. Cele mai multe experimente
de excluziune moleculară pot fi clasificate în separări de grup şi în
fracţionări de înaltă rezoluţie.
SEPARĂRILE DE GRUP pot fi divizate, funcţie de solut, în două
grupe: fracţionări de soluţi cu masă moleculară relativ mică şi fracţionări se
soluţi cu masă moleculară relativ mare.
Exemplele: desalifierea soluţiilor de proteine sau îndepărtarea unor
molecule mici de contaminanţi din extracte de proteine/acizi nucleici.
Pentru separările de grup, gelul trebuie ales astfel încât să conducă
la o excluziune completă a moleculelor cu masă moleculară mare în void
volume. În acest scop sunt recomandate Sephadex G-25, Bio-Gel P-6, şi
Sephacryl S-100HR pentru cele mai multe separări de grup. Mărimea
recomandată a particulelor este de 100 - 200 mesh ori particule cu un
diametru de 50 - 150 μm.
 Fracţionarea implică separarea gupelor de soluţi (analiți)
cu mase moleculare similare dintr-un amestec
multicomponent. În acest caz, gel trebuie ales astfel ca
domeniul de fracţionare să includă masele moleculare dorite a
se separa din solut. Dacă amestecul de solut conţine
macromolecule cu mase moleculare de până la 120000 Da,
cele mai potrivite suporturi cromatografice sunt
Bio-Gel P- 150,
Sephacryl S-200 HR ori
Sephadex G-150.
În cazul utilizării Bio-Gel P-100, Sephadex G- 100 sau
Sephacryl S- 100 HR o serie de proteine din probă cu masă
moleculară mai mare vor elua în void volume. Pe de altă
parte, dacă se utilizează dacă se utilizează Bio-Gel P-200,
Bio-Gel P-300 ori Sephadex G-200 acestea vor scădea atât
rezoluţia cât şi viteza de curgere.
 În cazul în care domeniul de masă
moleculară a amestecului de solut este
necunoscut, este necesară o selecţie
empirică a suportului cromatografic.

În cazul celor mai multe fracţionări se

recomandă utilizarea suporturilor
cromatografice de 100-200 ori 200-400
mesh (20-80 μm ori 10-40 μm).
În cazul gelurile celor mai fine este
recomandabil a se selecta o viteză de
curgere optimă.

Pentru separări analitice de mare finețe,

gradul superfine oferă cea mai bună
rezoluţie dar vitezele de curgere sunt
foarte scăzute.
 APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE
EXCLUZIUNE MOLECULARĂ
Cromatografia de excluziune moleculară este subdivizată
în gel filtrare şi în cromatografie de gel permeaţie. Prima
utilizează solvenţi apoşi suporturi cromatografice hidrofile.
Cel de al doilea tip de cromatografie este bazat pe solvenţi
organici neapoşi şi suporturi cromatografice hidrofobe.
Aceste metode sunt complementare în sensul că una este
aplicabilă pentru probe solubile în apă, în timp ce a doua
este aplicabilă substanţelor solubile în solvenţi mai puţin
polari.
Una dintre cele mai utilizate aplicaţii ale excluziune pe
baza mesei moleculare este separarea unor molecule cu
masă moleculară mare de speciile de molecule cu masă
moleculară mică ori de separarea lor de săruri.
 De exemplu, un gel cu o limită de excluziune de câteva mii,
poate separa clar, proteine de aminoacizi şi de peptide cu
masă moleculară mică.
O altă aplicaţie a cromatografiei de gel permeaţie o
reprezintă separarea unor omologi ori a unor oligomeri.
Această aplicaţie este ilustrată în figura de mai jos, unde este
prezentată separarea unor acizilor graşi din domeniul de masă
moleculară 116 - 344 pe un suport pe bază de polistiren,
împachetat, cu o limită de excluziune de 1000.
 Sephadex-ul poate fi utilizat de asemenea în cromatografia
de excluziune moleculară pentru separare în prezenţa unor
solvenţi organici precum dimetilformamida, în cazul Sephadex
G-10 ori a unor amestecuri de apă cu alcooli cu catenă scurtă,
în cazul Sephadex G-10, G-25 şi G-50.
Separările de grup: componentele probei sunt separate în două grupuri
majore, funcţie de domeniul mărimii lor. O separare de grup poate fi
utilizată la îndepărtarea contaminanţilor cu masă moleculară mare sau
mică (cum ar fi îndepărtarea roşului de fenol din fluidele și mediile de
cultură, desalifierea sau la schimbarea tampoanelor de lucru.

O cromatogramă care ilustrează o

separare de grup. Proba: ● =
hemoglobină, x = NaCl. Volumul probei:
a) = 10 ml, b) = 400 ml. Hemoglobina
este elutată în void volumul coloanei
(de exemplu, 370 ml) în timp ce clorura
de sodiu este eluată cu un volum total
de lichid (860 ml). Aproape tot volumul
de pori este utilizat în desalifiere.
Coloana de 85 X 4 cm diametru interior
este împachetată cu Sephadex G-25
Medium.
Fracţionarea de înaltă rezoluţie a
biomoleculelor: componentele probei
sunt separate ân funcţie de diferenţele
în masă moleculară. Fracţionarea de
înaltă rezoluţie poate fi utilizată în
izolarea unuia sau mai multor
componente, la separarea monomerilor
din agregate, la determinarea masei
moleculare ori la realizarea analizelor de
distribuţie a masei.
 DETERMINAREA MASEI MOLECULARE PRIN
ANALIZE DE DISTRIBUŢIE

Curbă de calibrare pentru determinarea masei moleculare a proteinelor prin

cromatografie de excludere sterică. Suportul cromatografic este Sephadex G-100.
Gel filtration chromatogram showing the elution profile
of Mj GATase (monomer) and ATPPase (dimer) on a
Superdex-200 column. The inset shows the molecular
weight calibration curve obtained using β-amylase,
ADH (alcohol dehydrogenase), BSA (bovine serum
albumin), carbonic anhydrase, and cytochrome c as
the molecular weight markers.
Gel filtrarea poate fi de asemenea
utilizată la facilitarea reîmpachetării
proteinelor denaturate prin controlul intim
(atent) în schimbarea condiţiilor de
tamponare.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

Domeniul de timp de rezidenţă în  Tehnica poate fi aplicată la

interiorul porilor de gel depinde de purificarea unor analiți (proteine,
mărimea efectivă a moleculelor de analit. acizi nucleici, enzime, polizaharide
ori a altor biomolecule), la
determinări de mase moleculare ori
SUPORTURI UTILIZATE ÎN la analize cantitative ale interacţiilor
CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRARE moleculare.

copolimer reticulat Faza staţionară este constituită din

de stiren-divinil particule inerte care conţin pori mici cu
benzen dimensiuni controlate.

geluri pe bază de 1. a. dextran (reticulat cu epiclorhidrină- microsfere de polimer

Sephadex); particule ce au la bază silice
b. dextran (reticulat cu NN'- metilen bisacrilamidă- Sephacryl);
c. dextran (reticulat cu 2,3-dibromopropanol -Sepharose CL )
d. alil dextran (reticulat cu NN'- metilen bisacrilamidă- Superdex)

geluri pe bază de agaroza ca atare Bio-Gel A

geluri pe bază de acrilamidă reticulată cu NN'-
metilen bisacrilamidă- Bio-Gel P Gelurile combinate de poliacrilamidă şi agaroză
Ultragel
Sephadex LH-20
 Relationships between Degree of
Polymerization and Antioxidant
Activities: A Study on
Proanthocyanidins from the
Leaves of a Medicinal Mangrove
Plant Ceriops tagal

Alzheimer’s disease is a chronic

neurodegenerative disorder which is
characterised by a loss of cognitive ability,
severe behavioral abnormalities and ultimately
death. Alzheimer’s disease is the most common
cause of dementia among the elderly and there
are currently 2.5 to 4.0 million estimated
Alzheimer’s disease patients in the United States
and some 17 to 25 million worldwide [1,2]. One
treatment strategy to enhance cholinergic
functions is the use of acetylcholinesterase
(AChE, EC3.1.1.7) inhibitors to increase the
amount of acetylcholine present in the synapses
between cholinergic neurons. In this respect, use
of a selective inhibitor for acetylcholinesterase Agrimonia pilosa Ledeb
has attracted particular attention for treatment
of the Alzheimer-type dementia [3].
 capacitatea de îmbibare cu o soluţie apoasă, cantitatea de lichid necesară obţinerii unui gram de gel
(water regain). Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran, posedă un water regain de aproximativ 1
ml/g de gel uscat în timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin dextran reticulat are un water regain de
aproximativ 20 ml/g de gel uscat.
 volumul particulelor (bed volume)
Volumul spaţiului gol (void volume). Acesta reprezintă spaţiul
total din jurul particulelor de gel într-o coloană împachetată. Valoarea
volumului spaţiului gol se determină prin măsurarea volumului de
solvent necesar eluării unui solut care este complet exclus din
matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi calibrate în scopul
determinării acestui parametru prin eluţia a unui colorant, blue
dextran 2000, care are o masă moleculară medie de 2000000
daltoni.
Volumul ocupat cu gel (Vt)
Volumul de eluţie. Acest volum reprezintă volumul de tampon de
eluţie necesar îndepărtării unui anumit solut, particular, dintr-o
coloană împachetată.
 Forma şi mărimea particulei de gel. În condiţii ideale, particulele de gel sunt sferice,
pentru a furniza un strat uniform de gel, cu o mare densitate a porilor. Mărimea
particulelor este definită prin mărimea ochiurilor acesteia (mesh) ori prin diametrul
sferei particulei.
Gradul de rezoluție oferit de viteza de curgere prin coloană depinde de dimensiunile
particulelor de gel. Particulele pot fi coarse, medium, fine şi superfine
Particulele cele mai mari (50 la100 mesh, 100 la 300 μm) oferă viteze de curgere
înalte dar o separare cromatografică cu rezoluţie scăzută.
În caz opus se află particulele de gel cu dimensiuni foarte mici ("superfine," 400
mesh, 10 la 40 μm).
 Limita de excluziune. Ea este definită ca
masa moleculară a celei mai mici molecule care
nu poate difuza în interiorul volumului de matrix
de gel. Toate moleculele mai mari decât această
masă vor fi eluate rapid, într-o singură zonă
 Domeniul de fracţionare. Domeniul de mase
moleculare de solut care se vor separa pe un gel
de excluziune sterică. Moleculele de solut din acest
domeniu, se vor separa într-o relaţie rerlativ
lineară, în funcţie de masa lor moleculară.

Coeficientul de partiţie
(disponibilitate, Kav) între faza Ve - Vo
lichidă şi faza de gel este o variabilă Kav =
independentă în ceea ce priveşte Vt - Vo
compactarea stratului de gel.
 CROMATOGRAFIA PLANARĂ LICHID-
LICHID

Principial, în cromatografia de partiţie lichid-lichid sunt utilizate

două faze lichide, o fază legată la un suport inert, denumită fază
staţionară şi o altă fază lichidă, denumită fază mobilă care
traversează faza staţionară şi care distribuie componente solutului,
în aceste două faze.
Componentele solutului/analitului prezintă
solubilitate în cele faze.
Procesul care se produce este deseori complicat de
apariţia unor fenomene de adsorbţie a substanţelor şi a fazei
mobile de către suportul inert.
Cromatografia de partiţie se poate realiza
pe coloane ( de exemplu coloane cu
pudră de celuloză), dar cele mai comune
şi utilizate metode sunt cele care
utilizează ca suport hârtia (cromatografia
pe hârtie, foarte rară) ori un strat subţire
de silicagel, alumină, celuloză depus pe
un suport solid de tipul sticlei, foliei de
aluminiu sau din material plastic
(cromatografia pe strat subţire, CSS, thin-
layer chromatography, TLC).
 Celuloza, ca şi alţi polimeri naturali ori sintetici, poate
lega o cantitate mare de apă. Astfel procesul de
separare cromatografică va implica partiţia
componenţilor probei între apa (solventul apos) legată
de suportul inert (faza staţionară) şi solventul de
developare (faza mobilă).

Frecvent, unul din componentele de developare îl

reprezintă apa.
În condiţiile în care între apă şi componentul organic
există un fenomen de nemiscibilitate, este
adăugat un al treilea component (solvent) care este
capabil să se amestece atât cu apa cât şi cu primul
component organic, pentru a se crea o singură fază
organică de solvent. Este cazul etanolului din sistemul
apă:etanol:nitrometan, unde etanolul este capabil să se
dizolve atât în apă cât şi în solventul organic, de
exemplu.
 Metodele de cromatografie planară includ:
 cromatografia pe strat subţire,
 cromatografia pe hârtie şi
 electrocromatografia.
Oricare dintre aceste metode utilizează un strat subţire
relativ plat care reprezintă el însuşi suportul cromatografic (de
exemplu, hârtia) ori pe suprafaţa căruia se află depus acest
suport.
Faza mobilă se deplasează prin faza staţionară sub
acţiunea forţei de capilaritate, a forţei gravitaţionale ori sub un
gradient de potenţial.
 Cromatografia pe strat subţire
Din punct de vedere teoretic al tipurilor de fază mobilă şi
staţionară utilizate în cromatografia pe strat subţire, există o
similare deosebită cu cromatografia lichidă pe coloană. O
caracteristică importantă a cromatografiei pe strat subţire (thin
layer chromatography, TLC) o reprezintă faptul că ea serveşte
drept ghid în dezvoltarea condiţiilor optime de realizare a
separării prin cromatografie lichidă pe coloană. Avantajele
utilizării acestui procedeu îl reprezintă viteza şi preţul scăzut ale
experimentelor exploratorii pe strat subţire.
O serie de experimentatori, de fapt, efectuând experimente
de cromatografie pe strat subţire îşi formează o opinie în
efectuarea experimentelor următoare pe coloană. În plus, la
utilizarea acestei metode la dezvoltarea metodelor
cromatografice pe coloană, TLC a devenit o metodă comună în
industria medicamentului, pentru determinarea purităţii
produselor.
 Ea este răspândită chiar și în laboratoarele clinice şi
reprezintă baza multor studii biochimice şi biologice. În plus,
metoda este larg utilizată în laboratoarele industriale. Drept
consecinţă a acestei largi arii de aplicare, s-a estimat că
numărul de analize efectuate prin cromatografie pe strat subţire
este cel puţin egal cu cel realizat prin cromatografie lichidă de
înaltă performanţă.
În mod clasic separările prin cromatografie pe strat subţire
sunt realizate pe suporturi din sticlă, folie de aluminiu ori plastic
care sunt acoperite cu un strat subţire şi aderent de de particule
fine; acest strat reprezintă suportul inert.
Particulele sunt similare celor utilizate în cromatografia de
adsorbţie, partiţie normală sau inversă, cromatografie de
excluziune moleculară. Fazele mobile sunt similare celor
utilizate în cromatografia lichidă de presiune înaltă.
Domeniile actuale de aplicare ale cromatografiei pe strat subţire

Domenii de aplicare Tipul de analize

Aplicaţii clinice Lipide
Studii metabolice
Screening-ul unor medicamente
Control antidrog (antidopping)
Aplicaţii industriale Dezvoltarea proceselor şi optimizarea lor
Monitorizarea unor procese
Validarea unor procese
Industrie alimentară Controlul calităţii
Aditivi (de exemplu, vitamine)
Pesticide
Teste de stabilitate (expirare)
Medicină legală Detectarea unor documente false
Investigaţii în otrăviri
Analize de vopsele
Aplicaţii farmaceutice Teste de control al uniformităţii
Analiza identităţii sau purităţii
Teste de stabilitate
Analize de mediu Apă
Sol
Analize de reziduuri
TLC Analysis Of a
Cosmetic Active on
HPTLC Silica Gel 60
F254 (analyte set 1)
 SUPORTURI CROMATOGRAFICE

Suporturile utilizate în cromatografia pe strat

subţire sunt comercializate în două forme, pentru
cromatografie pe strat subţire convenţională şi
cromatografie pe strat subţire de înaltă performanţă.
Primele posedă un strat subţire de 200-250 μm
înălţime care conţine particule cu o dimensiune de 20
μm sau mai mari.
Suporturile de înaltă performanţă posedă un strat
cromatografic de 100 μm înălţime cu diametrul
particulelor de 5 μm sau mai mici. Suporturile de înaltă
performanţă, după denumire, conduc la separări
precise, în interval de timp scurt. Astfel suporturile
cromatografice convenţionale posedă 2000 de talere
teoretice pe o distanţă de 12 cm, într-un timp de
developare ce cca. 25 minute. Suporturile
cromatografice de înaltă performanţă prezintă 4000 de
talere teoretice pe o distanţă de 3 cm. care necesită
circa 10 minute pentru dezvoltare, dar au însă
dezavantajul unei capacităţi reduse în ceea ce priveşte
volumul probei adăugate.
 În mod diferit de cromatografia lichidă de presiune înaltă şi de gaz
cromatografie unde faza mobilă reprezintă un parametru ce poate fi uşor
menţinut la o viteză specificată, în cromatografia pe strat subţire viteza fazei
mobile nu poate fi în general controlată în afară de cazul în care se
utilizează tehnica de developare cu curgere forţată.
Viteza de curgere este afectată de natura suportului cromatografic
(porozitate, împachetare, mărimea particulelor, etc.) cât şi de proprietăţile fazei
mobile (vâscozitate, tensiune de suprafaţă, presiunile de vapori ale solvenţilor,
etc.). În general viteza scade în timpul dezvoltării plăcii cromatografice (figura
de mai jos).
Datorită fenomenului de creştere a rezistenţei fazei staţionare faţă de
curgerea fazei mobile, în condiţiile utilizării unor suporturi de cromatografie pe
strat subţire de performanţă înaltă, se pot obţine rezultate superioare numai în
cazul unor distanţe scurte de developare.
În condiţiile menţinerii altor parametrii constanţi, rezoluţia Rs a doi
compuşi este mai dependentă de poziţia lor relativă pe cromatogramă
(RF) decât de distanţa de migrare a frontului (distanţa de developare).
Relaţia dintre distanţa de developare şi
timpul de developare în condiţiile utilizării
unui suport de silicagel HPTLC silicagel 60.
Faza mobilă: toluen/acetat de etil (1) şi
acetat de etil/metanol/apă/acid formic (2).
 PERFORMANŢELE SUPORTURILOR DE
CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBŢIRE

Majoritatea termenilor şi relaţiilor care caracterizează cromatografia pe coloană, pot

fi adaptaţi, uşor, cu mici modificări, cromatografiei pe strat subţire. Un termen nou,
factorul de retardare, RF este necesar a se prezenta în contextul cromatografiei pe strat
subţire.
Cromatografia pe strat subţire pentru un singur
solut este prezentată în formă de cromatogramă
figura de mai jos. Factorul de retardare pentru un
singur solut este dat de relaţia:

unde dR şi dM reprezintă distanţele lineare

măsurate de la linia de start până la mijlocul
spotului respectiv până la frontul de solvent.
Valorile pentru RF pot varia de la 1 pentru soluţii
care nu sunt întârziaţi şi care migrează odată cu
frontul până la o valoare apropiată de 0, pentru
soluţii care nu interacţionează cu faza mobilă.
Trebuie notat că dacă spoturile nu sunt simetrice,
cum de altfel se întâmplă frecvent, măsurarea dR
se efectuează de la linia de start până în punctul
de maximă intensitate al spotului.
 Variabilele care influenţează factorul de retenţie

Pentru a obţine cele mai corecte valori ale RF, este nevoie de o
precizie mare şi o mare reproductibilitate. Cei mai importanţi factori de
care depinde exactitatea (determinare magnitudinii RF), includ
grosimea stratului de suport, deci a fazei staţionare, contaminarea
(conţinutul în umiditate) a fazelor mobilă şi staţionară, temperatura,
gradul de saturaţie a camerei de developare cu vapori de fază mobilă
ori mărimea probei. Un control complet al acestor factori variabili nu
sunt în general controlabili în condiţii practice. Ameliorarea parţială a
acestor efecte poate fi deseori realizată totuşi prin substituirea cu un
factor relativ de retenţie RX a factorului de retardare, RF care reprezintă
raportul dintre distanţa parcursă de analit şi distanţa parcursă de o
substanţă standard.
 Aplicaţii ale cromatografiei pe strat subţire

Datele obţinute dintr-o singură cromatogramă de obicei nu

furnizează informaţii suficiente pentru a permite identificarea
diverselor specii prezente într-un amestec din cauza variabilităţii
valorilor RF cu mărimea probei, stratul subţire cromatografic şi
condiţiile existente în timpul cromatografierii. În plus, întotdeauna
există posibilitatea ca doi soluţi diferiţi să manifeste proprietăţi
cromatografice asemănătoare, cu valori RF identice sau foarte
apropiate în condiţiile de separare date.
Autentificarea unei substanţe prin utilizarea unei standard.

O metodă care deseori furnizează date importante în tentativa identificării unor

componente din probă este cea de aplicare pe placa cromatografică a unui spot cu
conţine un compus din specia căutată purificată ce este probabil prezentă în cea
necunoscută. Se compară apoi valorile RF între spotul substanţei necunoscute cu cel
al standardului. Valorile identice ale celor două RF furnizează o dovadă solidă a
identităţii celor două componente ale probei (figura de mai jos). Totuşi, confirmarea
este întotdeauna necesară. Un test uşor de confirmare este de a repeta experimentul
cu faze mobile şi staţionare diferite cât şi cu reactivi de vizualizare diferiţi.

Separarea unor derivaţi xantinici pe un

suport de cromatografie pe strat subţire
tip C-18 de fază inversă. Faza mobilă:
metanol/ K2HPO4, 0,l M (55:45 v/v).
Detecţie: vapori de iod. Timpul de separare
cromatografică: 1 oră, valorile RF:
teobromină, 0,68; teofilină, 0,56; cafeină,
0,44; 3-izobutil-1-metil xantină, 0,21.
 Cromatografia planară bidimensională
Figura de mai jos ilustrează separarea unor aminoacizi dintr-un amestec prin
cromatografiere în două dimensiuni. Proba se plasează în colţul unei plăci cromatografice de
formă pătrată. Cromatografierea se realizează în direcţie ascendentă, în solventul A. Acest
solvent este apoi îndepărtat prin evaporare iar placa cromatografică este rotită cu 90o, după
care se cromatografiază ascendent cu solventul B.

Cromatogramă bidimensională pe strat subţire

(silica gel) a unor aminoacizi. Solventul A:
toluen/2-clor etanol/piridină. Solvent B:
cloroform/alcool benzilic/acid acetic.
Aminoacizi: (1) acid aspartic, (2) acid
glutamic, (3) serină, (4) β-alanină, (5) glicine,
(6) alanină, (7) metionină, (8) valine, (9)
izoleucină şi (10) cisteină.
 Analize cantitative

O estimare semicantitativă a cantităţii de

component prezent poate fi obţinută prin
compararea ariilor spoturilor cu cea a
standardelor. Date mai exacte pot fi obţinute prin
răzuirea spotului de pe placa cromatografică,
urmată de extracţia sa de pe aceasta după care
se recurge la măsurarea printr-o analiză fizico-
chimică convenabilă. A treia metodă este cea
care se realizează prin scanarea cu ajutorul unui
densitometru şi care se pretează la determinări
ale radiaţiei emise de spot, prin fluorescenţă ori
prin reflecţie
 Cromatografia planară în laboratorul clinic

AMINOACIZI În laboratoarele clinice, estimarea acizilor

liberi în fluidele biologice şi ţesuturi prin
cromatografiei în strat subţire conduce la
punerea unor diagnostice în maladii
congenitale ale metabolismului
aminoacizilor, cistinuria clasică, cistinuria
heterozigotă, aminoacidopatii, sindrom
Alport,.etc.

ACIZI BILIARI

În scopuri clinice, măsurarea acizilor biliari

din specimene biologice (bilă, ser, conţinut
duodenal şi extracte fecale proaspete)
conduce la punerea unui diagnostic în
cazul unor maladii hepatice şi intestinale
CARBOHIDRAŢI

Multe maladii sunt însoţite de intensificarea eliminării unor diverse

zaharuri în probele biologice. Detecţia şi identificarea lor constituie o
etapă importantă în stabilirea unui diagnostic.

Profilurile lipidice se modifică în diverse patologii, ceea ce conduce

la interesul crescut în determinarea lor în diagnosticul clinic.
Investigarea lipidelor serice, în special a esterilor de colesterol
reprezintă o valoare mare în diagnosticul unor maladii hepato-
LIPIDE funcţionale ori în maladiile legate de metabolismul lipidic. În maladiile
legate de stocarea lipidelor, acumularea de colesterol se manifestă la
nivelul sângelui şi a ţesuturilor. O hiperlipidemie este corelată cu factorii
de risc în maladiile cardiovasculare. Analiza lipidelor serice este de
asemenea importantă în maladiile pielii.
FOSFOLIPIDE
 Porfirinele sunt derivaţi tetrapirolici, intermediari chimici în sinteza
hemoglobinei, mioglobinei ori a altor pigmenţi respiratori, ori a
citocromilor.
Detecţia şi identificarea porfirinelor şi ai precursorilor acestora în
probele biologice sunt de o importanţă terapeutică uriaşă. Ele sunt
PORFIRINE analizate în biochimia clinică în scopul diagnosticării unui grup de
maladii denumite porfirinemii, rezultate ale alterării biosintezei hemului.
Acumularea şi supraproducţia a acestor produşi intermediari în
ţesuturi, sânge, urină ori în fecale indică blocarea metabolică în sinteza
hemului. Aceste maladii sunt asociate cu manifestări acute şi/sau
cutanate.
 PROSTAGLANDINE

Prostaglandine reprezintă una dintre cele mai biologic active familii de

compuşi. Ele sunt acizi graşi C20 nesaturaţi cu un inel ciclopentan.
Derivaţii care conţin această structură (prostaglandine, prostacicline şi
tromboxani) sunt cunoscuţi sub denumirea comună de prostanoizi.
Prostaglandine se manifestă la concentraţii de ordinul nanogramelor
până la cel al picogramelor, în ţesutul uman şi în fluidele corporale. Ele
au diverse acţiuni biologice iar rolul lor fiziologic complet nu este încă
bine cunoscut.
Hormonii steroizi joacă un rol vital în
organismul uman, fiind definiţi prin funcţia lor
biologică. Nivelurile hormonilor steroizi activi
din ser şi produşii lor de eliminare din urină
sunt de mare semnificaţie clinică.

Hormonii glucocorticoizi
contribuie la activitatea
adipogenică în serul uman.
Maladia Addisons este
cauzată de deficienţă
glucocorticoidică în timp ce
în sindromul Cushings se
constată o secreţie masivă.
HORMONI
STEROIZI
Concentraţiile de steroizi estrogenici din urina
umană sunt importante în analiză în timpul sarcinii.
Progesterona este de asemenea implicată în
pregătirea şi menţinerea sarcinii.
Niveluri crescute ale pregnan-3α, 20α-diol şi
allopregnan-3α, 20α-diol urinare au fost observate în
sarcinile timpurii.
Creşterea 6β-hidroxicortizolului urinar este
observată în timpul sarcinii ori în cazuri de
hiperadrenocorticism. Aldosterona urinară este
analizată în scopul identificării pacienţilor suferinzi de
hiperaldosteronism.
Excreţia urinară de metaboliţi andro- şi
glucocorticoizi este studiată la pacienţi suferinzi de
cancer gastric în timp ce excreţia de
dehidroepiandresteronă, şi în particular eticolanolonă
reprezintă un marker în cancerul de sân.
ALŢI COMPUŞI DE INTERES CLINIC

 Gangliozidele reprezintă un grup variat de

glicosfingolipide compuse dintr-o catenă lungă
de bază şi acid gras, care împreună formează
partea ceramidică (N-acilsfingozina). Aceasta
este legată de un carbohidrat. Gangliozidele
sunt caracterizate de prezenţa uneia sau mai
multor unităţi de acid sialic în catena
oligozaharidică. Compuşii de bază sunt acidul
N-acetilneuraminic (Neu5Ac) şi acidul N-
glicolilneuraminic (Neu5Gc), despre care se
cunoaşte că joacă roluri cruciale în diverse
funcţii biologice. Gangliozidele sunt localizate
pe partea externă a membranei plasmatice,
reprezentând un mic procent din lipidele totale.
Ele au fost de asemenea identificate în
asociere cu organitele celulare. Gangliozidele
au un rol important în recunoaşterea celulă-
celulă, adeziune celulară, modularea
proliferării şi diferențierii celulare, fiind
expresate la niveluri înalte pe suprafaţa
celulelor umane, cel mai adesea în
ţesuturile nervoase.
 STUDII DE BIODISPONIBILITATE

Există o experienţă deosebită în utilizarea cromatografiei pe

stat subţire în analiza medicamentelor ori a drogurilor din probe
biologice din medicină, toxicologie, farmacologie, medicină legală,
etc. Analizele de medicamente ori droguri se realizează în probe
biologice diverse: sânge, urină, salivă, conţinut gastric, ţesuturi,
etc. iar tipul şi cantitatea de probă luată în analiză este funcţie de
substanţa care se doreşte a fi determinată. De exemplu, în
screening-ul abuzului de medicamente se utilizează urina
deoarece modalitatea de achiziţie a specimenului este non-
invazivă iar cele mai multe medicamente pot fi detectate chiar
după o durată rezonabilă de timp de la ingestie.
 Analiza drogurilor în laboratoare clinice se realizează prin numeroase
tehnici precum imunoanaliza, metode cromatografice ori de spectrometrie de
masă; alegerea optimă de analiză depinde de cost, efort uman ori tipul de
medicament. Dintre tehnicile cromatografice, cromatografia pe strat subţire cu
suport de silicagel este deosebit de utilizată în cazul programelor de
screening pentru medicamente. Toate probele care se analizează, sunt
supuse unei trepte de pre-purificare, înaintea trimiterii lor la analizele
cromatografice. S-a dezvoltat o metodă computerizată de identificare post-
cromatografică a tipurilor de compuşi, procesul fiind utilizat la studiile de
screening ale unor noi medicamente. Programul computerizat prelucrează
datele cromatografice obţinute experimental cu cele obţinute pentru
medicamente ori droguri cunoscute ori a metaboliţilor acestora regăsiţi în ser,
urină, ori alte specimene.
Cromatografia pe strat subţire rămâne cea mai utilizată tehnică în studiile de
toxicologie şi în programele de screening de abuz de drog/medicament.
Sistemele de eluţie recomandate sunt: acetat de etil/metanol/hidroxid de
amoniu pentru opioizi şi droguri de bază, cloroform/acetonă pentru
barbiturice şi alte droguri acide, heptan/eter etilic/acid acetic şi
cloroform/metanol/hidroxid de amoniu pentru canabinoizi.
 APLICAŢII MODERNE ALE CROMATOGRAFIEI
PLANARE

Cromatografia pe strat subţire reprezintă cea mai utilizată

metodă de detecţie, separare şi monitorizare a fosfolipidelor şi
a glicosfingolipidelor precum şi a unor compuşi de sinteză ori a
unor metaboliţi ai acestora. În particular, utilizarea de anticorpi
monoclonali în procedeul cromatografic pe strat subţire a
contribuit la dezvoltarea analizelor structurale a
glicosfingolipidelor. Există o serie de dificultăţi în extracţia
lipidelor prin utilizarea suporturilor cromatografice pe strat
subţire de performanţă înaltă deoarece contaminarea
silicagelului şi datorită scurgerii stratului subţire de
silicagel în timpul tratamentului. Dacă glicosfingolipidele
sunt transferate de pe placa HPTLC pe o membrană de plastic
cu proprietăţi hidrofobe, această dificultate este surmontată.
 Folosind avantajul
unei bune separări a
lipidelor pe un suport
HPTLC şi de imobilizare a
acestora pe o membrană
s-a dovedit că transferul
optim se realizează pe
membrane de difluorură
de poliviniliden (PVDF),
comparativ cu
membranele de
nitroceluloză, utilizate
iniţial care s-au dovedit a
avea o eficienţă de
transfer scăzută, fără
reproductibilitate.
Membranele de PVDF
sunt foarte stabile la
încălzire şi la diferiţi
solvenţi organici iar în plus
Reprezentarea schematică a metodei de transfer
reţin lipidele cu o eficienţă
de pe suportul cromatografic pe o membrană
deosebită.
sintetică, TLC blotting
 Această metodă a fost de numită tehnica de transfer de pe suportul
cromatografic, pe membrane sintetice, TLC blotting. Procedeul este
utilizat în studiul complexelor lipidice şi este aplicabil în cercetarea
biochimică a lipidelor. Printre utilizările procedeului amintim:
 Purificări la nivel micro (laborator) a complexelor lipidice;
 Analize de spectrometrie de masă a complexelor lipidice, pe
membrane PVDF (Analize TLC blotting/spectrometrie de masă);
 Analize de legare a microorganismelor pe membrane cu un lipid
imobilizat;
 Studiul interacţiilor lipid–proteină pe membrane, cu un lipid
imobilizat.
 IMUNOCOLORAREA MEMBRANELOR DE DIFLUORURĂ DE POLIVINILIDEN.

Antigenii lipidici pot fi imunocoloraţi, direct pe membrană.

După transfer, membranele de difluorură de poliviniliden sunt
imersate într-o soluţie de albumină serică bovină pentru a
bloca legarea nespacifică a proteinelor după care se
incubează peste noapte în soluţia anticorpului primar.
Legarea primului anticorp la antigenul lipidic se detectează
prin reacţia cu un al doilea anticorp (de obicei IgM anti-
şoarece) ce este cuplat cu peroxidază. Tratamentul cu
substrat al acestei enzime conduce la produşi coloraţi care se
vor evidenţia specific la locul de legare al primului anticorp.
Limita inferioară de detecţie pe membrane de PVDF este de
aproximativ 1/5 din antigen, din cea de detectare pe placa
cromatografică ceea ce indică faptul că glicosfingolipidul este
concentrat numai pe o parte a membranei alături de faptul că
nu se manifestă nici un fenomen de natură chimică în timpul
procesului de transfer.
 TLC BLOTTING ÎN PURIFICAREA COMPLEXELOR LIPIDICE

A fost dezvoltată o tehnică de purificare a glicosfingolipidelor şi a

fosfolipidelor, care utilizează tehnica de TLC blotting de pe plăcile de
cromatografie pe strat subţire de performanţă înaltă. Astfel, glicosfingopidele
sau fosfolipidele separate pe plăci HPTLC sunt evidenţiate cu un reactiv pe
bază de primuline (C21H14N3NaO3S3, alte denumiri comerciale Direct Yellow 59,
Primuline Yellow, etc.) care permite detecţia cu mare sensibilitate a
componentelor lipidice (figura de mai jos.). Primulinele sunt derivaţi de
dehidrotiotoluidină, formaţi printr-o reacţie de fuziune cu para toluidină şi sulf, la
temperatură înaltă.
 GEL-FILTRAREA PE STRAT SUBŢIRE
Caracterizarea structurală a părţii carbohidrat a unei glicoproteine implică
determinarea a mărimii unităţii zacharidice. Acest parameteru este uzual calculat din
compoziţia şi masa moleculară a glicopeptidelor care sunt obţinute după degradarea
proteolitică a glicoproteinei intacte. Masa moleculară este în mod obişnuit estimată prin
metode precum echilibrul de sedimentare prin ultracentrifugare şi cromatografia de gel
filtrare.
Tehnica de gel filtrare pe strat subţire a devenit o alternativă atractibilă de
determinare a maselor moleculare a glicopeptidelor datorită vitezei, adaptabilităţii la
cantităţi mici de probă, marii puteri de rezoolvare, posibilităţii de utilizare a unor solvenţi
denaturanţi, şi a utilizării unei aparaturi ieftine. Această tehnică a fost dezvoltată pentru
estimarea masei moleculare a unor proteine (> 12.000 daltoni) utilizând solvenţi
nedenaturanţi ori denaturanţi.
 CROMATOGRAFIA CU FAZĂ INVERSĂ PE COLOANĂ A PROTEINELOR

Cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă reprezintă o

tehnică bine stabilită de izolare, şi de analiză a peptidelor şi proteinelor.
Utilizarea sa în izolarea unei proteine ori de purificare a prezentat un
maximum de interes în purificarea acestora până în momentul dezvoltării
unor suporturi de cromatografie de schimb ionic ori de interacţie
hidrofobă de înaltă eficienţă.
În prezent sunt realizate suporturi de cromatografie de schimb ionic
ori de interacţie hidrofobă apte a realiza nivele de rezoluţie echivalente
cu cele obţinute prin cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă,
fără a prezenta riscul de denaturare a probei şi astfel de pierdere a
activităţii biologice.
Cu toate acestea există o multitudine de aplicaţii în care denaturarea
probei poate fi neglijată ori pot fi tolerate concentraţii crescute de
modificator organic (este cazul analizelor de puritate, studii structurale
ori purificări micropreparative înaintea microsecvenţierii).
Tehnica este deseori utilizată în biotehnologie în monitorizarea unor
procese, studii de puritate sau de determinări ale stabilităţii.
 Cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă

Aplicarea unui gradient de solvent este în mare superioară eluţiei izocratice

deoarece se realizează într-un cadru de timp rezonabil iar împrăştierea peak-
ului este redusă, ceea ce creşte sensibilitatea metodei. În eluţia în gradient în
cazul cromatografiei de înaltă rezoluţie cu fază inversă, proteinele sunt reţinute
esenţial pe baza caracterului lor hidrofob. Mecanismul de retenţie poate fi
considerat atât un fenomen de adsorbţie a solutului la suprafaţa fazei staţionare
hidrofobe cât şi un proces de partiţie între faza mobilă şi cea staţionă.
În primul caz, retenţia este legată de suprafaţa totală interfacială a
suportului împachetat de fază inversă, fiind exprimat prin coeficientul de
adsorbţie, KA. Retenţia se bazează pe asocierea hidrofobă între solut şi liganzii
hidrofobi de pe suprafaţă. Prin creşterea tăriei solventului a fazei mobile, forţele
de atracţie sunt din ce în ce mai reduse proces ce conduce la eluţia solutului.
Procesul poate fi privit ca fiind condus în mod entropic şi endotermic, de
exemplu, atât ΔS cât şi ΔH sunt pozitive. Prin relaţia dintre factorul de
capacitate a solutului k’ şi proprietăţile fazelor mobilă şi staţionară, teoria
solvofobică permite predicţia efectulului modificatorului organic al fazei mobile,
tăria ionică, reactivul de împerechere a ionului, tipul de ligand al suportului
împachetat precum şi alte variabile ce implică retenţia cromatografică a
proteinelor.
 În al doilea caz se consideră o partiţionare a solutului între fazele mobilă
şi staţionară, ultima fiind văzută ca o fază încărcată hidrofob. Acest sistem se
aseamănă cu un sistem bifazic n-octanol/apă a cărui selectivitate este
exprimată prin coeficintul de partiţie P a solutului. În esenţă, procesul efectiv
este în mare parte dependent de organizarea moleculară a catenei n-alchil a
catenei legate în structura suportului de fază inversă în stare solvatată, de
mărimea şi conformaţia solutului.
RETENȚIA PROTEINEI ÎN CAZUL CROMATOGRAFIEI DE ÎNALTĂ
REZOLUŢIE CU FAZĂ INVERSĂ ESTE GUVERNATĂ ÎN PRINCIPAL DE
SUPRAFAŢA PROTEINEI ŞI NU DE CHIMIA SUPRAFEŢEI SUPORT.

Deşi o serie de proteine prezintă o pierdere a activităţii în timpul

cromatografiei de înaltă rezoluţie cu fază inversă, altele îşi menţin total
activitatea biologică. Astfel, forţele hidrofobe necesare legării de faza inversă
competiţionează cu cele necesare menţinerii structurii secundare şi terţiare a
proteinei. Prin constrângeri sterice, hidrofobe şi ionice aceste proprietăţi
structurale definesc o suprafaţă cromatografică sau o „amprentă” a proteinei
care la rândul ei defineşte legarea de faza inversă. Acest concept al ataşării
multipunctuale a proteinei la suprafeţele de adsorbent este consecventă cu o
amprentă cromatografică relativ mare pentru o proteină comparativ cu cea a unei
molecule mici.
 Componentul organic al fazei mobile
Cei mai populari solvenţi organici sunt acetonitrilul, 1-propanolul şi
2-propanolul (alcoolul izopropilic). Propanolii sunt mult mai vâscoși
decât acetonitrilul și de aceea se constată o mai mare presiune pe
coloană însă acest fenomen nu este important în condiţiile în care se
utilizează viteze de curgere mici şi coloane cromatografice scurte.
Concentraţia de acetonitril necesară eluţiei unei proteine este
considerabil mai mare decât concentraţia echivalentă de 2-propanol,
aproximativ jumătate faţă de primul solvent.
S-a evidenţiat de asemenea că acetonitrilul este în mod intrinsec
mult mai denaturant decât alcoolii, procesul de recuperare fiind deseori
mai mare când se utilizează faze mobile care conţin propanol, în special
în cazul în care se separă o serie de proteine precum ovalbumina.
Acetonitrilul şi 2-propanolul pot fi îngheţaţi în amestecuri gheaţă
carbonică/amestecuri de alcooli şi astfel probele pot fi liofilizate.
În separări, toţi solvenţii trebuie să fie de cea mai înaltă calitate
posibilă.
 Aditivi minori la faza mobilă
Componenţii minori cei mai utilizaţi în cromatografia de înaltă rezoluţie
cu fază inversă sunt acizii perfluoroalcanoici (acid trifluoroacetic - TFA şi
acidul heptafluorobutiric, de exemplu). Aceştia par a disocia - solubiliza
proteinele în majoritatea solvenţilor organici utilizaţi în mod curent.
 TFA este preferat în comparaţie cu alţi acizi disociatori deoarece este
complet volatil şi nu va coroda coloana de oţel.
 TFA acţionează de asemenea ca un agent de împerechere de ioni, slab
hidrofob. Cele mai multe coloane utilizate în cromatografia de înaltă
rezoluţie cu fază inversă sunt pe bază de silice şi pe lângă supresia
ionizării silanolului în condiţii acide (şi în consecinţă eliminarea
interacţiilor ionice) ele sunt mult mai stabile la valori scăzute de pH.
Totuşi, trebuie avut în vedere că multe polipeptide îşi vor pierde structura
terţiară la aceste pH-uri.
 Cromatografia cu fază inversă oferă două capabilităţi importante în purificarea şi izolarea unor
proteine sau peptide pentru analizele de proteomică, după cum urmează:
 Înaltă rezoluţie.
 Compatibilitate cu spectroscopia de masă.
Proteinele şi peptidele ce diferă printrun singur rest de aminoacid pot fi deseori separate prin
cromatografie de înaltă performanţă cu fază inversă (RP-HPLC), după cum se observă în figura de
mai jos.
Literatura ştiinţifică conţine multe exemple de separare a unor polipetide similare precum
separarea factorului insulin-like de creştere ce diferă printr-o metionină oxidată de analogul
neoxidat ori a interleukin-2 muteinelor ce diferă printr-o substituţie la un singur aminoacid. În alt
caz, s-au separat variante de insulină care posedă uşoare diferenţe în secvenţa de aminoacizi.

Separarea variantelor de insulină (în ordinea

de eluţie: pui, bovină, ovină, de iepure, de om,
porcină, de şobolan tip I şi de şobolan tip II).
Insulina de iepure conţine o reonină, iar cea
de om o serină, o diferenţă de o grupare metil
într-o proteină de 5300 daltoni. Condiţii de
separare prin RP-HPLC: coloană C4, separare
în gradient de acetonitril cuprins între 27% şi
30% acetonilitril in H2O, în prezenţa a 0,1%
TFA, viteză de curgere 1,5 ml/min.
 Mecanismul separării polipeptidelor prin cromatografie cu fază inversă

Cromatografia cu fază inversă separă polipeptide printr-un mecanism complex, de

adsorbţie, deși în cazul moleculelor mici, acestea sunt separate printr-un mecanism
de echilibru care distribuie moleculele între fazele staţionară şi mobilă în timpul
trecerii lor prin coloană, în timp ce polipeptidele mici fiind prea mari pentru a
pătrunde în faza staţionară hidrofobă, sunt adsorbite de suprafaţă şi desorbite odată
cu creşterea concentraţiilor (polarităților) de fază mobilă (figura de mai jos).

Mecanismul retenţiei de proteine prin RPC. Proteinele pătrund în coloană şi sunt adsorbite la
suprafaţa hidrofobă. Datorită mărimii lor, numai o porţiune a acestor proteine „braţul
hidrofob” se leagă la adsorbent. La adăugarea unor concentraţii precise de solvent organic
proteinele sunt eliberate şi părăsesc suprafaţa coborând de-a lungul colonei.
 În momentul injectării pe coloană, polipeptidele se leagă la suprafaţa
adsorbentului şi se desorb numai când solventul organic atinge o concentraţie
specifică şi unică. Odată desorbite, ele vor interacţiona foarte slab cu suprafaţa
adsorbentului fiind astfel eluate le-a lungul coloanei. Polipeptidele pot fi
imaginate ca o „aluviune” pe faza staţionară, cu cea mai mare parte a moleculei
expusă la faza mobilă şi numai o parte a moleculei, denumită picior hidrofob, în
contact cu suprafaţa de fază inversă.
Diferenţele în „braţul hidrofob” al polipeptidelor rezultă din secvenţa de
amioacizi şi din diferenţele de conformaţie (fenomen discutat în cazul
hidrofobicităţii proteinelor). Desorbţia are loc într-o fereastră îngustă de
concentraţie al unui modificator organic. Astfel, retenţia polipeptidelor este
completă până la atingerea unei concentraţii critice de modificator organic când
acestea sunt rapid desorbite. Sensibilitatea desorbţiei unui polipeptid la o
concentraţie precisă de modificator organic conduce la selectivitatea RPC în
separarea polipeptidelor, în peak-uri în general înguste. Peptidele mici se
desorb mai rapid odată cu schimbarea concentraţiei de modificator organic
decât moleculele mici, totuşi, ele se desorb mai gradual decît proteinele ceea
ce sugerează un mecanism hibrid de separare.
 CROMATOGRAFIA CU FAZĂ INVERSĂ PENTRU
PERECHI DE IONI
Cromatografia cu perechi de ioni este un tip de cromatografie de fază inversă
utilizată la separarea şi determinarea unor specii ionice. Faza mobilă în cromatografia
cu perechi de ioni este constituită din tampoane apoase care conţin un solvent
organic precum metanolul ori acetonitrilul şi un compus ionic care conţine un
contraion cu sarcină opusă analitului. Contraionul este un ion care se combină cu
ionii analitului pentru a forma o pereche de ioni, neutră, specie care se reţine pe
un suport de fază inversă.
Sisteme cromatografice cu fază inversă pentru perechi de ioni.

Tipul fazei
Proba Faza mobilă Contraion
staţionare
Amine HClO4, 0,1 M /H2O/acetonitril CIO4- FLa
H2O/CH3OH/H2SO4 C12H25SO3- FL
Acizi carboxilici pH 7,4 (C4H9)4N+ FL
pH 7,4 (C4H9)4N+ Lb

Acizi sulfonici H20/C3H7OH (C16H33)(CH3)3N+ FL

pH 7,4 (C4H9)4N+ Lb
pH 3,8 Bis-(2-etilhexil)fosfat Lc
Coloranţi pH 2-4;H20/CH3OH (C4H9)4N+ FL
CROMATOGRAFIA DE
ADSORBȚIE
Cromatografia de adsorbţie,
ori cromatografia lichid-solid,
reprezintă forma clasică a
cromatografiei lichide, care a fost
introdusă, pentru prima dată, de
către Tswett, la începutul secolului
douăzeci. În ultimii ani ea a fost
adaptată, devenind o metodă
importantă în cromatografia lichidă
de înaltă presiune (HPLC).
 În cromatografia de adsorbţie compuşii ce se doresc separaţi sunt adsorbiţi pe
suprafaţa unui material solid, fiind apoi desorbiţi din solidul adsorbent prin eluţie cu un
solvent. Separarea compuşilor depinde de balanţa relativă dintre afinitatea
compuşilor pentru adsorbent şi solubilitatea lor în solventul utilizat. Afinităţile
relative ale compuşilor ce se doresc separaţi sunt funcţie de natura chimică a
substanţei, de natura solventului şi de natura adsorbentului.

Cromatografia de adsorbţie: A = adsorbent, S

= probă, ES = solvent de eluţie. (1) aplicarea
probei la capătul superior al coloane
cromatografice; (2) adsorbţia probei pe
suportul adsorbent. (3) adăugarea de solvent
de eluţie;. (4) şi (5) fracţionarea parţială a
componentelor 2 si 3; (6) fracţionarea
completă a probei; (7) şi (8) Separarea tuturor
celor trei componente la diverse stadii de
eluţie; (9) eluţia primului component de pe
coloană.
 Adsorbenţii solizi utilizaţi în mod obişnuit sunt alumina,
silicagelul, cărbunele, celuloza, amidonul, gelurile de
fosfat de calciu sau hidroxilapatită şi sucroza. În
cromatografia modernă fazelele staţionare cel mai mult
utilizate în sunt silicea şi alumina, ultima dintre acestea fiind
cea mai preferată în cele mai multe aplicaţii datorită
capacităţii sale înalte de încărcare cu probă şi datorită
domeniului larg de forme utilizabile.
 Solvenţii obişnuit utilizaţi sunt: hexanul, benzenul,
eterul de petrol, dietil eterul, cloroformul, clorura de
metilen, diverşi alcooli (etil, propil, n-butil şi t-butil
alcooli), alături de diferite tampoane apoase şi săruri, unele
în combinaţie cu solvenţii organici.
 Cu puţine excepţii, caracteristicile
de adsorpţie a două substanţe care se
pot compara, ordinea timpilor de retenţie
fiind: olefine < hidrocarburi aromatice <
halide, sulfuri <eteri < nitro-compuşi <
esteri ≈ aldehide ≈ cetone < alcooli ≈
amine < sulfone < suloxizi <amide <acizi
carboxilici (suprafeţele de silice şi
alumină sunt înalt polare, eluţiile
efectuându-se în mod obişnuit cu faze
mobile oarecum mai puţin polare.
 Astfel, o serie de cercetători tratează
cromatografia de adsorpţie drept un tip
de cromatografie de fază normală.
 APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE ADSORBŢIE

Tehnica cromatografie de adsorbţie este cea mai fezabilă pentru compuşi nepolari
care posedă mase moleculare mai mici de 5000.
Cu toate că există o suprapunere între cromatografia de adsorbţie şi cea de
partiţie, metodele tind a fi complementare.

O aplicaţie caracteristică a
cromatografiei de adsorbţie în
separarea cis- şi trans-pirazolinelor.
Coloană: 100 x 0.3 cm, suport silice
peliculară. Fază mobilă: clorură de
metilen/izooctan 50%/50%. Temperatura:
ambiantă. Viteză de curgere: 0,225
mL/min. Detector: UV, 254 nm.
 CROMATOGRAFIA PE HIDROXIAPATITĂ

O condiţie necesară în oricare strategie de purificare a

proteinelor o reprezintă combinarea tehnicilor care
exploatează diferite principii de separare în scopul
atingerii purificării celei mai înalte utilizând un număr
cât mai redus de trepte de purificare. În general,
combinări ale unor tehnici precum cromatografia de
schimb ionic, cromatografia de interacţie hidrofobă,
cromatografia de afinitate, cromatografia de afinitate cu
metal chelat, cromatografia de excluziune moleculară şi
cromatografia de fază inversă oferă cele mai versatile
abordări în design-ul unui protocol de purificare a
proteinelor. Aceasta este datorată faptului că metodele de
separare au la bază principii bine caracterizate şi
predictibile.
Pentru o multitudine de raţiuni, cromatografia pe
hidroxilapatită (HAP) a căpătat numai o popularitate
marginală ca metodă de purificare a proteinelor.
HAP prezintă comportament cromatografic nepredictibil, o
capacitate relativă mică de încărcare a probei şi proprietăţi
de manipulare relativ dificile. Pentru aceste raţiuni, HAP
este deseori considerată drept ultima alegere in
metodologia de separare a proteinelor. Pe de altă parte,
cum procesele de adsorbţie-desorbţie a proteinelor diferă
semnificativ de alte tehnici precum de exemplu
cromatografia de schimb ionic, uneori este posibil de a
obţine fracţionări a căror calitate nu poate fi realizată prin
alte tehnici cromatografice, unde deseori tehnicile
cromatografice convenţionale pot fi de nefolosit.
 Fosfatul de calciu a fost deseori utilizat în purificarea
proteinelor şi a enzimelor cu succese diferite încă de la
începutul cercetării ştiinţifice în domeniu, de către Brucke
(1861) în purificarea pepsinei.
În anul 1956, Tiselius şi colaboratorii (1956) au arătat că un
suport cromatografic mai adsorbent de proteine este realizat
prin conversia brushitei, Ca3(PO4)2, la hidroxiapatită,
Ca5(PO4)3OH, (Ca10(PO4)6(OH)2) prin fierbere într-o soluţie de
NaOH 1% timp de 1 oră. În continuare, cristalele fine de
hidroxiapatită pot fi separate prin decantare înainte de
împachetarea coloanei.
 Hidroxiapatita leagă mai puternic proteinele native, iar
capacitatea de retenţie scade semnificativ în cazul
proteinelor supuse procesului de denaturare.
 Retenţia proteinelor pe suportul de hidroxiapatită nu este
uşor precizabil.
 Deşi hidroxiapatita leagă atât proteine acide cât şi pe
cele bazice nu se poate vorbi de un mecanism simplu de
cromatografie prin schimb ionic în comportamentul
cromatografic observat. Structura de suprafaţă a cristalelor
de hidroxiapatită este reprezentată de un mozaic de
situsuri de adsorbţie pozitive (ionii de calciu) şi negative
(ionii fosfat).
Adsorbţia unor componenţi anionic se realizează la
domeniul de sarcini pozitive reprezentat de ionii de calciu (situs
C), în timp ce domeniile de sarcini negative ce cuprind ionii
fosfat (situsurile P) pot fi considerate drept schimbătoare de
cationi. Se poate considera astfel HAP drept o tehnică
cromatografică de "pseudo-afinitate" sau drept o metodă
de cromatografie de schimb ionic de tip "mixt".
La valori de pH neutre şi alcaline, suprafaţa de hidroxiapatită
este încărcată negativ datorită grupărilor fosfat.
 MECANISMUL LEGĂRII PROTEINELOR LA HIDROXIAPATITĂ

Mecanismul legării proteinelor la hidroxiapatită şi de eluţie

de pe aceasta a fost explicitat de către Gorbunoff. El se
manifestă prin:
(1) complexarea specifică a grupărilor carboxil proteice cu
locii de calciu ale cristalelor de hidroxiapatită (de exemplu
complexe, [HACa-OOC - proteină]) şi prin
(2) atracţia nespecifică dintre grupările amino încărcate pozitiv
ale proteinelor şi sarcinile negative ale hidroxiapatitei
(complexe de tipul [HAPO3---H3+N-proteină]).
(3) Astfel, suprafaţa cristalelor de hidroxiapatită prezintă un
mozaic de situsuri pozitive (de calciu) şi negative (de fosfat),
suprafaţa coloanei de hidroxiapatită poate fi văzută ca
negativă la un pH egal cu 6.8, la care coloanele de HAP se
manipulează în general, datorită neutralizării parţiale a locilor
pozitivi de calciu de către ionii fosfat (figura următoare).
Legarea unei proteine la hidroxiapatită. A reprezintă o proteină bazică în timp
ce B este o proteină acidă. Parantezele duble indicată fenomenul de repulsie în
timp ce liniile punctate sunt legăturile ionice. Săgeata triunghiulară indică
legăturile coordinative
În aceste condiţii, eluţia de pe coloană
poate fi afectată atât ca rezultat al
interacţiilor nespecifice ionice de (de tipul
Debye-Huckel) ori ca rezultat al dezlocuirii
specifice ale grupărilor proteice de pe
situsul C al hidroxiapatitei cu care au fost
complexate.
 Din aceste consideraţii rezultă că:
 Proteinele bazice pot fi eluate de pe mediile de
hidroxiapatită cu soluţii cu molarităţi foarte scăzute (de
exemplu 0,005M) de săruri de Ca2+ şi de Mg2+,
 Proteinele cu valori ale pI cuprinse între 5 şi 8, cu
soluţii de MgCl2 1,0 M, iar
 Proteinele acide cu soluţii fosfat 0,3 M.

În general, HAP este realizată prin eluţie în gradient linear (deseori

creat în domeniul 10 până la 400 mM) tampon fosfat, la un de pH 6,8,
alcătuit din amestecuri echimoleculare de fosfaţi sodiu ori potasiu mono
şi dibazici. Deoarece hidroxiapatita este stabilă numai la valori ale pH-
ului mai mari de 5, tampoanele de eluţie cu pH acid nu sunt indicate a
se utiliza.
 APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI PE HIDROXIAPATITĂ

În tehnicile de cromatografie pe hidroxiapatită, coloana este de obicei echilibrată, în timp ce

proba este aplicată la o concentraţie mică de tampon fosfat la un pH de 6,8. Proba de pe coloană
este apoi developată cu un gradient de concentraţie de tampon fosfat. În funcţie de aplicaţie, în
unele cazuri, un foarte îngust gradient (de exemplu între 0,02 la 0,05 M fosfat) conduce la rezultate
excelente, în timp ce în alte situaţii este necesar un gradient mare, cuprins de exemplu între 0,02 şi
0,35 M fosfat pentru a separare optimă. Figura următoare. ilustrează tehnica de purificare a
ovomucoidului comercial prin cromatografie pe coloană de HAP.

Purificarea ovomucoidului
comercial pe o coloană de
hidroxiapatită. Treapta I conţine
material inactiv cu un maximum de
absorbţie la 260 nm; pe parcursul
treptei a II a se separă ovomucoidul
în formă activă; volumul III conţine
lizozim; ulima treaptă - IV conduce
la separarea unor impurităţi, de
tipul tripsinei şi chimotripsinei.
 Ovomucoidul comercial
conţine o multitudine de
impurităţi precum lizozim,
ovoinhibitor, conalbumină şi
ovalbumină. Profilul
cromatografic din figură arată
că la aplicarea a două probe
de ovomucoid la o coloană
de HAP echilibrată cu 0,001
M NaCl, spălarea coloanei cu
NaCl 0,001 M, urmată de
eluţia în trepte cu 0.01 M
PO4, pH 6,8 (pentru a elua
ovomucoidul, o glicoproteină
cu o structură deschisă), 0;5
M NaCl (pentru a elua
proteinele bazice precum
lizozimul şi ovoinhibitororul)
şi 0,5 M PO4 (pentru a
epuiza coloana de alte
proteine acide) conduce la
obţinerea ovomucoidului într-
o formă înalt purificată.
 ghid de utilizare a HAP în cromatografie

 În cazul amestecurilor de proteine în mare parte bazice sau dacă se

doreşte reţinerea proteinelor bazice fără o pierdere a proteinelor acide,
coloanele se echilibrează cu fosfat, 0,001 M, pH 6.8.
 În scopul separării unor amestecuri de proteine în general acide în
special în cazul glicoproteinelor (sau dacă una din proteinele pe care dorim
a se reţine este acidă, în timp ce este posibilă pierderea unor proteine
neutre şi acide, se utilizează coloane echilibrate cu NaCl (NaCl 0,001 M
netamponat).
 Se utilizează coloane echilibrate cu MgCl2 sau CaCl2 (MgCl2 0,001 M
sau CaCl2 netamponate) numai pentru proteinele acide care nu se leagă la
coloane echilibrate cu NaCl.
 Dacă proba a fost încărcată, coloana trebuie să se spele utilizând
acelaşi tampon care a fost utilizat la echilibrarea coloanei. În general în
procedurile de eluţie este necesar a se urmări separarea proteinelor în
ordinea: proteinele bazice se eluează întâi, apoi proteinele neutre şi în final
cele acide.
 :
 Dacă se urmăreşte purificarea unor proteine individuale se utilizează
în general sistemul de tampon fosfat, la o concentraţie potrivită (cu sau
fără prezenţa unei alte săruri). Deoarece NaCl nu reuşeşte de multe ori să
elueze multe proteine neutre ori acide, este necesar deseori a se crea un
gradient de NaCl, de obicei cuprins între 0,01 - 0,5 M NaCl, în cazul
purificării proteinelor bazice de pe HAP.
 În unele cazuri, deoarece atât NaCl cât şi sulfatul de amoniu nu
afectează eluţie proteinelor neutre sau acide pe HAP, o probă proteică
provenită de pe o coloană de schimb ionic developată cu un gradient de
NaCl poate fi încărcată direct pe o coloană de HAP.
În acest context se poate exemplifica purificarea proteazelor din
microorganisme halofile prin cromatografie pe HAP în prezenţa unei
soluţii de NaCl de o concentraţie de 3,4 M. Alte exemple de purificare
a proteinelor pe coloană de HAP sunt reprezentate de izoformele
ceruloplasminei umane, anticorpi monoclonali, tubulină, histone din
cromatină, fumarazele citosolice şi mitocondriene din drojdia de bere,
etc.
Hidroxiapatita a fost utilizată cu succes în prezenţa
detergenţilor neionici (de exemplu, Triton X-100) pentru
purificarea proteinelor membranare precum şi a proteinei
transportoare ADP/ATP, proteinei transportoare a ionului
fosfat, a ubiquinol:citocrom c reductazei ori a citocrom c
oxidazei.

Separation of Single-stranded DNA, Double-

stranded DNA and RNA from an Environmental Viral
Community Using Hydroxyapatite Chromatography
 CROMATOGRAFIA DE INTERACŢIE HIDROFOBĂ.

Adsorbţia proteinelor prin cromatografie de interacţie

hidrofobă (Hydrophobic Interaction chromatography, HIC)
este favorizată de concentraţii înalte de săruri (în special
(NH4)2S04) care structurează apa. În mod echivalent,
contribuţia sărurilor a fost aplicată şi altor clase de
adsorbenţi amfifilici ce nu sunt analogi direcţi HIC.
În 1990, Porath a introdus termenul de
cromatografia de adsorbţie
promovată de condiţiile saline (salt-
promoted adsorption chromatography,
SPAC) pentru a regrupa aceste tehnici
cromatografice ce necesită concentraţii
înalte de săruri pentru a determina
adsorbţia unei proteine. Cromatografia
de adsorbţie tiofilică (thiophilic
adsorption chromatography, TAC),
cromatografia donor–acceptor de
electron (electron donor–acceptor
chromatography, EDAC) şi
cromatografia de interacţie hidrofobă
(HIC) au fost aşadar incluse în această
familie.
Efectul sării asupra adsorbţiei proteinei a fost
explicat ca fiind rezultatul unor creşteri nefavorabile
ale energiei libere, ΔG, pentru proteinele nelegate în
prezenţa unor concentraţii înalte de săruri.
Consecinţa termodinamică a acesteia o reprezintă
favorizarea legării proteinei la un ligand din cauza
unei arii de suprafaţă mai mică a complexului expus
solventului şi a cosolventului. Altfel spus, forma
legată a proteinei este termodinamic mai stabilă.
Eluţia proteinei de pe matrice este apoi realizată
simplu, prin suprimarea sării din tamponul de
adsorbţie. În HIC, interacţiile hidrofobe se manifestă
între zone hidrofobe aflate pe suprafaţa proteinei şi
liganzii hidrofobi, legaţi la suport.
 În comparație cu cromatografia în fază inversă (RPC), HIC
este efectuată în condiții blânde, în care proteinele ramân
in starea lor nativă.
 In HIC proteinele sunt reținute de faza staționară slab
hidrofobă la o concentrație ridicată de sare și se eluează cu
un gradient sare descendent.
 O explicație pentru rolul sărurilor neutre în interacțiunea
hidrofobă a proteinelor se bazează pe teoria solvophobică.
Astfel, efectul sării asupra retenției de proteine ​poate fi
legată cu creșterea incrementului molar al tensiunii
superficiale. Ca atare, sărurile cu o tensiune molară de
suprafață crescută produc o retenție de proteine mai
crescută la concentrații de sare molare egale.
 Magnitudinea efectului depinde atât de proprietățile
proteinei cât și a fazei staționare.
 Săruri utilizate în HIC care prezintă o tensiune molară de
suprafață crescută sunt (NH4)2SO4 BaCI2, CaCI2 and MgCI2
Procesele de salting out și de adsorbție
între proteine și un suport adsorbant.

(A) O proteină poate fi dispersată în

soluție fără sare.
(B) Când concentrația de sare crește,
moleculele de apă se ordonează
și sunt preluate, în timp ce
proteinele au tendința de a
agrega și precipita.
(C) La o concentrație moderată de
sare, interacțiunea hidrofobă
dintre moleculele de proteine nu
este suficient de puternică pentru
a provoca salting out, dar poate
conduce la adsorbția acestora pe
matricea hidrofobă.
 Cromatografia de interacţie hidrofobă a fost descrisă pentru
prima dată de către Tiselius în 1948, care a notat faptul că o serie
de compuşi precum coloranţii pot fi reţinuţi de către hârtia de filtru în
prezenţa unor soluţii de sulfat ori de fosfat, fenomen denumit cu
expresia de cromatografie de extracţie cu ajutorul sărurilor (salting-
out chromatography).

După cum şi numele o sugerează, HIC

este o tehnică de separare bazată pe
interacţiile dintre proteine şi o fază
staţionară insolubilă, nepolară
imobilizată.

Primele geluri cu aplicaţii practice pentru HIC au

prezentat un caracter mixt, hidrofob. Au fost apoi preparaţi
adsorbenţii neutrii (alchil şi aril eteri), ultimii conducând la
introducerea suporturilor octil- şi fenil- activate, utilizate în
curent acest moment în laboratorul de biochimie.
 S-a mai arătat că adsorbţia promovată de condiţiile saline a fost eficientă în
favorizarea adsorbţiei proteinelor pe un gel cyanocarbon substitut,
tricyanoaminopropen–divinil hidroxipropilsulfon agaroză (DVS–TCP gel) prin intermediul
unor interacţii electron donor–acceptor.
Toate gelurile sus-menţionate necesită concentraţii mari de săruri structurale de apă
pentru a favoriza legarea proteinelor, cu toate că mecanismele de interacţie sunt diferite:
adsorbţie specifică hidrofobă, interacţie tiofilică, respectiv interacţie electron donor–
acceptor.

Cromatografia de interacţie hidrofobă posedă avantajul că hidrofobicitatea

proteinelor conduce la separarea lor pe baza interacţiilor hidrofobe dintre liganzi
hidrofobi imobilizaţi şi regiunile nepolare de pe suprafaţa proteinelor. Adsorbţia
creşte odată cu creşterea concentraţiei de sare în faza mobilă iar eluţia se
realizează prin scăderea concentraţiei de sare a eluentului. Din acest motiv,
se poate utiliza şi termenul de „adsorbţie dependentă de sare” pentru acest tip
de cromatografie.
 Diferitele tipuri de eluţie pot fi utilizate pentru purificarea
amestecurilor complexe de proteine care ar fi dificil de separat utilizând
alte tehnici cromatografice. De fapt, HIC a fost utilizată cu succes în
scopuri de separare pe baza existenţei unor caracteristici
complementare de legare faţă de alte tehnici de cromatografiere a
proteinelor.
Van Oss şi colaboratorii au arătat că forţele van der Waals sunt
factorii majori ce contribuie la interacţiile hidrofobe („forţe interfaciale”) în
ciuda mecanismului complex implicat. Astfel, alterarea structurală a
biomoleculelor este minimă şi activitatea lor biologică este
menţinută prin utilizarea HIC, dată interacţiei mai slabe decât cea
regăsită în cazul interacţiei afine, schimbului de ioni sau a
cromatografiei de fază inversă (RPC).
HIC reprezintă o cale alternativă de exploatare a proprietăţilor
hidrofobe a proteinelor, realizată într-un mediu mai polar şi mai puţin
denaturant decât RPC, după cum această tehnică necesită utilizarea
unor solvenţi nepolari pentru eluţia proteinelor datorită legării puternice
la adsorbent.
 Cu toate că atât HIC cât şi cromatografia cu fază inversă sunt metode de separare bazate pe
interacţia proteinelor cu grupările hidrofobe ale fazei staţionare sunt bine de cunoscut diferenţele
fundamentale ce există între ele. În HIC, interacţiile slabe hidrofobe dintre proteine şi faza nepolară
staţionară sunt mediate prin concentraţii mari de săruri antichaotrope (Figura de mai jos) în timp
ce în cromatografia de fază inversă (RPC) aceste interacţii sunt mediate prin intermediul
modificatorilor organici.

Reprezentarea schematică a principiului de

separare prin HIC. După cum sărurile neutre conduc la
precipitarea proteinelor, concentraţiile mari de săruri
conduc la apariţia unor interacţii între zonele
hidrofobe de pe suprafaţa proteinelor ceea ce are ca
rezultat precipitarea acestora din soluţiile apoase.
Totuşi, prin creşterea concentraţiei de săruri chiar
până la punctul de precipitare, prin utilizarea unor
concentraţii mai diluate de proteină şi prin expunerea
soluţiei proteice la o matrice slab hidrofobă
imobilizată, proteinele se leagă la matricea de pe
coloană mai uşor decât să precipite. Sub aceste
condiţii proteinele îşi menţin conformaţia nativă (de
exemplu proprietatea biologică). Aceasta este o
consideraţie importantă în condiţiile purificării unor
enzime, eficienţa separării putând fi realizată prin
monitorizarea activităţii lor.
 Mai puţin probabil în cazul RPC, unde fazele mobile organice au tendinţa de
a deplia (dezmembra, denatura) proteinele. Astfel, faza staţionară împachetată şi
condiţiile de operare ale HIC sunt alese astfel încât să menţină proteinele în
conformaţiile lor native, biologic active. În HIC, liganzii slab hidrofobi (comparativ
cu împachetările din RPC), cum ar fi grupările nepolare cu catenă scurtă fenil ori
octil, sunt ataşate chimic la matrice hidrofile (fenil-Sepharose sau octil-
Sepharose), când se manifestă interacţii distincte între proteine şi suprafaţa fazei
staţionare, prin utilizarea unei faze mobile ce conţine săruri antichaotrope de tărie
ionică mare. Contrar RPC, în cazul HIC sunt utilizate densităţi scăzute de ligand
pe matricea împachetată (deseori o zecime faţă de suporturile utilizate în RPC).
În decursul ultimilor ani, HIC a fost dezvoltată de către mulţi cercetători iar
astăzi reprezintă o tehnică bine stabilită şi deosebit de utilă în tehnicile de
separare cromatografică din laborator sau în procesele industriale de purificare a
proteinelor. Dezvoltarea unui număr mare de faze staţionare diferite a condus la o
creştere a aplicaţiilor HIC în purificarea unor biomolecule, precum proteine serice,
proteine nucleare, hormoni, proteine recombinante şi enzime.
HIC este complementară cromatografiei
de schimb ionic şi cromatografiei de
excludere moleculară, iar împreună cu
tehnicile de separare mai sus
enumerate reprezintă cele trei
mecanisme distincte şi generale de
retenţie disponibile unui biochimist
pentru purificarea proteinelor în
aplicaţiile proteomice.

Cromatografia lichidă de înaltă

performanţă cu fază inversă (RPC) poate fi
aplicată serial la fracţiile colectate după
HIC şi cromatografia de schimb ionic
pentru purificarea ulterioară sau de
îndepărtare a sărurilor.
 CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE TIOFILICĂ

Importanţa atomilor de sulf pentru în cromatografia de adsorbţie prin intermediul

unui ligand a fost recunoscută acum 40 de ani. Adsorbţia aromatică a fost atunci un
fenomen studiat şi s-a descoperit că ea este mediată prin imobilizarea de grupări 2,4-
dinitrofenil în timp ce un efect sinergistic de adsorbţie a fost evidenţiat în condiţiile în
care ligantul a conţinut un atom de sulf în locul unuia de oxigen, aflat în apropierea
inelului aromatic. Aceasta a fost una dintre primele indicaţii că atomul de sulf, ca parte a
ligandului are un efect de adsorbţie a solutului. Tăria acestei interacţii a apărut
dependentă de substituenţii electrofili şi nucleofili ai inelului aromatic; în fapt, s-a dovedit
că adsorbţia are la bază formarea de complexe electron donor–acceptor.
Asocierea dintre sorbenţii tiofili şi separarea imunoglobulinelor s-a realizat odată cu
demonstrarea acestei proprietăţi de către Porath şi colaboratorii (1985) şi a făcut
posibilă fracţionarea proteinelor plasmatice prin cromatografie pe sorbenţi, derivaţi din
agaroză, realizaţi în urma reacţiei dintre divinilsulfonă şi 2-mercaptoetanol. După
aceasta, acest mod de separare a fost deseori aplicat în purificarea anticorpilor
deoarece sorbentul prezintă specificitate clară pentru acest tip de proteine. Această
descoperire a reprezentat o etapă importantă în dezvoltarea metodelor de separare a
anticorpilor implicând, drept liganzi cromatografici, o mare varietate de structuri chimice
care conţin atomi de sulf şi de azot, având diferite nivele de selectivitate.
Porath şi colaboratorii au descoperit
adsorbţia tiofilică pe suporturi
mercaptoetanol–divinil sulfon agaroză
(geluri T). Mecanismul de adsorbţie a fost
interpretat ca implicând ataşarea proteinei
în două puncte, la β-mercaptoetanol şi la
braţul de spaţiere divinlsulfonic, posibil
printr-o interacţie electron donor–
acceptor tiofilic. Studii ulterioare au
demonstrat caracteristici similare de
adsorbţie la geluri activate cu epiclorhidrină
la care s-a cuplat 2-mercaptopiridină.
 Structural, cei mai obişnuiţi sorbenţi pentru cromatografia de adsorbţie tiofilică derivă din
aşa-numitul gel B; care conţine liganzi lineari, cu doi atomi de sulf. Aceşti derivaţi au fost găsiţi
destul de buni în legarea selectivă a imunoglobulinelor, în prezenţa unor concentraţii mari de
săruri formatoare de structură a apei, denumite de altfel „săruri liotrope”, de tipul sulfatului de
amoniu sau sulfatului de sodiu. Din punct de vedere al acestei trăsături, cromatografia de
adsorbţie tiofilică se aseamănă cu cromatografia de interacţie hidrofobă: adsorbţia este
favorizată de concentraţii mari de săruri, eluţia realizându-se în condiţiile în care concentraţia lor
este redusă. Totuşi, în cazul cromatografiei de adsorbţie tiofilică nu se pot manifesta asocieri
hidrofobe sau interacţii ionice cu sorbenţii tiofilici deoarece structurile tio-etilsulfonice nu posedă
o hidrofobicitate pronunţată, pe de o parte şi nu conţin sarcini electrice, pe de altă parte.
Cromatografia de adsorbţie tiofilică, descrisă de către Porath, s-a arătat a fi de real folos în
purificarea anticorpilor monoclonali şi în general în fracţionarea proteinelor.
Matricele tiofilice de afinitate sunt cuplate cu ajutorul unor liganzi cu următoarea
structură chimică:

(M)atrice-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-X-Y
unde M reprezintă matricea de agaroză iar X reprezintă S, N ori O, iar Y este un rest
mic, alifatic, sau un heteroatom
 Principiul operaţional care stă la baza cromatografiei de adsorbţie tiofilică se
aseamănă cu cel al cromatografiei de interacţie hidrofobă. Astfel, proteinele sunt legate
la tării ionice mari şi eliberate în urma scăderii tăriei ionice. Faţă de matricele tradiţionale
hidrofobe utilizate în HIC precum fenil-Sepharose sau octil-Sepharose, matricele
tiofilice conduc la randamente înalte de separare cât şi la separări în zone înguste,
având drept caracteristică o afinitate înaltă faţă de imunoglobulinee şi scăzută faţă
de albumine.

Cromatografia de adsorbţie tiofilică este descrisă ca o metodă de purificare a

anticorpilor monoclonali murini din supernatantul unor culturi celulare. În acest caz se
utilizează sulfat de potasiu în concentraţie de 0,5M în tamponul de legare, obţinându-
se imunoglobuline de înaltă puritate. Totuşi datorită concentraţiei tipice scăzute
anticorpilor monoclonali din supernatantul unor culturi celulare, capacitatea matrix-ului
este în consecinţă, de asemenea scăzută. Capacitatea de legare a anticorpilor
monoclonali diluaţi poate fi crescută cu un factor de 10 sau mai mult prin schimbarea
sării liotrope din tamponul de legare, adică prin utilizarea sulfatului de amoniu şi în
acelaşi timp prin creşterea concentraţiei sale până la 1,0-1,2M
Purificarea anticorpilor monoclonali prin cromatografie de adsorbţie tiofilică. Se ilustrarează
legărea, spălarea şi eluţia. Etape: I Legarea la concentraţie mare de (NH4)2SO4, de exemplu,
1,2M (NH4)2SO4 II eluţia la o concentraţie scăzută de (NH4)2SO4, de exemplu 0,8M (eluţia
impurităţilor). III eluţia anticorpului monoclonal purificat realizată cu TRIS/HCI 0,05M, pH 9,0.
 CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic (ion-exchange chromatography,

IEC), denumită uneori şi cromatografie ionică (IC), se referă la
metodele moderne şi eficiente de separare şi determinare a speciilor
ionice, pe răşini schimbătoare de ioni. Cromatografia de schimb ionic
a fost iniţial dezvoltată la miljocul anilor ‘70 când s-a arătat că un
amestec de anion ori de cationi poate fi rapid rezolvat pe coloane de
cromatografie ori de înaltă performaţă, împachetate cu un suport alcătuit
dintr-o răşină schimbătoare de ioni, anioni ori cationi. În acel moment,
detecţia se realiza în general prin măsurători conductometrice. Astăzi,
sunt disponibile diverse detectoare utilizate în cromatografia de schimb
ionic.
Schimbul ionic este probabil cea mai frecvent utilizată tehnică
cromatografică pentru separarea şi purificarea proteinelor,
polipeptidelor, acizilor nucleici, polinucleotidelor, a altor biomolecule
încărcate electric. Raţiuniunea pentru succesul cromatografiei de
schimb ionic este reprezentată de generala sa aplicabilitate, puterea sa
matre de rezoluţie şi marii sale capacităţi, a simplicităţii,
reproductibilităţii şi controlabilităţii ei.
 Cromatografia de schimb ionic reprezintă o
variantă a cromatografiei de adsorbţie în care
adsorbentul solid posedă grupări chimice
încărcate electric legate covalent la un suport
solid, inert. Ionii sunt legaţi electrostatic la
grupările încărcate electric; aceşti ioni pot fi
schimbaţi cu ionii aflaţi într-o soluţie apoasă.
Schimbătorii de ioni sunt cel mai frecvent
utilizaţi în coloane, pentru a separa moleculele
funcţie de sarcină; deoarece moleculele
încărcate electric se leagă la schimbătorul de
ioni reversibil şi astfel ele pot fi legate ori eluate
prin schimbarea tăriei ionice sau a pH-ului
solventului de eluţie.
 Sunt disponibile două tipuri de schimbători de ioni: unii care posedă
grupări funcţionale legate chimic, cu sarcini electrice negative denumiţi
schimbători cationici şi alţii care posedă grupări funcţionale cu sarcini
electrice pozitive denumiţi schimbători anionici. Sarcinile de pe
schimbători sunt balansate de către contraioni de tipul ionilor clorură în
cazul schimbătorilor anionici şi de ioni metalici în cazul schimbătorilor
cationici. Moleculele din soluţie, care vor fi adsorbite pe schimbători au de
asemenea sarcini nete care sunt şi ele balansate de către contraioni. De
exemplu, dacă se analizează un proces de schimb ionic şi se consideră
că moleculele din soluţie au sarcini negative (X-), acestea sunt
contrabalansate de ionii de sodiu (Na+). Astfel de molecule încărcate
electric negativ pot fi cromatografiate pe un schimbător anionic (A+), care
posedă ioni de clorură drept contraioni pentru a se neutraliza şi a produce
A+Cl-. Când moleculele (Na+X-) din soluţie interacţionează cu un
schimbător de ioni, X- dislocuie ionul clorură, Cl-, de pe schimbător şi se
leagă electrostatic, formându-se A+X-, simultan cu eliberarea ionilor de
sodiu. Acest proces de schimb ionic este ilustrat în figura de mai jos. Un
proces similar, dar opus, se va produce pentru molecule încărcate pozitiv
(Y+CI-), care se vor cromatografia pe un suport cu sarcini electrice
negative. Acesta este cazul schimbătorilor cationici (C-Na+), unde
schimbătorii cationici vor lega moleculele încărcate pozitiv din soluţie.
Schema unui proces de schimb ionic:
moleculele (Na+X-) din soluţie
interacţionează cu un schimbător de
ioni, X- dislocuie ionul clorură, Cl-, de pe
schimbător şi se leagă electrostatic,
formându-se A+X-, simultan cu
eliberarea ionilor de sodiu.
 ECHILIBRUL DE SCHIMB IONIC

Procesele de schimb ionic se bazează pe un echilibru de

schimb dintre ionii din soluţie şi ionii de acelaşi semn de pe
suprafaţa unui suport insolubil, cu masă moleculară mare.
Schimbătorii naturali de ioni precum cleiurile şi zeoliţii au fost
recunoscuţi şi utilizaţi de multă vreme.
Răşinile schimbătoare de ioni sintetice au fost produse
pentru prima dată la mijlocul anilor 1930 pentru dedurizarea şi
deionizarea apei ori pentru purificarea unor soluţii.
Cele mai comune situsuri active ale unor rășini
schimbătoare de cationiţi sunt grupările sulfonil acide - SO3H+,
puternic acidă şi carboxil acid, -COO-H+, slab acidă.
Schimbătorii anioniţi conţin grupări amino terţiare -
N(CH3)3OH-, puternic bazică, ori grupări amino primare -NH3OH-,
slab bazică.
 În cazul în care un schimbător de ioni de tipul acid sulfonic
este adus în contact cu un solvent apos care conţine un cation, Mx+,
se produce un echilibru de schimb ce poate fi descris prin reacţia:

- x+ - x+ +
x RSO 3 H+ + M (RSO 3) x M + xH
solid solutie solid solutie

unde RSO-3H+ reprezintă una din multitudinea

de grupări sulfonice ataşate pe o
macromoleculă polimerică.

În mod similar, un schimbător bazic puternic interacţionează cu un anion Ax-

după reacţia:

+ x-
xRN(CH3)OH + Ax- [RH(CH3) 3]x A + xOH
solid solutie solid solutie
 Ca un exemplu de aplicare a legii masei la un echilibru de schimb ionic, se consideră pe
coloană are loc o reacţie între un ion monovalent, B+ cu o grupare acid-sulfonică prezentă pe
suportul cromatografic. Din considerente de neutralizare, retenţia iniţială a ionilor B+ se realizează
la capătul superior al coloanei după reacţia:

unde (s) şi (aq) delimitează faptul că sistemul conţine o fază solidă, respectiv apoasă. Eluţia
cu o soluţie diluată de acid clorhidric, de exemplu, modifică echilibrul din ecuaţia 1 în partea
stângă, ceea ce conduce la transferul parţial a ionilor B+ din faza staţionară în faza mobilă. Aceşti
ioni coboară apoi de-a lungul coloanei printr-o serie de transferuri între fazele staţionară şi mobilă.
Constanta de echilibru Kex, pentru reacţia de schimb prezentată în ecuaţia 1 ia forma:

unde [RSO3B+]s şi
[RSO3H+]s reprezintă
concentraţiile (strict
sub formă de activităţi)
După rearanjare rezultă: ale ionilor B+ şi H+ în
faza solidă.
 În timpul eluţiei, concentraţia ionilor de hidrogen din faza apoasă este mult mai mare
decât concentraţia ionilor de compus B, monovalent din faza mobilă. Pe lângă aceasta,
schimbătorul posedă un număr enorm de situsuri de schimb ionic comparativ cu numărul
de ioni B+ ce pot fi reţinuţi. Astfel, concentraţia totală a ionilor, [H+]aq şi [RSO-3H+]s nu este
afectată de schimburile din ecuaţia 1 ce descrie reacţia globală. Pentru acest motiv, în
condiţiile în care [RSO-3H+]s >> [B+]aq termenii din dreapta ecuaţiei 3 sunt în mod
substanţial constanţi şi astfel se poate scrie:

unde K reprezintă constanta ce corespunde

constantei de distribuţie descrisă anterior. Astfel,
toate ecuaţiile descrise în tratarea teoretică din
primul capitol pot fi aplicate cu succes.
 Se poate nota că Kex din ecuaţia 2 reprezintă afinitatea răşinii
pentru ionul B+ comparativ cu un alt ion (în cazul de faţă, H+). În
condiţiile în care Kex este mare, se poate spune că există o puternică
tendinţă a fazei solide de a reţine B+; în cazul în care Kex este mică,
efectul este diametral opus. Prin selecţia unui ion comun de referinţă
precum H+, se pot compara experimental rapoartele de distribuţie
pentru diverşi ioni pe un tip dat de răşină schimbătoare de ioni.
Experimentele relevă că ionii polivalenţi sunt mai puternic legaţi decât
speciile cu o singură sarcină electrică. Pentru un număr de sarcini date,
totuşi, apar diferenţe care sunt legate de mărimea ionului hidratat
precum şi de alte proprietăţi. Astfel, pentru o răşină schimbătoare de
ioni sulfonată, clasică, obişnuită, valorile Kex scad în ordinea: Tl+ > Ag+
> Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Pentru cationii divalenţi,
ordinea este: Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ >
Zn2+ > Mg2+ > UO22+.
În cazul anionilor, Kex pentru o răşină bazică scade în ordinea:
SO42-> C2O4- > I- > NO3- > Br- > Cl- > HCO2- > CH3COO- > OH- > F-.
Această serie este oarecum dependentă de tipul de răşină şi de
condiţiile de reacţie, putând fi considerată numai aproximativă.
Separarea prin cromatografie de schimb ionic depinde
de adsorbţia reversibilă a moleculelor de solut
încărcate electric la grupările de semn contrar
imobilizate pe schimbătorul de ioni. Cele mai multe
experimente sunt realizate în cinci etape importante,
ilustrate în figura următoare.

Principiul de
separare a unor
proteine prin
comatografie de
schimb ionic
realizată prin eluţie în
gradient de sare
(salin)
 Prima etapă o reprezintă echilibrarea în care schimbătorul de ioni este adus în
starea de start în termeni de pH şi tărie ionică, stare ce va permite legarea moleculelor
de solut. Grupările schimbătoare de ioni sunt asociate în acest moment cu contraionii de
schimb (uzual anioni ori cationi simplii, precum ionii clorură sau de sodiu).
Cea de a doua etapă o reprezintă aplicarea şi adsorbţia probei, în care moleculele
de solut care posedă sarcini corespunzătoare, ajung şi dislocuie contraionul, legându-se
reversibil la suport. Substanţele nelegate vor fi eluate de pe schimbător utilizând acelaşi
tampon de start.
În etapa a treia, substanţele sunt îndepărtate de pe coloană prin schimbarea
condiţiilor de eluţie nefavorabile pentru legarea ionică a moleculelor de solut.
Această eluţie implică în mod normal creşterea tăriei ionice a tamponului de eluţie
sau schimbarea pH-ului acestuia. În figura de mai sus, desorbţia se realizează prin
introducerea unui gradient crescător de sare, ceea ce conduce la eliberarea moleculelor
de solut de pe coloană în ordinea tăriei legării lor, substanţele cele mai slab legate eluând
primele.
Etapele a patra şi a cincea sunt cele de îndepărtare de pe coloană a substanţelor
care nu au fost eluate în condiţiile experimentale anterioare şi de reechilibrare a coloanei
pentru un nou proces de purificare.
 Separarea este astfel obţinută datorită diferenţelor
de interacții dintre un schimbător de ion cu molecule cu
densităţi diferite de sarcină şi de distribuţie a acestora pe
suprafaţa lor. Figura alăturată prezintă schematic modul
de legare a unor molecule cu sarcini diferite. Aceste
interacţii pot fi controlate prin variaţia condiţiilor precum
tăria ionică ori a pH-ului. Diferenţele în proprietăţilor
electrice ale compuşilor biologici sunt deseori
considerabile, din această cauză cromatografia de
schimb ionic este capabilă să separe specii cu foarte
mici diferenţe în proprietăţi, de exemplu două proteine
care diferă numai printr-un aminoacid ionizabil, motiv
pentru care această tehnică este deosebit de importantă
în analiza biochimică.

Reprezentarea schematică a diferenţei de legare şi

de eluţie ale unor molecule cu densităţi diferite de
sarcină precum şi de distribuţie a sarcinilor pe
suprafaţa lor.
 FACTORUL DE CAPACITATE A L UNUI SCHIMBĂTOR DE IONI
Factorul de capacitate sau de retenţie, k, este o măsură a retenţiei unui component netrebuind
a fi confundat cu capacitatea de încărcare (mg probă/ml) ori cu capacitatea ionică (mmol/ml).

O cromatogramă posibilă pe baza

căreia se poate calcula factorul de
capacitate k, a unui peak
cromatografic. Legendă: V0 = void
volume, VR1 = volumul de eluţie a
peak-ului 1, VR2 = volumul de eluţie a
peak-ului 2, Vt = volumul total, wR1 =
lăţimea peak-ului 1, wR2 = lăţimea
peak-ului 2.
Factorul de capacitate se calculează pentru fiecare peak individual. De exemplu, factorul
de capacitate k pentru peak-ul 1 din figura alăturată este derivat din ecuaţia:

Tehnica de adsorbţie precum cea de cromatografie de schimb ionic oferă factori mari de
capacitate după cum condiţiile experimentale pot fi alese astfel încât să conducă la volume de
retenţie a peak-ului mari în exces a Vt, opus tehnicii de gel filtrare unde capacitatea este limitată
deoarece toate peak-urile trebuiesc eluate cu un volum egal cu (Vt - V0).
 Capacitatea unui schimbător de ioni este o măsură cantitativă a abilităţii sale de
a îmbunătăţi schimbul de contraioni, din această cauză fiind un parametru deosebit de
important. Capacitatea poate fi exprimată ca şi capacitate ionică totală, capacitate
disponibilă sau capacitate dinamică.
Capacitatea ionică totală reprezintă numărul de grupări încărcate electric substituite
per gram de schimbător uscat ori per gram de schimbător îmbibat. Capacitatea ionică
totală poate fi măsurată prin titrare cu un acid sau o bază puternică.
Cantitatea totală de proteină care poate fi legată la un schimbător de ioni, în condiţii
experimentale definite, determină capacitatea disponibilă pentru gel. Dacă condiţiile
definite includ şi viteza de curgere la care gelul operează, cantitatea legată se referă la
capacitatea dinamică pentru schimbătorul de ioni. Capacitatea disponibilă şi cea
dinamică depind de:

proprietăţile proteinei;
proprietăţile schimbătorului de ioni;
condiţiile experimentale alese;

Proprietăţile proteinei care determină disponibilitatea sau capacitatea sa dinamică

pe o matrice schimbătoare de ioni particulară sunt mărimea sa şi raportul dintre sarcina
sa/pH.
 Proprietăţile matricei schimbătoare de ioni care
determină capacitatea lui de disponibilitate pentru o
proteină aleasă sunt limita de excluziune, tipul şi numărul
de grupări funcţionale de schimb ionice substituite. O
capactitate înaltă de disponibilitate este obţinută în
condiţiile unei matrice care estre macroporoasă şi înalt
substituită cu grupări ionice care îşi menţin sarcina îndr-un
domeniu larg de condiţii experimentale.
Matrix-urile neporoase au o capacitate considerabil de
mică comparativ cu matrix-urile poroase, dar şi o mare
eficienţă datorită distanţelor mai mici de difuziune.
Condiţiile experimentale care afectează capacitatea
observabilă sunt pH-ul, tăria ionică a tamponului, natura
contraionului, viteza de curgere şi temperatura.
 GRUPĂRI SCHIMBĂTOARE DE IONI
Prezenţa grupărilor schimbătoare de ioni este o proprietate fundamentală a oricărui
schimbător de ioni. Tipul de grupare determină tipul şi tăria schimbătorului de ioni, numărul
total al acestora şi disponibilitatea determinând capacitatea de schimb. Există o varietate de
grupări care au fost selectate pentru a fi utilizate în procesul de schimb ionic, o serie dintre
aceştia fiind prezentaţi în tabelul de mai jos.
Grupările sulfonice şi amino-cuaternare sunt utilizate pentru a forma schimbători de ioni
puternici, celelalte grupe funcţionale formând schimbătorii de ioni slabi. Termenele de
puternic şi slab se referă la măsura variaţiei de ionizare cu pH-ul şi nu la tăria legării.
Schimbătorii de ioni puternici sunt complet ionizaţi pe un domeniu mare de pH, în timp ce la
schimbătorii de ioni slabi gradul de disociere şi astfel capacitatea de schimb variază mai puţin
marcant cu pH-ul.

Schimbători anionici Grupare funcţională

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Aminoetil cuaternar (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Grupări funcţionale existente
Ammoniu cuaternar (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-
N+(CH3)3 pe schimbătorii de ioni.
Schimbători cationici Grupare funcţională

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Metil sulfonat (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-

CH2SO3-
 Schimbători de ioni pe bază de dextran
Schimbătorii de ioni pe bază de dextran sunt produşi prin introducerea unor grupări
funcţionale pe scheletul acestuia, o matrice de detran, reticulată. Aceste grupări sunt ataşate
la unităţile de glucoză din structura matricei prin legături eterice, stabile.

Domeniul complet al schimbătorilor de ioni pe bază de Sephadex este prezentat în

tabelul de mai jos. Schimbătorii de ioni anionici şi cationici sunt desemnaţi ca A-25 ori A-50 şi
C-25 ori C-50, respectiv, depinzând de porozitatea matrix-ului.

Schimbători de ioni pe bază de Sephadex

Tipuri Descriere Grupare funcţională Contraion

A-25 Schimbător de ioni slab bazic

DEAE Sephadex Dietilaminoetil- Clorură
A-50

A-25 Schimbător de ioni bazic tare

Dietil-(2-hidroxi-
QAE Sephadex Clorură
A-50 propil)aminoetil-

C-25 Schimbător de ioni slab acid

CM Sephadex Carboximetil- Sodiu
C-50

C-25 Schimbător de ioni acid tare

SP Sephadex Sulfopropil- Sodiu
C-50
 Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex sunt insolubili în
orice solvent. Ei sunt stabili în apă, soluţii saline, solvenţi organici,
soluţii slabe acide şi alcaline. În soluţii puternic acide se pot
manifesta procese de hidroliză a legăturilor glicozidice din care
cauză valori ale pH-ului mai mici de 2 trebuiesc ocolite, în
particular la temperaturi crescute. Schimbătorii de ioni pe bază de
Sephadex pot fi de asemenea utilizaţi în prezenţa solvenţilor
denaturanţi proces ce poate fi important în condiţiile separării unor
substanţe numai pe baza proprietăţilor lor electrostatice. În timpul
regenerării schimbătorul de ioni poate fi expus pentru timp scăzut
la o soluţie de NaOH, 0,2 M, fără o hidroliză apreciabilă.
Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex sunt susceptibili la
atacul unor dextranaze, motiv pentru care este nevoie ca în
condiţiile de stocare să fie prezent şi un agent antimicrobian.
Proprietăţile fizice ale acestor schimbători sunt prezentate în
tabelul următor:
 Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex pot fi sterilizaţi prin
autoclavare, (121°C), până la 30 minute, la unpH neutru, ăn
Stabilitatea fizică
formă de sare. În timpul autoclavării totuşi, se eliberează o
cantitate de carbohidraţi.
Proprietăţile de umflare ale schimbătorilor de ioni pe bază de
Sephadex sunt asemănătoare cu cele ale Sephadex-urilor de tip G
Capacitatea de de la care provin. În plus, Schimbătorii de ioni pe bază de
umflare Sephadex de tip 50 se umflă mai puternic decît cei de tip 25.
datorită prezenţei grupărilor ionice de schimb, pe matrice,
umflarea (îmbibarea) variază cu tăria ionică şi cu pH-ul.
La tării ionice scăzute, repulsia dintre grupările ce poartă aceeaşi
sarcină pe matrice sunt maxime, din această cauză umflarea
gelului în aceste condiţii, este mare. Gradul de umflare scade cu
Dependenţa de
creşterea tăriei ionice. Se poate nota că schimbătorii de ioni pe
tăria ionică
bază de Sephadex nu trebuie umflaţi în apă distilată deoarece,
datorită puternicelor interacţii ionice care e manifestă în aceste
condiţi, structura perlată se distruge.
 Gradul de disociere şi de aici extensia cu care un schimbător de
ioni este încărcat electric este dependentă de pH. Repulsia dintre
grupările schimbătoare de ioni este maximă la valori ale pH-ului
la care grupările schimbătoare de ioni sunt total disociate, scăzând
Dependenţa de pH
la valori de pH apropiate de pK ale grupărilor schimbătoare de
ioni. Se poate nota că schimbători tari precum QAE Sephadex şi
SP Sephadex au proprietăţi de umflare practic independente de
pH deoarece sunt încărcaţi electric pe un mare domeniu de pH.
Datorită diferenţelor în caracteristicile de umflare, schimbătorii
de ioni pe bază de Sephadex G-25 au o capacitate ionică mai
mare have per ml gel decât cei pe bază de Sephadex G-50. Astfel,
pentru biomolecule mai mici (masa moleculară < 30 000)
schimbătorii de ion de tip A-25 şi C-25 au o capacitate de
disponibilitate mai mare. În domeniul de mase moleculare cuprins
Capacitatea între 30 000 şi 100 000 totuşi, schimbătorii de ion de tip A-50 şi
C-50 posedă o capacitate de disponibilitate mai mare datorită
existenţei unor pori mai mari. În condiţiile lucrului cu
macromolecule mai mari de 100 000, s-a observat frecvent o mai
mare capacitate de disponibilitate la tipurile A-25 şi C-25 deşi, la
aceste mase moleculare, legarea se realizează numai pe suprafaţa
perlei de schimbător de ioni.
Celuloza este utilizată ca matrice, după introducerea unor grupări schimbătoare de ioni,
de tipul dietilaminoetil (DEAE) ori carboximetil (CM), ceea ce conduce la obţinerea unor
schimbători de ioni anionici respectiv cationici.
DEAE celuloza comercializată sub denumirea de DEAE Sephacel este macroporoasă şi are o
limită de excluziune a proteinelor cu masă moleculară de aproximativ 1 x 106. Interacţia ionică a
macromoleculelor cu masă moleculară mult mai mare de 1 x 106 este restiricţionată doar la
sarcinile electrice situate pe suprafaţa perlelor de schimbător.

DEAE şi CM Sepharose CL-6B sunt disponibile sub formă preînmuiată, putând fii
utilizate imdeiat pentru încărcare (împachetare) pe coloană. În privinţa capacitatăţii, se
poate spune că deoarece DEAE şi CM Sepharose CL-6B sunt schimbători de ioni slabi,
numărul de grupări ionice legate care sunt schimbate şi deci capacitatea pentru
macromolecule este dependentă de pH. Această dependenţă se ilustrează cu ajutorul
curbelor de titrare. Domeniul de pH la care se lucrează cu DEAE Sepharose CL-6B este de
2-9 în timp ce pentru CM Sepharose CL-6B este de 6-10.
 SELECŢIA GRUPĂRII SCHIMBĂTOARE DE IONI

În selecţia suportului cromatografic trebuie avut în vedere că nu există

un singur schimbător de ioni perfect pentru oricare separare. Alegerea
matrix-ului şi a grupării ionice substituite depinde de:
• necesităţile specifice aplicaţiei;
• mărimea moleculară a componentelor probei;
• punctul izoelectric al componentelor probei.
Substanţele se leagă la schimbătorul de ioni în momentul în care
posedă o sarcină opusă celei prezentate de suportul cromatografic.
Această legare este electrostatică şi reversibilă.
În cazul în care substanţele ce doresc a fi separate posedă numai un
tip de sarcini electrice, alegerea schimbătorului este clară. În condiţiile
separării unor substanţe cu încărcătură mixtă, ce prezintă sarcini atât
pozitive cât şi negative, substanţe denumite amfotere, sarcina netă va
depinde de pH. În consecinţă la o anumită valoare a pH-ului, o substanţă
amfoteră va avea o sarcină netă egală cu zero. Această valoare este
denumită punct izoelectric (pI) şi în acel punct substanţele nu se vor lega
nici de schimbătorul anionic nici de cel cationic, după cum se observă
schematizat în figura următoare.
Curbă de titrare. Sarcina netă a unei
proteine ca funcţie de pH
 Astfel, pH-ul unui tampon determină sarcina unor molecule amfotere în
timpul unui experiment. Din acest motiv, în principiu, se poate utiliza atât un
schimbător anionic ori unul cationic pentru a lega substanţa amfoteră, prin
selectarea unui pH optim. În practică totuşi, alegerea este bazată pe un tip de
schimbător şi un anumit pH, care conduc la cea mai bună separare a
moleculelor de interes, fără constrângeri referitoare la stabilitatea lor la acel pH.
O multitudine de macromolecule biologice se denaturează ori şi pierd din
activitate în afara unei domeniu bine stabilit al pH-ului şi astfel, alegerea
schimbătorului de ioni poate fi limitată de stabilitatea probei. Sub valoarea
punctului său izoelectric o proteină are o sarcină netă pozitivă, schimbul şi
astfel adsobţia realizându-se pe un schimbător cationic. Deasupra pI-ului său
proteina are o sarcină netă negativă, putându-se adsorbi pe schimbători de ioni
anionici. Totuşi, ea este stabilă numai în domeniul de pH cuprins între 5 şi 8,
astfel se va utiliza un schimbător de ioni anionic.
 Se pot trage următoarele concluzii:
Dacă componentele probei sunt mult mai stabile mai
mici decât valoarea pI, trebuie utilizat un schimbător
cationic.
Dacă ele sunt mai stabile în jurul valorilor pI, trebuie
utilizat un schimbător anionic.
Dacă stabilitatea componentelor este mare pe tot
domeniul de pH, pe ambele laturi ale pI, se poate
utiliza oricare schimbător de ioni.

Metode de testare în tub a condiţiilor de selecţie a schimbătorului de ioni

 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

Conform Uniunii Internaţionale de Chimie Pură şi Aplicată (IUPAC), cromatografia de afinitate

este definită ca o tehnică cromatografică lichidă care se bazează pe “o interacţie biologică”
pentru separarea şi analiza unui analit specific dintr-o probă. Exemple ale acestor interacţii
includ legarea unei enzime la un inhibitor sau al unui anticorp la un antigen. Astfel, cromatografia
de afinitate presupune, în primă fază obţinerea unui agent de legare cunoscut sub termenul de
ligand afin, care interacţionează selectiv cu analitul dorit, acesta fiind apoi plasat pe un suport solid
într-o coloană cromatografică. Odată preparat ligandul imobilizat el poate fi utilizat la izolarea ori la
cuantificarea unui analit.
Ligandul imobilizat este factorul cheie care determină succesul oricărei metodă de
cromatografie afină. După definiţia dată anterior în cromatografia de afinitate cei mai mulţi liganzi
au origine biologică, totuşi termenul de cromatografie afină este de asemenea utilizat de multă
vreme pentru a descrie o serie de coloane care conţin drept liganzi selectivi cu origine nebiologică.
Exemple ale acestor liganzi nebiologici sunt boronaţii, complexe de ioni de ioni metalici imobilizaţi,
coloranţi sintetici. Termeni precum „cromatografie de bioafinitate” şi de „adsorbţie biospecifică” sunt
utilizaţi ocazional pentru a specifica dacă ligand afin estre un compus biologic real. În ceea ce
priveşte originea ligandului, utilizat pentru a divide tehnicile afine de cromatografie se pot menţiona
diverse subcategorii precum cromatografia cu lectine imobilizate, cromatografia de imunoafinitate,
cromatografia cu ligand colorant de sinteză, ori cromatografia de afinitate cu ion metalic imobilizat.
Aceste tehnici afine vor fi examinate în continuare.
 Un alt factor utilizat pentru a se face distincţie între o metodă afină de
alta este tipul de suport utilizat în coloană. În „cromatografia de
afinitate cu presiune atmosferică (sau pe coloană)”, în mod uzual, suportul
utilizat are un diametru mare iar gelul nu estre rigid. Este cazul suportului
de agaroză, dextran, ori celuloză.

Ca mecanism de separare cromatografia de afinitate separă proteinele pe baza

unor interacţii reversibile dintre o proteină (ori un grup de proteine) şi un ligand specific
cuplat la o matrice cromatografică.
Tehnica este ideală în capturarea (extracţia) unei proteine sau ca treaptă
intermediară într-un protocol de purificare şi poate fi utilizată oriunde este disponibil un
ligand potrivit pentru proteina (proteinele) de interes. Cu o selectivitate înaltă şi de aici o
rezoluţie mare, o mare capacitate pentru proteina (proteinele) de interes treptele de
purificare realizează mari factori de recuperare, de ordinul a sutelor şi chiar miilor de ori.
Proteina (proteinele) ţintă sunt colectate într-o formă purificată, concentrată.
 Interacţiile biologice dintre ligand şi molecula ţintă pot fi rezultatul unor
interacţii electrostatice sau hidrofobe, a unor forţe van der Waals' şi/sau legături
de hidrogen. Pentru a elua molecula ţintă de pe mediul afin interacţia poate fi
reversată atât prin metode specifice, de utilizare a unui ligand competitiv cât şi
nespecific prin schimbarea pH-ului, a tăriei ionice sau a polarităţii. Astfel, într-o
singură etapă, purificarea prin cromatografie de afinitate poate oferi un imens
avantaj din punct de vedere a timpului de realizare comparativ cu procedurile
de separare în etape multiple. Efectul de concentrare conduce la posibilitatea
procesării unui volum mare de probă, şi în final, proteina (proteinele) ţintă
putând fi capturată dintr-un amestec biologic complex; formele native de pot fi
separate de formele sale denaturate, putând fi purificate din volume mici de
material biologic, cu un nivel înalt de îndepărtare a substanţelor contaminante.
Succesul purificării prin cromatografie de afinitate presupune existenţa unui
ligand biospecific care poate fi ataşat covalent la matricea cromatografică,
ligandul cuplat trebuind să reţină prin legare specifică afină şi reversibilă
molecula ţintă şi astfel, să permită moleculei ţintă să fie eluate în forma sa
activă. Orice component poate fi utilizat ca şi ligand pentru purificarea
partenerului său respectiv de legare.
Interacţii biologice utilizate în selectarea ligandului respectiv a moleculei ţintă,
utilizate în cromatografia de afinitate

 Enzimă Substrat analog, inhibitor, cofactor

 Anticorp Antigen, virus, celulă.
Polizaharide, glicoproteine, receptor celular
 Lectină
de suprafaţă, celulă.
Secvenţa de baze complementară, histone,
Acid
 polimeraza acidului nucleic, proteina de
nucleic
legare a acidului nucleic.
Hormon,
 Receptor, proteină transportoare (carrier)
vitamină
Glutatio Glutation-S-transferază ori proteine de

n fuziune GST
Proteine de fuziune poli (His), proteine
Ioni
 native cu histidină, cisteină şi/sau resturi de
metalici
triptofan pe suprafaţa lor.
O reprezentare schematică a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate

Reprezentarea schematică a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate. a) mediul

afin este echilibrat cu tamponul de legare; b) proba este aplicată în condiţii care favorizează
legarea specifică a moleculei (moleculelor) ţintă la substanţa complementară de legare (ligandul).
Substanţele ţintă se leagă specific, dar reversibil, la ligand, în timp ce componentele care nu
prezintă afinitate pentru ligand sunt îndepărtate prin eluţie (spălare) de pe coloana afină; c)
proteina ţintă este recuperată prin schimbarea condiţiilor ce au favorizat legarea la ligandul
imobilizat. Eluţia se realizează specific, prin utilizarea unui ligand competitiv ori nespecific prin
schimbarea pH-ului, a tăriei ionice ori a polarităţii. Proteina ţintă este astfel colectată într-o formă
purificată şi concentrată; d) mediul afin este reechilibrat cu tampon de legare
Reprezentarea schematică a procesului de cromatografie afină.
Etapele a), b), c), şi d) sunt prezentate în figura prezentată mai sus.
Condiţii de eluţie în cromatografia de afinitate

Metode de eluţie:
Metoda 1, cel mai simplu caz: o
schimbare în compoziţia tamponului
conduce la eluarea substanţei legate,
fără a o altera şi fără a denatura
ligandul.

Metoda 2. Se utilizează pH-uri extreme

ori concentraţii mari de agenţi chaotropi
pentru eluţie, însă acest procedeu poate
conduce la alterarea temporară ori
permanentă a moleculei ţintă ori a
ligandului.

Metodele 3 şi 4. Se realizează o eluţie specifică prin

adăugarea unei substanţe care competiţionează la
legarea de ligand. Aceste metode pot creşte
specificitatea mediilor care utilizează liganzi specifici de
grup.
 ALEGEREA MATRICEI CROMATOGRAFICE

Alegerea matricei optime reprezintă o etapă foarte importantă în orice proces

cromatografic. O matrice bună pentru a fi utilizată în cromatografia de afinitate
trebuie sa posede următoarele proprietăţi:
1. Hidrofilicitate: să posede proprietăţi specifica care să-i confere interacţii
nespecifice reduse.
2. Pori mari: să permită tuturor spaţiilor matricei să fie disponibile la cele mai
multe molecule din amestecul de separat. O serie de matrici permit legarea numai la
suprafaţa externă, fiind utilizate mai ales în separarea unor molecule foarte mari, a
unor celule sau a unor viruşi.
3. Rigiditate: matricea trebuie să reziste la presiunile de împachetare şi de
curgere a solventului în timpul eluţiei sau a spălării.
4. Inerţie: matrice nu trebuie să contribuie la procesul de separare
cromatografică.
5. Stabilitate chimică: matricea trebuie să fie stabilă la toţi solvenţii utilizaţi în
separarea cromatografică.
O matrice optimă trebuie să posede o structură macroporoasă cu o mare
stabilitate chimică şi fizică, cu o cât mai mică adsorbţie nespecifică, care să faciliteze
o capacitate înaltă de legare şi de recuperare a probei, alături de o rezistenţă mare
faţă de eluţiile în condiţii dure sau condiţiile de spălare.
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE CU ION DE METAL IMOBILIZAT
La mijlocul anilor ‘70, echipa de cercetători condusă de Porath a introdus un nou tip de
cromatografie ce a fost atunci denumită iniţial “cromatografie cu metal chelat”, după care s-a
redenumit “cromatografie de afinitate (adsorbţie) cu metal (ion) imobilizat” (immobilized metal
affinity chromatography, IMAC).
Tehnica se bazează pe diferenţele de afinitate ale proteinelor faţă de ioni metalici
legaţi de substanţe ce au proprietăţi chelatoare, care sunt imobilizate pe un suport
(răşină) cromatografic.
Cu toate că bazele acestei metode nu au fost noi, Porath şi colaboratorii s-au focusat pe
utilizarea acestei noi tehnici în separarea proteinelor. Această caracteristică de “bio-afinitate”
a captat atenţia biochimiştilor, chimiştilor şi biologilor care au utilizat IMAC şi au descoperit
noi valenţe în aplicații particulare a metodei.
Cea mai cunoscută îmbunătăţire o reprezintă aplicaţiile ce utilizează o “coadă”
(tag) de poli-histidină la separarea polipeptidelor recombinante care consistă din
inserţia unei secvenţe terminale de resturi histidinice fie la capătul N- ori la cel C-
terminal al proteinei (peptidei). Utilizarea unor astfel de histidine sau a altor secvenţe ce
posedă afinitate pentru metale în IMAC a dovedit a reprezenta o metodă deosebit de utilă în
recuperarea proteinelor, în special în condiţiile în care se urmăreşte o producţie mare şi a
unui randament crescut de proteine. În consecinţă, IMAC a apărut drept o metodă majoră
utilizată în purificarea proteinelor, pornind din faza de laborator până la cea de pilot ori
industrială.
Au fost publicate o multitudine de studii referitoare la IMAC, unele dintre ele prezentând
noi aplicaţii ale metodei ori de introducere a unor noi posibile arii de utilizare, în care această
tehnică poate fi exploatată.
Interacţiile dintre resturile învecinate ale secvenţei hexa-
histidinice şi matricea Ni-NitriloTetraAcetat.

acidul iminodiacetic, IDA;

acidul nitrilotriacetic, NTA
 Utilizarea diferenţelor de afinitate în interacţia proteină – ion metalic

Legarea proteinelor (ori a peptidelor) la ionii metalici se bazează pe interacţiile

dintre grupările donoare de electroni prezente pe suprafaţa proteinelor şi un ion
metalic care prezintă unul sau mai multe situsuri de coordinare, mai mult sau mai
puţin accesibile, expuse. IMAC se realizează între un sorbent, ori un matrix, la care
se ataşează covalent grupări metalice, chelatoare (Figura de mai jos).

Reprezentarea schematică a
mecanismelor implicate în
adsorbția şi desorbția
proteinelor în cromatografia
de afinitate cu metal (ion)
imobilizat (IMAC). Se prezintă
interacţiile specifice ce se
stabilesc între ionul de metal
chelator, suportul chelator şi
secvenţa polihistidinică.
 În condiţiile în care ionii metalici sunt adăugaţi (încărcaţi), chelatorii multidentaţi şi ionii metalici
formează complexe în care ionii metalici sunt fixaţi pentru interacţia următoare cu compuşii ce
trebuie să fie rezolvaţi. La sfârşitul acestei etape, ionii metalici aflaţi în complexe trebuie să posede
situsuri de coordinaţie libere la care se vor lega solventul ori moleculele de solut după interacţia
dintre proteine şi ionii metalici, proteinele legate pot fi eliberate prin utilizarea unui dezlocuitor
(precum imidazolul).

Tăria legăturii metal–proteină variază de la o proteină la alta ceea ce

conduce în majoritatea cazurilor la o diferenţiere între proteine,
proces ce poate fi exploatat efectiv în randamente mari de separare
ori în izolarea unor proteine specifice.
 Ioni metalici utilizaţi în mod comun în IMAC

Diferenţele în afinităţi ale proteinelor pentru un metal pot fi explicate, cel puţin în parte, pe
baza principiului acizilor ori bazelor tari sau slabe, descrise de către Pearson. În această teorie
se statuează că dacă doi atomi formează o legătură, un atom acţionează ca un acid Lewis iar
cel de al doilea atom ca o bază Lewis. Tăria legăturii este guvernată de valorile intrinseci “tari”
ori “slabe” ai atomilor implicaţi. Teoria acizilor tari sau slabi ori a bazelor tari şi slabe dictează că
legăturile dintre atomi cu o poziţie similară, de exemplu un acid tare combinat cu o bază tare
sunt cele mai puternice. Urmând conceptul de mai sus, ionii metalici precum K+, Ca+2, Mg+2 şi
Fe +3 sunt clasificaţi drept acizi Lewis tari, în timp ce ionii monovalenţi ai metalelor precum Ag+ şi
Cu+ sunt categorisiţi drept acizi Lewis slabi. Ionii metalelor tranziţionale de tipul, Co+2, Zn+2, Cu+2
şi Ni+2, sunt consideraţi acizi “de limită”. Aceşti ioni metalici sunt cel mai adesea utilizaţi în
IMAC, în particular Ni(II), care conferă la un număr de coordinaţie egal cu şase, posedă o
stabilitate electrochimică în condiţii cromatografice, o polarizabilitate limită şi o
stabilitate redox. Ionii metalici chelatori manifestă variaţii în afinitate faţă de proteine, care
poate fi precizată prin utilizarea teoriei descrise de Pearson.
Această teorie a acizilor şi bazelor tari şi slabi postulează că există trei tipuri majori de
liganzi. Acei liganzi care conţin oxigen (de exemplu carboxilat), azot alifatic (precum asparagina
şi glutamina) şi fosfor (de exemplu aminoacizi fosforilaţi) sunt clasificaţi drept baze Lewis tari.
Liganzii care conţin sulf (de exemplu cisteina) sunt clasificaţi drept baze slabe, acei care conţin
azot aromatic (de exemplu histidina şi triptofanul) sunt consideraţi baze de limită. Acizii aflaţi la
limită şi care conţin Co+2, Zn+2, Cu+2 şi Ni+2, coordinează în mod favorabil cu atomii de azot
aromatici (baze la limită) şi de asemenea cu atomii de sulf (baze slabe).
 În interacţiile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizaţi şi resturile de
aminoacizi de pe suprafaţa proteinei, grupările funcţionale imidazolil, tiol şi indolil
sunt principalele ţinte pentru ionii metalici. Grupările funcţionale carboxil şi fosfat
sunt principalele ţinte pentru ionii metalici tari precum Fe(III) şi Mg(II). Un concept
acceptat este acela al distribuţiei spaţiale a resturilor de histidină pe întreaga suprafaţă a
unei proteine în timp ce accesibilitatea acestora va influenţa caracteristicile de retenţie
ale moleculei proteice. Au fost descrise în literatura de specialitate o serie de peptide cu
mare afinitate pentru metal după cum s-au prezentat motife din structura proteică de
legare a metalului neînvecinate precum cele găsite în prolactină sau în hormonul de
creştere. Este de remarcat că existenţa unui motif de legare al metalului nu este
întotdeauna garanţia pentru succesul IMAC, după cum există un număr de enzime cu
afinitate pentru metal care se leagă la matrix-ul chelator prin intermediul unui situs care
nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie de secţiuni de legare a metalului la
proteină, chiar dacă sunt expuse, pot contribui foarte puţin la tăria netă a retenţiei a
proteinei în IMAC.
 Chelatori de metale şi matrix-uri polimerice de chelare
Majoritatea grupărilor chelatoare utilizate în IMAC sunt compuşi chelatori multidentaţi ce
furnizează tăria complexului format de către proteină, ion metalic şi gruparea chelatoare. Aceste
substanţe chelatoare sunt ataşate pe o suprafaţă de sorbent prin intermediul unor grupări de legare
(braţe, spacere) care pot varia în lungime ori în compoziţie. Structura finală formată după ce ionul
metalic este chelatat de către gruparea chelatoare trebuie să permită o oarecare libertate situsurilor
de coordinaţie în ion metalic pentru adsorbţia ori legarea proteinelor și a moleculelor de solvent.
Diferenţele în numărul de situsuri de coordinaţie libere poate explica în parte de ce o serie de
substanţe chelatoare (acidul iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezintă
selectivităţi diferite şi activităţi de adsorbţie faţă de proteina ţintă, dată. În tridentatul IDA, metalul se
va lega la atomul de azot şi de doi atomi de oxigen din grupările carboxilat, lăsând trei situsuri
libere pentru molecula de proteină ori solvent (în condiţiile utilizării Ni+2 ca metal chelator, acesta
putând da o tărie metal-chelatoare superioară, dar pe de altă parte, o slăbire a puterii de reţinere a
proteinei. O altă însuşire a chelatorului ar fi reprezentată de o scădere a riscului de scurgere
(pierdere) a metalului chelat. Figura de mai jos arată un model al celor mai comuni şi utilizaţi
chelatori, IDA şi NTA legaţi la atomii de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune răşini chelatoare

încărcate cu ioni de Ni(II): Ni(II)– acid iminodiacetic, Ni(II)–
IDA (a) şi Ni(II)– acid nitrilotriacetic, Ni(II)– NTA (b) precum şi
o comparaţie a interacţiilor dintre matricele chelatoare cu
ionii de nichel (c, d).
 Acidul iminodiacetic, IDA, reprezintă standardul, cel
mai comun agent ligand chelator de metal pentru
imobilizarea ionilor metalici în suporturile IMAC. Mulţi alţi
chelatori (adsorbenţi) utilizaţi în IMAC au fost proiectaţi în
ultimele decade, fiecare având propriile lor avantaje şi
limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic
carboximetilat (CM-ASP). Un alt chelator foarte utilizat în
IMAC este NTA, mai recent dezvoltat.
Dezvoltarea unor agenţi chelatori potenţiali noi cu
afinitate pentru metal nu este limitată la o grupare
funcţională ceea ce va conduce la apariţia unor noi clase
de compuşi cu proprietăţi de ancorare a metalului utilizate
în IMAC. O serie de compuşi, neînrudiţi structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizaţi în prezent.

Compoziţia tamponului de eluent folosit variază în mare măsură

în condiţiile identificării condiţiilor optime pentru o separarea unei
proteine date şi în multe cazuri, reprezintă factorul principal al
specificităţii atinse într-un protocol de purificare prin IMAC.
 Factorii care contribuie la legătura proteină–metal

O multitudine de studii indică histidina drept aminoacidul care posedă cea

mai puternică afinitate pentru ionii metalici. Este general acceptat că histidina,
asemeni resturilor de triptofan şi cisteină ca rezultat al interacţiilor puternice cu
ionii metalici sunt compuşii cheie în legarea proteinelor în IMAC. Aceşti trei
aminoacizi au cele mai mari retenţii, comparativ de exemplu, cu resturile
glutamat şi aspartat, care esenţial nu prezintă nici o retenţie. Studiile efectuate
au corelat retenţiile unui mare număr de peptide sintetice ori biologic active pe
Ni(II), Zn(II) şi Cu(II) chelaţi pe IDA, cu profilurile lor în aminoacizi în scopul de
a evalua proprietăţile de adsorbţie ale aminoacizilor implicaţi în retenţia
peptidelor. Alte investigaţii au relevat că proprietatea de retenţie a unor proteine
este în mare parte guvernată de resturile de histidină expuse pe suprafaţa
proteinei.
 Cisteina prezintă de asemenea o afinitate puternică faţă de metal,
deşi oarecum mai scăzută decât histidina. Afinitatea pentru metal a
acestor doi aminoacizi poate fi atribuită în general grupărilor lor
funcţionale, în particular a grupărilor imidazol şi tiol, ale histidinei
respectiv cisteinei. În cazul histidinei, alte grupări funcţionale precum
grupările carboxil şi  amino, joacă de asemenea un rol în procesul de
legare la metal. Alţi aminoacizi care pot să posede o afinitate substanţială
faţă de metal sunt triptofanul, fenilalanina şi tirozina care acţionează
direct prin intermediul catenelor lor aromatice, în timp ce arginina, lizina,
asparagina, glutamina şi metionina, acţionează indirect prin efecte
individuale sau combinate pe accesibilitatea histidinei. Cu toate că
retenţia proteinelor ori a peptidelor este în mod primar (cauzal) dată de
afinitatea faţă de metal a aminoacizilor constituenţi, alţi factori pot
contribui profund alături de afinitatea faţă de metal, factori ce includ
secvenţa în aminoacizi (poziţia aminoacizilor în catenă, structura
primară), plierea proteinei ori proprietăţile suprafeţei acestora.
Se poate spune faptul că aceste caracteristici de retenţie ale
proteinelor în IMAC nu este uşor de precizat.
 În interacţiile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizaţi şi
resturile de aminoacizi de pe suprafaţa proteinei, grupările funcţionale
imidazolil, tiol şi indolil sunt principalele ţinte pentru ionii metalici. Grupările
funcţionale carboxil şi fosfat sunt principalele ţinte pentru ionii metalici tari
precum Fe(III) şi Mg(II).
Un concept acceptat este acela al distribuţiei spaţiale a resturilor de
histidină pe întreaga suprafaţă a unei proteine în timp ce accesibilitatea
acestora va influenţa caracteristicile de retenţie ale moleculei proteice. Au
fost descrise în literatura de specialitate o serie de peptide cu mare afinitate
pentru metal după cum s-au prezentat motife din structura proteică de legare
a metalului neînvecinate precum cele găsite în prolactină sau în hormonul de
creştere. Este de remarcat că existenţa unui motif de legare a metalului nu
este întotdeauna garanţia pentru succesul IMAC, după cum există un număr
de enzime cu afinitate pentru metal care se leagă la matrix-ul chelator prin
intermediul unui situs care nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie
de secţiuni de legare a metalului la proteină, chiar dacă sunt expuse, pot
contribui foarte puţin la tăria netă a retenţiei a proteinei în IMAC.
 Chelatori de metale şi matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea grupărilor chelatoare utilizate în IMAC sunt compuşi chelatori multidentaţi ce

furnizează tăria complexului format de către proteină, ion metalic şi gruparea chelatoare.
Compoziţia tamponului de eluent folosit variază în mare măsură de condiţiile optime identificate
pentru separarea unei proteine date şi în multe cazuri, reprezintă factorul principal al specificităţii
atinse într-un protocol de purificare prin IMAC. Aceste substanţe chelatoare sunt ataşate pe o
suprafaţă de sorbent prin intermediul unor grupări de legare (braţe, spacere) care pot varia în
lungime ori în compoziţie. Structura finală formată după ce ionul metalic este chelatat de către
gruparea chelatoare trebuie să permită o oarecare libertate situsurilor de coordinaţie în ion metalic
pentru adsorbţia ori legarea proteinelor ori a moleculelor de solvent. Diferenţele în numărul de
situsuri de coordinaţie libere poate explica în parte de ce o serie de substanţe chelatoare (acidul
iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezintă selectivităţi diferite şi activităţi de
adsorbţie faţă de proteina ţintă, dată. În tridentatul IDA, metalul se va lega la atomul de azot şi de
doi atomi de oxigen din grupările carboxilat, lăsând trei situsuri libere pentru molecula de proteină
ori solvent (în condiţiile utilizării Ni+2). În acelaşi mod, tetradentatul NTA este considerat a lega ionul
meztalic cu un oxigen extra carboxilat, acesta putând da o tărie metal chelatoare superioară, dar pe
de altă parte, o slăbire a puterii de reţinere a proteinei. O altă însuşire a chelatorului tetradentat ar fi
reprezentată de o scădere a riscului de scurgere (pierdere) a metalului chelat.
Figura arată un model al celor mai comuni şi utilizaţi chelatori, IDA şi NTA legaţi la atomii
de Ni.

Structurile a două dintre cei mai

utilizate răşini chelatoare încărcate cu
ioni de Ni(II):
a. Ni(II)– acid iminodiacetic, Ni(II)– IDA
şi
b. Ni(II)– acid nitrilotriacetic, Ni(II)– NTA
precum şi o prezentare a modului de
realizare a interacţiilor dintre
matricele chelatoare cu ionii de
nichel (c, d) .
 Acidul iminodiacetic, IDA, reprezintă standardul, cel mai utilizat agent ligand
chelator de metal pentru imobilizarea ionilor metalici în suporturile IMAC. Mulţi alţi
chelatori (adsorbenţi) utilizaţi în IMAC au fost proiectaţi în ultimele decade, fiecare
având propriile lor avantaje şi limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate
precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic carboximetilat (CM-ASP). Un
alt chelator foarte utilizat în IMAC ar fi NTA, mai recent dezvoltat. Dezvoltarea unor
agenţi chelatori potenţiali noi cu afinitate pentru metal nu este limitată la o grupare
funcţională ceea ce va conduce la apariţia unor noi clase de compuşi cu proprietăţi
de ancorare a metalului utilizate în IMAC. O serie de compuşi, neînrudiţi structural cu
aminele carboximetilate, sunt relativ utilizaţi în prezent.

Structuri ale unor noi grupări

chelatoare utilizate în IMAC

De exemplu dye-resistant yellow 2KT, O-fosfoserina (OPS) şi 8-hidroxiquinolina (8-HQ).

Selectarea unei combinaţii optime de chelator şi de ion de metal este importantă după cum şi
răşina chelatoare poate avea efecte adverse în retenţia proteinei. S-a observat că diferit de
metalul utilizat, răşina chelatoare poate avea un efect important în retenţia proteinei,
sugerându-se că, prin utilizarea unei răşini diferite, retenţia proteinei poate fi alterată ca
rezultat al interacţiilor dintre complexul proteină–metal şi răşina chelatoare utilizată.
 Suportul polimeric utilizat trebuie să îndeplinească o serie de
caracteristici fizico-chimici în scopul de a fi corespunzător procesului IMAC.
Astfel un suport ideal trebuie să fie:
 uşor de derivatizat;
 să nu manifeste adsorbţie nespecifică;
 să prezinte proprietăţi fizice, mecanice bune şi o bună stabilitate
chimică;
 să posede o porozitate înaltă care să conducă la o accesibilitate uşoară
a ligandului;
 să poată fi utilizat la viteze mari de curgere;
 să fie stabil la eluenţi, inclusiv, în ultimă instanţă la compuşi
denaturanţi;
 să permită regenerarea coloanei fără o degenerare a matrix-ului;
 să furnizeze geluri stabile care să nu-şi modifice volumul prin
deshidratare ori umflare în timpul procesului cromatografic.
 Factorii care guvernează adsorbţia şi desorbţia
proteinelor

numărul de legături dintre ionul de metal şi un un chelator de metal imobilizat guvernează

afinitatea totală a complexului chelator–ion de metal pentru proteine ori peptide. Chelatorul trebuie
să aibă o puternică afinitate pentru ionul de metal (pentru a preveni, de exemplu, efectul
transferului de ion de metal), dar trebuie să lase de asemenea o serie de situsuri de coordinare
libere pentru a fi capabile să lege proteina la ionul de metal. Se pare că stabilitatea structurii
chelator–ion de metal depinde de tipul de ion de metal şi de compoziţia tamponului eluent utilizat.
Un număr de caracteristici ale chelatului pot să influenţeze selectivitatea legării metal–proteină:
geometri de coordinare a complexului, sarcina, volumul steric şi chiralitatea.

FAZA MOBILĂ: pH-ul, TĂRIA IONICĂ ŞI CAPACITATEA DE TAMPONARE

Selectivitatea unei IMAC pentru o proteină poate de asemenea să depindă de

compoziţia fazei mobile. Creşterea tăriei ionice a tampoanelor poate să conducă
la o supresie a interacţiilor secundare, electrostatice nedorite cu o creştere a
legării proteinei la complexul chetator după cum o scădere a concentraţiei saline
poate conduce uneori la o mai slabă adsorbţie a acesteia. Clorura de sodiu (la
concentraţii de 0,1–1,0 M) este în mod constant inclusă în tampoanele IMAC
pentru a suprima interacţiile ionice dintre probă şi matrix, ca şi cele dintre proteine.
Utilizarea valorilor crescute de pH (7 ori 8) şi a unei tării ionice mari conduce la particularizarea
IMAC faţă de alte tehnici cromatografice, precum cea de schimb ionic. IMAC se aseamănă cel mai
bine cu cromatografia de interacţie hidrofobă (HIC) deoarece se realizează cu tampoane ce conţin
concentraţii crescute de săruri.
Adsorbţia unei proteine în IMAC se realizează la un pH dat la care grupările
donore de electroni de pe suprafaţa unei proteine sunt parţial neprotonate. Este
deseori întâlnit în practică inducerea adsorbţie proteinei pe un suport IMAC sub
condiţii uşor alcaline, în prezenţa unei tării ionice crescute a tamponului.
Tampoanele fosfat şi acetat sunt cele mai utilizate în IMAC. Rolul pH-ului este
deosebit de complex în eluţia şi adsorbţia proteinelor, deoarece el influenţează un
număr de proprietăţi, inclusiv caracterul nucleofil al componentelor tamponului,
proprietăţile electron-donor acceptor ale soluţilor şi stabilitatea ionului de metal.
Domeniul de pH cuprins între 6 şi 8 favorizează retenţia resturilor histidinice şi
cisteinice; într-un domeniu mai alcalin, coordinaţiile dintre grupările amino
funcţionale sunt favorizate, ceea ce conduce la o scădere a selectivităţii.
Aditivi şi dezlocuitori de proteine

Detergenţii pot fi utilizaţi în IMAC drept amplificatori de selectivitate. Tween-ul-80, la o concentraţie

de 0,01% (v/v) a fost utilizat în purificarea prolactinei recombinate umane ori a prolactinei de la
primate, dovedind a fi deosebit de util în diminuarea interacţiilor nedorite. Uneori, un solvent organic
este adăugat la tampon pentru a ajuta la îndepărtarea endotoxinelor fără efecte dăunătoarea asupra
împachetării corecte a proteinelor, ori în scopul eliminării unor contaminanţi în cazul purificării
albuminei din extracte proteice
 Avantajele şi dezavantajele cromatografie
de afinitate cu metal imobilizat

 IMAC se realizează deseori într-o singură treaptă de purificare;

 Capacitatea de încărcare cu proteină este relativ înaltă, comparativ
cu alte tehnici de cromatografie de afinitate (0,1–10 mM/ml gel);
 Ionii de metal pot fi uşor de îndepărtat de pe răşină cu ajutorul unui
agent chelator mai puternic, EDTA sau EGTA. Ionii de metal diferiţi pot
fi astfel testaţi utilizând aceeaşi răşină chelatoare, pentru a determina
ligandul ce dă cele mai mari satisfacţii în separarea unei proteine de
interes;
 Trecerea la scală mare a procesului IMAC este extrem de uşoară
şi reproductibilă, ceea ce face din această tehnică un candidat în
aplicaţiile industriale;
 IMAC este utilizată în concentrarea soluţiilor diluate de proteine;
 IMAC este compatibilă un număr mare de tampoane cu forţă ionică
crescută şi care conţin componente chaotrope;
 În general, IMAC nu are efecte adverse asupra
structurii proteice, fiind raportate puţine cazuri în care
metaloenzimele care posedă un ion de metal esenţial a
fost extras. Un caz a fost de asemenea raportat în pentru o
proteină separată prin IMAC pe o coloană Cu(II) –IDA, dar
alterarea a fost cauzată de către agenţii reducători care au
cauzat proteoliza oxidativă catalizată de ionul de Cu(II);
 Efectuarea unei treceri (pasaj) printr-o coloană
neîncărcată de IMAC, conduce la obţinerea unor soluţii
tranzitoriu sterile deoarece toţi ionii de metal esenţiali
creşterii bacteriene sunt îndepărtaţi prin chelatare;
 O răşină IMAC pot fi regenerate de foarte multe ori,
fără o pierdere a caracteristicilor cromatografice. Gelurile
utilizate în IMAC sunt extrem de robuste cu condiţia ca
valori de pH sub 4 să nu fie utilizate.
 O comparaţie între IMAC şi procedeele standard de cromatografie de
afinitate

Afinitate Biospecificitate/
Caracteristică
pentru metal bioafinitate
Stabilitatea ligandului Înaltă Scăzută
Încărcarea cu proteină Înaltă Scăzută
Condiţii de eluţie Blânde Deseori extremă
Recuperarea ligandului Completă În general
după regenerarea incompletă
coloanei
Selectivitate Scăzută-medie Înaltă
Cost Scăzut Înaltă
 DEZAVANTAJELE UTILIZĂRII IMAC

 Fenomenul de transfer al ionului de metal conduce la pierderi de proteină şi

la randamente mici în recuperare. O altă problemă ar fi dacă proteina ţintă
reţine ionul de metal capturat în structura sa. În acest caz ionul capturat poate
afecta sau chiar aboli bioactivitatea proteinei. Sechestrarea ionului de metal de
către proteină este de asemenea periculoasă dacă se intenţionează a o utiliza
în scop terapeutic, deoarece o serie de metale în mod curent utilizate în IMAC
sunt considerate a fi carcinogene. Ionii metalici de Co(II) ori Ni(II), aproape
generaal utilizaţi în IMAC, sunt cunoscuţi a fi agenţi carcinogeni, deşi ei sunt
consideraţi mutageni slabi, comparativ cu arsenul ori cromul hexavalent.
Nichelul a fost legat de o expresie anormală a unui număr mare de gene
considerate a fi implicate în inducţia cancerului. Acest fenomen poate fi
remediat prin alegerea unui alt ion metalic chelator care interacţionează cu
proteina ţintă. O altă cale care poate fi urmată este cea în care se utilizează un
agent chelator adsorbent puternic, de tipul TED [tris(carboximetil)-etilen
diamină].
 Scurgerea de ion de metal de pe răşină conduce la contaminarea cu acesta a
produsului final, problemă deosebit de importantă în cazul preparatelor terapeutice.
O problemă aparte în acest caz este cea datorată chiar de interacţia dintre ionul
metalic şi proteina însăşi,, mai ales în cazul proteinelor cu uz terapeutic, după cum
este cunoscut faptul că ionii de metal nu numai că sunt catalizatori ai reacţiilor
oxidative ci şi afectează negativ stabilizarea preparatelor proteice liofilizate, deşi se
ştie că ionii de metal au fost utilizaţi drept aditivi alături de zaharide în creşterea
stabilităţii proteinelor în decursul liofilizării. În acest caz, în care ionul de metal este
un factor destabilizator, creşterea stabilităţii preparatului proteic se poate realiza
prin adăugare de agenţi chelatori. Probele proteice care conţin ion metalici
contaminanţi după o treaptă de IMAC pot fi în continuare supuse unor alte etape de
purificare care în final conduc la preparate necontaminate, cu uz terapeutic. În cazul
în care se doreşte eliminarea urmelor de metal într-o singură treaptă se poate
recurge la o coloană de tipul de tipul TED în scopul capturării ionilor de metal
contaminanţi din preparatul proteic. O altă cale elegantă de eliminare a scurgerii de
ion de metal o reprezintă utilizarea unor suporturi de imobilizare a metalului cu
constante mari de legare a acestuia, şi astfel se poate preveni pierderea ionului de
metal.
 Utilizarea condiţiilor oxidative şi catalitice în timpul procesului de separare în
condiţiile în care ionii metalici sunt imobilizaţi sunt nedorite datorită apariţiei unor
procese redox care conduc la alterarea proteinei.
Utilizarea cromatografiei de afinitate pentru ion de metal în conjunctie
cu alte tehnici cromatografice

• SECVENŢELE TERMINALE CU AFINITATE PENTRU

METAL: AVANTAJE ŞI APLICAŢII
– Identificarea proteinelor de fuziune
– Creşterea vitezei procesului de purificare
– imobilizarea unei proteine pe o suprafaţă
– Utilizarea secvenţelor tag
– creşterea stabilităţii proteinei şi de creştere a nivelului de
exprimare
 CROMATOGRAFIA CU IONI DE ARGINT INCLUŞI

 Cromatografia cu ion de argint (denumită uneori şi cromatografie de

argentare) reprezintă o tehnică care se bazează pe o proprietate a
ionilor de argint de a forma complexe polare şi reversibile cu centrii
nesaturaţi prezenţi într-o serie de molecule organice precum cele din
lipidic ori flavonoidic. Se face astfel posibilă separarea pe baza
numărului, configuraţiei geometrice şi a poziţiei legăturilor duble. În
practica cromatografică aceasta se realizează în conjuncţie cu una
dintre procedurile cromatografice stabilite: prin TLC, în cele mai multe
experimente realizate în trecut sau mai recent, prin HPLC ori prin
cromatografie de fluid supercritic.
 Sistemul, în mod uzual utilizat, implică încorporarea ionilor de argint
într-un suport solid şi uneori, în cazul cromatografiei cu fază inversă,
utilizarea unei faze mobile în care au fost dizolvaţi ioni de argint.
Celelalte componente ale aranjamentului cromatografic de bază sunt
similare cromatografiei convenţională.
 O multitudine de metode de cromatografie cu ion de argint sunt
general aplicabile la o varietate de probe în timp ce altele, sunt mult mai
specifice.
 PRINCIPIUL ŞI MECANISMUL CROMATOGRAFIEI CU IONI DE ARGINT INCLUŞI

Cromatografia cu ioni de argint incluşi se bazează pe principiul că moleculele organice

nesaturate reacţionează reversibil cu metale tranziţionale precum argintul, formând complexe
polare cu sarcină transferată. Astfel, se formează o legătură sigma între electronii 2 p π* ai
legăturii duble şi orbitalii 5s şi 5p liberi ai ionului de argint. Este implicată de asemenea o
legătură π între electronii de antilegătură 2 p π* ai legăturii duble şi orbitalii 4d ocupaţi ai
ionului de argint. Tăria complexului este determinată de accesibilitatea electronilor în
orbitali şi de inhibiţiile sterice ale acestora.
Se cunoaşte mai mult despre stabilitatea acestor complexe realizate în studii de interacţie a
ionilor de argint cu diverse olefine cu catenă scurtă.
În cazul cromatografiei cu ioni de argint incluşi în suportul cromatografic, a acizilor graşi este
cunoscut că, în cazul dienelor cu grupări metilen întrerupte, stabilitatea complexelor creşte odată cu
creşterea numărului de legături duble, izomerii cu legături duble aflate în poziţie cis sunt mai
puternic reţinut decât izomerii trans, iar stabilitatea scade odată cu creşterea lungimii catenei, şi
tinde odată cu creşterea iniţială a distanţei dintre legăturile duble să devină mai mare. Dienele
conjugate sunt reţinute mai puţin puternic decât dienele cu grupări metilen întrerupte şi monoenele
care sunt mai puternic reţinute comparativ cu monoinele.
 Coloanele cromatografice de tipul în care ionii de argint
sunt legaţi prin intermediul legăturilor ionice la resturi de acid
fenilsulfonic, legate la rândul lor de matricea de silice posedă
proprietăţi chimice relativ bune.
Numeroşi factori, în special cei legaţi de compoziţie,
de temperatură a coloanei şi de viteza de curgere a fazei
mobile pot fi controlaţi cu acurateţe.
Acest sistem a fost utilizat în obţinerea unor informaţii
cantitative asupra mecanismului de interacţie între ionii de
argint şi legăturile duble. S-a constatat că in acest sistem
cromatografic interactia ionului de argint inclus poate implica
un mecanism mixt de retenţie. De exemplu, dupa cum ionii de
argint participă la complexarea legăturilor duble, grupările
libere de silanol interacţionează cu grupările esterice ale
acizilor graşi.
Cromatografia în strat subțire 2 al α-
Santalene (banda 1), β-Santalene (banda
2) și amestec hidrocarburi terpenice
(banda 3) pe (2A) gel de silice normală
(0% AgNO3)
Anticancer Benzotriazoles
 CROMATOGRAFIA CU FAZĂ STAŢIONARĂ CHIRALĂ
Enantiomerii, după cum bine se cunoaşte, posedă proprietăţi fizico-chimice identice până în
momentul în care sunt plasaţi într-un mediu care este însuşi chiral. Din acest motiv, ei trebuie să
posede o retenţie egală în interacţia cu orice fază staţionară achirală, neputând fi separaţi cu
ajutorul sistemelor cromatografice achirale. Pentru a crea un mediu chiral, se poate adăuga o
componentă chirală adiţională la sistemul cromatografic, aşa-numitul selector chiral.
Selectorul chiral poate fi prezent în faza mobilă (tehnică denumită fază mobilă
chirală) ori în faza staţionară (fază staţionară chirală).
Exista si cazul general, in care selectorul chiral este prezent în ambele faze iar
recunoaşterea chirală se manifestă simultan, în fazele mobilă şi staţionară.
FAZE STAŢIONARE CHIRALE

Majoritatea acestora sunt realizate pe suport de silicagel ce este

acoperit cu un material polimeric de care este legat un izomer optic
activ. De exemplu, forma L a prolinei se leagă la un copolimer
reticulat polistiren-p-divinilbenzen pentru a se produce o fază
staţionară optic activă necesară separării a unor amestecuri
racemice de aminoacizi.
În această aplicaţie, sunt introduşi ionii de cupru în soluţia
enantiomerică de analit ce urmează a fi separată. După cum se
observă în figura următoare are loc formarea unui complex terţiar
între faza staţionară, anionii de aminoacid şi cationii de cupru.
Constanta de formare a acestui complex diferă de formele D şi L ale
aminoacidului analit ceea ce face posibilă separarea acestora.
Reprezentarea schematică a complexului
ternar format între
 L-prolină legată la faza staţionară,
un aminoacid prezent într-un analit şi
ionul bivalent de cupru.
 Au fost dedicate o serie de studii pentru dezvoltarea unei mai bune
metodologii în cromatografia chirală, enantioselectivă, ceea ce a condus la
identificarea unor noi faze staţionare chirale. O serie de agenţi chirali au fost
derivatizaţi şi imobilizaţi pe suprafaţa suportului cromatografic (deseori
reprezentat de silicagel) servind drept discriminatori chirali în timpul procesului
cromatografic. De multe ori fazele staţionare chirale sunt de preferat în
procesul de separare cromatografică datorită vitezei de analiză, posibilitatea
analizării ori a purificării unor enantiomeri dintr-un amestec complex, a
reproductibilităţii analizei precum şi a flexibilităţii ei. În plus, sistemele
cromatografice analitice pot fi adaptate la separări preparative când se pot
colecta enantiomeri în formă pură.

Această tehnică cromatografia cu fază staţionară chirală are drept aplicabilitate

practică studiile de recunoaştere moleculară, după cum retenţia diferenţială a
enantiomerilor în sistemul cromatografic care utilizează faze chirale staţionare poate
fi datorată discriminării chirale la nivelul situsurilor chirale, interacţii care se pot
explora.
S-a arătat că parametrii cromatografici obţinuţi prin fazele staţionare chirale pot fi
deosebit de sensibili, ceea ce conduce la separări în cazul unor enantiomeri cu proprietăţi
foarte apropiate. În plus, fazele staţionare chirale pot fi utilizate în studii specifice de
recunoaştere chirală între molecule. O altă aplicaţie a cromatografiei cu fază chirală o
constituie studiul unor medicamente cu structură chirală.
O clasificare convenţională a tipurilor de faze staţionare după modul
de interacţie între faza staţionară şi enantiomer

Tip de interacţie Exemple

albumina serică, glicoproteina a1-

Afinitate chirală a proteinelor acidă (orosomucoid), ovomucoid şi
chimotripsina.

Acces stereoselectiv la polimeri chirali

Polizaharide derivatizate ori libere.
helicaţi

Interacţii sterice μ-μ între un donor şi

un acceptor de tip chiral cu grupări Interacţii Pirkle.
amido aromatice

Interacţii gazdă-macromoleculă în Ciclodextrine, eteri coroană şi polimeri

interiorul unei cavităţi chirale legaţi.
Ioni de cupru complexaţi cu zone
Schimb de ligand
moleculare chirale.
 Afinitate chirală a proteinelor

Deşi α-1 glicoproteina acidă (AGP, orosomucoid) şi ovomucoidul

(OVM) au cel mai mare câmp de aplicaţii, multe rapoarte ştiinţifice au
descris separarea cromatografică şi/sau studii de legare prin utilizarea
albuminei serice bovine (BSA), a albuminei serice umane (HSA) şi a
celobiohidrolazei I (CBH I) drept selectori chiral imobilizati. Toate
aceste coloane sunt disponibile comercial la fel precum si coloanele
chirale cu avidină ori pepsină, legate.
Proteine precum proteina de legare a riboflavinei, ovoglicoproteina
(fracţia activă a preparatelor proaspete de ovomucoid) şi
amiloglucozidaza reprezintă sunt candidaţi promiţători în separarea
chirală a compuşilor biologic activi.
Alte faze chirale staţionare descrise în literatură utilizează cu o
aplicabilitate relativ limitată sunt:
 tripsina imobilizată
 α-chimotripsina,
 conalbumina (ovotransferina) şi
 lizozimul.
 Se mai poate nota că numărul de proteine care pot fi utilizate
drept selectori chirali imobilizaţi în electroforeza capilară ori în alte
tehnici înrudite este mult mai mic decât cel utilizat în cromatografia
lichidă.
Au fost descrise separări chirale prin electrocromatografie în
tuburi deschise capilare (open tubular capillary
electrochromatography, OTCEC) cu proteine adsorbite pe perete
(lizozim, avidină, albumina serică bovină - BSA, orosomucoid,
albumina serică umană - HSA) ca faze staţionare.
În paralel au fost testate reţele de BSA–dextran şi geluri reticulate
de BSA şi celobiohidrolază I în geluri de electroforeză de afinitate.
În concluzie, aceste faze staţionare se realizează din proteine
naturale legate la matricea de silice. Caracteristica de bază o
reprezintă faptul că aceste proteine conţin un mare număr de centrii
chirali recunoscuţi a reacţiona puternic cu analiţii mici manifestând o
selectivitate chirală puternică. S-au evidenţiat situsuri interactive
specifice care conduc la selectivitatea chirală, dar, sunt prezente mult
mai multe situsuri ce numai contribuie la retenţia generală. Aceste alte
situsuri pot fi dezactivate de către aditivii prezenţi în faza mobilă (de
exemplu octilamina) care reduc astfel retenţia generală dar cresc
selectivitatea chirală.
 Acces stereoselectiv la polimeri chirali helicaţi
Cel de al doilea tip se bazează pe interacţii chirale între solut şi polimeri naturali şi a fost
dezvoltă de către Okamato şi colaboratorii ce au descris în anul 1987 prima preparare de
suport chiral la care polizaharidele au fost legate de gelul de matricea solidă activată prin
intermediul γ –amino-propil-silice. Metoda de fixare constă din utilizarea drept reactiv de legare
a diizocianatului.

Fixarea 3,5-dicloro- şi a 3,5-

dimetilfenil carbamatatului
la celuloză pe gel de γ –
aminopropilsilice.
 Dintre diversele tipuri de polimeri polizaharidici precum celuloza, amiloza, chitosanul, xilanul,
curdlanul, dextranul şi inulina, celuloza şi amiloza au fost utilizate în prepararea şi comercializarea
suporturilor cromatografice de separare chirală. Celuloza şi amiloza ca atare nu pot şi nu sunt
comercializate drept suporturi cromatografice de separare chirală datorită capacităţii lor scăzute în
rezoluţie ca şi din cauza problemelor ce apar în manipularea lor. Din această cauză aceşti polimeri
au fost derivatizaţi sub diverse forme (precum tricarbamaţi ori triesteri). Aceşti derivaţi sunt apoi
legaţi pe suportul de silice.
Catenele polimerice ale unităţilor de D−(+) glucoză conţin legături β-1,4 în cazul celulozei şi
respectiv α 1,4 în cazul amilozei. Aceste catene se află într-o parte şi în alta în formă lineară în
cazul celulozei şi în formă elicoidală în cazul amilozei.
Suporturile cromatografice de separare chirală pe bază de polizaharide sunt disponibile atât în
modul de cromatografiere în fază normală cât şi în cel de fază inversă.

Structurile tridimensionale ale celulozei

şi ale amilozei
 Mecanismul de recunoaştere chirală la nivel molecular a interacţiei
chirale în cazul suporturilor cromatografice chirale pe bază de
polizaharide rămâne încă neclar deşi s-a raportat că rezoluţia chirală
realizată pe baza acestora este realizată prin interacţii de hidrogen,
interacţii π – π, interacţii dipol – dipol induse, între suportul chiral şi
enantiomeri.
S-a observat că legarea coordinativă contribuie de asemenea la rezoluţia
chirală a enantiomerilor ce conţin atomi de sulf în cadrul moleculei.
În plus faţă de aceste legături, efectele sterice guvernează de asemenea
rezoluţia chirală pe aceste suporturi pe bază de polizaharide.
Aşadar, structura tridimensională a amestecurilor racemice (racemaţilor,
care conţin grupări funcţionale şi inele aromatice) se asamblează stereogenic
în diverse moduri în cavităţile chirale ale fazei staţionare, care se stabilizează
prin aceste legături de magnitudini diferite atât pentru enantiomerii (+) cât şi
pentru cei (−) şi astfel are loc ori se manifestă rezoluţia enantiomerilor.
Structurile chimice şi ale celor mai
utilizate suporturi cromatografice de
separare chirală pe bază de
polizaharide (celuloză şi amiloză).
Esteri de celuloză: celuloză triacetat
(1); celuloză tribenzoat (2); celuloză
tri-4 metilbenzoat (3); celuloză
tricinamat (4); celuloză tri-3-
metilbenzoat (5); Carbamaţi ai
celulozei: celuloză trifenil carbamat
(6); celuloză tri-3,5-dimetilfenil
carbamat (7); celuloză 4-clorofenil
carbamat (8); celuloză tri-4 metil
fenilcarbamat (9); Carbamaţi ai
amilozei: amiloză tris 3,5-dimetilfenil
carbamat (10); amiloză tris (S)-α
metilfenil carbamat (11); amiloză tris
(R)-α metilfenil carbamat (12).
 Interacţii sterice μ-μ între un donor şi un acceptor de tip chiral cu
grupări amido aromatice (Interacţii Pirkle.)

Cel de al treilea tip este reprezentat de substanţele chirale cu o masă

moleculară relativă mică legate la silice. În acest caz fazele chirale staţionare
de tip Pirkle sau înrudite cu acest tip de faze sunt compuse din selectori chirali
mici, sintetici ori molecule chirale care sunt ataşate la grupările silanol ale
suportului de silice prin braţe („spacere”) achirale.
Selectorii chirali conţin grupări ori părţi aromatice (fenil, dinitrofenil, naftil,
etc.), capabile să interacţioneze printr-o interacţie “în trei puncte” ce are loc
între selectorul chiral şi analit. În plus faţă de interacţiile prin legături de
hidrogen şi cele dipol-dipol, interacţiile π – π dintre părţile aromatice din
structura selectorului chiral şi analit, joacă un rol predominant.
Fiecare dintre grupările legate are un număr limitat de centrii chirali dar,
datorită mărimii lor mici, se pot lega un număr mare de grupări la silice (opus
cazului în care complexelor mai mari cu părţi chirale). Din această cauză apare
o probabilitate relativ înaltă de menţinere a interacţiei dintre solut şi centru
chiral. Avantajul fazelor chirale Pirkle este acela că per total, cum molecula care
interacţionează este mică, soluţii nu sunt puternic reţinuţi şi astfel selectivitatea
chirală devine factorul dominant.
 William Pirkle este cel care a descoperit şi dezvoltat acest tip de faze staţionare chirale. În
raţionamentul său, Pirkle s-a bazat pe faptul că dacă o moleculă chirală are afinităţi diferite
pentru enantiomeri, ea trebuie să posede un minimum de trei puncte de interacţie; dintre
acestea, cel puţin unul este stereochimic dependent.
În condiţiile utilizării fazei staţionare chirale de tip Pirkle, recunoaşterea chirală se
manifestă la ambele situsuri de legare. Situsurile majore de legare sunt clasificate astfel: inele
aromatice π - bazice; inele aromatice π – acide; situsuri acide; situsuri bazice; situsuri acide;
situsuri de interacţie sterică.
Inelele aromatice sunt potenţial realizatoare de interacţii π – π. Situsurile acide furnizează
hidrogenii pentru formarea punţilor intermoleculare potenţiale dintre aceştia. Situsurile bazice,
ca şi electronii π, pot de asemenea forma punţi de hidrogen. Interacţiile sterice se pot manifesta
de asemenea între două grupări mari.
Suporturile de cromatografie chirală prin interacţie Pirkle se divid în trei clase: π –
acceptori de electroni; π – donori de electroni; acceptori de electroni π şi donori de electroni π.
Figura de mai jos prezintă schematic mecanismul de legare chirală prin interacţie Pirkle.

Reprezentarea schematică a mecanismului de

legare chirală prin interacţie Pirkle. A= grupare π
acidă; B= Situs acid; C= Situs bazic.
 Un mare avantaj în utilizarea fazelor staţionare chirale de tip Pirkle o
reprezintă capacitatea de a inversa ordinea de eluţie prin utilizarea aceluiaşi
tip de fază staţionară chirală, dar cu configuraţie absolută inversată. Este
astfel posibil a elua în urme enantiomerul, înaintea celui major, o trăsătură
dorită în cazul determinării purităţii enantiomerilor. Pentru separări preparative
este benefic a elua compusul dorit, primul.

Fazele staţionare chirale de tip Pirkle pot separa o multitudine de

enantiomeri din numeroase grupe de compuşi, precum: medicamente din
clasa acidului aril propionic, compuşi antiinflamatori nesteroidici, compuşi cu
importanţă în agricultură, produse naturale, β- blocante, o multitudine de
compuşi farmacologici activi, etc.
 Al patrulea tip de faze staţionare chirale este reprezentat de suporturi ce conţin în
structura lor glicopeptide macrociclice şi a fost introdus în cromatografie de către
Armstrong, în anul 1994.
Glicopeptidele macrociclice sunt compuşi chimici care conţin un număr mare de
centrii chirali, care genereaza o serie de cavităţi moleculare în care moleculele de solut
pot intra şi astfel interacţiona cu grupări aflate în aceste zone.
Caracterul spaţial al solutului va determina gradul de pătrundere şi în consecinţă
proximitatea interacţiei care, în schimb, va determina energia de interacţie şi
magnitudinea retenţiei.

Antibioticele macrociclice posedă o serie de caracteristici care le permit să interacţioneze cu

analiţii şi astfel să servească drept selectori chirali. Ele posedă un număr de centrii stereogenici şi
grupări funcţionale, care participă la multiplele interacţii cu moleculele chirale. Ele posedă o masă
moleculară cuprinsă între 600 - 2200 şi au deseori numeroase grupări funcţionale inserate pe
structura lor.
-pot fi acide, bazice ori neutre, neavând ori având o absorbanţă redusă în domeniul UV–
VIS.
-pot interacţiona prin interacţii hidrofobe, dipol–dipol, interacţii π–π, legături de hidrogen
precum şi prin repulsii sterice.
Una dintre cele mai importante interacţii sunt cele ionice ori cele de schimb de electroni. În
plus faţă de părţile hidrofobe, aceste molecule posedă grupări hidrofile precum şi un număr de
grupări ionizabile, ceea ce permite o bună solubilitate în soluţii apoase.
 Ansamicinele, rifamicina B şi
rifamicina SV, au o semnificaţie
istorică, deoarece ele au fost
utilizate la început drept
selectori chirali exclusiv în
Cele mai de succes şi mai utilizate
electroforeza capilară, înainte
antibiotice macrociclice ca şi selectori
de a fi utilizate în cromatografie.
chirali sunt glicopeptidele. Ansamicinele,
Rifamicina B a fost primul dintre
polipeptida tiostreptonă şi
compuşii ansa utilizaţi în
aminoglicozidele, fradiomicină, kanamicină
electroforeza capilară pentru
şi streptomicină, au fost de asemenea
separarea efectivă a unei
utilizate drept selectori chirali.
varietăţi de analiţi ce conţin
grupări amino. Aceste au o
structură caracteristică ansa ce
cuprinde o structură de inel ori
un cromofor ce este înţepat de
o catenă. Catena alifatică poate
fi înalt substituită din care
cauză ansamicinele diferă prin
tipul şi poziţia substituenţilor pe
inelul naftohidroquinonic, după
cum se observă în figură
UTILIZATAREA UNOR ANTIBIOTICE CA FAZE STAŢIONARE CHIRALE

Structurile chimice, numerotare

(A, B) şi reprezentarea schematică
spaţială (C, D) a rifamicinei B şi a
rifamicinei SV.
 Catena alifatică a ambilor compuşi prezintă un etil ester la C21 şi un metil eter la C23.
ansamicinele cele mai des utilizate în separări chirale sunt rifamicina B şi rifamicina SV. S-a arătat
că rifamicina B prezintă enantioselectivitate faţă de compuşi cationici, în timp ce rifamicina SV este
enantioselectivă faţă de soluţi neutrii ori oarecum anionici.
Ansamicinele rifamicina B şi SV, absorb puternic în regiuni spectrale UV şi vizibile din cauza
inelului naftohidroquinonic. Fiecare compus are maximum de absorbţie la 220, 304 şi 425 nm. Din
această cauză rifamicinele sunt utilizate la concentraţii relativ înalte (20–25 mM), separările fiind în
monitorizate (urmărite) cel mai adesea prin detecţie indirectă. Detecţia indirectă se realizează în
general, prin analiza peak-urilor negative, proces datorat reducerii absorbanţei comparativ cu
semnalul de fond (semnal background).
Glicopeptide
Antibioticele macrociclice de natură glicopeptidică par a fi cei mai buni selectori chirali
descoperiţi până în prezent. Ele includ avoparcina, ristocetina A, teicoplanina, vancomicina şi doi
analogi derivaţi ai vancomicinei.

Structurile chimice ale antibioticelor

macrociclice de natură glicopeptidică
utilizate în cromatografia cu fază
chirală: (A) vancomicina, (B)
teicoplanina, (C) avoparcina, (D)
ristocetina A.
 tiostreptona
Polipeptide şi aminoglicozide Kanamicin sulfat
Streptomicina
fradiomicina

O dată cu introducerea fazelor legate ce conţin antibiotic macrociclic acestea au devenit

extrem de populare deoarece s-au dovedit deosebit de utile ca în separările chirale prin
cromatografie lichidă, în special de înaltă performanţă. Antibioticele macrociclice vancomicina,
ristocetina A, teicoplanina, avoparcina, rifamicina B şi tiostreptona au fost utilizate pentru
separări chirale. Antibioticele macrociclice de natură glicopeptididică, vancomicina, ristocetina A,
teicoplanina şi avoparcina par a avea o enantioselectivitate mai largă comparativ cu cea a
ansamicinelor ori a polipeptidului tiostreptonă. Antibioticele macrociclice sunt legate covalent la
gelul de silice prin intermediul unor variate punţi de natură chimică ce le asigură stabilitatea cu
menţinerea proprietăţilor de recunoaştere chirală.
Antibioticele macrociclice de natură glicopeptididică şi tiostreptona sunt ataşate la gelul de
silice prin reacţia grupărilor lor carboxilice cu organosilani, în timp ce antibioticul macrociclic
rifamicina B poate fi ataşată prin intermediul reacţiei dintre grupările aminice cu organosilani.
Antibioticele macrociclice de natură glicopeptidică pot fi de asemenea ataşate prin reacţie de
epoxilare similar metodei utilizate pentru imobilizarea ciclodextrinelor, ori pot fi imobilizate prin
metoda cu izocianat, în mediu anhidru de dimetilformamidă.
 Fazele cu glicopeptide legate pot fi utilizate în modul de fază normală, fază
inversă ori în solvenţi organici polari pentru a atinge diferite enantioselectivităţi sau
pot fi derivatizare pentru a li se altera enantioselectivitatea.
Fazele cu antibiotice macrociclice legate realizează criteriul general pe care
cele mai utilizate faze legate îl îndeplinesc, adică sunt suficient de efective ca
medii de separare, manifestă o bună rezistenţă mecanică, alături de un preţ
accesibil. Fazele legate cu antibiotice macrociclice sunt similare fazelor staţionare
chirale cu proteine legate şi au o capacitate mai mare alături de o mai bună
stabilitate.
Enantioseparările se realizează printr-o multitudine de interacţii precum:
complexări π–π,
legături de hidrogen,
incluziuni hidrofobe,
interacţii dipol-dipol,
repulsii sterice, precum şi
combinaţii ale acestor interacţii.
În timp ce cu alte faze staţionare se pot produce o serie din interacţii
asemănătoare, ele nu sunt în mod normal accesibile pentru o singură fază legată
cu o proximitate închisă.
În opoziţie la fazele staţionare chirale cu proteine legate, cele pe bază de
antibiotice macrociclice pot fi utilizate în procedeul cu fază normală fără nici o
modificare ireversibilă în enantioselectivitate, proces datorat în primul caz
denaturării proteinei legate. Aceste faze pot fi utilizate şi în separări preparative.
 Vancomicina, rifamicina B şi tiostreptona au fost primele
antibiotice macrociclice introduse sub formă legată în cromatografia cu
fază staţionară chirală. Dintre acestea trei, numai vancomicina a
demonstrat un potenţial larg de aplicare, fiind folosită atât în procedeul
cromatografic cu fază inversă cât şi în cel cu fază normală. Vancomicina
a fost de asemenea derivatizată cu 3,5-dimetil - fenilizocianat (DMP) şi
evaluată apoi din punct de vedere al calităţilor de fază chirală. Faza
staţionară cu DMP - vancomicină a fost capabilă să rezolve o serie de
compuşi pe care suportul chiral cu vancomicină nu a reuşit, în special în
cazul hidroxizinei şi a altiazidei.
Suportul chiral cu vancomicină legată a fost utilizat într-un mare
număr de aplicaţii, pentru separarea multor compuşi optic activi. Acest
suport chiral a fost utilizat la rezolvarea unor amestecuri racemice de
piridone (derivaţi ai piridinei cu una sau mai multe grupări cetonice pe un
inel), arildihidropirimidin carboxilaţi (analogi dihidropiridinici ai
modulatorilor canalelor de calciu de tip nifedipinic, un agent clasic
coronaro – vasodilator şi blocant al canalului de calciu, care reduce
accesibilitatea ionilor de calciu la nivelul musculaturii netede şi a inimii,
utilizat în tratamentul anginei pectorale); enantiomeri ai citalopramului
(medicament utilizat în tratamentul depresiilor) ori ai metaboliţilor
demetilaţi derivaţi ai acestuia din plasma umană, a α aminoacizilor şi
dansil derivaţilor acestora; imide ciclice, barbiturice, piperdin-2,6-dione şi
produşi de semisinteză din alcaloizi izolaţi din ergot.
 Teicoplanina s-a utilizat ca fază chirală legată în separarea a peste de
compuşi 90 optic activi printre care aminoacizi şi peptide, salbutamolului (un
agent simpatomimetic utilizat drept bronhodilator, în special în tratamentul
astmei) şi ai metaboliţilor lui din matrix-uri biologice, în determinarea
enantiomerilor albuterolului (un stimulant β-adrenergic utilizat drept
bronhodilator în tratamentul astei şi a altor boli obstructive de pulmon) din
plasmă, în separarea unor aminoacizi rari aromatici. Aceasta din urmă diferă de
vancomicină printr-o „coadă” hidrofobă, ceea ce-i conferă proprietăţi chirale
diferite. Teicoplanina a fost deseori utilizată împreună cu vancomicina în
separarea unui mare număr de soluţi.
Ristocetina A reprezintă unul din ultimele glicopeptide utilizate în
cromatografia cu fază chirală. Prin utilizarea ei s-au separat peste 230 de
amestecuri racemice, în sistem de fază normală ori fază inversă. Din punct de
vedere al caracteristicilor de retenţie, al stabilităţii coloanei, se pare că acest
suport chiral este complementar primelor două glicopeptide prezentate mai sus,
vancomicina şi teicoplanina.
 Avoparcina a fost izolată din sangele de pui de găină şi
a fost utilizată la drept fază chirală legată la gelul de silice
în analizele HPLC, fiind folosită în condiţiile în care alte faze
staţionare chirale nu pot rezolva în totalitate o serie de
amestecuri racemice, precum cele ale verapamilului (un
vasodilator calciu blocant utilizat în tratamentul
hipertensiunii, anginei pectorale şi a unor aritmii cardiace),
a tiroxinei (un hormon ce conţine iod secretat de către
glanda tiroidă şi care amplifică viteza metabolismului
celular, reglând creşterea), ori a mefenitoinei (un
medicament toxic anticonvulsiv cu denumire comercială
mesantoin utilizat în tratamentul epilepsiei în condiţiile în
care alte medicamente anticonvulsive devin ineficace).
Interactii de schimb de ligand (Ioni de cupru complexaţi cu zone moleculare chirale)

Al cincilea tip de cromatografie cu fază chirală legată se

referă la cea de schimb enantioselectiv de ligand, tehnică
sugerată de Davankov şi colaboratorii spre sfârşitul anilor ’70,
fiind utilizată la rezolvarea unor amestecuri de racemici în
enantiomerii constituenţi, fiind astfel prima tehnică de
cromatografie lichidă care conduce la o separare completă şi
certă a stereoizomerilor din cele mai importante clase de
compuşi naturali ori de sinteză, precum α aminoacizii,
hidroxiacizi, aminoalcooli şi a multor altora. Introducerea
cromatografiei cu schimb de ligand a condus la o dezvoltare în
cercetarea chimică (studii stereochimice, sinteze asimetrice,
cataliză enantioselectivă) şi în cea farmacologică.
 Principiul de bază al separării enantioselective prin cromatografie cu schimb de
ligand a fost demonstrat de către un selector chiral chimic legat la o matrice polimerică
precum un complex al Cu (II) cu o serie de aminoacizi naturali care formează în anumite
condiţii complexe ternare compuse din ligandul chiral din faza staţionară, ionul de Cu (II)
şi analit. Enantioselectivitatea formării de complexe ternare, de exemplu diferenţa în
stabilităţi termodinamice a două structuri diastereoizomerice ce cuprind enantiomeri (R)
sau (S) ai analitului este extrem de mare.
Implicarea a doi enantiomeri într-un proces de complexare este aproape identic iar
în ceea ce priveşte mărimea şi sarcina celor două complexe diastereomerice ternare
formate acestea sunt exact identice. Două specii diastereomerice pot diferi numai prin
forma spaţială a lor, singura diferenţă care poate afecta în mod dramatic reprezentând-o
adsorbţia lor pe suprafeţe solide ori pseudo-solide. Acest fenomen reprezintă baza fizică
a procesului de discriminare chirală
 Metode de separare

de atingere a s tarii de echilibru

Cromatografia Elec tro foreza (steady state, displacement electrophoresis)
frontalã, liberã, de migrare î n s olutii (tampon)
moving boundary electrophoresis is otachophoreza
focus are (focalizare) is oelectrica
î n medii s tabilizate, zonalãisoelectric focusing
(zone electrophoresis)
suportul stabilizeazã zonele de migrare
si permite o mai bunã separare
suporturi chimic active
medii suport cu structurã capilarã
medii suport cu structurã reticularã imunoelectroforeza
pe hârtie pe strat subtire electroforeza de afinitate
pe folii de acetat de celulozã pe poliacrilamidã
pe agar, agarozã
pe amidon
 Istoric
• 600 i. C. - Thales din Milet
• 1908- Reiss
• 1909 – Michaelis
• 1937 – Tiselius
• 1947 – Martin & Synge - definesc
ionoforeza
 Concepte de bază in electroforeza
Fenomenele electrocinetice de transport se tine cont de
faptul de faptul că:
 Particula care migreaza (coloidul de dispersie)
 Existența unui mediul de dispersie
 în mediul de dispersie, coloizii de
dispersie sunt putatori de sarcina
electrica
Cohen -la contactul dintre două faze, faza cu
constanta dielectrică mare se încarcă pozitiv
Graham- chemosorbtie
 qs reprezintă densitatea electrică superficială
d2 este grosimea stratului dublu
ε este constanta dielectrică a mediului
ϛ (zeta)=potențial electrocinetic care apare la
suprafața particulei din mediu și care
generează separarea electroforetică

k-1 = grosimea stratului dublu electric (sau

lungimea Debye)
kB = constanta Boltzmann
T= temperatura
e = sarcina electrică
F = constanta Faraday
I = tăria ionică
zi ; ci = valența respectiv concentrația molară
a ionilor din soluție
O particulă încărcată electric, într-un mediu lichid tamponat, sub acțiunea unui câmp electric uniform, se va
deplasa cu o viteză constantă, determinată de acțiunea a patru forțe:
•Forța de atracție electroforetică (F1) egală cu produsul dintre sarcina electrică Q a particulei ( a entității
electrocinetice) și intensitatea câmpului electric aplicat (E)

•Forța de frecare Stokes (F2), egală cu produsul dintre coeficientul de vâscozitate a mediului (η), raza
particulei (r) și viteza electroforetică, v după relația:

F2= 6πηrv

•Forța de frânare electroforetică (F3) rezultată ca urmare a atracției exercitate de câmpul electric asupra
ionilor electrolitului (soluția tampon în care se deplasează particula) conform relației:

F3= (Q - ε• ξ•r)•E
unde, Q reprezintă sarcina electrică a particulei;
ε este constanta dielectrică a mediului;
ξ reprezintă potențialul zeta;
r este raza particulei;
E reprezintă intensitatea câmpului electric aplicat.
Forța datorată efectului de frânare (F4), forță care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului în
apropierea particulei, sub acțiunea unui câmp electric uniform.
 Imediat după aplicarea unui câmp electric , suma vectorială a celor patru forțe devine
egală cu zero, iar viteza electroforetică devine constantă:

Pentru electroforeza în medii stabilizate (gel de amidon, poliacrilamidă, etc.) F3 și F4 sunt practic
neglijabile, astfel încât forței de atracție electroforetice (F1) se opune forța de frecare Stokes (F2):

ceea ce înseamnă că:

Din ultima relație se calculează viteza electroforetică:

Ecuația de mai sus conduce la relația Huckel:
unde ξ reprezintă potențialul zeta;
ε este constanta dielectrică a mediului;
H este gradientul de potențial, egal cu raportul
dintre tensiunea aplicată, U și distanța dintre
electrozi, l.
r este raza particulei;
E reprezintă intensitatea câmpului electric
aplicat.

La baza fenomenelor
electrocinetice importanță practică
are relația Helmholtz-
Smoluchovski:
Henry, plecând de la relațiile
Huckel și Helmholtz-Smoluchovski,
le generalizează conform teoriei
stratului difuz:
unde re reprezintă raza efectivă a particulei
hidratate, r+δ, iar χ este inversul grosimii stratului
dublu electric, fiind cuantificat de relația:
 în care: z reprezintă valența;
e este sarcina elementară;
n este numărul ionilor

La temperatura camerei,
pentru n=c (în moli/litru)

Se poate deci evalua potențialul zeta (ξ):

unde v reprezintă viteza electroforetică.

 MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea electroforetică, µ, se defineste ca raportul dintre viteza

electroforetică si intensitatea câmpului electric.

Din relatia de mai sus se observa ca mobilitatea electroforetica depinde

de raportul Q/r, adica particulele pentru care acest raport este identic au
mobilitati electroforetice identice.

Deoarece viteza electroforetica poate fi exprimata ca raportul

dintre distanta de migrare dsi intervalul de timp t,

mobilitatea electroforetica se poate exprima si prin relatia

În practică se folosește mobilitatea relativă, µo (µ relativă) care este proporțională cu
distanța de migrare:

Mobilitatea relativa, µrel, se defineste ca raportul dintre distanta d, de migrare a

unei benzi si distanta de migrare dcol, a frontului de colorant

Mobilitatea relativă se calculează prin compararea mobilităților diferitelor particule,

considerându-se că timpul de migrare și intensitatea câmpului electric sunt constante
(adică particulele care se compară au condiții identice de migrare electroforetică.
 Pentru electroforeza în medii stabilizate, când

adică,

Se calculează viteza de migrare drept:

Coeficientul 6π•η•r este denumit coeficient de fricțiune (frecare) în medii

stabilizate. El depinde de o multitudine de factori.
 Substituind viteza electroforetică din relația de mai
sus în ecuația mobilității relative:

atunci,

Se observă astfel faptul că mobilitatea relativă este în funcție de sarcina particulei, Q

și de raza sa, r:

unde :
Q reprezintă sarcina particulelor,
iar r este raza particulei.
Se poate spune că particulele cu un raport Q/r identic vor avea o mobilitate identică
 Cum Q este produsul dintre suprafață și
densitatea de sarcină superficială, qs,
pentru o particulă sferică cu raza r, sarcina
particulei este:
Q = 4 π•r2•qs

iar mobilitatea relativă este funcție de raportul

Q/r

atunci, Q/r = 4 π•r•qs

ceea ce arată că dacă variațiile dimensiunilor particulelor sunt

compensate de variațiile de sarcină electrică superficială,
particulele vor migra cu mobilități egale.
 REZOLUȚIA DE SEPARARE

În electroforeza într-un mediu stabilizat, particulele cu

mobilități (µ) diferite se vor deplasa în zone discrete.
Teoretic separarea diferitelor particule sub formă de zone
discrete este realizată, dacă mobilitățile relative sunt
suficient de diferite și dacă distanța migrării este suficient
de mare.
Eficiența unei separări electroforetice este exprimată printr-
o mărime denumită rezoluție de separare, Rs.
Considerând două zone separate electroforetic,
cu lățimea benzii egală cu l1 și l2, iar distanța
dintre ele fiind egală cu Δd, rezoluția de
separare este egală cu:

unde Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2, iar l1 și l2 sunt

lățimile celor două zone formate de două tipuri de particule.
 Drumul parcurs (distanța) în procesul separării electroforetice este
egală cu: d = v•t
unde v reprezintă viteza electroforetică iar t este timpul de migrare

Din relația mobilității, µ=V/E se deduce viteza electroforetică, v=µ•E, iar drumul
parcurs de o particulă în funcție de mobilitatea sa este dat de relația:

Se poate spune că drumul parcurs de o particulă este egal cu produsul dintre

mobilitatea sa, timpul de migrare și câmpul electric aplicat.
Pentru particula 1, drumul parcurs de aceasta este egal cu d1 = µ1•E•t iar drumul
parcurs de particula 2 este egal cu d2 = µ2•E•t.

Cum Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2 fiind egală cu diferența de

migrare între cele două particule (d1-d2) se deduce rezoluția de separare:
Se consideră că:
(1) pentru o separare electroforetică eficientă este necesară o rezoluție de
separare cuprinsă între 1 și 1,5;
(2) lățimea zonelor de separare (l1 și l2 din figura de mai sus) are un rol
hotărâtor. Ea este asociată cu dispersia Gauss datorată procesului
aleatoriu de deplasare.
Dispersia totală este suma a cinci termeni care acționează independent:
Difuziunea termică;
Microheterogenitatea;
Difuziunea turbulentă;
Electrodifuziunea;
Electrosorbția.
Primii doi termeni acționează și sunt importanți în cazul electroforezei în mediu
liber; difuziunea termică și difuziunea turbulentă sunt termeni importanti în
cazul electroforezei pe medii stabilizate.
Pe de altă parte, analiza relației rezoluției de separare în contextul proceselor de
dispersie arată că pentru creșterea rezoluției de separare este de preferat
creșterea intensității câmpului electric și nu a timpului de migrare.
 FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ REZOLUȚIA DE
SEPARARE ȘI MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea particulelor care se deplasează într-un câmp electric

uniform precum și rezoluția de separare dintre particule cu
mobilități diferite sunt influențate de următorii factori:
•pH-ul soluției tampon. Acesta afectează mobilitatea deoarece
sarcina electrică este funcție de pH. Din această cauză, alegerea
soluției cu pH optim conduce la rezoluții superiore.
•Difuziunea postelectroforetică care depinde de metoda
electroforetică utilizată.
•Factori proprii particulelor: mărime, formă, sarcină electrică,
concentrație, gradul de hidratare și disociere.
•Factori caracteristici mediului de separare: vâscozitate, pH,
intensitatea câmpului electric, timpul de migrare.
•Alți factori.
 TĂRIA IONICĂ (FORȚA IONICĂ)
Câmpul ionic dezvoltat de un ion în soluție depinde
de:
(a) concentrația sa;
(b) valența (sarcina) sa;
(c) prezența altor ioni în soluție.
În soluții diluate, tăria ionică este independentă
de natura chimică a ionului. Pentru a ține cont
de toți acești parametrii, s-a introdus o mărime
denumită tărie ionică (forță ionică).
Prin definiție, tăria (forța) ionică (j) reprezintă
semisuma termenilor obținuți prin înmulțirea
concentrațiilor molare (c) a fiecărui ion în
soluție cu pătratul valenței sale (z):

unde i = 1,2,....n
În calculul forței ionice a unei soluții tampon se consideră că acizii slabi sunt
nedisociați, în schimb sărurile lor sunt complet disociate.
Astfel, pentru o soluție tampon conținând 8,8 g/l acid dietilbarbituric și 10,3
g/l dietilbarbiturat de sodiu, forța ionică este dată numai din disocierea sării de sodiu
și ionul de dietilbarbiturat. Cum dietilbarbituratul are masa moleculară de 206,18g,
10,3 grame reprezintă 0,05 moli/l, de aici se trage concluzia că tăria ionică (j) este
egală cu 0,05M.
Teoretic, mobilitatea electroforetică este invers proporțională cu rădăcina pătrată a
forței ionice:
Din această relație se poate observa că:
la micșorarea tăriei ionice are loc o creștere a intensității
câmpului electric uniform aplicat. Astfel, datorită faptului că
rezoluția de separare este direct proporțională cu intensitatea
câmpului electric uniform aplicat, scăderea tăriei ionice conduce la
creșterea rezoluției de separare.
În general se consideră că:
(a) soluții tampon cu forțe ionice mici permit viteze de migrare mari,
deci mobilități mari;
(b) forțe ionice mai mari de 0,15M conduc la viteze de migrare mici
la timpi de migrare mici dar cu o rezoluție bună. Trebuie totuși
avut în vedere că o forță ionică prea mică poate conduce la
precipitarea probelor.
 EFECTUL TERMIC JOULE

În timpul unei separări electroforetice, la trecerea curentului

electric prin soluție are loc o degajare de căldură denumită
căldură Joule sau efect Joule. Acest efect este deosebit de
important în condițiile în care poate afecta negativ separarea
electroforetică prin favorizarea proceselor de difuziune, a
apariției curenților de convecție ori de denaturare a probei
(mai ales în cazul enzimelor). Din acest motiv este necesară
menținerea între anumite limite a acestui efect.
Efectul termic Joule poate fi controlat
(a) în sisteme tampon continue prin valoarea puterii electrice
intrate (dacă temperatura este constantă);
(b) în sisteme tampon discontinue (multifazice) prin
controlul rezistenței electrice a mediului de separare.
Rezistența electrică crește odată cu avansarea frontului mobil datorită
scăderii conductivității mediului. Astfel, la o intensitate a curentului (I)
constantă, la o creștere a tensiunii (U), căldura degajată este în relație
directă cu timpul de migrare. Dacă tensiunea este constantă, scăderea
intensității este funcție de timpul de separare iar căldura degajată
dezvoltată prin efect Joule va fi redusă însă rezoluția de separare va fi
slabă.
Conform primei legi a lui Ohm, intensitatea curentului (I) este direct
proporțională cu tensiunea electrică (voltajul, V) și invers
proporțională cu rezistența (R). Rezistența sistemelor electroforetice
este dată de
tampoanele utilizate,
de tipul de configurații ale gelului
de volumul total al gelurilor care se rulează.
tensiunea electrică este dată de produsul dintre intensitate și rezistență
după relația:
 ELECTRO(ENDO)OSMOZA

Electro(endo)osmoza este un fenomen electrocinetic care apare în urma deplasării fazei

lichide de dispersie printr-un capilar, sisteme capilare sau medii poroase la aplicarea
unui câmp electric exterior.
Ea se caracterizează prin deplasarea electrolitului în câmpul electric aplicat.
Din aceeași categorie de fenomene fac parte potențialul de curgere (fenomen opus
electroendoosmozei) și potențialul de sedimentare.
În medii suport stabilizate (hârtie de filtru, dar mai ales în gelul de agaroză)
electroendoosmoza se corelează cu proporția de sarcini negative ale acestora, motiv
pentru care se induce un flux de lichid spre catod. Cum particulele care se separă sunt
încărcate negativ, iar migrarea lor se realizează spre anod, apar fenomene de convecții
interne, deci se produc modificări ale mobilității electroforetice și astfel ale rezoluției de
separare.
În medii poroase saturate cu o soluție ionică se manifestă o serie de sarcini electrice
fixate pe suprafața fazei solide, distribuția spațială a anionilor și cationilor din faza
lichidă are la bază teoria stratului dublu electric. Dacă sarcinile fixe sunt negative, sunt
necesari cationi în exces din faza mobilă pentru a asigura electro-neutralitatea. La
aplicarea unui câmp electric exterior, acești cationi în exces exercită un moment
adițional în fluidul din por care conduce faza lichidă spre catod. Această mișcare
netă a fluidului față de structura solidului într-un gradient electric impus este denumită
electroosmoză. În practică, viteza electroosmotică este descrisă la scală macroscopică de
relația:

În concluzie, pentru ca electroforeza să fie reproductibilă, este

necesar a se preciza riguros condițiile de lucru precum: calitatea
mediului de separare, proprietățile sistemului tampon,
caracteristicile probei, stabilirea câmpului electric aplicat,
temperatura și timpul de lucru.
 APARATURA UTILIZATĂ LA SEPARĂRILE
ELECTROFORETICE

Pentru a realiza un experiment de separare

și analiză electroforetică sunt necesare
următoarele sisteme:
Sursă de putere care generează un curent
electric continuu, stabilizat;
Aparatul propriu-zis alcătuit după metoda
electroforetică utilizată, având o construcție
variată dar care trebuie să prezinte
compartimente pentru electrozi (din platină,
grafit, etc.) și uneori sisteme de
termostatare;
Dispozitive anexe care cuprind:
(a) dispozitiv de turnat plăci (amidon,
poliacrilamidă, etc.);
(b) cuve de fixare, colorare, spălare
(decolorare);
(c) sistem de uscare (uneori cu aer
cald);
(d) sisteme de evaluare optică
(spectrofotometru cu sistem de baleiere,
densitometru cu lungime de undă fixa, cu
sistem de reflexie sau fluorescență, sisteme
video de preluare a imaginii și de analiză a
gelurilor;
(e) dispozitive specifice.
 ELECTROFOREZA ÎN MEDIU LIBER

Prin definiție, electroforeza în mediu liber se bazează pe deplasarea

liberă a componentelor cu mobilități diferite dintr-un amestec sub
acțiunea unui câmp electric exterior. În acest context, între diferitele
componente se formează suprafețe de separare (fronturi - de unde și
denumirea de electroforeză frontală). Aceste fronturi pot fi observate
prin modificarea bruscă a indicelui de refracție (ca și în cazul
ultracentrifugării). Prin măsurarea acestui indice de refracție de-a lungul
celulei electroforetice se obțin diagrame electroforetice denumite
diagrame Schlieren. Din deplasarea fronturilor se calculează vitezele
de migrare.
Tehnica este pretabilă la automatizare și computerizare, fiind de
asemenea utilizată la separarea componentelor în flux continuu
(proteine, organite celulare, celule).
Aparatura utilizată în electroforeza în mediu liber are la bază aparatul Tiselius,
care are forma literei U, însă aparatele moderne au modificări la sistemul de
electrozi (reversibili), la modul de alimentare cu soluție tampon, modul de
încărcare a probei, modul de înregistrare a vitezei de deplasare.
Părțile principale ale aparatului sunt reprezentate din
(a) compartimentul de electrozi;
(b) celula electroforetică;
(c) sistemul de termostatare;
(d) sistemul de înregistrare.
Celula electroforetică este alcătuită din trei sectoare care se pot deplasa lateral prin
glisare. Modul de încărcare cu probă este prezentat în figura de mai jos. Separarea
se realizează la temperaturi scăzute (2 - 4oC) la o diferență de potențial de 4-10
V/cm timp de 6 ore.
Să presupunem că avem un amestec de două componente PA și PB (pot fi luate în
discuție două proteine) cu mobilități diferite (µA ˃µB) care se deplasează în aceeași
direcție.
Dacă în momentul inițial concentrația celor două proteine este constantă/identică pe
tot parcursul tubului electroforetic, după cum semnalul la sistemul optic este
constant. După introducerea în câmp electric, proteina PA, cu mobilitate mai mare va
migra mai rapid spre anod, îmbogățind frontul de solvent dar sărăcind coada tubului
(figura de mai jos)

Principiul de separare a două componente prin electroforeză în mediu liber.

 După trecerea unui timp suficient de mare proteina PA se va concentra în fronul
de electroforeză, iar proteina PB va migra după aceasta. Dacă se reprezintă
grafic semnalul primit de sistemul optic se realizează o diagramă Schlieren.

Diagrama Schlieren pentru două componente

(PA și PB) separate prin electroforeză în mediu
liber (c=concentrație, n=indice de refracție).

Prin derivatizarea concentrației sau a indicelui de refracție rezultă o

electroforegramă cu peak-uri electroforetice.
 AVANTAJELE UTILIZĂRII ELECTROFOREZEI
FRONTALE

De la introducerea electroforezei în mediu liber (free-flow electrophoresis, FFE), în anii 1960,

această metodă de separare și-a găsit o poziţie permanentă printre metodele de analiză şi
preparative în biochimie precum şi în chimie pentru separarea, de exemplu, a celulelor,
organitelor celulare, a peptidelor, proteinelor, a compușilor anorganici și organici. În FFE,
substanţe de analizat sunt separate în mod continuu într-un câmp electric aplicat perpendicular
peste un strat subțire de tampon transportor în flux continuu după cum se observă în figurile
urmatoare.
Un amestec de probă este injectat în fluxul continuu de electrolit transportor, iar după un timp de
migrare, componente, diferit încărcate, se împart pe culoarele de migrare diferite care pot fi în
continuare colectate la capătul aparatului.
Sistemele FFE disponibile la scară largă în comerţ au fost iniţial dezvoltat ca sisteme de curățare
a unei probe, de exemplu, ca o treaptă de Prefracționare înainte de a o electroforeză
bidimensională. În continuare au fost dezvoltate mini sisteme cu dimensiuni reduse de FFE care
se pot cupla la spectrometrul de masă sau la cromatograful de lichide și care permit separarea
continuă cu posibilităţi de detectare a on-line. Această combinaţie de FFE, ca metodă pentru
separarea continuă cu detectare on-line, permite monitorizarea în timp real a analitului, în cazul
probelor biologice ale unor pacienţi, produşi de reacţie, etc. Sistemele rămân în continuare
complicate și sunt încă lente în funcţionare, totuși utilizarea lor pare a fi foarte promiţătoare.
Aparatele electroforetice care funcționează după principiul curgerii libere (frontale) în formă
miniaturizată (µ-FFE) și-ar putea găsi aplicații în construcția unor aparate miniaturizate portabile
de monitorizare a unor pacienți.
O ilustrare a principiului electroforezei
libere frontale și principalele
componente ale unui sistem de
separare electroforetică și micro-
electroforetică. Tamponul curge în flux
laminar într-un film continuu de 0,3 mm,
de sus în jos sub acțiunea forței
gravitaționale. Proba se introduce
lateral. Sub acțiunea câmpului electric,
componentele probei se deplasează
spre anod lateral și totodată de sus în
jos, odată cu tamponul.
FFE la spitalul universitar din
Basel
Miniaturizarea FFE implică mai multe avantaje mai ales având în vedere
volumul eşantionului şi de viteză de separare. În contrast cu volumele de
ordinul mililitrilor de probă consumate de tehnicile convenţionale de
dispozitivele FFE, microsistemele FFE au nevoie doar de câteva zeci de
nanolitrii până la câteva sute de microlitri de probă. Acest lucru este deosebit
de util în analizele clinice, în cazul în care de multe ori sunt disponibile numai
volume scăzute de probă biologică. Mai mult, timpul de analiză scade de la
câteva ore-zeci de minute, la câteva secunde în cazul timpului de analiză
microdispozitive FFE

DEZAVANTAJELE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Dintre dezavantajele electroforezei frontale se pot enumera:

•Aparatura necesară;
•Amestecarea zonelor datorită difuziunii, curenților de convecție, motiv pentru care
este strict necesară existența unui sistem de termostatare;
Existența unor anomalii de interpretare. Astfel, suprafața peak-ului nu este identică
cu concentrația de proteină. Un alt tip de anomalii sunt legate de migrare. În acest
context viteza de migrare ascendentă nu este identică cu viteza de migrare
descendentă. Acest fenomen, în mod obișnuit, se poate neglija, dar pentru o
electroforeză de mare acuratețe, această anomalie nu este de dorit.
APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Date recente arată că toate tipurile de

electroforeză standard pot fi aplicate cu
succes electroforezei frontale, dintre care
cele mai obișnuite aplicații sunt:
 electroforeza frontală în flux continuu,
 focalizarea izoelectrică în flux
continuu,
 izotacoforeza în flux continuu și
 electroforeza frontală în trepte de câmp
electric
 SEPARAREA POPULAȚIILOR DE CELULE PRIN
ELECTROFOREZĂ ÎN FLUX CONTINUU

Există mai multe dificultăţi implicate în separarea electroforetică de celule sau alte bioparticule.
În primul rând, celulele care urmează a fi separate trebuie să fie prezente ca o suspensie
monocelulară. Agregatele de celule sau ansamblurilor lor nu pot fi separate. Astfel, celule
sanguine, limfatice, sau prezente în alte fluide ale corpului pot fi destul de uşor pregătite, în timp
ce celulele din ţesuturi trebuie să fie mai întâi izolate prin dezintegrare mecanică. Multe proceduri
de izolare a celulelor conduc la o deteriorare a acestora prin disrupere și de eliberare a nucleilor
sau a ADN-ului, oferind preparate care nu pot fi utilizate la separarea electroforetică. Distrugerea
celulelor prin simpla dezintegrare mecanică poate fi redusă prin tratarea țesuturilor cu diferite
enzime combinată apoi cu metode mecanice blânde, cum ar fi amestecare ușoară sau aspiraţie
printr-o pipetă gură largă. Această procedură este singura modalitate de a obţine o suspensie
monocelulară din țesuturi precum cel tumoral. Enzimele care s-au dovedit a fi adecvate pentru
obţinerea de suspensii monocelulare din ţesuturi diferite sunt tripsina, chimotripsina, colagenaza,
hialuronidaza şi dispaza. Cu toate acestea, astfel de enzime, de multe ori au dezavantajul de a
cliva o serie de grupări specifice de suprafaţă, modificând sarcina superficială a acestora, care
reprezintă o condiţie prealabilă pentru separarea electroforetică. Acesta este unul dintre
principalele motive pentru care un număr relativ mic de exemple de succes de separare
electroforetică a celulelor ţesutului pot fi găsite în literatura de specialitate.
O abordare diferită, utilizată la pregătirea prealabilă a celulelor, cum ar fi a nefronilor, care
sunt conectați între ei prin intermediul unor complexe juncționale Ca2+-dependente, este de a
trata țesutul cu complexanți slabi ai Ca2+, precum citratul, EDTA sau EGTA, în combinaţie cu
o agitarea blândă. În general, orice nuclei eliberați în timpul procedurii de izolare pot fi
eliminați prin filtrarea suspensiei pe vată de sticlă introdusă într-o pipetă Pasteur. ADN-ul
liber, care poate apărea în cazul în care nucleii sunt dezintegrați, trebuie să fie de asemenea,
eliminați, deoarece, în câmp electric, conduc la agregarea celulară. Un tratament scurt cu DN-
ază ultrapură (20-30µg/ml) la temperatura camerei timp de 5-10 minute este în general
suficientă.
O altă problemă este alegerea mediului de pregătire şi de separare. Cele mai multe dintre
instrumente de electroforeză în flux continuu prezintă sisteme eficiente de răcire care permit a
se crește tăria ionică a mediului de separare până la 8-10 x 102 µohm/cm. Aceasta este încă o
tărie apropiată condiţiilor fiziologice în care se separă celule în stare viabilă. În scopul de a
atenua pierderea viabilității celulelor acestea trebuie să fie colectate în mai multe soluţii
fiziologice, cum ar fi medii de cultură, după ce acestea au fost separate prin camera
electroforetică. Compoziţia cele mai potrivită a tamponului de separare trebuie să fie
identificată pentru fiecare tip de celule.
 ELECTROFOREZA FRONTALĂ PE COLOANA

O altă aplicație a electroforezei în flux continuu o reprezintă tehnica

denumită electroforeză în flux liber pe coloană, în timp ce metoda cea mai
cunoscută fiind electroforeza preparativă ascendentă.

Aparatul este alcătuit dintr-o coloană cilindrică parțial umplută cu

tampon cu densitate specifică mai mare decât cea a celulelor.
Suprafața astfel realizată va reprezenta stratul de start pe care
celulele sunt depuse (starting cushion). În continuare coloana se
umple cu o soluție izotonă de tampon.
Densitatea specifică crescută a stratului de start se realizează cu
”Ficoll-Hypaque, sucroză ori apă grea. Electrozii se găsesc în
compartimente separate.
În condițiile aplicării unui câmp electric, celulele vor migra
ascendent spre anod, viteza de migrare a acestora fiind în relație
directă cu sarcina superficială de pe suprafața lor. Separarea durează
circa o oră, formându-se zone distincte care se pot colecta în
fracțiuni. Coloana este termostatată și prezintă o capacitate de circa
2•x106-2•x108 celule/ciclu de separare.
 Studying Materials and Processes in Microgravity:
Materials Science

• The Continuous Flow

Electrophoresis
System is used to
separate and purify
biological cells and
proteins.
O importanță deosebită o reprezintă utilizarea electroforezei în mediu
liber la studiul analitic al macromoleculelor biologice. Tiselius, folosind
un tampon cu pH=7,6 a reușit să separe proteinele serice în patru
fracțiuni: albumina, cu mobilitatea cea mai mare și trei fracțiuni
globulinice (α, β și γ, cu mobilități descrescătoare de la α, la β și γ).
Ulterior s-a observat că la pH=8,6 (la care toate proteinele serice sunt
negative, ele migrând spre anod), globulinele α se rezolvă ca două
subfracții α1 ți α2, iar la introducerea unor ioni de calciu (Ca2+
interacționează cu componentele serice modificând astfel mobilitatea lor)
într-un tampon veronal, fracția β se separă în două componente:β1 și β2.
În mod curent, electroforeza în mediu liber
se utilizează la separarea:
(a) celulelor intacte (de exemplu a celulelor
sanguine);
(b) a organitelor celulare (lizozomi,
mitocondrii, aparat Golgi);
(c) sistemelor de membrane celulare.
Procedeul este utilizat:
a. la studiul adezivității bacteriilor,
b. la purificarea plasminogenului tisular
exprimat în drojdii,
c. la separarea celulelor transformate și
clonate, fiind utilizată în tehnologia
anticorpilor monoclonali.
Prin utilizarea unei celule electroforetice în flux liber orizontale (figura
alăturată) procedeul se utilizează la studiul eritrocitelor umane din
sânge periferic în cazuri normale și patologice (malarie), în studiul
celulelor imunocompetente T și B și a celulelor dendritice, la
diagnosticarea și clasificarea unor leucemii și monitorizarea
tratamentului aplicat precum și la urmărirea efectelor antitumorale ale
unor medicamente. S-a obținut astfel un medicament cu structură de
polizaharid extras din Coriolus versicolor (familia Basidomicetae)
denumit krestin cu efect antitumoral și reversor (care reinstaurează
comportamentul normal al limfocitelor, readucându-le în limite normale
funcțiile leucocitelor și macrofagelor).
Prezentarea schematică a reducerii selective și masive a
sarcinii electrice superficiale la unele populații celulare cu
ajutorul unor anticorpi specifici în cazul separării celulelor cu
mobilități electroforetice apropiate sau identice.
 •ELECTROFOREZA ZONALĂ
În momentul în care Tiselius (1937) a publicat lucrarea sa clasică referitoare la
electroforeza în mediu liber. în 1937, Konig (1937) a indicat posibilitatea de a
utiliza hârtia de filtru pentru separarea electroforetică a amestecurilor de proteine.
În deceniul al cincilea din secolul trecut o serie de cercetători au descris variate
tehnici care au utilizat hârtia ca agent anticonvectiv pentru separarea
amestecurilor de aminoacizi, peptide, proteine și alte substanțe.

Utilizarea hârtiei de filtru sau a altor medii suport solide introduc de

asemenea o serie de factori care influențează mobilitatea electroforetică
a moleculelor încărcate electric:
 Electroosmoza
 curgerea hidrodinamică a lichidului
 Adsorbția
 efecte cromatografice
 efecte de stivuire.
Din acesteastă cauză, electroforeza zonală nu poate fi utilizată
pentru determinarea precisă a mobilității electroforetice, a
punctului izoelectric sau a altor proprietăți de migrare a
substanțelor fără o procedură de standardizare adecvată pentru
tehnicile particulare.
Suportul ideal ar trebui să fie acela care nu prezintă
impurități, este chimic inactiv în ceea ce privește substanțele
separate, nu prezintă activitate adsorbtivă și prezintă cel mai
scăzut efect electroosmotic. Nici un mediu suport nu îndeplinește
în totalitate toate aceste condiții, deși acetatul de celuloză, gelurile
de agaroză și de poliacrilamidă posedă proprietăți mult mai
favorabile.
În prezent se folosesc o varietate de medii suport stabilizante care se pot
împărți în:
•Medii suport cu structură capilară, care
(a) prezintă proprietăți anticonvective - dacă secțiunea capilară este
suficient de mică (într-un canal cu secțiune circulară curgerea descrește cu
puterea a 4-a a razei);
(b) sunt stabile fizico-chimic;
(c) prezintă proprietăți mecanice bune;
(d) sunt netoxice;
(e) sunt ieftine și astfel accesibile;
(f) sunt relativ inerte – este cazul hârtiei de filtru, a acetatului de celuloză, a
mediilor specifice cromatografiei pe strat subțire (celuloza microcristalină,
silicagelul, alumina, silicagelul);
(g) au proprietăți electroforetice specifice bune – nu interacționează decât
foarte slab cu compușii pe care îi separă (excepție face hârtia de filtru la
care se observă o adsorbție nespecifică).
În cazul acestor medii suport, proteinele serice se separă în
albumină și patru sau mai multe componente globulinice dar cu o rezoluție
inegală, cu o poziție relativă a fracțiunilor (zonelor) asemănătoare.
•Medii suport care, datorită structurii poroase caracteristice,
participă activ în separare. În acest caz separarea electroforetică
are loc atât densității sarcinilor electrice cât și a efectului de cernere
moleculară. Astfel, două particule cu aceeași sarcină electrică dar cu
dimensiuni diferite, vor fi separate ca zone distincte, particulele mai
mici migrând mai ușor. De exemplu, dacă prin electroforeză pe
hârtie proteinele serice se separă în fracțiile albumină, α1-, α2-, β-
și γ-globuline, după electroforeza pe gel de amidon se identifică
circa 15 zone proteice. Din categoria acestor medii fac parte gelul de
amidon, gelul de agaroză (unde efectul de sită moleculară apare la
concentrații mari de gel) și gelul de poliacrilamidă (care prezintă
avantajul de a putea alege dimensiunea porilor).
•Medii afine.
 ELECTROFOREZA PE HÂRTIE

În acest caz, hârtia de filtru reprezintă

mediul stabilizant care posedă următoarele
caracteristici: (a) conține minimum 96%
celuloză, insolubilă în NaOH concentrat;
(b) prezintă o capacitate mare de imbibiție
(absorbție) - mărimea acestei proprietăți
este dată de firma producătoare și trebuie
să fie de două ori mai mare decât greutatea
sa;
(c) este lipsită de metale grele (de
exemplu Pb), care modifică
conductibilitatea sa electrică; (are o
structură uniformă a fibrelor de celuloză,
unidirecționate;

(d) prezintă o densitate caracteristică a fibrelor - o hârtie de filtru fină sau

medie prezintă o textură deasă care va conduce la separări în zone bine
delimitate, dar într-un timp mai mare, în timp ce o hârtie de filtru grosieră
se îmbibă rapid cu cantități mari de tampon iar separările vor conduce la
zone neclare, într-un timp mai scurt;
(e) la un pH acid și la tării ionice scăzute apar fenomene de adsorbție a
proteinelor pe suportul de hârtie de filtru ceea ce va conduce la formarea
benzilor cu coadă.
Tamponul, reprezintă de asemenea o componentă
importantă în sistemul electroforetic. În cazul
electroforezei pe hârtie, tamponul se află în
compartimentul electrozilor, la un nivel egal și constantă,
evitându-se fenomenul de sifonare. Menținerea evaporării
tamponului în limite rezonabile se realizează prin:
(a) scăderea forței ionice, legată de efectul Joule și de
efectul de flux capilar;
(b) saturarea compartimentului de separare cu vapori;
(c) adăugarea de propilenglicol sau glicerină (5-15%) în
soluția tampon sau
(d) în cazul electroforezei de înaltă tensiune, prin plasarea
hârtiei de filtru în solvenți hidrofobi.
Valoarea pI este specifică unei proteine și ea depinde
de natura solventului și de concentrația electrolitului
(a nu se confunda pI cu punctul izotonic, definit ca
valoarea pH-ului unei soluții apoase de proteină după
îndepărtarea tuturor ionilor necoloidali din soluție).
În separarea electroforetică este necesară a conduce
cu mare atenție pH-ul și tăria ionică a soluției tampon.
De obicei tăria ionică a soluției tampon este cuprinsă
între 0,06-0,1. Soluțiile tampon cu o tărie ionică mai
mică de 0,06 nu tamponează suficient în timp ce
soluțiile cu o tărie ionică mai mare de 0,1 conduc la Dependența dintre pH-ul soluției și
sarcina electrică a două polipeptide,
un efect Joule, marcant, ceea ce conduce la o degajare insulina umană și fragmentul
semnificativă de căldură. polipeptidice des-B23-B30-
Echipamentul utilizat în electroforeza pe hârtie este octapeptid insulină (DOI).
alcătuit din două componente principale: o cameră
(tanc) electroforetic și o sursă de putere electrică.
Tancurile electroforetice sunt variate în construcție și
depind de aranjamentul pe orizontală sau verticală a
benzii de hârtie electroforetică precum și de
necesitățile caracteristice ale unor experimente
particulare.
Tancul electroforetic comun utilizat
la electroforeza pe hârtie de voltaj
scăzut este de două tipuri, după cum
hârtia de filtru este așezată. În tipul
orizontal, hârtia de filtru este fixată
orizontal la capetele incintei. La tipul
vertical, hârtia de filtru este așezată
vertical pe o baghetă. La extremități,
banda de hârtie este imersată în vasele
de tampon la aceeași adâncime în timp
ce nivelul tamponului în cele două
compartimente trebuie să fie egal.
Unele aparate prezintă un sistem
labirint prin care comunică, în condiții
speciale, cele două rezervoare,
prevenindu-se astfel fenomenul de
sifonare prin banda de hârtie în timpul
separării electroforetice. Aparatul este
de asemenea prevăzut cu un capac,
realizat de obicei din plexiglas.

Reprezentarea schematică a tipurilor de tancuri utilizate la

electroforeza pe hârtie: (a) tip orizontal; (b) tip vertical; (c) tip cu
banda de hârtie imersată; (d) tip cu banda de hârtie închisă.
 Cele mai bune rezultate sunt obținute cu electrozi obținuți din platină în
formă de fir sau folie, care pot fi utilizați în diverși electroliți la diverse pH-
uri. Pentru a se preveni contaminarea cu produși de electroliză care se
eliberează la nivelul electrodului, banda de hârtie de filtru nu trebuie să fie
introdusă direct în compartimentul electrozilor, ci într-un compartiment
adiacent acestora, iar contactul electric este realizat prin intermediul unor
bucăți din hârtie de filtru sau bumbac a unor punți din agar sau printr-un
sistem special de labirint.
Volumul de electrolit-tampon în vase trebuie să fie suficient de mare pentru
a preveni influența produșilor de electroliză asupra separării electroforetice.
Volumul V care transportă ionii de hidrogen în timpul unui experiment poate
fi calculat astfel:

unde UH+ reprezintă mobilitatea H+, I este intensitatea curentului (Amperi), t este
timpul (secunde) iar K este conductivitatea soluției. Astfel, în cazul unor electroliți
diluați și la timpi mari de separare, tamponul trebuie să circule continuu între
compartimentele cu electrozi.
 Sursa de curent trebuie să fie capabilă să ofere
un curent sau un voltaj constant, preferabil
ambele. Pentru cele mai comune separări sursa
de curent adecvată trebuie să aibă capacitatea
de a oferi 50 mA și 500V. Intensitatea maximă
a curentului care poate fi utilizată pe unitatea
de arie a benzii de hârtie de filtru supuse
separării electroforetice poate fi calculată
astfel:

unde I (mA) reprezintă intensitatea curentului, P (cm2) este aria benzii de hârtie
de filtru măsurată între suprafețele de electrolit și compartimentele electrozilor
iar U (V) este potențialul electric.
În general tensiunea maximă de lucru este de 400 V, cu o cădere maximă de
15V/cm (în medie de 2-10V/cm).
Pentru determinări cantitative substanțele separate pe benzile din hârtie de filtru pot fi utilizate
atât metode directe cât și cele indirecte. În cazul metodelor directe, substanța care trebuie să fie
măsurată trebuie să absoarbă radiație UV sau să fie fluorescentă ori radioactivă. În metodele
indirecte zonele separate trebuie să fie mai întâi colorate iar absorbanța măsurată cu ajutorul unui
densitometru racordat. Au fost construite o serie de densitometre semi - sau total automatizate
care trasează grafic intensitatea luminii transmise sau reflectate de pe o electroforegramă colorată
versus distanța de-a lungul benzii electroforetice în formă de curbe electroforetice. Aria din
interiorul acestor curbe este determinată fie automat printr-o scalare integrată, fie cu ajutorul unui
planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor. Sunt descrise de asemenea
scannere computerizate care permit analiza cantitativă completă a unei electroferograme în câteva
secunde. Aria din interiorul acestor curbe este determinată fie automat printr-o scalare integrată,
fie cu ajutorul unui planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor.
Aplicarea probei se face pe banda de hârtie de filtru îmbibată
cu soluție tampon, fixată în aparat, după crearea unui mediu
saturat și stabilizat în vapori, cu ajutorul unei pipete capilare,
seringi Hamilton (1-5µl), micropipete, fără a zgâria hârtia. Se
folosesc două tipuri de spotări: în picătură sau în linie.

Profilul electroforetic al proteinelor serice

separate pe hârtie, de filtru, colorate cu
amino black 10B și scannate cu un
densitometru semiautomat.
Pentru urmărirea separării electroforetice
se apelează la un colorant ca substanță de
referință. De obicei se utilizează albastru
de bromofenol, un colorant trifenilmetanic

Albastru de brom fenol

CEI MAI FOLOSIȚI COLORANȚI UTILIZAȚI ÎN EVIDENȚIEREA
COMPONENTELOR PROTEICE SEPARATE prin electroforeză pe hârtie sunt
amino black 10B, Azocarmine B, Light Green SF și Ponceau Red 2R.

Structura chimică a colorantului diazolic

Amido black 10B, utilizat în practica
biochimică la colorarea totală a proteinelor.

Structura chimică a azo-colorantului Ponceau 2R

(Xylidine ponceau, Ponceau G, Red R, Acid Red
26, Food Red 5).
Componentele lipoproteice ale serului sanguin pot fi detectate pe banda de hârtie prin
colorare cu Sudan Black B ori Oil Red O.

Structura chimică a colorantului diazo Sudan

Black (10)B.

Structura chimică a colorantului diazo Oil Red O

(Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125,
C26H24N4O).).
Prin utilizarea acestor proceduri se pot separa și detectate patru fracții lipoproteice:
chilomicroni, α-lipoproteine, pre-β-lipoproteine and β-lipoproteine. Totuși, cea mai
bună rezoluție a fracțiilor lipoproteice din serul sanguin se obțin pe gelul de agaroză ori
pe membrane de acetat de celuloză.
Componentele glicoproteice sunt detectate pe hârtie cu ajutorul
 reactivului Schiff-acid periodic, în cazul glicoproteinelor neutre,
difenilamină pentru mucoproteine și glicozaminoglicani,
 albastru de toluidină și Azure A pentru glicoproteine acide,
 alcian blue pentru glicozaminoglicani acizi.
Pe un ser normal se regăsesc 5-6 fracții glicoproteice, a căror concentrație se
modifică în timpul proceselor patologice ale ficatului, rinichilor, sistemului nervos
central și în timpul maladiilor tumorale.
După colorare, excesul de colorant este îndepărtat de pe banda de hârtie prin spălare cu
un solvent convenabil. Pentru o decolorare mai eficientă se poate adăuga detergent la
soluția de solvent ori spălarea se realizează la o temperatură de aproximativ 80°C.
 ELECTROFOREZA PE HÂRTIE LA TENSIUNE ÎNALTĂ

În acest caz tensiunea aplicată este de circa 50-215V/cm, iar la bornele sursei de curent
tensiunea a redresorului este de 10 kV. Se poate afirma că o creștere de la 5V la
100V/cm (adică o creștere de 20 de ori) viteza de migrare crește de asemenea de 20 de
ori dar cantitatea de căldură degajată va crește de 202, adică de 400 de ori, motiv pentru
care este absolut necesară o termostatare uniformă (o termostatare neuniformă conduce
la apariția zonelor de semilună-marginile hârtiei se usucă mai tare. Se mai poate nota că
la concentrații mari de probă rezoluția de separare este scăzută și se vor obține zone cu
coadă.
Electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se utilizează la separarea aminoacizilor (se
realizează într-un tampon acid - acid formic-acetat de sodiu), a peptidelor (separarea se
realizează în tampon piridină-acid acetic (la un pH cuprins între 3,0 și 5,0), glucidelor
sau a bazelor azotate purinice și pirimidinice.
Sub forma bidimensională, electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se poate combina
cu cromatografia pe hârtie.
 ELECTROFOREZA PE STRAT SUBȚIRE
În momentul introducerii cromatografiei în strat subțire și a electroforezei în strat
subțire, cu ceva timp în urmă, comoditatea și sensibilitatea crescută (de la 10 la 50 de
ori) în comparație cu tehnicile pe hârtie au fost considerate metode promițătoare
pentru analizele compoziției proteinelor și a acizilor nucleici. Electroforeza în strat
subțire combinată cu cromatografia în strat subțire a reprezentat o metodă de rutină
pentru separarea a unor mici cantități de aminoacizi, nucleotide, ioni anorganici și a
altor substanțe cu masă moleculară mică.
Utilizarea mediilor suport de strat subțire oferă următoarele avantaje față de tehnicile
care utilizează hârtia:
(1) necesită un echipament mult mai simplu pentru preparare;
(2) rezoluția este în general superioară;
(3) separările se pot realiza la potențiale înalte în perioade de timp foarte scurte;
(4) sunt necesare mici cantități de probă, putându-se realiza mai ușor separări atât
cantitative cât și micro-preparative;
(5) probele nu trebuie desalinizate, ele se aplică direct pe strat. Astfel, ureea și
glucidele rămân în start, ionii migrând rapid;
(6) se pot utiliza reactivi agresivi de spray-ere și în acest mod se coboară limita de
detecție.
Din punct de vedere al echipamentului
utilizat, se folosesc aparate convenționale
de tip orizontal, similare celora utilizate
electroforeza pe hârtie, acetat de celuloză
ori pe gel de agar. Pentru separări la
potențiale mai înalte și pentru separări Cameră pentru electroforeză în strat subțire. (a)
bidimensionale, s-au descris diverse placă orizontală prevăzută cu system de răcire; (b)
camere prevăzute cu sisteme de răcire. foițe de izolare; (c) strat subțire pe placă de sticlă;
Aparatul pentru electroforeză pe strat (d) bride de hârtie (Whatman 3 MM); (e) placă de
subțire este prezentat schematic în sticlă, 5 mm grosime; (f) compartimente pentru
tampon și electrozi; (w) sistem de răcire.
alăturată. El posedă un plan orizontal
sub care se află un sistem de răcire cu
apă, pe care se așează placa (cu
dimensiuni de 10 x 10 sau 20 x 20 cm) cu
strat subțire (circa 250-300 µm) care este
pusă în contact cu tamponul prin
intermediul unor bride din hârtie de filtru.
Aparatul este acoperit cu o placă de
sticlă. Mica distanță dintre placa cu strat
subțire și placa care acoperă aparatul Hunter Thin Layer Peptide Mapping
acționează ca o cameră umedă și previne Electrophoresis System, CE. For high
uscarea stratului subțire. resolution two dimensional tryptic peptide
mapping and phosphoamino acid (PAA)
analysis
În cazul separărilor efectuate pe ser sanguin, volumul de probă este în
funcție de cantitatea de creatinină. În general proba spotată trebuie să
conțină maximum 5 µg de creatinină. Timpul de separare este de
aproximativ 25-30 minute la o tensiune de 30 V/cm.
Proteinele sau alte substanțe macromoleculare pot fi separate prin
combinația gel filtrare pe strat subțire-electroforeză pe strat subțire. În
funcție de masele moleculare ale probei, se poate utiliza Sephadex
Superfine (de la G-25 la G-200). Sephadex-ul, echilibrat cu tamponul
adecvat, este depus pe o placă de sticlă. Placa cu strat subțire este plasată
într-un aparat adecvat ca cel prezentat în figura următoare, fiind
echilibrată cu un tampon care curge prin stratul de gel. Stratul trebuie
conectat cu un rezervor prin intermediul unei bride (legături) din hârtie
de filtru Whatman No. 1 la capătul superior, iar placa se înclină într-un
unghi de 15-20o față de orizontală.
O bucată de hârtie de filtru Whatman 3MM este
atașată la capătul inferior pentru a îndepărta
fluidul filtrat. După finalizarea filtrării, placa este
aranjată orizontal iar electroforeza este realizată
pe o direcție perpendiculară față de prima Aparat pentru o separare bidimensională
dimensiune. Pentru a obține o imagine a spoturilor utilizând gel filtrarea și electroforeza pe strat
subțire de Sephadex. (a) sistem suport; (b)
proteice, placa este acoperită cu grijă cu o bucată fantă pentru conexiunea prin hârtie de filtru;
de hârtie de filtru Whatman No. 1 și după 5 minute (c) sistem de răcire a platformei cu apă; (d)
bazin care conține tampon ori solvent
de contact, hârtia este îndepărtată de pe stratul utilizat la dezvoltarea electroforegramei; (e)
subțire, uscată la 100°C și colorată cu amino black sistem de schimbare a poziției suportului
plăcii; (f) orificii și (g) șuruburi de prindere.
ori un alt colorant specific proteinelor.
Gel filtrarea pe dextran/electroforeza pe strat
subțire a fost utilizată la separarea proteinelor
serice, a unor coloranți tetrazolici, aminoacizi și
peptide urinare precum și alte substanțe.
 ELECTROFOREZA PE FOLII DIN DERIVAȚI DE CELULOZĂ

Dacă inițial membranele de acetat de celuloză au fost produse pentru filtrare, utilizarea
membranelor de acetat de celuloză ca mediu suport a fost sugerată de Kohn în 1957.
Foliile de acetat de celuloză se obțin prin tratamentul celulozei cu anhidridă acetică, iar
produsul, triacetat de celuloză este cel mai des utilizat pentru electroforeză.
Membrana (cu o grosime de cca. 12 µm și cu un diametru al porilor de cca. 0,4 µm)
este un material omogen care conține numai urme de impurități.
Este de culoare alb opacă, cu suprafață netedă și uniformă.
La microscop se observă o structură microporoasă care împiedică difuziunea zonelor
sau a spoturilor, din acest motiv se obține o bună separare a proteinelor plasmatice chiar
la o tensiune mică.
Puritatea materialului este mare, lipsesc hemicelulozele, lignina iar metalele grele
sunt prezente numai în urme. Față de hârtia de filtru, adsorbția proteinelor și a altor
substanțe pe acest mediu suport este minimă, deci fenomenul de coadă sau de aspect de
cometă fiind practic eliminat.
Timpul de separare este mai scurt iar membranele de acetat de celuloză sunt ideale
pentru tehnicile de imunodifuzie și imunoelectroforeză.
 Foliile (strips-urile) din acetat de celuloză sunt insolubile în apă,
alcooli, eteri, acizi și baze diluate și în majoritatea hidrocarburilor,
dar sunt ușor solubile în fenol, acid acetic glacial, diclorometan și
acetonă, și în mod particular în cloroform:etanol 90:10 (v/v) și
diclorometan:acetonă 50:50 (v/v).
Strips-urile pot fi transformate în translucide (transparente) prin
imersia lor în ulei din semințe de bumbac, decalină, ulei de parafină
ori ulei Whitemore 120, care este important pentru scanarea optică a
benzilor colorate de pe foliile de acetat de celuloză. Ele pot fi
impregnate și permanent stocate în glicerol, care previne destrucția
spoturilor colorate.
dezavantajele utilizării membranelor de acetat de celuloză
prețul mai mare față de hârtia de filtru,
necesitatea de a acorda mai multă atenție pentru obținerea unor
rezultate reproductibile.
 În prezent s-au adus îmbunătățiri ale produsului
inițial prin apariția acetatului de celuloză
gelatinizat (Cellogel).

Membranele de dimensiuni dorite sunt așezate într-o placă Petri cu tampon și lăsate să
plutească până la dispariția petelor alb-opace după care se scufundă complet. Membranele de
Cellogel nu necesită aceste precauții, ele putându-se scufunda timp de 10 minute.

Pentru separări electroforetice de proteine și acizi nucleici s-au introdus membranele de

nitroceluloză. Aceste membrane, cu o mărime a porilor cuprinsă între 0,1-12 µm, au fost
utilizate în mod constant în analizele de acizi nucleici în special a hibrizilor RNA-DNA și
DNA-DNA. Membranele prezintă o adsorbtivitate selectivă față de proteine și acizi
nucleici în condiții adecvate.

Strip-urile din nitroceluloză (5 x 1 cm), când sunt utilizate la electroforeza proteinelor,

trebuie mai întâi tratate timp de 5 minute cu o soluție de detergent neionic (Tween 60), 2%
preparată într-un tampon pH=8,6. În aceste condiții, membranele tratate cu detergent nu
adsorb proteine și pot fi utilizate pentru separări de proteine în gradienți înalți de potențial de
15-20 V•cm-1 timp de 10-15 minute.
 Membranele îmbibate se plasează imediat în sistemul reglabil și se
aplică probele cu ajutorul unei micropipete sau unui dispozitiv de
aplicare simultană a probelor (10-16 probe).) Volumul aplicat de
probă este în funcție de grosimea membranei și de concentrația
proteică.
La pH neutru și alcalin, RNA migrează rapid în folie spre anod, în
timp ce DNA nativ rămâne pe linia de start.
DNA monocatenar denaturat migrează spre anod.
Membranele de nitroceluloză cu dimensiuni variate a mărimii
porilor, impregnate cu detergenți ori soluții de albumină serică, pot
fi utilizate la separări de proteine, polinucleotide și nucleoproteine.

Nigrozina (denumită și Indian ink) este cel mai

bun colorant al proteinelor pe folii de
nitroceluloză.

Un alt colorant utilizat cu

rezultate bune în colorarea
proteinelor este Ponceau S.
Modelul de bază a tancurilor electroforetice utilizate pentru
membranele de celuloză seamănă cu cele utilizate la tehnica
electroforetică pe hârtie. O serie dintre acestea prezintă
sisteme de răcire și pot fi utilizate concomitent pentru
electroforeză pe membrane și pe strat subțire. Ambele
separări se pot realiza atât la voltaje scăzute cât și la cele
înalte. Pentru a minimaliza procesul de evaporare, se poate
adăuga glicerol la soluția tampon. Controlul evaporării se
poate realiza și prin folosirea de soluții tampon cu tării ionice
mici (o concentrație mică a soluției tampon favorizează
creșterea vitezei de migrare în paralel cu scăderea efectului
Joule.

Astfel, dacă tăria ionică este dată de relația:

După electroforeză strip-ul de acetat de celuloză este uscat la 100°C
timp de aproximativ 10 minute.
 Metodele de colorare și detecție utilizate sunt asemănătoare cu cele
utilizate la hârtia de filtru.
 Sunt de preferat ca soluțiile apoase de colorant față de soluțiile
alcoolice, concentrația acestora fiind deobicei mai scăzută față de cea
aplicată pentru hârtia de filtru.
 Membranele din acetatul de celuloză și nitroceluloză sunt ideale
pentru examinările absorbțiometrice și fluoro-densitometrice, precum și
de detecție a substanțelor radioactive prin autoradiografie ori prin
metode de scanare directă.
 MICROELECTROFOREZA PE ACETAT DE CELULOZĂ
Benzile (strips-urile) de membrane (acetat de celuloză sau nitroceluloză) de mici
dimensiuni (50 x 10mm) disponibile dau posibilitatea efectuării a analizei proteice
complete pe 0,25 µl de ser sanguin (electroforeza microzonală, microelectroforeza pe acetat
de celuloză) în 50 minute.
Procedeul de miniaturizare prin reducerea dimensiunilor membranei, a probelor și a
timpului se bazează pe faptul că mobilitatea electroforetică este relație directă cu distanța de
migrare și invers proporțională cu timpul și intensitatea câmpului electric aplicat după
relația:
 Aplicații ale electroforezei pe membrane de acetat de celuloză

Membranele de celuloză sunt utilizate în mod comun pentru separarea proteinelor

plasmatice, glico- și lipoproteinelor, hemoglobinelor, enzimelor și a altor proteine.
Ele putând fi folosite în metodele analitice și în scopuri preparative.
Metoda electroforetică pe membrane de acetat de celuloză este încă cea mai des
utilizată în diagnosticarea unor maladii. Tabelul următor prezintă profilul
electroforetic obținut în urma separării pe Cellogel al unei proteinograme din ser
sanguin normal.
Procente Deviație
Fracția electroforetică analizată
% standard
Albumine 61% ± 1,5
Alfa 1-globuline 2,5% ± 1,5

Alfa 2-globuline ± 2,0

8%
Beta globuline 10% ± 2,0
Gama globuline 16% ± 3,5
Analiza proteinogramei este deosebit de importantă în identificarea unor maladii prin analiza
concentrației unor proteine serice. Astfel prin interpretarea unei proteinograme se pot depista:
-hipergamaglobulinemiile (creșterea tuturor claselor de imunoglobuline);
-hipogamaglobulinemiile (diminuarea tuturor claselor de imunoglobuline);
-mielomul sau macroglobulinemia lui Waldenström (apariția unei benzi foarte omogene care
semnifică prezența unei proteine monoclonale);
-sindromul nefrotic (hiperexpresia globulinelor α2 și β, cu diminuarea albuminei și a γ
globulinelor);
-ateroscleroza (creșterea β globulinelor);
-poliatrita reumatoidă (creșteri policlonale ale γ globulinelor și creșterea fracției α2 globulinei.

Figura de mai prezintă profilul unei electroforegrame obținute după procesarea

electroforetică a unei probe de ser sanguin normal.
Protéinogramme sérique normal
INTERPRETATION du protéinogramme (2)
Valeurs normales
Causes d’erreur
sérum hémolysé
présence de fibrinogenen
Inflammation AIGUE (2)
 Insuffisance hépatique
(cirrhoses, hépatites fulminantes)
Syndrome NEPHROTIQUE
Hypogammaglobulinémie des
déficits immunitaires
Hypergammaglobulinémie
POLYCLONALE
Hypergammaglobulinémie
MONOCLONALE
 Tehnica electroforetică care implică membranele de acetat de celuloză este de
asemenea utilă în monitorizarea unui tratament aplicat. Ea este superioară
tehnicilor imunologice în determinarea izoenzimelor enolazei (procedeul durează
circa 10 minute iar necesarul de ser este de circa 10µl), activitatea enzimatică
fiind determinată în aproximativ 5 minute prin bioluminiscență.
Enolaza, de asemenea, cunoscut sub numele de fosfopiruvat hidrataza (EC 4.2.1.11), este o
metaloenzima responsabila de conversia 2-fosfogliceratului (2-PG) la fosfoenolpiruvat (PEP),
etapa a noua și penultima a glicolizei. Reacția chimică catalizată de enolaza este:
2-fosfo-D-glicerat fosfoenolpiruvat + H2O
Enolaza aparține familiei de liaze, hidro-liaze specifice, care clivează legăturile carbon-oxigen.
Denumirea sistematică a acestei enzime este 2-fosfo-D-glicerat hidro-liaza (formatoare de
fosfoenolpiruvat).
Reacția este reversibilă, în funcție de concentrațiile de mediu ale substraturilor. Enolaza este
prezenta în toate țesuturile și organismele capabile sa posede calea glicolizei sau organismele
fermentative.
Enzima a fost descoperita de Lohmann și Meyerhof în 1934 si a fost izolata dintr-o varietate de
surse, inclusiv țesutul muscular ori eritrocite.
In om sunt prezente 3 subunitati ale enolazei, α, β, si γ, fiecare dintre ele fiind codificate de gene
separate. Cele 3 subunitati se pot combina si forma cinci izoenzime diferite: αα, αβ, αγ, ββ, and
γγ. Trei dintre acestea (toate homodimere) sunt mai reprezentative in celulele omului adult decat
celelalte. La om, deficiența in izoenzima ENO1 este legata de anemia hemolitică ereditară în timp
ce deficienta in izoenzima ENO3 este legata de boala de stocare glicogenului XIII.
Electroforeza pe membrane de acetat de celuloză a fost și este utilizată la studiul comparativ
al unor proteine serice la om și la alte animale.

A fost folosită la studiul histonelor (proteine bazice ale cromatinei la eucariote), la studiul
hemoglobinelor normale și patologice când s-au evidențiat la pH=8,4, hemoglobina A, Hb F,
Hb S, Hb S și Hb C de Hb E și Hb O.
Membranele de acetat de celuloză se utilizează și în tehnicile de imunoelectroforeză,
colorarea efectuându-se în acest caz cu ajutorul AgNO3, iar imunodetecția realizându-se direct,
pe membrană, fără transfer pe o altă membrană de nitroceluloză.

Blocurile de Cellogel (cu o grosime de circa 2,5-5 mm) s-au folosit în scop preparativ, în
acest caz utilizându-se la separare 0,25-1 ml de ser sanguin.
Electroforeza pe gel de amidon

Loading samples onto a starch gel for electrophoresis

Electroforeza pe gel din amidon, prima metodă de electroforeză
zonală care a pus în valoare efectul de sită moleculară a mediului
suport a fost introdusă de Smithies. Ea a fost recunoscută drept o
tehnică care furnizează mijloace elegante de rezolvare a ionilor
similari și cu mobilități libere identice. Astfel, o matrice de gel - nu
și în cazul mediilor poroase de tipul hârtiei sau a granulelor de
amidon - prezintă o structură reticulată care poate impune o
rezistență fricțională apreciabilă la trecerea ionilor, accesul
acestora în structura de rețea fiind dat de mărimea porilor și
dimensiunea ionilor care migrează. Cum în cazul gelurilor de
amidon, domeniul dimensiunii medii a porilor se apropie de
domeniul dimensiunilor proteinelor, fracții proteice variate vor fi
întârziate diferențial într-un grad proporțional cu dimensiunea lor.
Ca atare, datorită reticulării fine și având un efect de sită
moleculară, separarea amestecurilor este realizată în astfel de
geluri matrice atât prin dimensiunile, forma, cât și prin diferențele
de sarcină electrică.
Amidonul este un polizaharid insolubil în apă. În stare nativă,
în prezența apei el se umflă. Matricea electroforetică se obține
printr-o hidroliză parțială când amidonul se convertește într-o
formă care se solubilizează la o temperatură de circa 70oC și
care apoi se solidifică într-un gel ferm la temperatura camerei.
Mărimea porilor din gelul de amidon este dată de concentrația
acestuia și de gradul de hidroliză, ea variind într-un domeniu
redus prin faptul că nici concentrații, nici gradul de hidroliză nu
pot fi schimbate decât în anumite limite, bine definite, fără a
afecta caracteristicile mecanice ale gelului.
Dacă la început s-a utilizat amidonul din cartof, s-a constatat
că rezultate mai bune se obțin cu cel din orez.
Față de alte medii stabilizante de separare a proteinelor, peptidelor ori a
acizilor ribonucleici, amidonul prezintă o serie de avantaje comparativ cu
hârtia, gelatina, agarul, silicagelul:
(i) Adsorbția celor mai multe proteine pe amidon este neglijabilă;
(ii) Eluția segmentelor de amidon după separarea electroforetică se
realizează mai ușor decât în cazul gelului de gelatină ori agar ceea ce
reprezintă un factor important în scopurile preparative;
(iii) Amidonul formează mai ușor o pastă omogenă cu diverse tampoane
față de pudra de celuloză;
(iv) Electrosmoza este mai mică decât în cazul multor altor medii suport
deși acest fenomen poate cauza o separare slabă, mai ales în cazul când
tehnica este cea “de bloc de amidon” și se realizează în modele de
aranjament orizontal.
Electroforeza pe gel de amidon este considerată după unii autori
a fi o metodă blândă de purificare a proteinelor fără șanse de
denaturare, putându-se pune alături de metoda salting-out ori
precipitarea cu acizi, alcool sau acetonă. Pe de altă parte, alți
autori consideră că din contră, în timpul electroforezei au loc
procese ireversibile de denaturare care conduc la o pierdere
considerabilă de proteină. Chestiunea în cauză se ridică dacă
acest proces se manifestă din cauza dezvoltării de căldură
datorată efectului Joule, la intensități de 17-20 mA a curentului
electric cu soluții tampon de tărie mare, după cum procesul de
denaturare nu se observă la tării ionice scăzute când rezultatele
sunt satisfăcătoare.
Amidonul este utilizat ca mediu suport
în trei tehnici electroforetice zonale:
Electroforeza clasică pe gel de
amidon, descrisă pentru prima dată de
Smithies;
Electroforeza pe coloană, dezvoltată
de către Carlson și independent de
Flodin și Porath;
Electroforeza pe bloc de amidon,
introdusă de Kunkel și Slater.
Aparatura utilizată în electroforeza pe
gel de amidon este de două tipuri: I)
pentru geluri orizontale; II) aparate cu
gel vertical. Ambele aparate sunt
alcătuite de 2 rezervoare cu soluție
tampon, compartimentate pentru a
împiedica produșii de electroliză să
intre în contact direct cu gelul.
Contactul dintre suport și gel se
realizează prin intermediul unor
legături (bride) din hârtie de filtru sau
tifon (bumbac) iar legăturile dintre
compartimente se formează în același
mod.
Godeurile se efectuează cu ajutorul unui pieptene din plexi-glace care se plasează peste
stratul de amidon înainte de gelificare și se îndepărtează după aceasta. Dimensiunile
godeelor sunt de 15-30 mm lungime, 1 mm lățime și 50 mm adâncime.
În general separări bune sau foarte bune se pot obține la temperatura camerei la o
tensiune de 6V/cm timp de 6 ore sau la o temperatură de 5oC și la o tensiune de
10V/cm, în sistem de tampon continue sau discontinue.
După separarea electroforetică gelul este extras cu grijă din cuva de electroforeză și
tăiate paralel cu suprafața în două părți egale.
Sunt recomandate diverse proceduri de colorare a gelurilor. Astfel, colorarea se poate
realiza prin turnarea colorantului peste suprafața secționată.
Pentru evidențierea proteinelor, o serie de lucrări prezintă colorația cu soluție de Amido
black 10B în metanol:apă:acid acetic glacial (50:50:10) timp de l0-30 min.

Lipoproteinele pot fi colorate prin incubare timp de 16 ore într-o o soluție alcătuită din:
1,2 g Sudan black 10B, 40 ml de apă distilată, 600 ml etanol și 2 ml NaOH,.
Decolorarea completă se realizează după 6-8 zile după imersare într-o soluție de etanol
60%. De asemenea, pentru a vizualiza lipoproteinele se poate utiliza o soluție saturată
de Oil Red O pregătită într-un amestec metanol:apă:acid acetic glacial (60:10:30).).
 Proteinele care conțin cupru precum hemocianina,
sunt detectate prin plasarea gelului secționat pentru 3-4 ore
într-o soluție care conține 50 ml acetat de sodiu l0% și 3 ml
de soluție ditio-oximidă, 0,1% preparată în alcool. Apariția
unei colorații verde-închis este un rezultat pozitiv.
Hemoglobinele sunt detectate cu reactiv benzidină
sau cea descrisă pentru electroforeza pe gel de agar. Hem-
proteinele pot fi de asemenea colorate cu o-tolidină. Pentru
complexul acestor proteine cu hemoglobina care prezintă o
activitate peroxidază-like, o-dianisidina pare a fi cel mai bun
reactiv, ea formând o colorație brună.
 o serie de aplicații ale electroforezei pe gel de amidon

Tărie ionică
Material biologic Tampon pH V mA Timp (ore)
(Molaritate)
Barbital 0,1 25-60
Lipoproteine serice normale și patologice 8,6 100-500
Fosfat 0,5 24
Proteine lenticulare bovine Barbital 0,1 8,6 400 - 24
Tuberculo-proteine Barbital 0,1 8,6 360 17-20 30
Fosfataza alcalină intestinală Barbital 0,02 8,6 200 7-9 12
Acetat 0,017 4,00 175 30 24
Hormonul de creștere (somatotropină)
Carbonat 0,1 11,2 175 30 72
β-Galactozidză Pirofosfat 0,025 8,5 370 1 16
Chimotripsinogen Cacodilat 0,1 6,6 3,2V/cm - 65
Tirozinază de mamifere Barbital 0,1 8,5 300 11 19
Tripsină Acetat 0.1 4,00 /300 - 10
0,02M borat +
Hemocianină Borat 8,0/3 92V/cm - 12
NaOH 0,008M
Hemoglobină Borat 0,05 M 8,5 6V/cm - 5
Plasmă umană Borat 0,025 - 450 - 18
 ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZĂ

Agaroza este singurul hidrocoloid neadeziv care și-a găsit o multitudine de utilizări în
științele separatologice după prepararea sa de către Araki (1937) ca un component
aparent fără grupări sulfat, din agaropectina, bogată în astfel de grupări, la rândul ei
obținută din agar.
Cele două componente se separă prin acetilare și dizolvare în cloroform când agaroza
acetilată este solubilă. Încă din secolul al XVII-lea în Japonia, agarul și o mulți alți
hidrocoloizi derivați dintr-o serie de alge roșii de mare din clasa Rhodophyceae
(speciile Gelidium și Gracilaria) au fost utilizați la prepararea hranei.
Agarul a fost introdus ca mediu pentru imunoelectroforeză de către Grabar și
Williams în anul 1953, tehnica originală descrisă de aceștia fiind ocazional utilizată și
astăzi. Electroforeza pe agar tratat este de altfel principala metodă curentă de
identificare a variantelor de hemoglobină.
 Agarul a fost aplicat de către Polson în anul 1961 pentru separări cromatografice
bazate pe proprietatea sa de sitare moleculară, după care acesta a fost înlocuit gradat cu
agaroza, începutul fiind făcut de către Hjerten (1961).
 Conținutul în sulfat a agarozelor de diferite grade furnizate pentru
utilizare în laborator este în general sub 0,12% comparativ cu 4%
conținutul în agaropectină. Din această cauză agaroza poate fi utilizată
în prepararea gelurilor fără nevoia utilizării unor aditivi sau a unor
agenți de reticulare iar inerția sa față de interacția cu proteinele și acizii
nucleici reprezintă principalele rațiuni ale ei în larga utilizare ca mediu
de separare. Tot ce este necesar în prepararea gelurilor este de a dizolva
agaroza pulbere prin încălzire controlată la fierbere sau aproape de
temperatura de fierbere, după care să se lase să se răcească. Procesul de
gelificare se manifestă spontan și este complet în gelurile reci. În plus
față de simplicitatea pregătirii gelului de agaroză, alături de inerția față
de interacții cu proteinele și acizii nucleici îi oferă acesteia o
multitudine de avantaje ca mediu de separare precum recuperarea
simplă a probei, netoxicitatea și simplicitatea pregătirii gelului.
Agaroza este de asemenea unică ca aplicativitate în numeroase
proceduri imunoelectroforetice.
În comparație cu gelul de poliacrilamidă, gelul de agaroză este un material foarte poros, ceea ce îi
limitează oportunitatea folosirii sale în formă nemodificată la separări de proteine bazate pe
efectul de sită moleculară cu masă moleculară mai mică de 60 kDa. Pe de altă parte, marea sa
permeabilitate face din gelul de agaroză un mediu superior poliacrilamidei pentru studii
imunochimice.
Proprietățile gelurilor de agaroză. Din punct de
vedere chimic, agaroza este un polizaharid liniar
compus din unități alternative de D- și L-
galactozobioză (agarobioză) legate prin legături β
1-4 (figura alăturată) cu catene de o lungime dată
de cele 400 de unități de agarobioză, legate prin
legături α 1-3 și cu o masă moleculară de circa 120
kDa (figura de mai jos), cu resturi substituite
carboxilat, piruvat și/sau sulfat.
Gelificarea se manifestă ca un proces de inter-legare a protofibrilelor. Astfel, în timpul acestui
proces, lanțurile dublu catenate elicoidale se desfac iar legăturile 3,6 din structura 3,6
anhidrogalactozei se desfac de asemenea, ceea ce conduce la fragmentarea lanțului inițial în
lanțuri dublu elicoidale mai scurte a căror capete se vor uni încrucișat, proces de numit
schimbarea partenerului. În continuare are loc asocierea în suprafibrile cu raza de 10-20 nm
(figura de mai jos), supraînfășurare care explică rezistența mai mare și porii mai mari a gelului
de agaroză comparativ cu alte geluri care nu formează suprafibrile (ca de exemplu gelul de
amidon, gelul de poliacrilamidă cu un grad de reticulare, C% cuprins între 1 și 5).

Gelurile sunt translucide

deoarece fibrele înfășurate
împrăștie lumina dar devin
transparente prin uscare.
 Abilitatea de a forma fibrile groase, puternice permit agarozei să formeze
geluri chiar la concentrații sub 0,2%. Încorporarea agarozei în suprafibre groase fac
aceste geluri înalt poroase până la o concentrație mai mare de 6%, limita la care
agaroza poate fi dizolvată fără a apela la temperaturi de autoclavare. Concentrații până
la 16% se pot realiza numai prin autoclavare. La gelurile cu o concentrație egală cu
2% efectul de sită moleculară nu este prezent, electroforeza fiind de tip capilar, în
timp ce la gelurile cu o concentrație cuprinsă între 3 și 10%, distanțele între și din
interiorul suprafibrilelor devin egale și ia astfel naștere un gel cu o singură
dimensiune a fibrelor. Porozitatea mare a agarozei o face superioară
poliacrilamidei pentru separarea proteinelor mari, polipeptidelor, complexelor cu
un domeniu de masă (Mr) cuprins între 100 kDa și mai mulți megadaltoni.
Prin utilizarea agarozei se pot separa fragmente de ADN din domeniul
1000 la 23000 perechi de baze (bp).
În cazul agarozei hidroxietilate numărul de lanțuri din constituția
suprafibrilelor este mai mic decât în cazul agarozei nesubstituite și din această cauză
porii gelului sunt mai mici fiind similari cu cei ai gelului de poliacrilamidă, având o
mare capacitate de sitare moleculară similară gelului de poliacrilamidă însă rezistența
mecanică este mai mică decât a agarozei nemodificate. Recent, au fost obținute noi
formule de derivați de agaroză care au proprietăți mecanice îmbunătățite.
În funcție de gradul de substituție cu sarcini negative și de modificările chimice
survenite, se disting trei categorii de agaroză caracterizate prin:
a)conținutul în resturi sulfat (exprimat în %);
b)electroosmoză;
c)temperatura de gelificare;
d)temperatura de topire.
Electroendoosmoza preparatelor de agaroză este dată de parțial de conținutul în
resturi sulfat și piruvat. Acest fenomen poate fi măsurat convențional:
 cu ajutorul ciancobalaminei (vitamina B12), colorată în roșu,
 cu Dextran-500, care poate fi detectat în urma precipitării cu etanol,
 urmărind migrarea albuminei serice bovine (BSA).
De obicei se utilizează deplasarea BSA la pH=8,6 iar în
urma acestei analize se determină factorul –mr, după care se
clasifică agarozele în agaroze cu electroosmoză mare, medie
(standard) și mică. Grupările sulfat prezente în cele mai multe
preparate induc o mică electroendosmoză (EEO) în timpul
electroforezei. Electroendosmoza se manifestă ca o curgere de
tampon prin gel. Efectul este datorat faptului că sarcinile
negative ale grupărilor sulfat din matricea de gel nu se pot
mișca spre anod motiv pentru care apare ca rezultat o pompare
compensatoare de tampon spre catod. Efectul asupra
mobilității proteinelor este în general mic, totuși devine
pronunțat în sisteme de tampon discontinue utilizate pentru
îngustarea benzilor din proba aplicată. EEO poate astfel
induce colapsarea gelurilor în sisteme tampon discontinue
datorită electroendosmozei inegale prin frontul de tampon.
Astfel, o serie de sisteme de tamponare descrise pentru
gelurile de poliacrilamidă nu funcționează la fel de bine
pentru gelurile de agaroză.
Agarozele cu electroosmoză diferită se utilizează în tehnici specifice precum:
Agarozele cu electroosmoză mare (-mr=0,25) se utilizează în tehnicile de
contraimunoelectroforeză;
Agarozele cu electroosmoză standard și mică (-mr =0,13-0,07) se utilizează
pentru electroforeză și imunoelectroforeză. Ele sunt folosite la separarea
acizilor nucleici (agarozele standard), dedetectând DN-azele, RNA-azele,
proteazele, inhibitorii endonucleazelor, enzimele de restricție și modificare,
ligazele, polimerazele.
Agarozele cu electroosmoză egală cu zero sunt utilizate pentru focusare
(focalizare) izoelectrică. Ele se obțin prin adăugarea unor aditivi sau printr-un
procedeu chimic (reacție de substituție) în scopul blocării (contrabalansării)
sarcinilor electrice negative cu grupări electropozitive. Aditivii dintr-o serie de
zero-EEO agaroze contribuie la formarea unui background în timpul colorării.
Agarozele hidroxietilate (numărul de grupări
hidroxietil fiind de circa 15%) formează geluri
cu concentrație de 2-10% cu dimensiunile
porilor aproximativ egale cu cea a proteinelor.
Ele au o temperatură de gelificare în jurul a
25oC iar temperatura de solidificare de
aproximativ 45oC (25/45). Astfel, o agaroză
hidroxietilată 15/45 formează geluri de
concentrație 2-10%, asemănătoare gelurilor de
poliacrilamidă. Agarozele cu un procent de 5%
hidroxietil formează geluri cu o temperatură de
topire de 60-65oC
 Echipamente și sisteme tampon.

Gelurile de agaroză sunt în mod curent utilizate pentru

electroforeză plană, orizontală pe care gelurile sunt plasate între
electrodul anodic și catodic aflați în camere umplute cu tampon și
conectate prin punți umede. Cu excepția unor cerințe uzuale la
platforma pe care se așează gelul se poate adapta ușor un sistem
de răcire prin recircularea apei. Gelurile sunt turnate în casete
deschise ori prevăzute cu două spațiatoare. Se are în vedere că
utilizarea punților din hârtie sau bumbac conduce la o pierdere de
voltaj prin ele ceea ce conduce la o creșterea a efectului de
încălzire și apariția fenomenului de condensare în camera de
separare electroforetică.
Pierderea de voltaj de-a lungul gelului
trebuie să fie controlată direct de la nivelul
gelului și nu din sursa de curent. În plus
hârtia de filtru nu este totdeauna
recomandată deoarece prin utilizarea sa
drept bridă de contact, datorită procesului
de electroosmoză, puntea dinspre anod se
poate usca împreună cu extremitatea
respectivă a gelului în timp ce la
extremitatea catodică se adună lichid în
exces, deoarece hârtia de filtru nu poate
prelua și transfera cantități mari de lichid.
Condensarea vaporilor pe gel este ușor de
prevenit printr-o simplă barieră de vapori
care se așează pe gel.
Calculul voltajului se realizează prin asumarea
faptului că în sistemele electroforetice submarine,
numai aproximativ 80% din curent trece prin gel,
căderea de tensiune (V/cm) poate fi estimată prin
relația:
Pentru electroforeza acizilor nucleici utilizarea punților (bridelor)
de legătură a fost eliminată prin aplicarea tehnici cunoscute
drept „submersă” în care gelul este așezat pe o platformă
încărcată cu tampon conectată la camerele electrozilor. Modul
de electroforeză submarin nu este în mod curent aplicabil în
electroforeza proteinelor deoarece acestea au tendința de a
difuza în tamponul înconjurător, în timp ce acizii nucleici posedă
constante de difuziune foarte mici, motiv pentru care migrează
aproape în întregime prin gel la aplicare unui câmp electric, cu o
doar mică difuziune. Gelurile de migrare din agaroză în format
vertical cu camere de electrozi sunt rareori utilizați deoarece
agaroza are tendința de a se dilata și astfel de a părăsi caseta.
Inițial, aplicarea probei în gelul de agaroză s-a realizat
prin tăierea unei fante în gel. Această tehnică este în
continuare utilizată la electroforeza acizilor nucleici,
care formează benzi înguste când migrează nerestinctiv
din soluția de probă în gelul de migrare restrictiv,
comparativ cu proteinele la care se manifestă foarte
mică îngustare a benzii care permează gelul ușor. În
plus, godeurile induc distorsiuni ale benzilor proteice
datorită: (i) procesului de permeație parțială în
marginile godeului înainte de începerea „de facto” a
separării electroforetice; și (ii) datorită tensiunii
electrice inegale care se manifestă le-a lungul godeului
în momentul aplicării unui câmp electric. Datorită
ușurinței cu care soluțiile pot fi îmbibate în agaroză
urmată de compresia temporară cu hârtie de transfer,
(iii) probele pot fi depuse pe gel în benzi demarcate prin
intermediul așa-numitei tehnici „folie de aplicare a
probei”, un plastic subțire întins peste gel care are
prevăzute niște fante prin care probele sunt depuse pe
gel. Acest sistem de aplicare a probei a fost sugerat de
Cawley simplificând procedura comparativ cu cea de
formare de godeuri.
 Din punct de vedere electric, în cele mai multe aparate se utilizează un gradient de potențial
de 15-20 V/cm. Acesta corespunde unei puteri totale a câmpului electric de 250-300 V și o
intensitate de curent de 100-140 mA, depinzând de mărimea electrozilor. În cazul gelurilor
subțiri de 3 mm grosime, tensiunea aplicată este de 6 V/cm.

Fixarea fracțiilor proteice se realizează: a) fie prin imersarea gelului în soluție de acid acetic
20% timp de o oră, după care gelul se usucă timp de 16 ore la 37oC; b) fie prin imersarea sa
într-un amestec de acid picric (soluție saturată):acid acetic (20%) într-un raport 3/1 timp de 15
minute, după care gelul se usucă.

Toate metodele comune de colorare utilizate

(bazate pe Coomassie Brillant Blue,
fluorescență, chimiluminescență, și de tip
coloidal) funcționează bine cu agaroza, metoda
cu Coomassie coloidal fiind una dintre cele
mai rapide. Amido Black 10B (soluție 1%
preparată într-o soluție de acid acetic 7% sau
preparată într-un amestec metanol:acid
acetic:apă, în raport de 5:1:5) este utilizat
deoarece produce zone distincte și facilitează
vizualizarea α- și β-lipoproteinelor. Structura chimică a Coomassie Brillant
Blue G-250 (sinonime: Serva blue G sau
C.I. acid blue 90), un colorant
trifenilmetanic.
O adaptare a electroforezei pe agaroză o reprezintă electroforeza de
înaltă rezoluție. Ea este utilizată în clinică în laboratorul de analize
medicale. Prin utilizarea ei, se evidențiază schimbări calitative și cantitative
ale proteinelor serice, semnificative din punct de vedere clinic care nu pot fi
decelate prin electroforeză convențională sau pe acetat de celuloză.
Practic se lucrează pe gel de agaroză de 1 mm grosime, turnate
pe folii de film flexibil de poliester, Gelbond™ care sunt păstrate în soluție
tampon și în ambalaje ermetice, care facilitează mânuirea și stocarea
gelului prelucrat.
Volumul de probă este de 2-4 µL, putându-se aplica simultan 6 ori
12 probe. Timpul de separare este de aproximativ 45 de minute la o
tensiune de 20V/cm
 INTERPRETAREA ELECTROFOREGRAMELOR ÎN TERMEN DE
VARIAȚIE A PROTEINELOR INDIVIDUALE
Abilitatea gelului de agaroză de a
revela proteine diferite variază în
funcție de concentrația de proteină,
capacitatea de legare a colorantului și
de gradul de omogenitate
electroforetică. În general, capacitatea
de legare a colorantului scade odată cu
creșterea conținutului în oligozaharide
și lipide. Figura de mai jos dă o
prezentare schematică a concentrației
relative și eterogenitatea
electroforetică a proteinelor
plasmatice majore, într-un subiect
sănătos, având cel mai frecvent
fenotip Distribuția electroforetică și concentrațiile relative ale proteinelor majore plasmatice
comparativ cu fracțiile obținute prin electroforeză clasică. Abreviații: Alb, Albumină;
Lp, Lipoproteine; Om, Orosomucoid; α1-At, α1-antitripsină; α2-M, α2-
macroglobulină; GC, componente specifice de grup; Hp, haptoglobine; CIG,
globulină insolubilă la rece; Hz, hemopexină, Tf, transferină; C3, complement C3;
Fg, fibrinogen; Ig, imunoglobuină; și CRP, proteină C-reactivă
Tabelul de mai jos prezintă proteinele individuale care pot fi prezente în concentrații
care pot influența profilul electroforetic. Datele din paranteze sunt prezente la așa
concentrații încât nu pot influența semnificativ profilul electroforetic.
Proteina țintă Domeniul normal (g/L)

Prealbumina 0,15-0,36
Albumina 39-51
α-Lipoproteine (3-7)
(α-Fetoproteina)a <1-1 -5
(Orosomucoid) 0,40-1,05
α1-Antitripsina 0,8-1,9
Globuline specifice de grup 0,2-0,55
(Inhibitorii inter-α1-tripsină) 0,2-0,7
(Ceruloplasmina) 0,22-0,46
α2-Macroglobulinele 1,2-2,4
Haptoglobinele (1-1, 2-2, 2-1) 0,40-2,9
Globulinele insolubile la rece 0,1-0,3
Transferina 1,7-2,7
β-Lipoproteinele 2,2-7,4
Al treilea component al sistemului complement, C3 0,6-2,2
IgA 1,0-3,0
Fibrinogenul 2,2-4,4
(IgM) 0,6-2,2
IgG 6,5-15,5
(Catenele de imunoglobulină ușoară) <0,001
(Proteina C-reactivă) <0,02
 Analiza profilului electroforetic

Zone electroforetice Observație Cauze posibile

Masă celulară hepatică scăzută,
Zona prealbuminei Scăzută Răspuns inflamator
Malnutriție
Răspuns inflamator,
Malnutriție,
Scăzută Pierderi în greutate,
Zona albuminei Maladii maligne,
Un volum extracelular crescut.
Medicamente (penicilină)
Front anodal rapid
Icter
Intensitate scăzută Leziuni ale celulei hepatice
Interzona albumină-
Malnutriție
α1
Intensitate crescută Abuz de alcool
α1- Lipoproteine
Nivel estrogenic crescut postmenstrual
Polimorfism Variante genetice.
Răspuns inflamator,
Zona α1 Crescută
Alterarea celulei hepatice
α1-Antitripsina
Deficiență genetică,
Relativ scăzută
Scăderi în greutate.
Dependentă de vârstă la copii,
Zona α2
Crescută Persoane în vârstă (>70),
α2-Macroglobulina
Proteinurie selectivă
Crescută Răspuns inflamator,
Haptoglobina
Relativ scăzută Hemoliză in vivo
Benzi înguste Componenta M
Imunoglobuline Difuzie crescută Creștere policlonală
Apariție în benzi Creștere oligoclonală, infecție virală, malignitate
Un profil policlonal semnificativ al electroforezei proteinelor serice
pe gel de agaroză (anodul fiind în stânga). Banda γ prevăzută cu
asterisc este lărgită și se întinde pe toată aria de mobilitate gama
(Panelul B). Trasarea densitometrică a acestei observații vizuale
relevă un peak difuz de mobilitate gama. Acest profil este cel mai
adesea dat de prezența unui proces inflamator ori reactiv, precum și
în bolile cronice ale ficatului, în bolile țesutului conectiv, în infecții
cronice, ori într-o maladie limfoproliferativă (Panel A).
 Variante genetice (proteina Bence Jones,
Polimorfism
componenta M, hemoglobină)
Zona β1
Crește Deficiență de fier, estrogeni
Transferina
Malnutriție, scăderi în greutate răspuns
Scade
inflamator

Hipercolesterolemie
β-Lipoproteine Poziție crescută O mobilitate scăzută cu creșterea intensității
sugerează o obstrucție biliară

Zona β2 Malignitate, infecții ale mucoasei, artrită, abuz

Creștere selectivă
IgA de alcool
Polimorfism Variante genetice,
Poziție Conversia in vivo/invitro a C3 la C3c
C3 Răspuns cronic inflamator,
Crește
Obstrucție biliară
Scade Activarea complementului
Zona γ Crește Răspuns inflamator
Fibrinogen
 PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR DIN
PLASMĂ COMPARATIV CU CELE DIN FLUIDUL
CEREBROSPINAL

În mod normal, aproximativ 80% din proteinele fluidului

cerebrospinal fluid (CSF) au originea în plasmă iar restul sunt
sintetizate local. Timpul de înjumătățire pentru proteinele plasmatice
care intră în spațiul subarahnoid este de aproximativ o săptămână, și
din acest motiv compoziția în proteine a CSF o urmează pe cea din
plasmă, cu o oarecare întârziere. Rezistența de transfer a proteinelor
plasmatice crește rapid odată cu masa moleculară și din acest motiv
raportul dintre proteinele mari (IgM, β-lipoproteine și α2-
macroglobuline) și albumină, este în mod normal mai scăzut în CSF
decât în plasmă. Această discriminare pe baza masei moleculare se
micșorează când concentrația proteică a CSF este crescută.
 PROFILUL ELECTROFORETIC AL
PROTEINELOR DIN URINĂ COMPARATIV
CU CELE DIN PLASMĂ

Un determinat primar pentru profilul proteinelor urinare este compoziția și cantitatea de

proteine care permează filtrarea glomerulară în relație cu capacitatea resorbtivă tubulară.
În mod normal, aceasta este limitată la aproximativ 200 mg/zi. Asupra pierderii urinare
intense de cantități de proteină, analizele comparative electroforetice disting trei
posibilități majore:
(a) proteinuria glomerulară neselectivă,
(b) proteinuria glomerulară selectivă, și
(c) proteinuria Bence Jones.
 PROTEINURIA BENCE JONES

Excreția urinară a catenelor ușoare de imunoglobuline κ ori λ, cu origine monoclonală

(proteinuria Bence Jones) conduce la apariția unei singure (ori uzual dublă) bande, mai mult ori
mai puțin închisă la culoare, undeva în zona α1 spre zona cu mobilitate mică γ. Natura ei poate fi
demonstrată prin imunoelectroforeză, dar este de preferată o evidențiere prin imunofixare după o
electroforeză pe gel de agaroză în prezența antiserurilor anti κ și anti λ. Rezultatul unor analize
imunoelectroforetice convenționale este mai dificil de interpretat decât rezultatul obținut prin
imunofixare dacă concentrația de catenă ușoară monoclonală este scăzută, deoarece catenele
policlonale ușoare apar în urină.
Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroză în
prezență de dodecil sulfat de sodiu

S-a introdus pentru analiza calitativă a proteinelor urinare electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezența
dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). SDS-PAGE separă proteinele în funcţie de mărimea lor moleculară, iar
monomerii catenelor ușoare libere (policlonale sau monoclonale) sunt vizualizate ca o bandă cu masă
moleculară (Mr) de 25.000 Da, care sunt deosebite cu uşurinţă de imunoglobulinele intacte (cu masă
moleculară de 150.000 Da). SDS-PAGE diferenţiază, de asemenea, proteinuriea cu origine glomerulară
(proteine, cu masă moleculară de 66.000 Da), de cea cu origine tubulară (proteine cu masă moleculară de
66.000 Da), sau cu origine mixtă. Această metodă este, aşadar, un potenţial instrument clinic pentru evaluarea
funcţiei renale, un important factor de prognostic în MM. Cu toate acestea SDS-PAGE, nu este utilizată pe
scară largă în laboratoarele clinice, pentru că este exigentă din punct de vedere tehnic, un timp mai
mare, şi este mai costisitoare.
Le Bricon și colaboratorii (1998; 2000) propun pentru prima dată o tehnică de
analiză a proteinelor urinare prin electroforeză pe gel de agaroză în prezență de
dodecil sulfat de sodiu (SDS-AGE) la pacienți suferinzi de Mielom multiplu. Astfel,
urina, fără o concentrare prealabilă, se analizează prin SDS-AGE pe suport
Hydragel®, mediu electroforetic utilizat în mod comun la analiza proteinuriei.

Profilul electroforetic a cinci probe diferite obținut

după SDS-AGE. De la stânga spre dreapta: 1,
proteinurie glomerulară selectivă: transferină și
albumină; 2, BJP prerenală pură: dimeri ai
catenelor ușoare și monomer, înainte de
tratamentul cu β mercaptoetanol; 3, proteinurie
mixtă: immunoglobuline, transferină, albumină,
α1- microglobulină (Alfa-1 µ), monomeri ai
catenelor ușoare (policlonali), proteina de legare
a retinolului (RBP) și β2-microglobulină (Beta-2
µ); 4, BJP prerenală pură: monomeri ai
catenelor ușoare; 5, proteinurie tubulară: mici
cantități de albumină, monomeri ai catenelor
ușoare (policlonale) și RBP. Caracterul
monoclonal al catenelor ușoare detectate sunt
confirmate prin imunofixare.
Trebuie însă accentuate o serie de limitări ale tehnicii SDS-AGE. Cea mai importantă
este faptul că SDS-AGE nu poate să realizeze o distincție definitivă între proteinele
monoclonale şi cele policlonale. În absenţa unor leziuni tubulare (în cazul BJP pură
sau în proteinuria glomerulară), se evidențiază întotdeauna banda electroforetică
corespunzătoare Mr=25.000 Da caracteristică BJP.
În concluzie, SDS-AGE
pare a fi un instrument de laborator clinic pentru urmărire a pacienţilor diagnosticați cu
MM.
SDS-AGE are o înaltă rezoluţie, sensibilitate, şi reproductibilitate.
Într-un laborator specializat, metoda este utilă în monitorizarea progresiei maladiei la
pacienți prin intermediul determinării semicantitative a BJP.
Comparativ cu electroforeza pe gel de agaroză de rutină, SDS-AGE combină simplitatea
(nu este nevoie de o concentrare prealabilă a urinei) cu o sensibilitate crescută pentru
detectarea BJP.
Profilurile electroforetice glomerulare, tubulare ori mixte se identifică ușor pe gelul de
agaroză. Interpretarea profilurilor benzilor proteice după SDS-AGE cere, totuşi,
conştientizarea unor capcane, în special în ceea ce priveşte polimerizarea catenelor ușoare şi
prezenţa unor catene ușoare mono-şi/sau policlonale în specimenele de urină a pacienţilor
diagnosticați cu mielom multiplu.
În unele cazuri, SDS-AGE poate fi ușor mai sensibilă decât imunofixarea în detecția
proteinelor Bence Jones la concentrații scăzute.
 ELECTROFOREZA FRAGMENTELOR DE ADN PE GEL DE AGAROZĂ

Acizii nucleici sunt polimeri compuși din unităţi nucleotidice individuale, unităţile fiind conectate prin
intermediul legăturilor diester fosfat la scheletul zaharidic. Efectul net al acestor legături este cel de a oferi
polimerilor o sarcină netă negativă.
Încă de la începutul tehnicilor electroforetice s-a axiomat faptul că moleculele care transportă o sarcină
electrică vor migra într-un câmp electric într-un mod previzibil. Atunci când este supusă unui câmp electric, o
moleculă care transportă o sarcină netă negativă va migra spre polul pozitiv, în timp ce o moleculă încărcată
cu o sarcină netă negativă va migra spre polul negativ.

Atunci când macromolecule de acizi nucleici încărcate electric sunt plasate în

matricea semi-solidă a unui gel, ele vor migra spre polul pozitiv într-un mod
previzibil şi reproductibil, procesul putând fi descris ca o funcţie exponenţială
negativă a lungimii acestora. Altfel spus, moleculele mai scurte vor migra mai repede
în timp ce moleculele mai mari (mai lungi) vor migra mai lent. Într-adevăr, în cazul
unui acid nucleic, aflat într-un câmp electric uniform, orice alt element al expresiei
migrării sale este o constantă, iar mobilitatea sa este complet determinată de
mărimea moleculei (masa moleculară a unui acid nucleic se exprimă în daltoni sau
în perechi de baze, base pair, bp, de fapt nucleotide; o pereche de baze este
aproximativ egală cu 660 daltoni). Metoda este deosebit de simplă, rapidă și
sensibilă pentru separarea, identificarea și purificarea fragmentelor de ADN.
Din punct de vedere practic, intr-un gel de
agaroză, este dificil să se rezolve cu
precizie acizi nucleici dubli catenari mai
mici de aproximativ 100 de baze, deoarece
proprietăţile de cernere moleculară a
agarozei nu sunt suficient de pregnante. Pe
de altă parte, macromoleculele mai mari
de aproximativ 25.000 bp dar mai mici de
aproximativ 2.000.000 bp vor migra în gel
cu viteze diferite, datorită limitării de
mobilitate. Macromoleculele de acizi
nucleici mai mari de 2.000.000 bp nu vor
putea penetra un gel convențional de Mobilitatea electroforetică a fragmentelor de
agaroză. Astfel, domeniul efectiv de restricție a ADN într-un gel de agaroză. DNA provine
mărime pentru electroforeza acizilor din bacteriofagul lambda în urma digestiei cu enzima
nucleici dublu catenari pe un gel de restricție Hind III. Graficul arată că distanța de
migrare în centimetri în funcție de mărimea în
convențional de agaroză este între 100 bp
perechi de baze a fragmentului separat
și 25.000 de bp. În acest interval
comportamentul macromoleculei este
precis şi previzibil. Acest comportament
este prezentat în figura alăturată.
În anii ‘80, a fost prezentată o teorie prin care se consideră că
acizi nucleici migrează prin gel asemănător mișcării ondulatorii
a unui şarpe. Astfel macromolecula se mișcă din față și trage
restul de macromoleculă după ea. În acest model, cu cât
molecula este mai mare, cu atât ea interacționează mai puternic
cu matricea de gel și astfel
. întâmpină o rezistenţă mai mare din
partea acesteia în așa fel încât timpul său de staționare într-o
zonă este mai mare. Aşa cum a fost arătat mai sus, creşterea
rezistenţei gelului este neliniară. Acest model, numit „biased
reptation”, este suficient pentru a explica tot comportamentul
unui acid nucleic într-o matrice de semi-solidă.
În anul 1989 un grup de cercetători de la Universitatea din
Washington, au testat această teorie, filmând macromoleculele
de ADN care se deplasează printr-un gel de agaroză. Filmul a
arătat atât mișcarea ondulatorie, sigmoidală, cât și interacțiunile
dintre acid nucleic și matricea gelului de agaroză.
Separarea fragmentelor de ADN de dimensiuni
diferite prin electroforeză pe gel vertical. Gelul este
preparat prin turnarea agarozei topite sau a
acrilamidei nepolimerizate între două geamuri de
sticlă aflate la o distanță de câțiva milimetrii. După
solidificarea agarozei ori polimerizarea acrilamidei se
formează o matrice de gel, a cărei pori depinde de
concentrația de gel sau de acrilamidă utilizată.
Deoarece porii sunt mai mari în gelurile de agaroză
decât în cele de poliacrilamidă, cel din înainte este
utilizat la separarea fragmentelor mari de ADN (între
500 și 20 kb) în timp ce al doilea se utilizează la
separarea fragmentelor mici (de la o nucleotidă, până
la 2 kb). Amestecul de fragmente de ADN care
urmează a fi separat este depus într-un godeu din
partea superioară după care se aplică un câmp
electric prin gel. Fragmentele de ADN se mișcă spre
polul pozitiv cu o viteză invers proporțională cu
logaritmul lungimii lor formând benzi care pot fi
vizualizate prin autoradiografie (dacă fragmentele
sunt radiomarcate) ori prin adăugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu; în acest ultim
caz, agaroza lichefiată este lăsată să se solidifice pe
un suport de sticlă sau plastic orizontal
Cum matricea de gel restricționează difuzia întâmplătoare a
moleculelor, moleculele cu lungimi diferite se separă în zone
discrete („benzi”) a căror lățime este egală cu lățimea godeului
unde s-a plasat amestecul original de ADN

Analiza unor fragmente de ADN

după separare electroforetică pe
gel de agaroză. Prima linie conține
fragmente cu masă moleculară
cunoscută de ADN obținute în
urma digestiei cu o enzimă de
restricție a unui ADN cunoscut.
Celelalte patru linii arată diverse
fragmente cu mărimi diferite
prezente în probe.
Se poate spune astfel că mobilitatea ADN este funcție de masa
moleculară, câmpul electric aplicat, compoziția nucleotidică,
temperatura de lucru și soluția de tampon utilizată la separare.
Deplasarea moleculelor liniare de ADN se realizează cu o viteză invers
proporțională cu logaritmul masei lor moleculare.
După cum se cunoaște, conformația ADN explică mobilitățile diferite la
mase moleculare egale. Astfel, ADN o serie de conformații: circular
închisă (covalentry closed circle) supraînfășurată (supercoiled), circular
deschisă (open circular), liniară. Moblitatea electroforetică a celor trei
forme de ADN este în funcție de condițiile de lucru.
Pentru vizualizate postelectroforetică a
fragmentelor de ADN se utilizează tehnici
autoradiografice (dacă fragmentele sunt
radiomarcate) ori prin adăugare de colorant
fluorescent de tipul bromurii de etidiu
(figura alăturată).
Bromura de etidiu, o moleculă planară, se
intercalează în structura ADN între bazele
azotate iar buclele supraînfășurate încărcate
cu sarcină negativă ale conformației
circular închise se desfac și în aceste
condiții mobilitatea electroforetică se
reduce.
 Legarea bromurii de etidiu la ADN crește de asemenea fluorescența intrinsecă.
Ca rezultat, în condițiile iluminării unui gel cu lumină ultravioletă, regiunile de
gel care conțin ADN, vor fi mai strălucitoare față de regiunile gelului fără ADN.

La concentrații de 0,1-0,5 µg/ml de bromură de etidiu, toate

buclele înfășurate sau supraînfășurate sunt desfăcute. De
asemenea, bromura de etidiu reduce și mobilitatea conformațiilor
circular închise și liniare. ADN marcat radioactiv poate fi
vizualizat și prin autoradiografia gelului. În acest caz, gelul este
depus în contact cu un film fotografic, la întuneric; filmul astfel
expus va indica pozițiile ADN prezent marcat. Dacă filmul se
developează, se obține imaginea fotografică a ADN. Benzile de
ADN radiomarcat pot fi detectate prin analiza particulelor β
eliberate de moleculele marcate din gel. Datele rezultate se pot
stoca în computer și pot fi convertite într-o imagine asemănătoare
unei autoradiograme
Compoziția nucleotidică nu influențează în mod semnificativ mobilitatea
electroforetică, în schimb, concentrația de agaroză este esențială: cu cât
concentrația de gel este mai mare, cu atât mobilitatea fragmentelor de ADN
este mai mică. Prin folosirea gelurilor în gradient de concentrație este posibilă
separarea ADN de diferite mărimi.
Pentru a obține o rezoluție bună, căderea de tensiune între bornele aparatului de
electroforeză trebuie să fie de 5V/cm. În general, la diferențe mici de potențial,
mobilitatea fragmentelor lineare de ADN este proporțională cu intensitatea
câmpului electric.
În general se lucrează la temperatura camerei. Pentru geluri care conțin mai puțin
de 0,5% agaroză, se recomandă migrarea la o temperatură de 4oC. Majoritatea
protocoalelor de lucru recomandă tamponul Tris, 50mM, pH=7,5-7,8 drept optim în
ceea ce privește tăria ionică și capacitatea de tamponare.
Aparatura utilizată este de obicei orizontală, asemănătoare celei utilizate la
electroforeza proteinelor. Este de asemenea necesar un redresor de curent cu o
intensitate maximă de 100 mA și o tensiune maximă de 100V, iar pentru evidențiere
postelectroforetică a fragmentelor de ADN după colorare cu bromură de etidiu, de o
lampă UV prevăzută cu un filtru de 300 nm.
Tehnica de lucru pentru electroforeza
submersă a fragmentelor de ADN. De
obicei se utilizează o agaroză cu o
electroosmoză standard (-mr = 0,13) sau
mai mică (-mr = 0,07). Gelurile se prepară
asemănător celor de amidon, iar după
solidificare se plasează pe platforma cuvei
unde se acoperă cu tampon, stratul de
deasupra fiind de circa 1 mm. La trecerea
unui curent electric, rezistența electrică a
stratului de soluție tampon este aproape
egală cu cea a gelului și astfel, cea mai
importantă parte a curentului aplicat va
trece prin gel. Această tehnică este numită
electroforeză cu gel scufundat (submers) și
este cea mai utilizată tehnică de analiză
electroforetică a fragmentelor de ADN.
 Electroforeza fragmentelor de ADN în câmp electric
pulsator

Dacă prin metoda clasică, convențională se pot separa fragmente de ADN de până la 20 kbp cu
rezoluție bună, cele până la 40 kbp cu rezoluție satisfăcătoare, pentru separarea fragmentelor
până la 500 kbp se rezolvă cu rezoluție slabă, într-un gel de agaroză foarte fragil cu o
concentrație de 0,1%. La mijlocul anilor `80 s-au dezvoltat o serie de metode de analiză
electroforetică a moleculelor de acizi nucleici în domeniul de mărime care limitează mobilitatea.
Soluția a implicat introducerea mobilității dependente de mărime a moleculelor de acizi nucleici
prin alterarea câmpului electric. Primul tip de alterare implică simpla schimbare de polaritate a
câmpului electric într-o manieră regulată. S-a arătat că o schimbare periodică a polarității va
induce moleculelor o mișcare de întoarcere în forma literei U, în matricea de gel. Chiar pentru
cele mai mari molecule, această întoarcere permite separarea moleculelor. Dacă lungimea
timpului de reversare a moleculelor este de aproximativ o treime din timpul de mișcare spre
înainte, ele se vor putea separa în câteva ore pe agaroză standard. Prima demonstrație practică a
acestei metode, denumită ”electroforeză în câmp inversat” (Field Inversion Gel Electrophoresis-
FIGE), a rezolvat complet printr-o migrare de o secundă înainte urmată de o secundă înapoi
molecule mari de 2.000.000 bp precum cromozomii intacți din drojdie. De atunci s-au dezvoltat o
varietate de metode, în mod comun denumite ”electroforeză în câmp pulsator”. Prin aceste
tehnici cele mai mari molecule de ADN cu o lungime cuprinsă între 2•104 la 107 bp (20 kb la 10
megabp, Mb), se pot separa în funcție de masa lor moleculară. Separarea prin electroforeză în
câmp pulsator depinde de comportamentul singular al moleculelor mari de DNA într-un câmp
electric care este pornit și oprit (pulsat) la intervale mici de timp.
În condițiile în care se aplică un câmp electric unor
molecule mari de ADN aflate într-un gel, molecule
migrează în direcția câmpului electric și de asemenea se
întind pe toată lungimea lor. Dacă curentul este stopat,
moleculele încep să se “relaxeze” prin înfășurări
întâmplătoare. Timpul necesar pentru relaxare este
direct proporțional cu lungimea moleculei. Câmpul
electric este apoi reaplicat într-un unghi de 90° ori 180°
față de prima direcție. Moleculele mai mari se
relaxează mai puțin decât moleculele mai scurte în
momentul în care curentul este oprit. Cum moleculele
trebuie să se relaxeze prin înfășurări întâmplătoare
înaintea miscării lor într-o nouă direcție, moleculele
mai mari încep să se miște în direcția nouă impusă mai
lent decât cele mai scurte. Alternarea repetată a
direcției câmpului electric forțează moleculele mari de
ADN de diferite mărimi să se îndepărteze mai mult și
mai multe între ele.
Electroforeza în câmp pulsator este foarte importantă în
purificarea moleculelor mari de ADN, până la ≈107 bp în
lungime. Tehnica este necesară pentru analiza cromozomilor
celulari de la 5•105 bp (cel mai mic fiind cromozomul de la
drojdie) până la aproximativ 2-3•108 bp (cromozomii animali
și de plante). Cromozomii cei mai mari trebuie în prealabil să
fie digerați în fragmente de 107 bp ori mai mici înainte de
analiză. Astfel de fragmente de restricție pot fi generate cu
ajutorul enzimelor de restricție care taie la situsuri de
restricție găsite la situsuri de restricție de 8 bp
 Se poate spune că principiul (caracteristica metodei) o reprezintă faptul
că fragmentele de ADN sunt obligate să-și schimbe periodic direcția de
deplasare ca urmare a schimbării direcției câmpului electric. Intervalul
de timp pentru migrare într-o direcție sau alta determină limita
superioară a dimensiunii fragmentelor de ADN care se vor separa
distinct. Dependența de timp este aproape liniară: la frecvențe de timp de
0,1 secunde, se separă fragmente mai mari de 10 Kbp, în timp ce la
intervale de timp de o oră, se vor separa fragmente de circa 1 Mbp.
Timpul necesar separării prin electroforeză în câmp pulsator este cuprins
între 20 și 80 de ore, în condițiile în care gelul de agaroză are o
concentrație de 0,5-1%

Temperatura de lucru este de 14-15oC, la o cădere de tensiune de 2,5-10V/cm. Calculul

voltajului se realizează prin asumarea faptului că în sistemele electroforetice submarine,
numai aproximativ 80% din curent trece prin gel, căderea de tensiune (V/cm) poate fi
estimată prin relația:
 Schemele unei serii diverse de tipuri de aparate
utilizate în electroforeza acizilor nucleici în câmp
pulsator.

Mobilitatea moleculelor de ADN este în funcție de tensiunea (diferența de potențial) aplicată,

temperatura de lucru, frecvența schimbării direcției câmpului electric și de soluția de tampon
folosită, din care cauză trebuie identificată combinația optimă tensiune/temperatură (rezoluția
de separare scăzând odată cu creșterea temperaturii și a tensiunii, deși viteza de migrare
electroforetică crește). Din acest motiv se recomandă schimbarea frecvenței ciclurilor de două
sau mai multe ori în timpul separării. Prin această tehnică, este oarecum dificil a se determina
masă moleculară cu toate că se pot utiliza markeri de masă. Asemănător vizualizării
fragmentelor mici de ADN, și în acest caz gelul poate fi colorat cu bromură de etidiu (1 µg/ml),
când fluorescența intens orange a colorantului intercalat în molecula de ADN dublu helicală
conduce la cuantificarea a minimum 50ng de ADN.
Dintre aplicațiile electroforezei în câmp pulsator se pot enumera
obținerea hărților genetice, (a librăriilor metagenomice), a cariotipului
electroforetic la drojdii (Sacharomices cerevisiae, Candida albicans) la
protozoare (Giardia intestinalis). Ea s-a utilizat în studiul genomului
uman, de analiză a unor regiuni implicate în maladii cunoscute precum
complexul major de histocompatibilitate, de analiză a genei distrofiei
musculare Duchenne, unde s-a pus la punct un test molecular de
diagnostic în cazul femeilor ”vector” purtătoare a genei defecte și astfel
de diagnostic prenatal în familii cu risc crescut. Se poate spune că
apariția electroforezei în câmp pulsator a contribuit semnificativ la
dezvoltarea biologiei moleculare.
Dintre dezavantaje se pot enumera timpul mare de izolare și restricție a
ADN care preced electroforeza, acesta fiind dezavantajul major a
analizelor de macrorestricție prin intermediul electroforezei în câmp
pulsator. Astfel, un protocol standard durează cinci-șase zile până la
evaluarea rezultatelor
 ELECTROFOREZA
PROTEINELOR PE GELURI DE
POLIACRILAMIDĂ
Sursele comerciale furnizează acrilamidă și N,N'-metilen bisacrilamidă
cu o puritate suficientă care permite utilizarea lor fără o acțiune de
pregătire. O serie de reactivi pot fi obținuți în formă pre-mixată
(amestecați) gata pentru reacția de polimerizare. Există disponibile
comercial componente înalt purificate care permit formarea gelurilor
transparente la lungimi de undă cuprinse în domeniul ultraviolet (260
și 280 nm), care permit scanarea directă pentru identificarea acizilor
nucleici ori a proteinelor.
Dintre dezavantaje se pot enumera: neurotoxicitatea, cancerogenitatea
acrilamidei iar la contactul cu pielea, componentele amestecului de
polimerizare pot cauza iritații. În plus, reproductibilitatea depinde de
puritatea reactivilor și a condițiilor de lucru. Ca regulă, componentele
trebuie să fie stocate în vase închise la culoare, la frigider. Odată ce
monomerii au fost dizolvați durata de viață a soluției este de
aproximativ 3 luni. Este recomandat ca pH-ul soluției să fie măsurat
periodic deoarece odată cu îmbătrânirea soluției, pH-ul va crește.
Astfel, această soluție va necesita un timp mai îndelung de
polimerizare, fenomen care servește de asemenea drept indicație că
monomerii se deteriorează.
Acrilamida (amida acidului acrilic, 2-propen amida) este o pulbere
albă, ușor solubilă în apă, solubilă în solvenți polari (etanol, acetonă,
cloroform) și insolubilă în solvenți nepolari (tetraclorură de carbon, n-
heptan) Ea își păstrează proprietăție chimice timp îndelungat dacă este
păstrată corespunzător. Dacă este expusă la lumină, polimerizează slab
și formează mici cantități de poliacrilamidă. Amida acidului acrilic se
prepară fie prin sinteză chimică, prin hidroliza acrilonitrilului, fie prin
biosinteză, când utilizând o tulpină de Cornynebacterium se obține cu
un randament de aproximativ 100% acrilamidă.
Acrilamida se purifică prin recristalizare la o temperatură de 60oC din
cloroform sau soluții alcoolice cu un randament de circa 60%.
Acrilamida astfel obținută este aptă pentru focusare izoelecrică și alte
tehnici unde sunt necesare geluri foarte subțiri.
Utilizarea unor reactivi de înaltă calitate este o condiţie prealabilă pentru
obținerea unor geluri reproductibile și de înaltă rezoluţie. Acest lucru este
valabil mai ales pentru acrilamidă, care constituie componenta cea mai
abundentă în amestecul de monomeri. Reziduurile de acid acrilic,
poliacrilamidă liniară şi a impurităţilor ionice sunt contaminanţi majori care
scad calitatea preparatelor de acrilamidă.
1. Acid acrilic va copolimeriza cu acrilamida şi bisacrilamida, ceea ce pentru
gelul rezultant conferă proprietăţi de schimbător de ioni.
2. Poliacrilamida lineară, prin furnizarea unui nucleu de polimerizare
necontrolat, poate conduce la geluri nereproductibile.
3. Contaminanţii ionici pot să includă atât inhibitori cât și acceleratori ai
reacției de polimerizare. În special, metale precum cuprul poate inhiba
polimerizarea gelului.
Componentele tampon trebuie să fie de grad de reactiv şi numai apa
deionizată trebuie să fie utilizată pentru toate fazele electroforezei pe gel de
poliacrilamidă.
 Alți agenți de reticulare.

Versatilitatea gelurilor poliacrilamide este, de asemenea demonstrată de

numărul mare de agenți de reticulare, pe langa Bis, care pot fi folosiți
pentru a turna geluri cu proprietăţi specifice în scopul unei fracţionări
diferite. Acestea sunt enumerate în tabelul de mai sus. N,N'-(1,2-
Dihidroxietilen) bisacrilamida (DHEBA) poate fi folosită pentru
turnarea geluri reversibile, deoarece structura de 1,2-diol face DHEBA
un conpus sensibil la clivaj prin oxidare cu acid periodic. Acelaşi
principiu se aplică, de asemenea, pentru gelurile pe bază de N,N'-(1,2-
Dihidroxietilen) bisacrilamidă (DATD) Alternativ, geluri pe bază de
etilen diacrilat (EDA) pot fi utilizate, deoarece acest agenytul de
reticulare conține legături ester care pot clivate prin hidroliză. Agenții
de reticulare poli(etilen glicol diacrilat) fac parte din aceeaşi serie de
derivaţi esterici. Așa cum s-a descris anterior, gelurile pe bază de N,N’-
bisacrililcistamină (BAC) conțin punți disulfurice ușor clivabile.
N,N’Cistaminbisacrilamida este utilizată la gelurile de acrilamidă
solubilizabile, înlocuind echimolecular bisacrilamida. Gelurile se
solubilizează utilizând agenți reducători ai legăturii disulfurice (-S-S-), 2
mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritriol.
Diacrilpiperazina (N-Bis-acrililpiperazină, BAP) se sintetizează relative ușor
și este foarte solubilă în apă. Ea formează geluri cu conductibilitate mai
mare decât cele obținute prin copolimerizarea acrilamidei cu bisacrilamidă.
Aceste geluri nu se umflă prea tare cu apă iar în prezența dodecilsulfatului
de sodiu porii gelului scad aparent. Prin utilizarea gelurilor cu
diacrilpiperazină drept agent de reticulare separarea și detecția proteinelor
este îmbunătățită, iar transferul proteinelor pe membrane de nitroceluloză
este mai eficient.
N,N’ Dialiltartratdiamina formează geluri care își măresc volumul cu
aproximativ 30% în apă. Ele sunt solubile în acid periodic sau periodat de
potasiu. Gelurile formate de N,N’dialiltartratdiamină au o stabilitate
mecanică mai bună, sunt mai aderente pe sticlă și sunt perfect transparente,
comparabilă cu cea a gelurilor de poliacrilamidă-bisacrilamidă.
Structura chimică
a unor monomeri
acrilamido N-
substituiți utilizați
la prepararea
gelurilor de
poliacrilamidă
În general sistemele catalitice se pot împărți în:
Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin reacții redox;
Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin fotocataliză.
În afara celor două mari categorii există de asemenea sisteme combinate.
Sisteme catalitice redox constau de obicei din:
Inițiator al reacției de polimerizare vinilică (acesta este o substanță care
introdusă în sistemul chimic în concentrație mică poate declanșa procesul
chimic respectiv. Inițiatorul se descompune cu ușurință în radicali liberi). Cel
mai utilizat inițiator al reacției de polimerizare este persulfatul, S2O82-.
Catalizator (accelerator) al reacției de polimerizare (acesta este o substanță
care modifică viteza de reacție, catalizând formarea de radicali liberi, în acest
caz). O condiție necesară pentru a funcționa drept catalizator este de a poseda
două grupări amino separate prin doi atomi de carbon sau o grupare amino
terțiară.
Schema reacției de descompunere a persulfatului și de generare a radicalilor liberi
Cel mai utilizat accelerator în polimerizarea vinilică
a acrilamidei este tetrametiletilen diamina, TEMED.
În acest sistem, TEMED accelerează
descompunerea moleculelor de persulfat în doi
radicali sulfat iar aceștia inițiază reacția de
polimerizare

Trebuie însă avut în vedere necesitatea prezenței TEMED

pentru această reacție. Eficiența polimerizării în acest
sistem scade rapid la valori ale pH-ului mai mici de 6,0

1.4. piperazin dimetil (1. 4 dimetilpiperazina, DMPIP)

reprezintă un alt catalizator utilizat în polimerizarea
vinilică. Acesta este însă un catalizator mai slab decât
TEMED, dar este mai bun pentru colorarea gelurilor
cu argint amoniacal (în acest caz se adaugă la sistemul
catalitic tiosulfat de sodiu alături de persulfat).
Un alt sistem catalitic utilizat la prepararea gelurilor de poliacrilamidă este format din
riboflavină și TEMED. Astfel, riboflavina, sub acțiunea radiație UV generează radicali
liberi care inițiază reacția de polimerizare. Sistemul conține și TEMED pentru a mări
viteza de reacție. Polimerizarea durează circa o oră iar în absența TEMED reacția
decurge în aproximativ 8 ore, după circa o oră, doar 60% din monomeri fiind
polimerizați, obținându-se astfel geluri nereproductibile, monomerii neintrați în reacție
putând interacționa cu resturile de aminoacizi din constituția proteinelor supuse separării
electroforetice, putând chiar interacționa cu diverse componente ale sistemului tampon.
De obicei fotopolimerizarea cu riboflavină drept accelerator, este utilizată pentru gelurile cu
pH scăzut .
Un sistem diferit de fotopolimerizare cuprinde
un colorant cationic (albastru de metilen) și un
cuplu redox alcătuit din sodiu toluen sulfinat
(un reducător )și clorură de difeniliodoniu (un
oxidant mediu).

Catalizatori ai reacției de fotopolimerizare: A. clorură de difeniliodoniu

(DPIC); B. toluen sulfinat de sodiu (STS), C. albastru de metilen (MB).
Ultimul, poate fi utilizat și în combinație cu riboflavin-5'-fosfatul
 FACTORII DE CARE DEPINDE VITEZA REACȚIEI DE
POLIMERIZARE

Viteza reacției de polimerizare depinde de:

(1) Concentraţia netă de monomeri şi de radicalilor liberi ( de obicei se utilizează TEMED
în concentrație de 10 mM și persulfat);
(2) Temperatura la care are loc reacția de polimerizare. În acest context se cunoaște că
reacția de polimerizare este exotermă și din această cauză temperatura trebuie să fie
controlată cu atenție. Ea se desfășoară mai ușor la temperatura camerei, cu toate că există
matrice termostatate. În general la gelurile plate, disiparea căldurii este mai eficientă cu cât
grosimea gelului este mai mică;
(3) Puritatea reactivilor;
(4) Concentrația de inhibitori. Prin inhibitor
trebui înțeles orice compus care distruge
radicalii liberi. Astfel, orice compus care poate
acţiona ca o trapă pentru radicalii liberi va
acţiona ca un inhibitor de polimerizare.
Oxigenul atmosferic este cel mai important
inhibitor și din acest motiv este necesară o
degazare corespunzătoare a amestecului de
polimerizare pentru a elimina oxigenul dizolvat
în soluţiile de acrilamidă. Prezența oxigenului
este critică pentru o reproductibilitate absolută
a electroforezei. Cu toate acestea, pot fi
acceptabile și geluri obținute fără o degazare
completă.
Alți inhibitori ai reacției de polimerizare sunt
(a) aminele alifatice, (b) compușii aromatici
precum piridina, (c) protonii (existenți în
mediul acid).
Pentru ca gelurile să fie reproductibile, toți
acești parametrii trebuie să fie controlați cu
atenție.
 PROPRIETĂȚILE GELULUI DE POLIACRILAMIDĂ

Prin polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida, se formează o rețea tridimensională în condițiile în care

agentul de reticulare bifuncțional se leagă de lanţurile liniare de poliacrilamidă adiacente formând un mediu
poros în care dimensiunile porilor sunt în funcție de concentrațiile inițiale ale monomerilor (acrilamidă și
bisacrilamidă) și de condițiile de realizare a reacției de polimerizare (sistem catalitic, temperatură, etc.).
Prin convenţie, gelurile de poliacrilamidă sunt caracterizate printr-o pereche de valori, T% şi
C%, în cazul în care T% reprezintă procentul de greutate al cantității totale de monomeri,
inclusiv a agentului de reticulare (în g/100 ml),

adică:

unde a reprezintă cantitatea de acrilamidă iar b este cantitatea de

bisacrilamidă în timp ce V este volumul total de soluție.
C(%) reprezintă procentul (proporția) de agent de reticulare ca procent din totalul de
monomeri, adică din cantitatea totală de monomeri.

C(%) se calculează după relația:

După cum se observă, C(%) este practic gradul de reticulare.

S-au observat o serie de anomalii în condițiile în care se utilizează doi agenți de
reticulare cu mase moleculară diferită. Aceștia nu vor avea aceeași frecvență.
agentul de reticulare mai mic va avea o frecvență mai mare. Astfel, uneori se
utilizează fracția molară, X care poate fi definită ca:
 Efectul de cernere moleculară
Termenul de por nu definește un element geometric decât în sens orientativ și
comparativ. Mărimea porilor semnifică rezistența opusă de rețeaua tridimensională
a gelului la deplasarea macromoleculelor (în speță a proteinelor). Cu ajutorul
gelului de poliacrilamidă se pot separa molecule de la câteva sute la câteva milioane
de daltoni. Mărimea efectivă a porilor este în funcție de concentrația totală a
monomerilor, T (%) și de proprietățile agentului de reticulare, C (%).

Dependența de concentrația de monomeri, T(%) și C(%)

O macromoleculă cu sarcină electrică dată în funcție de dimensiunile sale și de

dimensiunile porilor va fi mai mult sau mai puțin frânată în deplasarea sa în câmp, fiind
caracterizată printre altele, prin mobilitatea electroforetică. În practică se folosește
mobilitatea relativă electroforetică care este proporțională cu distanța de migrare. Ea se
calculează prin compararea mobilităților diferitelor macromolecule considerând timpul
de separare și intensitatea curentului electric, constante.
Mobilitatea relativă se notează cu Rf și definește ca raportul dintre mobilitatea unei
macromolecule oarecare și mobilitatea unei macromolecule standard sau a unui
colorant care migrează cu frontul. Rf poate fi definit și ca raportul între mobilitățile
unei macromolecule în mediu restrictiv µ și mobilitatea sa într-un mediu liber,
nerestriciv, µo după relația:

Rf este o constantă fizică care caracterizează o macromoleculă dată într-un gel cu

o anumită compoziție, în condiții definite
Pentru a obține date despre: (a) dimensiunile și sarcina netă a unei macromolecule, (b) omogenitatea,
(c) concentrația optimă a unui gel care poate rezolva sau diferenția două specii moleculare, se folosesc
reprezentările Ferguson (figura alăturată).
KR (măsura frânării deplasării macromoleculei în gel) și y0 (măsură a mobilității macromoleculei în
mediu liber, nerestrictiv la T (%)=0) sunt parametrii caracteristici ale macromoleculei luate în studiu.
În plus, y0 poate fi corelată cu sarcina electrică netă.
În lumina acestei reprezentări gelurile pot fi:
Zerodimensionale, când fibrele de polimer au o lungime aproximativ egală cu 0, polimerul fiind liniar
și supraînfășurat formând suprafibre cu pori mari cu raza de 20-40 nm.
Unidimensionale, când fibrele de polimer au o lungime ”infinită” iar numărul de capete este
neglijabil. Este cazul poliacrilamidei convențional reticulate cu C(%)=2-5% care pare a avea
predominant caracter de gel unidimensional cu fibre cu rază de 1-2 nm.

Reprezentarea Ferguson. Din panta

dreptei (α) se calculează coeficientul KR iar
din intersecția cu axa oy se obține yo
valoare dată pentru T(%)=0.
Interpretarea gelurilor native este mai complexă decât interpretarea gelurilor
după SDS – PAGE deoarece mobilitatea relativă reflectă diferențele de
sarcină electrică și de masă sau ambele, mai ales în cazul în care proteinele
au un pI mai mic decât pH-ul tamponului, caz în care acestea nu vor migra
sau vor migra în sens opus ("retro-foreză“) înapoi în camera de tampon
superioară.

Ecuația care guvernează mobilitatea unei proteine în geluri native este

următoarea:

log Rf = log (Yo) - KRT

Unde:
Rf = mobilitate relativă, normalizată față de frontul de colorant
sau față de un alt standard.
Yo = mobilitatea relativă a proteinei în absența oricărei interacții
cu gelul.
KR = "coeficient de retardare," în măsura în care matricea de
gel afectează mobilitatea.
T =% concentrația de monomeri din matricea de gel.
 Configurațiile geometrice probabile ale diferitelor tipuri structurale de geluri de
poliacrilamidă

Tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă. A. Poliacrilamidă nereticulară

cu C(%)=0%. Este un gel unidimensional iar consistența polimerului este
lichid-vâscoasă. B. Un gel de poliacrilamidă cu C(%) de valoare medie. C. Un
gel de poliacrilamidă cu C(%) de valoare mare. D. Un gel de poliacrilamidă
reticulat pur, zerodimensional (C(%)=T(%)).
La valori ale C% situate în domeniul 5-50%, fibrele de poliacrilamidă sunt
zerodimensionale, supraînfășurate, diametrul porilor crește, iar practic moleculele
nu mai sunt frânate în migrarea lor în câmp electric. Figura de mai jos prezintă
dependența factorului de frânare în funcție de concentrația totală de polimeri, T%.

Dependența mărimii porilor de gradul de reticulare, C(%).

Creşterea ulterioară a C% cauzează formarea de legături mai scurte şi
mai groase de lanţuri de polimer.
În ceea ce privește dependența mărimii porilor de parametrul T(%), se poate spune
că la o valoare constantă a gradului de reticulare (C%=2-5%), mărimea porilor
scade pe măsură ce valoarea parametrului T% crește după relația:

Astfel, mărimea efectivă a porilor a unui gel de

poliacrilamidă este o funcţie inversă a concentrației
totale de monomeri (T%). Pentru orice concentrație
totală de monomer dat, dimensiunea porilor efectivă,
variază de asemenea, în funcţie de proporţia de agent de
reticulare din amestecul de reacţie (C%). Odată cu
creșterea T(%), la o concentrație scăzută de agent de
reticulare, numărul de catene liniare crește, iar mărimea
porilor scade. Când T% este crescut la o concentrația
fixă, dar scăzută de agent de reticulare, numărul de
catene crește iar dimensiunea porilor se reduce. Pe de
altă parte, dimensiunea porilor este o funcţie bifazică
dependentă de C (%). În condițiile în care se variază C
(%), la un T% constant, scade dimensiunea porilor,
nivelul minim fiind atins la aproximativ C=5%
Pe lângă aplicațiile evidente de analiză a purității unor probe proteice, electroforeza este
utilizată la determinări fizico-chimice. Dacă proteina supusă analizei într-o serie de geluri cu
concentrații (T%) și se măsoară mobilitatea ei electroforetică relativă, Rm (Rm, Rf este
definit ca raportul dintre distanța migrată de proteina dată și distanța migrată de colorantul
trasor, de obicei albastrul de bromfenol) în fiecare gel se poate construi o diagramă liniară,
log Rm versus T% (diagrama Ferguson). Această reprezentare poate da o importantă
informație: panta acestei drepte este o măsură a mărimii moleculare și este denumită
coeficient de retardare (retardation coefficient, KR). Prelungirea acestei drepte care
intersectează axa 0y (Y=Rm când T=0) este o măsură a mobilității electroforetice în condiții
libere (când gelul nu este prezent) și așadar este o măsură a sarcinii electrice nete.
 Reprezentarea grafică a
logaritmului mobilității
electroforetice a BSA
versus concentrația
(densitatea) gelului (T%) la
un grad de reticulare (C%)
constant de 2%.

În cazul electroforezei bidimensionale, prima dimensiune se realizează în cele

mai bune condiții în geluri cilindrice.
Dacă gelurile placă pot fi în egală măsură omogene sau în gradient, gelurile
cilindrice sunt de obicei omogene.
 STRATEGIA DE SEPARARE A
PROTEINELOR PE GELURI DIN
POLIACRILAMIDĂ

În funcție de proprietățile proteinei (proteinelor) luate în studiu

și în funcție de scopul urmărit, trebuie avut în vedere:
- compoziția chimică, concentrația și structura gelului de
poliacrilamidă (gel omogen, gel în gradient, etc.);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);
- condițiile de separare (denaturante, nedenaturante,
disociative, nedisociative);
- sistemul tampon (continuu sau discontinuu)
- forța ionică și pH-ul sistemului tampon.
 Compoziția chimică, concentrația și structura gelului de poliacrilamidă

Din punct de vedere al compoziției chimice, acrilamida poate fi polimerizată cu

bisacrilamida (cel mai adesea folosită), bisacrilcistamina (BAC), dialiltartatdiamina
(DATD), dihidroxietilenbisacrilamida (DHEBA), etc. Ultimii trei agenți de reticulare se
utilizează la prepararea gelurilor solubilizabile, în tehnici la scală micropreparativă,
deoarece acești agenți permit solubilizarea gelului în condițiile cele mai avantajoase
pentru conservarea integrității structurale și funcționale a proteinelor luate în analiză.
Dacă gelul este format din două zone, gelul de concentrare (T%=4%) este plasat
deasupra gelului restrictiv de rezolvare, ultimul având o concentrație de monomeri
cuprinsă între 5 și 30%. Gelul de concentrare (de stivuire) conține tampon Tris-HCl
0,125 M, pH=6,8, iar gelul de separare conține tampon Tris-HCl 0,375 M, pH=8,8.
Discontinuitatea de pH dintre cele două geluri suprapuse este desemnată pentru a
regla mobilitatea efectivă ale ionilor de glicinat din compartimentul catodic.
Concentrațiile de tampon Tris-HCl din cele două geluri derivă din considerații
electrochimice. Porozitatea gelului de concentrare este atât de mare pentru a nu
împiedică mișcarea proteinelor și funcționează în general ca un mediu suport cu
proprietăți anticonvective în timpul formării zonei înguste de start. Separarea
proteinelor se realizează mai jos, în gelul de rezolvare. Porozitatea acestui din urmă
gel este determinată empiric fiind potrivită mobilității proteinelor din probă. Nu există o
regulă clară pentru a predicționa concentrația corectă a concentrației de gel pentru un
amestec de proteine necunoscute neanalizate electroforetic. Alegerea este făcută
astfel ca proteinele de interes să se separe în gel. În mod obișnuit se începe cu un gel
cu 7,5%T pentru electroforeza inițială a probei cu mobilități necunoscute.
Concentrația gelului se referă la concentrația totală a monomerilor
(parametrul T%) și a gradului de reticulare (parametrul C%) Pentru proteine
bine caracterizate, alegerea concentrației gelului nu reprezintă o problemă. În
general, pentru proteine cu masă moleculară cuprinsă între 20.000 și 150.000
daltoni, se recomandă geluri cu T%=5-12%. În cazul proteinelor cu masă
moleculară cuprinsă între 10.000 și 80.000 daltoni se recomandă geluri cu
T%<10-12% iar în cazul proteinelor masă moleculară mai mică de 15.000 daltoni
se utilizează geluri cu T%>15%.
Structura gelurilor este strâns legată de parametrii T(%) și C(%) Astfel, un gel
omogen se caracterizează printr-o singură valoare a concentrației totale de
monomeri, T(%), în timp ce un gel cu gradient este caracterizat printr-un
gradient de concentrație, deobicei cuprins între 5 și 20%. Gelurile în gradient
sunt mai avantajoase deoarece oferă mai multe date despre proteinele supuse
electroforezei. Gradientul poate fi liniar sau exponențial, putând astfel vorbi
despre gradient de pori. Gelurile omogene au pori de aceeași mărime.
Pentru obținerea unei rezoluții optime de separare a două proteine, se
folosește un gel omogen de concentrație potrivită. Concentrația gelului este în
funcție de mărimea și sarcina electrică a proteinei luate în studiu, putând să fie
stabilită (determinată) prin măsurarea mobilității fiecărei proteine într-o serie de
geluri de concentrații (T%) diferite.
Se disting patru categorii de probleme (situații) de separare:
1. Cele două proteine au densități de sarcină electrică identice, deci mobilități identice
într-un mediu nerestrictiv (panelul A).

2. Proteina cu mobilitate mai mare (densitate de sarcină electrică mai mare) este mai mică
în dimensiuni. În acest caz separarea se realizează pe baza mobilității și a masei
moleculare. Se consideră că cele două proteine sunt sinergice iar prin creșterea
concentrației de gel crește și rezoluția de separare (panelul B).
3. Una dintre proteine are dimensiuni mai mari și mobilitate electroforetică mai mare. În
acest caz separarea se realizează în funcție de dimensiune și sarcină electrică, cele două
proteine fiind antagoniste. Cazul este caracteristic sistemelor nedisociative (panelul C).
4. Două proteine au aceleași dimensiuni dar au mobilități electroforetice diferite (este cazul
izoenzimelor, hemoglobinelor, etc.). În acest caz concentrația monomerilor nu are efect
asupra separării relative a celor două proteine. Situația corespunde separărilor prin
focusare izoelectrică sau prin izotacoforeză (panelul D).
Soluțiile de monomeri se prepară uzual ca soluții stoc, concentrate. Pentru gelurile utilizate în
separarea de proteine este preferată o soluție stoc de monomeri cu T%=30% și C%=2,7% care se
prepară prin dizolvarea a 29,2g de acrilamidă și 0,8g de bisacrilamidă în 70 ml de apă complet
deionizată (volumul final fiind de 100 ml iar densitatea specifică de 1,025). Soluția de monomeri
trebuie filtrată și stocată la rece, preferabil într-un vas de sticlă. Pentru gelurile utilizate în
separarea de acizi nucleici se folosește un amestec alcătuit din acrilamidă:bisacrilamidă cu
T%=30% și C%=3,3% preparată din 29g de acrilamidă și 1g de bisacrilamidă.
Concentrațiile de inițiator sunt determinate empiric prin urmărirea polimerizării în timp de 15-
20 minute după adăugare. În aceste condiții, gelificarea se realizează complet în 90 de minute.
Dacă se utilizează geluri de concentrare, este necesar ca acestea să aibă structuri poroase mari.
Pentru o polimerizare rapidă (în circa 8-10 minute) se adaugă persulfat de amoniu, la o
concentrație finală de 0,05% respectiv TEMED, 0,1%.
Soluțiile stoc de monomer și de tampon se combină până la concentrația dorită și apoi se
deaerează sub un vid modest timp de aproximativ 15 minute. Inițiatorul și catalizatorul sunt apoi
adăugate iar amestecul se toarnă în aparatul montat. Dacă se utilizează gel de concentrare, se
prepară și se toarnă mai întâi gelul se rezolvare (separare). El este apoi acoperit cu o soluție de
izobutanol saturat în apă pentru a exclude aerul din vecinătatea superioară a gelului și pentru a
forma o legătură puternică între cele două geluri. După aproximativ o oră, stratul de alcool este
îndepărtat și gelul format în partea superioară se spală cu apă până la dispariția mirosului
caracteristic de butanol, după care se toarnă amestecul de gel de concentrare peste gelul de
separare și se introduce un ”pieptene” formator de godeuri pentru a forma spații în care se aplică
proba. După finalizarea polimerizării și îndepărtarea pieptenului, gelul este gata de utilizare.
În cazul gelurilor de poliacrilamidă preturnate acestea sunt inerent
instabile în afara domeniului de pH cuprins între 4 și 6. După un stocaj de
aproape 4 luni la o temperatură de 4oC, în tampoanele uzual utilizate în
electroforeză, uneori are loc o scădere notabilă a profilului benzilor
separate electroforetic. În consecință, pentru a obține o rezoluție maximă,
este necesar să se utilizeze numai geluri preparate în soluții cât mai
proaspăte.
Alterarea structurii poliacrilamidei este un proces lent de hidroliză a
grupărilor carbox-amididice (-CO-NH2) ale monomerilor de acrilamidă și
care se manifestă în tampoane bazice. Hidroliza conduce la formarea unor
grupări carboxil (-COO-), ionizabile. Gelurile vechi au o structură a
porilor este schimbată ele luând caracteristici de schimbători de ioni
datorită hidrolizei. Îmbătrânirea gelurilor de poliacrilamidă are o
semnificație comercială deoarece limitează perioada de utilizare a
gelurilor preturnate.
 Forma gelului
Primele electroforeze care au folosit poliacrilamida drept mediu suport s-au efectuat pe
geluri plate, orizontale și apoi pe geluri cilindrice (unde amestecul de polimerizare se toarnă
în tuburi de sticlă sau plexiglace). În prezent însă, în majoritatea cazurilor se apelează la
separarea pe verticală în geluri plate (geluri placă), cu o grosime a gelului cuprinsă între 50
µm și 3 mm.

Gelurile placă orizontală (sau verticală) sunt simplu de preparat , într-un timp scurt. Pe
un astfel de gel se aplică mai multe probe, inclusiv proteine standard cu masă
moleculară cunoscută, separându-se în condiții identice. Numărul de probe aplicate este
în funcție de necesități iar analiza calitativă și estimările cantitative se efectuează cu mai
multă ușurință și precizie în cazul gelurilor cilindrice. Se elimină astfel artefactele optice,
ceea ce face posibilă fotografierea corectă. În plus, în cazul gelurilor placă, căldura
produsă prin efect Joule este mai repede disipată comparativ cu gelurile cilindrice iar
uscarea gelurilor este relativ simplă.
Gelurile cilindrice sunt
de neînlocuit la separarea proteinelor marcate cu radioizotopi când se urmărește
determinarea cantitativă a radioactivității.
 Ele sunt de preferat atunci când trebuie determinată activitatea enzimatică a
fracțiunilor separate deoarece cantitatea aplicată este mult mai mare (fără a afecta
calitatea separării).
 Gelurile cilindrice sunt preferate la testarea pH-ului optim de lucru și a concentrației
optime a gelului de poliacrilamidă
 CONDIȚII DE SEPARARE
Condițiile de separare trebuie să asigure o solubilizare completă a probelor
proteice, alegerea acestora realizându-se sistematic în funcție de proprietățile
hidrofile/hidrofobe ale proteinelor.
Pentru testarea solubilității numai prin disocierea legăturilor hidrofile, proba este
incubată în soluții tampon alcaline, neutre și acide, în prezența/absența clorurii de
potasiu (0,1-0,5 M), la o temperatură de 4oC, pentru a nu afecta activitatea
biologică.

Dacă proba nu se solubilizează, se repetă testarea în

prezență de EDTA (etilendiaminotetraacetat), 0,1 M. EDTA
complexează ionii metalici divalenți și astfel se desfac
legăturile în care aceștia sunt implicați.

Urea este deseori utilizată ca agent de disociere în electroforeza pe gel. Urea, care disrupe
legăturile de hidrogen și legăturile hidrofobe poate cauza agregări nedorite ori formarea unor
structuri secundare care afectează mobilitățile proteinelor. Ea este deseori utilizată în
denaturarea acizilor nucleici. Urea este un component esențial al gelurilor la care este
necesară menținerea configurațiilor unicatenare a ADN sau ARN, pentru a se determina cu
acuratețe masele moleculare. Disocierea legăturilor de hidrogen necesită uree în concentrații
mari (7-8 M).

Poliolii (de exempul glicerina, trixidroxipropan, propantriolul) este folosită frecvent pentru
solubilizarea proteinelor în condițiile menținerii activității biologice.
 Dacă proba continuă să rămână insolubilă se recurge la detergenți, compuși
care modifică hidrofobicitatea relativă a proteinelor și care astfel îmbunătățesc
separarea electroforetică.
Într-o mică măsură același efect se obține prin folosirea tampoanelor relativ
hidrofobe pe bază de N-etilmorfolină sau hidroxietilmorfolină

O N C H2 C H3 O N C H2 C H2 OH

A B

Structura chimică a N-etilmorfolinei (A) și a hidroxietilmorfolinei (B)

 Electroforeza în condiții denaturante

Cea mai mare parte a studiilor de electroforeză în gel de poliacrilamidă folosește condiții
denaturante, disociative. În aceste condiții, proteinele oligomere disociază în lanțuri
polipeptidice, componente. Astfel, proteinele își pierd activitatea biologică. Detergenții se
utilizează în electroforeză când este necesară disruperea interacțiilor proteină-lipid și
proteină-proteină. În acest scop au fost utilizați o serie de detergenți. Cel mai cunoscut
agent de disociere este dodecilul sulfat de sodiu (lauril sulfatul de sodiu, SDS).
SDS este un detergent ionic care are formula CH3-(CH2)10-CH2-SO3-Na+.

Structura chimică a
dodecilsulfatului de sodiu, SDS.
Se observă brațul nepolar și
regiunea polară care posedă o
sarcină negativă
 Cele mai multe proteine sunt ușor solubile în SDS, făcând electroforeza în prezență
de SDS (SDS-PAGE) o metodă general aplicabilă.
 Puritatea (calitatea) detergentului este o condiție importantă în SDS-PAGE.
 Efectele impurităților prezente în preparatele de SDS sunt impredictibile.
Dintre contaminanți, cele mai nedorite efecte le au probabil alchil sulfații,
alții decât dodecil sulfatul (C12); în special decil sulfatul (C10), tetradecil
sulfatul (C14) și hexadecil sulfatul (C16) Aceștia se leagă la proteine cu
afinități diferite și în consecință afectează mobilitățile.
 Contaminanții lipofilici prezenți în preparatele de SDS, printre care
dodecanolul, pot fi incluși în complexele SDS-proteină și în micelele de
SDS conducând la scăderea rezoluției. Numai SDS purificat (care se
realizează prin recristalizare în n heptan) trebuie utilizată pentru
electroforeză, dar chiar cu SDS pur, diferite glicoproteine, lipoproteine și
nucleoproteine au tendința de a se lega la detergent neregulat, rezultanta
fiind o migrare anormală a complexelor SDS-polipeptide în ceea ce
privește masele lor moleculare. În plus, prezența unor săruri anorganice în
preparatul de SDS conduce la modificarea proprietăților tensioactive ale
acestuia. Dintre proprietățile fizice ale SDS se pot aminti:
 SDS are o solubilitate în apă de 3% (masă/volum);
 SDS precipită la temperaturi cuprinse între 0-10oC.
DODECIL SULFATUL DE LITIU (lithium dodecyl sulfate, LDS) a fost
uneori substituit SDS în analizele efectuate pe geluri de poliacrilamidă
după cum BROMURA DE CETILTRIMETILAMONIU
(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) a fost de asemenea utilizată în
electroforeza proteinelor.
LDS este mai solubil decât SDS și nu precipită la temperaturi
scăzute (la 4oC se leagă afin la poliacrilamidă, deși la 25oC nu prezintă o
astfel de proprietate), ceea ce permite migrarea gelurilor la temperaturi
scăzute. S-a constatat că dacă într-un sistem tampon continuu, SDS este
înlocuit cu LDS, separarea moleculelor cu masă moleculară mică este
accelerată datorită deficitului de LDS în regiunea frontală a gelului. Dacă
gelul este saturat în LDS, rezoluția separării la 4oC pe acest gel este mai
bună decât cea obținută după electroforeză un gel de poliacrilamidă în
prezență de SDS efectuată la 25oC.
CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) este un denaturant mai slab decât
SDS, prezervând anumite activități biologice care sunt distruse de către SDS.
MAJORITATEA PROTEINELOR LEAGĂ SDS ÎNTR-UN RAPORT
CONSTANT DE 1,4 G SDS/GRAM PROTEINĂ. ÎN ACESTE CONDIȚII,
SARCINILE INTRINSECI (PROPRII) ALE POLIPEPTIDELOR SUNT
NESEMNIFICATIVE COMPARATIV CU SARCINILE ELECTRICE
NEGATIVE REZULTATE DUPĂ LEGAREA SDS. DENSITĂȚILE DE
SARCINĂ ELECTRICĂ SUPERFICIALĂ ALE COMPLEXELOR SDS-
POLIPEPTIDE SUNT ÎN PRINCIPIU IDENTICE, CEEA CE PERMITE
SEPARAREA (ÎNTR-UN GEL CU POROZITATE CONTROLATĂ) STRICT
ÎN FUNCȚIE DE DIMENSIUNILE POLIPEPTIDELOR. În acest fel, pe
lângă compoziția (conținutul) polipeptidelor din probă, se determină și
masele moleculare ale polipeptidelor, dacă sunt separate în același
timp cu un set de proteine cu masă moleculară cunoscută, prin
raportare la acestea. Tehnica de lucru este simplă iar cantitatea de
probă este de ordinul a micro sau a nanogramelor.
Cea mai mare parte dintre proteine se solubilizează în SDS,
indiferent de sursă, însă există și excepții: astfel,
glicoproteinele și lipoproteinele nu pot fi saturate în SDS, deoarece, în
primul caz, partea neproteică a unităților hidrofile oligozaharidice
previn legarea micelelor de SDS partea proteică numai interacționând
cu acesta.
 Proteinele puternic bazice (de exemplu, histonele)
interacționează prin legare electrostatică a micelelor de SDS prin
intermediul grupărilor sulfat. Migrarea histonelor poate fi îmbunătățită
prin utilizarea gelurilor în gradient de pori care permit catenelor
polipeptidice să acceadă la limita lor de pori.
În cazul glicoproteinelor, impedimentul poate fi relativ îndepărtat
prin utilizarea tampoanelor Tris-borat în condiții alcaline, astfel
crescându-se sarcina netă negativă a glicoproteinelor ceea ce conduce
la viteze de migrare bine corelate cu masa moleculară.

Pe de altă parte, proteinele pure, au tendința ca la

temperaturi ridicate să formeze agregate și să precipite. Este
cazul hemaglutininei bacteriene care disociază complet după
30 de minute de fierbere la 100oC în prezență de SDS.
Competiția agregare/dezagregare se poate rezolva prin
scăderea concentrației proteinei din probă.
 S-a studiat interacțiunea diferiților detergenți anionici cu albumina
serică bovină (BSA). În stare nativă, BSA conține 10-11 situsuri cu
constante mari de legare a ionilor de detergent. Legarea ionilor de
detergent de proteina nativă nedenaturată se realizează secvențial (unul
după altul), în timp ce legarea detergentului la proteina denaturată este
puternic cooperativă. Existența complexelor discrete proteină-detergent
sugerează că asocierea ionilor de detergent este, de asemenea
importantă, atunci când afinitatea detergentului pentru proteină este mai
mică. Un raport de legare mai mare decât cel normal pentru un singur situs
de legare se explică numai prin formarea de micele de detergent în acel
loc, adică ionii de detergent se leagă atât la proteină cât și la ionii de
detergent deja legați. acest fenomen este numit amplificarea legării, iar
acest tip de legare poartă numele legare micelară și s-a demonstrat că
este reversibil. La atingerea concentrației micelare critice acest mecanism
încetează.
Saturarea cu SDS a unei proteine depinde de
asemenea în punctul izoelectric al acesteia, indirect
influențând comportamentul electroforetic. De
asemenea, saturarea cu SDS este posibilă la
temperatura camerei și se aplică la electroforeza
bidimensională, gelurilor folosite la separarea
proteinelor prin focusare izoelectrică fiind pregătite
pentru a doua dimensiune, electroforeza pe gel de
poliacrilamidă în prezență de SDS (SDS-PAGE). În
acest caz, incubarea la fierbere este înlocuită printr-o
incubare la temperatura camerei într-un amestec format
din uree, 9M și Triton X-100, 20%.
Un alt agent de disociere foarte utilizat în disocierea probelor pregătite pentru
electroforeză este UREEA.
Denaturarea produsă de uree este dependentă de temperatură, pH și tărie
ionică. Pentru o denaturare completă, se utilizează uree cu o concentrație mai
mare sau egală cu 8M, alături de agenții reducători ai punților disulfurice. Totuși
există proteine care nu se pot denatura.
Avantajul utilizării ureei drept agent de denaturare constă în faptul că în
unele separări electroforetice ea nu afectează sarcina electrică intrinsecă a
proteinei permițând astfel o separare atât în funcție de masa moleculară cât și în
funcție de sarcina electrică. Efectul denaturant al ureei datorat ruperii legăturilor
de hidrogen inter și intramoleculare poate fi reversat prin îndepărtarea ei prin
dializă.
Dezavantajele utilizării sale constau în faptul că nu se poate determina cu
precizie masa moleculară, nu este la fel de eficientă ca SDS în disocierea
proteinelor. De exemplu, ureea disociază în proporție de 50% un lizat celular brut
(la electroforeză, 50% din lizat este agregat nefiind apt să penetreteze gelul) în
timp ce SDS disociază același preparat în proporție de 90%.
Unele proteine, pentru a fi disociate complet necesită prezența simultană
a SDS și a ureei.
Clorura de guanidină (guanidina hidroclorică) este, de asemenea, un
agent de disociere utilizat în disocierea probelor pregătite pentru
electroforeză. În concentrații de 4-6M, ea realizează ruperea legăturilor
necovalente provocând desfacerea structurii cuaternare și distrugerea
structurilor secundare și terțiare datorită capacității superioare de a
participa la stabilirea legăturilor de hidrogen. Majoritatea proteinelor în
guanidină hidroclorică au o conformație total dezordonată și din această
cauză este rareori folosită în separările electroforetice.
Disocierea completă a celor mai multe proteine se realizează prin
incubarea probei diluate în tamponul de migrare la 95-100oC (pe baie de
apă) timp de 2-5 minute în prezența atât a SDS în exces cât și a β-
mercaptoetanolului, ditioeritrolului sau ditiotreitolului (agenți utilizați la
reducerea punților disulfurice)

Mecanismul reducerii
punților disulfurice de către
tiocompuși. Coloana din
stânga: reducerea cu
monotioli (de tipul β-
mercaptoetanolului).
Coloana din dreapta:
reducerea cu ditioli ciclizabili
(cum ar fi ditiotreitolul, DTT).
Sferele întunecate reprezintă
suprafața proteinei.
Practic, testarea celui mai bun amestec de disociere se face prin
păstrarea constantă a concentrației proteice, a concentrației de
agent reducător (de obicei β-mercaptoetanol), și a concentrației
de detergent cu varierea timpului de incubare. Dacă rezultatul
este nesatisfăcător, se trece la varierea unui alt parametru dintre
cei arătați mai sus.

În procedura Laemmli (1970) probele pregătite pentru electroforeză pe gel de

poliacrilamidă în prezență de SDS (SDS-PAGE) se prepară în tampon Tris-HCl, 0,0625
M, pH 6.8, SDS, 2%, β-mercaptoetanol, 5%, glicerol, 10%, și aproximativ 0,025%
(greutate/volum) colorant de monitorizare a migrării, albastru de bromfenol.
 Este de preferat a se prepara un stoc de tampon pentru probă care să conțină toate
componentele cu excepția β-mercaptoetanolului, acesta adăugându-se chiar înainte de
utilizare. Glicerolul oferă probei o densitate care îi permite depunerea sa în godeul
gelului de separare aflat sub tamponul de migrare.
 Colorantul de migrare permite atât aplicarea probei cât și monitorizarea migrării
electroforetice (el migrează odată cu ionul frontal, adică odată cu frontul).
Cantitatea de detergent prezentă în tamponul probei este suficientă pentru
a asigura saturarea amestecului de proteine. În cazuri rare, când proba are o
tărie ionică foarte crescută (> 0,2 M), ea poate fi dizolvată în tamponul stoc al
probei (tamponul de încărcare) într-un raport de 1:1 (v/v), fiind totuși, mai
indicată o diluție într-un raport de cel puțin 1:4 (v/v).
 Cantitatea de proteină din proba care se încarcă pe un gel depinde de
metoda de detectare utilizată. Proteinele de interes care se încarcă pe gel
trebuie să fie într-o cantitate suficientă pentru a fi ulterior localizate.
Detectarea în geluri impune o cantitate de proteină/bandă de circa 1 µg
pentru a avea o vizibilitate uşoară a benzilor proteice colorate cu coloranţii
anionici, de tipul Coomassie Brilliant Blue R-250 sau de 0.1 µg de
proteine/bandă în cazul colorării cu argint.
 Electroforeza în condiții nedenaturante

În acest tip de electroforeză se păstrează conformația nativă a proteinelor,

interacțiile dintre subunități și activitatea biologică, separarea realizându-se pe
baza dimensiunii și sarcinii nete a proteinelor. În acest caz, se utilizează
detergenți neionici, în general nedenaturanți, folosiți la solubilizarea proteinelor
de membrană sau a altor proteine când se urmărește păstrarea activității
biologice.
Cel mai cunoscut detergent neionic utilizat în electroforeză este Triton X-100,
care din punct de vedere structural este o polioxietilenă, cu structura chimică
prezentată alăturat (unde n=10). În scopul deslușirii mecanismului molecular de
legare, s-a studiat interacția detergent-proteină. Astfel, Triton X-100
interacționează hidrofob cu unele proteine precum albumina serică bovină
(BSA), albumina serică umană, β-lactoglobulina, în timp ce alte proteine nu
leagă acest detergent (mioglobina, imunoglobulina G umană, etc.). S-a constatat
că BSA are 4 situsuri de legare a Triton X-100, nefiind însă o legare cooperativă
(prezentă la legarea cu SDS), probabil, datorită concentrației micelare critice
relativ mici. Avantajul utilizării Triton X-100 derivă din capacitatea de solubilizare
a proteinelor de membrană, iar în general, sunt preferați detergenți cu o
concentrație micelară critică mai mică de 1 mM.
 SISTEME TAMPON
Deşi cunoştinţele cu privire la proprietăţile geluri sunt
relativ modeste, se cunoaşte destul de mult despre
comportamentul ionilor din tampoane în condițiile
aplicării unui câmp electric. Astfel, au fost concepute o
serie de sisteme tampon interesante si utile, astfel încât
există o mare flexibilitate în alegerea sistemului de
tampon
Tamponul de electrolit, evident, are un efect profund asupra
migrării electroforetice. Tipul de tampon utilizat conduce la stabilirea
condiţiilor intensității câmpului electric aplicat şi afectează separarea şi
de aici rezoluţia. Proteinele diferă foarte mult în sensibilitatea lor la
tării ionice, specii ionice, pH, şi necesitățile lor în cofactori (dacă sunt
enzime). Astfel, sistemul de tampon utilizat este în funcție de proba
care urmează a fi separată electroforetic.
Tamponul ales pentru separarea proteinelor prin electroforeză
nativă (nedenaturantă) de multe ori depinde mai mult de tipul
proteinelor luate în studiu decât de cerințele electroforetice.
Sistemele electroforetice în care ionii unei singure soluții tampon
sunt prezenți în probă, gel și compartimentul electrozilor
(concentrația lor putând fi diferită) la un pH constant se numesc
SISTEME TAMPON CONTINUE. Un sistem continuu de tampon se
poate utiliza pentru separarea acizilor nucleici şi a proteinelor la
concentraţii de aproximativ 1 mg/ml sau mai mare. În acest caz, în tancul
electroforetic se folosește acelaşi tampon, la un pH constant, ca și la
prepararea gelului. De asemenea, proba este încărcată direct pe gelul unde
se va produce separarea electroforetică. După cum moleculele vor migra
prin porii de gel, acestea sunt fracţionate în funcţie de mobilitatea lor.
Lățimea benzilor este determinată în principal de volumul probei aplicate,
acest parametru limitând rezoluția în sistemele continue de electroforeză.
Probe diluate necesită volume mari pentru a furniza cantităţi detectabile de
material, obţinându-se benzi relativ largi. Utilizarea gelurilor de
dimensiunea porilor constantă, limitează sistemele continue la probe cu o
concentrație mare de proteine care conduc astfel la cele mai bune rezultate.
De obicei gelul are porii suficient de mici pentru a permite separarea în
funcție de dimensiunile macromoleculelor proteice.
Unele proteine plasmatice și celulare se pot separa mai bine în geluri de
poliacrilamidă cu gradient de concentrație în sistem continuu, viteza
de deplasare a proteinelor descrescând în timp și ajungând zero, odată cu
atingerea limitei lor de por. În acest fel, crește rezoluția de separare,
electroforeza cu limită de pori fiind foarte valoroasă pentru separări de
proteine pe baza masei lor moleculare.
Se poate spune că într-un gel omogen separarea
macromoleculelor se realizează în funcție de sarcină electrică și masă
moleculară, în timp ce într-un gel cu gradient de concentrație, separarea
macromoleculelor se realizează în funcție de masă moleculară.
De exemplu, într-un gel omogen cu T%=7,5 α1-antitripsina are o
mobilitate mai mică decât albumina, migrând după aceasta, într-un gel în
gradient de concentrație, α1-antitripsina (MM=54.000 Da) va migra în fața
albuminei (MM=68.000Da).
Folosind geluri de poliacrilamidă cu gradient liniar de
concentrație (gradient de pori) %T=3-30, %C=3,8, în sistem de tampon
continuu, se constată că distanța de migrare (D) este proporțională
cu logaritmul timpului de migrare după relația:
unde a reprezintă panta dreptei iar b este intersecția cu abcisa

Dreapta de regresie utilizată la calculul

masei moleculare a unei macromolecule
după electroforeză pe geluri cu gradient
de concentrație a porilor.

Există o relație liniară între logaritmul masei moleculare și

logaritmul pantei dreptei de regresie, dată de relația:

Această formulă este utilizată la calculul masei

moleculare a unei proteine studiate.
Îmbunătățirea puterii de rezoluție s-a realizat odată cu introducerea sistemelor de tampon
discontinue. Altfel spus, aceste sisteme sunt concepute pentru a accentua zonele probei pentru
separări de înaltă rezoluție. Sistemele de tampon discontinue (sau multifazice) utilizează ioni
de tamponare diferiți în gel şi în soluţiile de electrozi. ÎN ELECTROFOREZA ZONALĂ
MULTIFAZICĂ, DISCONTINUĂ, probele sunt aplicate pe un gel cu porozitate mare,
gelul de concentrare (stivuire), care serveşte ca și un mediu anticonvectiv. Toate speciile
ionice, inclusiv moleculele din probă, formează fronturi în mişcare.
 Ionii din tamponul de gel, formează un front de ioni care se mişcă înaintea moleculelor
de probă.
 Ionii din tamponul de electrozi formează un front care se mișcă în spatele probei.
 Ionii din probă (macromoleculele cu sarcină electrică) dintre fronturile de tampon se
concentrează (”se stivuiesc”) în zone extrem de îngustă aranjate în ordinea descreșterii mobilităţii
lor. Moleculele din probă se concentrează (se stivuiesc) rapid, în regiuni foarte înguste, nu mai
mari de câteva sute de microni, cu conţinut proteic ridicat, de circa 100 mg/ml proteină.
 Probele (macromoleculele) stivuite se vor deplasa prin pori mari ai gelului de stivuire
ca zone individuale foarte înguste, indiferent de volumul de probă iniţial, şi intră în gelul
restrictiv de rezolvare (sau de separare), gel cu o dimensiune mică a porilor, în serii foarte
înguste aflate la distanțe mici, unele de celelalte. Odată ajunse în gelul de rezolvare, cernerea
devine predominantă şi macromoleculele de probă "se destivuiesc" şi se separă, în funcţie de
mărimea şi sarcina lor electrică.
 Sisteme de tampon discontinue

Ornstein (1964) şi Davis (1964) au dezvoltat pentru prima dată sisteme

electroforetice pe gel de poliacrilamidă (PAGE) de înaltă rezoluţie pentru
separarea proteinelor native. Sistemul propus de ei a fost atât de popular,
încât este încă utilizat pe scară largă. Acesta a fost conceput pentru analiza de
proteine serice, dar funcţionează bine pentru o gamă largă de tipuri de
proteine. Sistemul de tampon Ornstein-Davis este prima tehnică de încercat
atunci când se lucrează cu o probă nouă de proteine native. Ornstein a arătat
că o înaltă rezoluţie este atinsă atunci când zona de start a proteinelor din
probă este cât mai îngustă posibil. Astfel, el a conceput o metodă
electroforetică care comprimă zonele de proteină cu mult dincolo de limitele
atinse prin mijloace mecanice. Formularea lui se bazează pe ecuaţiile care
descriu fluxul de curent în soluţii ionice şi proprietăţile tampoanelor.
Ideea lui Ornstein a fost cea de includere a proteinele din
probă într-un tip de sandwich intim mărginit de două
fronturi de ioni de electroliţi care se deplasează în câmp
electric. Sub influenţa câmpului electric, proteinele din
probă devin comprimate între frontul de ioni conducător
şi cel de extremitate finală și segregă în zone învecinate,
în ordinea de mobilităţi lor relative. Acest proces are loc
în regiune gelului cu pori mari, de concentrare.
Proteinele din probă ajung la gelul de rezolvare într-o
bandă de start foarte subţire. Odată ce proteine trec în
gelul de rezolvare, predomină efectul de separare prin
cernere moleculară. Sistemul Ornstein-Davis, folosește
ioni de clorură drept ioni conducători, după cum ionii
glicinat sunt ioni finali, în ionul Tris este un ion
comun. Dintre componentele posibile disponibile în
momentul în care sistemul electroforetic a fost dezvoltat,
proprietăţile acestor tampoane au fost cele mai potrivite
pentru cerinţele procesului de electroforeză. În timp, prin
analize electrochimice s-au descris o serie de sisteme
tampon care se pretează separării electroforetice.
 Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în condiții
discontinue și nedenaturante după Ornstein-Davis.
Este instructiv de a considera evenimentele ionice care au loc în timpul electroforeză
discontinue, mai ales având în vedere popularitatea acestuia. Alte sisteme discontinue
funcţionează prin mecanisme similare.
Sistemul Ornstein-Davis, foloseşte la separarea proteinelor, două tampoane
diferite care conţin anioni diferiți şi un cation comun. Ionul clorură, prezent în gel
de când acesta este turnat, devine ion frontal iar ionii glicinat care provin din
tamponul de migrare (tamponul de electrozi) devine ion terminal. Ionul Tris,
comun, susţine electroneutralitatea. Cele mai multe proteine serice transport
sarcini negative nete în acest sistem şi migrează spre anod.
Sistemul Ornstein-Davis constă din patru părţi interdependente: (1) un gel de stivuire
(concentrare), (2) un gel de separare, (3) un tampon de electrod (de migrare), şi (4)
probă. Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris
de Ornstein-Davis sunt prezentate în figura următoare.
Gelul este format din două secțiuni (panel A), o porțiune cu porozitate mare (gelul de
concentrare) cu T%=4 este turnată peste gelul restricitiv de rezolvare (T%=5-30). Gelul
de concentrare conține tampon Tris-Cl, 0,125 M, pH=6,8, în timp ce gelul de separare
conține tampon Tris-Cl, 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele două zone
de gel este desemnată pentru a regla mobilitatea efectivă a ionului glicinat.
ei.
Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris de Ornstein-Davis

Etapele separării unui amestec de proteine în sistem discontinuu tampon Ornstein-Davis.

(A) gelul este format din două secţiuni. Un gel de concentrare cu pori mari aflat în parte
superioară este turnat peste un gel restrictiv de rezolvare (separare). Fiecare secțiune de gel
conţine tampon Tris-HCl, dar concentraţiile şi pH-urile celor două tampoane
corespunzătoare celor două secţiuni sunt diferite. Gelul de concentrație este indicat printr-o
nuanță de gri deschis în timp ce gelul de separare este de culoare gri-închis. Proba proteică
dizolvată în tamponul gelului de concentrare diluat este plasată în godeurile gelului de
concentrare (linii orizontale întunecate). Tamponul Tris- glicină de electrozi (culoarea
fondului figurii) este în contact cu partea de sus a gelului, partea de sus a probei, precum şi
partea de jos a gelului. Anodul este situat în partea inferioară a gelului iar catodul se află în
zona superioară, nefiind prezentate. În acest sistem proteinele serice de exemplu, au sarcini
nete negative şi se mișcă în jos spre anod. Ionii de Tris sunt distribuiți în întregul sistem şi
servesc la menţinerea electroneutralității. Intensitatea câmpului electric, E, la scurt timp
după aplicarea unei tensiuni electrice, este reprezentată în graficul din partea dreaptă a
imaginii de gel. Câmpul electric din gel, E este relativ scăzut, ca o consecinţă a
conductivitate relativ ridicată datorată ionilor de clorură, mobili.
(B ). În momentul aplicării unei tensiuni, constituenții anionici ai sistemului se
vor alinia în ordinea de mobilităţi lor electroforetice. Magnitudinea mobilității
ionului clorură (Cl-), în zona tamponului de gel este mai mare decât mobilitatea
ionului glicinat (Gly), provenit din zona tamponului de electrozi. Proteinele din
probă, cu mobilităţi intermediare, sunt introduse într-un sandwich (în ordinea de
mobilitatea lor) între frontul clorură şi frontul de ioni glicinat. Astfel, proteinele
din probă devin "stivuite" în regiunea foarte îngustă dintre cele cele două
fronturi de ioni de tampon în mişcare şi formează, spațial, o zonă foarte îngustă
de start. Intensitatea câmpului electric este influenţată de distribuţie locală a
purtătorilor de sarcină, care sunt proteinele din zona de probă. Intensitatea, E, a
câmpului în zone diferite care conțin ioni este ajustată, astfel încât toate
fronturile ionice migrează cu aceeaşi viteză. (C). La scurt timp după ce procesul
de concentrare este finalizat, proteinele din probă trec în gelul de rezolvare care
este prevăzut cu pori mai mici pori unde mișcarea este încetinită datorită
procesului de cernere moleculară. În gelul de rezolvare, ionii de glicinat
depășesc proteinele din probă şi vor migra chiar în spatele ionilor clorură. În
timpul etapei de rezolvare, proteinele vor răspunde la câmpul electric relativ
ridicat determinat de ionii glicinat din gel. Electroforeza continuă cu proteinele
din probă în tampon Tris- glicină, până când aparatul este închis.
Stivuirea. Când este aplicată o tensiune de curent, ionii clorură din secţiunile
de gel, proteinele anionice din probă, precum şi ionii de glicinat din zona
tamponului de electrod încep să se deplaseze spre anod (panel B). Tris-ul (o
bază), precum şi orice altă proteină cationică din probă migrează spre catod.
Aşa cum ioni de clorură părăsesc proba, în spatele lor se creează o regiune
localizată, de conductivitate scăzută și câmp înalt. Câmpul crescut din spatele
frontului de ion clorură accelerează proteinele din probă şi ionii de glicinat de
la tampon electrodului la aceeaşi viteză ca şi a ionilor clorură (Eµ=constant).
Gradul de ionizare a glicinei, la pH-ul tamponului de electrozi (pH=8,3) este de
aşa natură că mobilitatea efectivă a ionilor glicinat este mai mică decât ca a
ionului clorură şi a proteinelor din probă. (Mobilitatea efectivă a unei electrolit
slab este mobilitatea medie a formei ionizate; µef=µx, unde x este fracţiunea
de molecule ionizate la un pH specific iar µ este mobilitatea acestuia. Fiecare
moleculă poate fi gândită ca fiind ionizată x% din timp şi neionizată restul
timpului. pKa a glicinei este pH=9,8 iar la pH=8,3, moleculele de glicină sunt
disociate în proporție de 1/30 în ioni glicinat).
O regiune a frontului mobil se formează rapid cu ioni de clorură, frontali
și ionii de glicinat în spate, iar proteinele din probă sunt comprimate
între ele. Proteinele formează, zone individuale subțiri, așezate precum
fișicul de monede, în ordinea descrescătoare a mobilităţii, între ionul
conducător, clorură şi ionul de sfârşit, glicinat. În acest timp, pH-ul
gelului de concentrare devine 8,3 deoarece ionii de glicină se
deplasează prin acest gel. În stiva creată, fiecare zonă proteică se află
într-un câmp electric scăzut care se mișcă în față și un câmp electric
ridicat aflat în spatele ei. Orice moleculă de proteină avansează în zona
din fața sa unde întâlnește un câmp electric cu intensitate scăzută, fiind
încetinită până când zona sa îl va prelua. Invers, o moleculă proteică
care provine spatele acestei zone este accelerată de câmpul electric
crescut de acolo. În starea de echilibru, fiecare dintre proteine este
concentrată într-o zona îngustă, de înaltă densitate, determinată
exclusiv de mobilitatea sa, în condiţii electroforetice.
Separarea. În cazul în care regiunile mobile se deplasează în ajung la
interfaţa dintre gelul de concentrare (stivuire) şi gelul de rezolvare, proteinele
vor fi încetinite accentuat datorită existenței porilor restrictivi ai gelului de
separare. În acelaşi timp, pH-ul este brusc crescut la o valoare de 8,8 şi
creşte rapid la un pH de 9,5 deoarece Tris-Cl se înlocuieşte cu tris-glicinat.
Mobilitatea efectivă a ionilor de glicinat la pH 9,5 este destul de mare și ca
atare depășește proteinele din probă care sunt încetinite în mișcare de către
porii gelului de rezolvare, migrând chiar în spatele frontului de clorură (x=1/3)
În aceste condiții zonele de proteine devin necomprimate şi încep să se
separe în benzi macroscopice prin cernere moleculară (panel C). In gelul de
rezolvare, proteine se mișcă la pH 9,5. pH-ul de operare a gelului de
separare, egal cu 9,5 a fost introdus în sistemul Ornstein-Davis pentru a
asigura o mobilitate eficientă a glicinatului, mai mare decât cea a celei mai
rapide proteine serice (prealbumina) în geluri cu %T=7,5. După cum are loc
progresul migrării, benzile proteice, inițial foarte subțiri se lățesc într-un ordin
de milimetrii, drept consecință a difuziei și diluției.
 Principiul electroforezei pe gel de
poliacrilamidă în sistem discontinuu.
Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în condiții discontinue și denaturante
după protocolul descris de Laemmli.

Laemmli (1970) a modificat sistemul Ornstein-Davis, pentru a permite

determinări ale greutate moleculară. Sistemul Laemmli conține SDS 0,1% în
tampoanele Ornstein-Davis şi utilizează o etapă de denaturare prin tratament termic
a probei. Tratamentul este conceput pentru a denatura complet proteinele de probă
în componentele lor polipeptidice constitutive înainte de electroforeză.
În momentul în care un amestec de proteine se incubează într-un tampon
care conţine SDS (2%) şi un agent tiol reducător, cum ar fi 2-mercaptoetanolul
(5%) la temperatură, proteinele sunt complet denaturate iar polipeptidele rezultate,
datorită SDS-ului, se încarcă cu o sarcină negativă uniform, în raport cu masa lor.
Agentul de reducere rupe legăturile disulfurice între segmentele proteinelor native,
în timp ce SDS, un denaturant bine-cunoscut, îmbracă polipeptidele uniform, cu 1,4
g de SDS pe gram de polipeptid. Proprietăţile detergentului ecranează proprietățile
polipeptidelor. Toate complexele SDS-polipeptide iau o formă similară prelungită,
asemănătoare unei vergea, cu dimensiuni proporţionale cu greutatea lor moleculară.
În plus, densitatea de sarcină a complexelor SDS-polipeptidă este independentă de
pH în intervalul 7-10 și astfel fracţionarea în gel este guvernată strict de procesul
de cernere moleculară, astfel încât prin utilizarea acestui sistem se poate la estima
greutățile moleculare ale polipeptidelor separate.
 O serie de tipuri de proteine nu se comportă într-un mod aşteptat în cursul
SDS-PAGE. Proteinele incomplet reduse, cu unele punți intra- sau intermoleculare
disulfurice intacte, nu sunt saturate cu SDS, deoarece o parte din domeniile lor de legare
a SDS nu sunt disponibile la detergent. Glicoproteinele şi lipoproteinele nu sunt, de
asemenea, saturate cu SDS, deoarece componentele lor neproteice nu interacţionează cu
detergent. Proteine care conțin secvențe neuzuale de aminoacizi, în special cele cu un conținut
crescut în resturi de lizină sau cele cu un conţinut crescut în resturi de prolină, proteinele foarte
bazice şi cele foarte acide se comportă anomal în SDS-PAGE, probabil pentru că raportul
sarcină electrică/masă a complexelor SDS-polipeptidă sunt diferite de cele care ar fi de
aşteptat, dată pentru dimensiunea lor. În mod similar, complexele foarte mari SDS-proteină, cu
mase moleculare de sute de kilodaltoni, ar putea avea conformații anormale.
Polipeptidele mai mici de aproximativ 12.000 Da nu sunt rezolvate bine în cele mai
multe sisteme SDS-PAGE. Complexe SDS-polipeptidă mici, fie au aceleaşi conformație
aproximativ sferică, fie nu pot fi separate de zona de micele de SDS pur care se formează în
spatele frontului de ioni conducători.
Sistemele electroforetice descrise de Laemmli și Ornstein-Davis pot fi utilizate la
separarea atât a proteinelor cât și a acizilor nucleici. În cazul separării acizilor nucleici, este
totuși preferat sistemul Laemmli deoarece în cazul acestei tehnici, prezența SDS conduce la
denaturarea nucleazelor contaminante.
 ESTIMAREA MASEI MOLECULARE PRIN SDS-PAGE

În procedura descrisă de Laemmli, tratamentul probei anterior SDS-PAGE conduce la

desfacerea proteinelor în subunităţile lor componente şi lasă subunităţile acoperite cu detergent
anionic. Mobilităţile electroforetice ale tuturor complexelor polipeptidă-SDS rezultate își asumă
aceeaşi relaţie funcţională în referitoare la masa lor moleculară. Într-o primă aproximare, vitezele
de migrare a derivaților SDS sunt invers proporţionale cu logaritmii maselor lor moleculare. SDS-
polipeptidele, astfel, se vor deplasa prin geluri într-un mod previzibil, complexele cu masă
moleculară mică vor migra mai repede decât cele mari. Aceasta înseamnă că masa moleculară a
unei proteine poate fi estimată din mobilităţile relative ale subunităţilor sale în SDS-PAGE, calibrat.
Estimările de masă moleculară sunt printre aplicaţiile cele mai des folosite de electroforeza pe gel
şi reprezintă o parte a popularității SDS-PAGE prin metoda Laemmli.

Masele moleculare sunt determinate în SDS-PAGE prin compararea mobilităţii proteinei de

testare cu mobilităţile unor proteine marker cunoscute. Parametrul relevant este
mobilitatea relativă, Rf, definită ca mobilitatea a unei proteine raportată la mobilitatea
frontului de ioni. Acest parametru permite normalizarea mobilităţilor la o mărime
măsurabilă semnificativă şi caracteristică. Mai degrabă decât a determina mobilităţi, este
suficient să se calculeze Rf ca raportul dintre distanta parcursa de o proteina din partea de
sus a gelului de rezolvare împărţit la distanţă de migrare a frontului de ioni. Deoarece
frontul de ioni este dificil de a localiza, în practică, mobilităţile sunt normalizate la colorant
de urmărire care migrează doar puţin în spatele frontului de ioni:
Graficul log M vs Rf construit
din distanţele de migrare a
standardelor conduc la
calibrarea curbei gelului.
Valorile Rf ale proteinelor de
testat sunt apoi comparate cu
cele ale standardelor.
Interpolarea valorilor Rf ale
proteinei de testat pe curba
standard oferă masa ei
moleculară aproximativă
Curbă de calibrare, logMr vs. Rf plotată cu o serie de markeri
de masă moleculară cuprins în domeniul 10.000-200.000Da,
separați pe un gel omogen (T%=10% și C%=2,75%) de
poliacrilamidă în prezență de SDS. Se poate observa deviația
de la linearitate. Proteinele marker sunt (masa moleculară,
Mr fiind dată în kDa): miozină (194); RNA polimerază
(subunitatea β) (160); β galactozidază (116); fosforilază B
(94); RNA polimerază (subunitea β) (95); albumină serică
bovină (68); ovalbumină (43); RNA polimerază (subunitea
σ) (38,4); anhidrază carbonică (30); tripsinogen (24.5); β-
1actoglobulină (17,5); lizozim (14,5).
Curbele standard sunt de fapt în formă sigmoidală. Liniaritatea aparentă a
curbei standard nu poate acoperi însă, întreaga gamă de mase moleculare
pentru un amestec de proteine separate într-un gel particular. Cu toate
acestea, log M este suficient de aplatizat, într-un sens matematic, pentru a
permite estimări în masă moleculară destul de exacte care urmează să fie
făcute prin interpolare, şi chiar şi prin extrapolare, peste domenii relativ
mari. Intervalele aproximative utile a gelurilor după SDS-PAGE pentru
estimări de masă moleculară sunt după cum urmează: pentru mase
moleculare din domeniul 40.000 la 200.000 Da, geluri cu T%=7,5%; pentru
mase moleculare din domeniul 30.000 la 100.000, geluri cu T%=10%;
pentru mase moleculare din domeniul 15000 la 90000 Da, geluri cu
T%=12%; pentru mase moleculare din domeniul 10.000 la 70.000 Da,
geluri cu T%=15%.
Amestecuri de proteine standard cu masă moleculară cunoscută sunt
disponibile în comerţ pentru calibrarea geluri în vederea electroforezei
proteinelor.
 Markeri de masă moleculară utilizați în SDS-PAGE

• Este important a avea la îndemână o gama largă de markeri de

masă moleculară, astfel încât să se exploreze orice dimensiune a
unui polipeptid. Aceștia ar trebui să suficienți pentru cele mai multe
scopuri, deoarece se întind pe un interval de aproximativ 1000 de
ori a masei moleculare (deşi markeri cu masă mai mică de 10 kDa
sunt rar folosiți).
• Kit-urile care acoperă intervale de masă moleculară limitate sunt, în
general, disponibile din mai multe surse comerciale De exemplu, se
oferă trei seturi de markeri denumiți markeri pe un domeniu scăzut,
pe un domeniu mare şi markeri pe o gamă largă, pentru a fi utilizate
ca standarde pentru separaţii de proteine în intervale cuprinse între
14.000-90.000 Da, 45.000-200.000 Da, respectiv 6.500-200.000
Da. Dacă aceștia nu sunt de ajuns, se poate pregăti o serie proprie
prin reticularea catenelor polipeptidice ale unor proteine mici (de
exemplu, lizozim, hemoglobină, albumină serică bovină).
Hartă de migrare a proteinelor pe gel. Poziția relativă a proteinelor standard sunt
prezentate pentru o serie de geluri, după separare în SDS-PAGE, procedura Laemmli.

Este ușor să se aleagă concentrațiile optime ale gelului (%T) necesar separării proteinelor mai ales pentru SDS-
PAGE decât pentru cele separate prin electroforeză în condții native pentru că separarea complexelor proteină-
SDS este în principal dependentă de lungimea catenei polipeptidice. Astfel, gelurile Laemmli cu T=7,5% rezolvă
proteine din domeniul de mase moleculare cuprinsă între 40 și 200 kDa, în timp ce gelurile T=10% rezolvă
proteinele cu greutate moleculară cuprinsă între 20 și 200 kDa, gelurile cu T=12% rezolvă proteinele cu greutate
moleculară cuprinsă între 15 și 100 kDa, iar gelurile cu T=15% rezolvă proteinele cu greutate moleculară
cuprinsă între 6 și 90 kDa
 ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ ÎN GRADIENT DE
POROZITATE
Migrarea macromoleculelor într-o matrice de gel cu o concentraţie continuu variabilă
(ceea ce semnifică un gradient de porozitate), are ca efect compactarea zonelor de
proteine de-a lungul direcției de migrare, astfel că banda proteică, traversează
concentrații din ce în ce mai mari de gel, iar viteza sa de migrare scade continuu. Acest
proces conduce la o îngustare progresivă a benzii proteice. Există şi alte motive pentru a
recurge la geluri de porozitate gradată.

Principiul tehnicii este prezentat în figura alăturată, când,

după o separare electroforetică în timp suficient (de cel
puţin 10 kV•h) pentru ca mobilitatea proteinelor să fie
constantă şi în cele din urmă să înceteze pentru că fiecare
element constitutiv al probei să ajungă într-o regiune a
gelului cu o densitate la care dimensiunea medie a porilor
se apropie de diametrul proteinelor (limita de pori). Astfel,
raportul dintre distanţele de migrare a unei proteine cu cea
a oricărui alteia devine o constantă, după ce au intrat toate
într-o regiune a gelului în care acestea sunt supuse unor
condiţii de cernere drastică. Din această cauză profilul
electroforetic devine constant după o migrare prelungită
într-un gel cu gradient de concentrație. Concentraţia de
gel, la care rata de migrare pentru o proteină dată devine
constantă se numeşte limită de pori: dacă acest porozitate
marcată în mod corespunzător cu ajutorul unui set adecvat
de proteine marker, atunci este posibil să se coreleze
distanţa de migrare a oricărui element constitutiv în
amestec cu masa sa moleculară.
Metoda descrisă pentru determinarea masei
moleculare după SDS-PAGE, folosind un gradient
linear de pori. Curba arată o relaţie liniară între
logaritmul masei moleculare și √D (D1/2) pentru o
serie de 34 de proteine standard care acoperă
domeniul de masele moleculare cuprinse între
13.000 și 95.000 Da, separate pe un gel în
gradient T%=3-30% (la un C% constant de 8,4%).
Schema unui sistem pentru turnarea gelurilor de
poliacrilamidă în gradient linear: A, dispozitiv bicameral de
formare a gradientului; B, rezervor; C, cameră de
amestecare; D, supapă; E, bară magnetică de agitare; F,
agitator magnetic; G, robinet; H, pompă peristaltică; I,
tubulatură; J, casetă de turnare a gelului placă vertical.
 Calitatea gradientului generat poate fi verificată prin adăugarea
unui colorant, cum ar fi p-nitrofenolul sau albastru de bromofenol
într-unul dintre rezervoare şi apoi de scanarea gelului cu un
densitometru.

În cazul în care se are în vedere

turnarea simultană a unui număr de
geluri placă verticale

Reprezentarea schematică a unui

aparat pentru prepararea unui număr
de geluri de poliacrilamidă cu gradient
liniar de pori: A, sistem de producere a
gradientului; B, rezervor (concentrație
mare de monomeri, T% mare); C,
cameră de amestecare (concentrație
mică mare de monomeri, T% mică); D,
valvă; E, bară magnetică; F, agitator
magnetic; G, robinet de închidere; H,
pompă peristaltică; I, casetă de
turnare a mai multor copii de geluri
verticale.
 Limitele concentrației aleasă pentru gradient depinde de compoziția probei ce
urmează a fi separată. Gradienți de tipul 4-24, 4-26, 4-30, 2-30% etc., sunt considerați
în general mai potriviți a se utiliza pentru cele mai multe probe proteice (de exemplu
proteine serice, proteine urinare, etc.), deși, dacă electroforeza este prelungită este
posibil ca proteinele cu Mr în jur de 30,000 Da să migreze în afara gelului.
. Aplicații ale electroforezei pe geluri de poliacrilamidă în gradient de
porozitate
Electroforeza în gradient de pori în prezența SDS poate rezolva, o gamă largă de proteine
într-un domeniu mare de masă moleculară. Prin urmare, asocierea dintre focalizare
izoelectrică şi electroforeza în gradient de pori în prezență de SDS maximizează numărul de
proteine identificate într-un gel după o singură separare bidimensională. Pentru a obţine pI-ul
și masa proteinelor native, se utilizează în prima dimensiune focalizarea izoelectrică în
absența ureei urmată de electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante

În cazul unei proteine multimerice, parţial purificate, numărul de subunități şi masa
moleculară a subunităţilor sunt analizate simultan prin electroforeză 2-D cu electroforeza în
gradient de pori pentru prima dimensiune și SDS-PAGE pentru a doua dimensiune. După o
primă electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante, poziţia proteinelor
multimerice în gel este determinată prin teste specifice acestei proteine pentru estimarea
masei sale moleculare native, după care proteina multimerică este disociată în subunităţile
sale prin tratament cu SDS. Masa moleculară a fiecărei subunități este determinată prin
electroforeză pe gel de poliacrilamidă în prezență de SDS iar numărul de subunități dintr-o
proteină nativă complexă se calculează din aceste valori.
Au fost descrise alte aplicații ale electroforezei în analiza lipoproteinelor, inclusiv
lipoproteinelor cu densitate mare (HDL) precum și a lipoproteinelor cu densitate mică
(LDL). În cele mai multe laboratoare de analiză specializată, metodele uzuale de
separare și analiză a lipoproteinelor din ser sunt cele de ultracentrifugare în gradient de
densitate. Un dezavantaj al acestei metode constă din necesarul unui echipament scump
şi personal cu experienţă, în timp ce separarea și analiza acestora prin electroforeză în
gradient de pori este o metodă relativ simplă, necostisitoare, şi sensibilă pentru
detectarea subfracțiilor lipoproteice dintr-un volum mic de ser. De altfel, electroforeza
în gradient de pori în condiții nedenaturante separă lipoproteinele, pe baza diferenţelor
de dimensiune a particulelor şi astfel poate oferi în mod direct dimensiunea particulelor,
în timp ce separarea ultracentrifugarea în gradient de densitate se bazează pe diferenţa
de densitate, parametru indirect, dependent de dimensiunea particulelor. Dacă, înainte
de electroforeză, în cazul în care lipoproteinele din probă sunt precolorate printr-o
tehnică de colorare a lipidelor (colorare cu negru de Sudan B, de exemplu) migrarea lor
poate fi monitorizată în timp real. De exemplu, HDL poate fi fracţionată în 14 subclase
prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante.
În plus faţă de interacţiunea funcţională a proteinelor sau a subunităţilor
acestora, reacțiile antigen-anticorp sunt analizate după separarea prin electroforeză
în gradient de pori în condiții nedenaturante. Mobilitatea unui complex de antigen-
anticorp este mai lentă decât cea a unei molecule singulare de antigen. Mai mult
decât atât, un complex al unei molecule de antigen şi doi anticorpi monoclonali
care recunosc doi epitopi distincți migrează mai lent decât un complex format
dintr-un antigen şi un anticorp monoclonal. Prin urmare, prin electroforeză în
gradient de pori în condiții nedenaturante se poate determina dacă două anticorpi
monoclonali împotriva acelaşi antigen recunosc epitopi diferiți sau identici, și
astfel este posibil realizarea unui studiu de cartografiere a epitopilor prin
electroforeză pe gel.
se poate realiza de asemenea, studiul complexelor ADN-proteine. În analiza de
modificare a mobilității electroforetice (electrophoretic mobility shift assay,
EMSA), electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante are o capacitate
de rezoluţie înaltă şi este utilă pentru analiza complexele ADN-proteine care
conțin proteine diferite ori pentru detectarea unor proteine de legare a de ADN
mutanți.
ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ ÎN PREZENȚA
BROMURII DE CETIL-TRIMETIL-AMONIU
Cationic Electrophoresis
În cazul în care, în loc de încărcarea negativă cu SDS, se utilizează o
încărcare pozitivă a proteinelor cu detergenți de tipul bromurii de
cetiltrimetilamoniu (CTAB), sarcina negativă a glucidelor se
neutralizează prin legarea suplimentară a unor molecule de detergent.
Acest proces conduce la obținerea unor benzi mai clare. CTAB este
cunoscut că solubilizează proteinele foarte eficient şi a fost folosit pentru
izolarea unor proteine "dificile"
În CTAB-PAGE proteinele se deplasează spre polul negativ, mai
degrabă decât spre electrodul pozitiv și ca atare trebuie utilizat un
sistem diferit de tamponare.
2D-CTAB/SDS-PAGE este o tehnică de electroforeză bidimensională în gel, potrivita
în special pentru separarea unor proteinele membranare.
Prin aceasta tehnica, se pot analiza chiar și acele proteine cu pI puternic bazic
deoarece CTAB este un detergent cationic care stabilizează sarcini pozitive în afara
regiunilor hidrofobe ale proteinelor membranare, ceea ce conduce la menținerea lor
în soluție iar separarea se realizează funcție de dimensiunile lor. Efectul de
stabilizare este susținut de un pH acid.
În plus față de acest efect, condițiile acide conduc la o eliminare parțială a
proteinelor solubile.
ELECTROFOREZA NATIVĂ PE GEL DE POLIACRILAMIDĂ ÎN PREZENȚĂ
DE COOMASIE BRILLANT BLUE
În ultimii ani, separarea de complexe proteice prin electroforeză nativă pe gel de
poliacrilamidă în prezență de CBB (Blue native PAGE, BN-PAGE) s-a dovedit a fi o
metodă dominantă în identificarea unor tulburări funcţionale prin analiză din
omogenate totale, ţesuturi, celule ori fracţiuni celulare. Metoda a fost utilizată la
determinarea greutății moleculare a complexelor proteice din intervalul cuprins între
10 şi 10.000 kDa. Au fost analizate cu succes mai ales complexele membranare
intrinseci de transfer a electronilor/protonilor din mitocondrii şi cloroplastele. Metoda
a fost combinată cu alte tehnici pentru a determina starea oligomerică, stochiometria,
activitatea enzimatică şi structura moleculară a complexelor multiproteice. Aşa cum
multe probe pot fi separate în paralel, într-o singură migrare electroforetică, printr-o
comparaţie directă a complexelor proteice se permite uşor identificarea unor tulburări,
ceea ce permite direcționarea spre analize funcţionale suplimentare. În proteomică,
separarea de înaltă rezoluţie de proteine este, în general realizată prin separări
bidimensionale (2-D), în conformitate cu punctul izoelectric al proteinelor (IEF-
PAGE) şi masa lor moleculară (SDS-PAGE). Aceasta ultimă tehnică de denaturare
separă sute de mii de proteine din probe complexe. Cu toate acestea, proteinele
hidrofobe de membrană sunt greu detectabile, după 2-D IEF/SDS-PAGE.
BN-PAGE reprezintă o strategie alternativă de separarea cu rezoluţie înaltă a proteinelor de
membrană şi de menţinere a funcţiei lor enzimatice. Metoda se numește nativă, deoarece cele
mai complexe de proteine separate își păstrează funcţiile enzimatice şi blue native, deoarece
separarea electroforetică se bazează pe proprietatea colorantului Coomassie blue G250
(CBB) de a se lega la proteine. BN-PAGE a fost descrisă pentru prima data în 1991 în cazul
separării complexelor de proteine membranare din lanţul respirator al mitocondriei umane.
 Astăzi, BN-PAGE reprezintă o alegere în cazul în care este necesară o
analiză a interacţiunilor proteinelor native de membrană, la o rezoluţie înaltă şi cu
randament sporit.
Importanţa biologică a interacţiunilor dintre proteine este dată de faptul
că proteinele se exprima în funcţie de gene în toate organismele vii. Proteinele sunt
molecule funcţionale care operează pe căi metabolice, de dezvoltare şi de reglare,
dintr-o celulă, ţesut sau dintr-un organism. Proteinele multiple sunt complexe
integrate, în scopul organizării lor în mai multe funcţii enzimatice. Complexe de
proteine, prin urmare, reflectă organizarea macromoleculară a stării celulare, care
reprezintă fundamentul în înţelegerea funcţiilor celulare. În practica proteomică,
obiectivul central îl reprezintă identificarea tuturor proteinelor prezente într-o stare
definită de dezvoltare a unui organism, ţesut, celuleă sau subfracție celulară şi de a
caracteriza modificările lor calitative şi cantitative, ca răspuns la schimbările de
mediu.
Pregătirea probei în vederea BN-PAGE. Blue native PAGE separă complexe ale proteinelor de
membrană în stare nativă. Pentru a obţine rezultate optime, pregătirea probelor reprezintă pasul
cel mai critic, din acest motiv toate treptele de prelucare se efectuează pe gheaţă. Pentru a mări
șansele de solubilizare a complexelor proteice și de creștere a stabilității lor, se are în vedere că
solubilitatea proteinelor depinde atât de natura probei, precum şi pe tipul de detergent şi de
concentrația acestuia, aceste variabile trebuind testate pentru oricare probă de interes.
Solubilizarea complexelor proteice. Membranele biologice sunt ansambluri complexe de lipide şi
proteine. Un compus lipidic este de obicei compus din două cozi hidrofobe de hidrocarbură
conectate la un cap polar. Lipidele sunt cel mai adesea aranjate într-o structură bistratificată cu
cozile hidrofobe alăturate iar capetele hidrofile ale acestora sunt îndreptate spre exterior.
Proteinele de membrană sunt încorporate în zonele hidrofobe ale bistratului membranar prin
interacţiunea lor cu faza hidrofobă lipidică. Proteine se adună în complexe multisubunitare pentru
a îndeplini funcţiile celulare în cadrul fazei de membrană.
Evoluția unui proces de migrare electroforetică prin BN-PAGE. Imaginile reprezintă trei puncte
caracteristice din perioada de timp de electroforeză prin BN-PAGE. Aparatul electroforetic constă din
anod (partea de jos) şi tancul rezervor de tampon catodic (sus, umplute cu tampon catodic, care conține
CBB, albastru), gelul se află situat între două plăci de sticlă (ca un sandwich) iar menținerea temperaturii
(la 4oC) se realizează printr-un sistem de răcire prin intermediul tamponului anodal în tot timpul
electroforezei. Tamponul din zona anodală este agitat pentru a menține o temperatură constantă. Înainte
de începerea electroforezei, tamponul catodal care conține CBB este completat în rezervorul cu tampon şi
probele sunt depuse în godeuri (săgeata de culoare albă, godeul probei, panelul 1, înainte de începerea
migrării). În timpul electroforezei, probele încărcate electric intră în gelul de concentrare (stivuire) şi după
un timp, colorantul Coomassie care se deplasează cu frontul ajunge la jumătatea gelului de separare. În
acest moment, complexele proteice încep să devină vizibile în gelul de separare. În acest moment,
tamponul cu Coomassie catodic se schimbă cu un tampon catodal incolor (săgeţile de culoare albă,
panelul 2, în timpul migrării). BN-PAGE poate fi oprită atunci când tampon colorat cu CBB pătată a ajuns
la sfârşitul gelului de separare şi separarea de complexe este finalizată (săgeţile de culoare albă, panelul
3, sfârșitul migrării)
BN-PAGE a complexelor de proteine membranare tilacoide.
Markerul de masă moleculară (MP) conține următoarele
proteine standard separate: tireoglobulină 696, feritină 440,
catalază 232, lactat dehidrogenază 140, şi albumină 67, kDa.
Din 1×108 cloroplastele de orz corespunzând la 400 µg de
proteină, au fost izolate plastide care au fost în continuare
lizate, iar membranele tilacoide au fost colectate prin
centrifugare. Proteinele membranare au fost solubilizate cu
dodecilmaltozid şi separate pe un gel de poliacrilamidă cu
gradient liniar de pori (6-12%), prin blue native PAGE (TM).
Linia a doua de gel a fost colorată cu CBB (CS). Pentru a se
determina activitatea diaforazei
NAD(P)H:plastoquinon:oxidoreductazei (asterisc pe partea
dreaptă a gelului), gelul din prima dimensiune, a fost incubat
în 50 mM tampon fosfat pH=8,0/EDTA, 1mM. Reacția de
culoare a fost iniţiată prin adăugarea a 0,2 mM NADH şi 0,5
mg/ml nitro blue tetrazoliu. Gelul s-a incubat în continuare
timp de 12 ore. Se evidențiază (prin săgeţi) două complexe
proteice care conţin clorofilă (AS) la o masă moleculară de
550 kDa (semnalul de sus, echivalent complexului PS I, LHC
I) şi un altul, la o masă moleculară de 120 kDa (semnalul mai
mic, echivalent complexului LHC II).
 ELECTROFOREZA NATIVĂ PE GELURI
DE POLIACRILAMIDĂ INCOLORE

nu este nimic altceva, decât un sistem de gel folosit în BN-PAGE, fără a utiliza
colorantul CBB

Pentru a evita o potenţială agregare a proteinelor de membrană din extractele de

detergent în timpul migrării electroforetice, se adaugă detergenţi blânzi la gelurile
native incolore (tabelul de mai jos)

Detergentul utilizat Proba biologică

Mitocondrie la mamifere
β-D-dodecilmaltozid Mitocondria la drojdii
Cloroplaste la plante (tilacoide)
β-D-decilmaltozid Mitocondrie la mamifere
β-D-octilglucozid Mitocondrie la drojdii
Triton X-100 Mitocondrie la drojdii
Nonidet P-40 Mitocondrie la drojdii
Lubrol Mitocondrie la drojdii
Digitonină Mitocondria la drojdii
Structura chimică a octilglucozidului (octil-
beta-D-glucopiranozid).
SEPARAREA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ
PRIN FOCALIZARE (FOCUSARE) IZOELECTRICĂ
IEF (isoelectric foccusing) este o tehnică electroforetică pentru fracționarea
compuşilor amfoterici în funcţie de pI-ul lor de-a lungul unui gradient continuu
de pH. In opozitie cu electroforeza zonala, unde mediul de separare posedă un
pH constant (tamponat) care stabilește o sarcină electrică constantă pe
suprafața moleculei și care conduce, în absența procesului de stivuire (cernere
moleculară) la o mobilitate constantă, sarcina electrică de suprafaţă ale unui
compus amfoter în IEF este într-o continuă schimbare, şi scădere, în funcţie de
curba sa de titrare, în timp ce trece de-a lungul unui gradient de pH până când
ajunge la o poziţie de echilibru, adică în regiunea în care pH-ul se potriveşte cu
pI-ul său.
Acolo, mobilitatea acestei molecule este egală cu zero iar molecula se
oprește. In unele sisteme, gradientul este creat şi menţinut, prin trecerea
unui curent electric printr-o soluţie de compuşi amfoterici, care au valori ale
pI-urilor apropiate pe o distanță care cuprinde un domeniu dat de pH.

Principiul focalizării izoelectrice. In alte sisteme, inainte de încărcarea probei, se

stabilește un gradient de pH. (A) Se încarcă proba și se aplică pe gel. Proteinele vor
migra în funcție de pH-ul lor izoelectric, localizare la care sarcina lor netă este nulă;
(B) Proteinele formează benzi electroforetice care pot fi excizate sau utilizate în
experimente ulterioare.
Din punct de vedere chimic, amfoliții transportori sunt acizi oligo-amino, acizi oligo-carboxilici,
disponibili comercial sub denumiri diferite. Există trei abordări de bază în sinteza amfoliților
transportori:
•abordarea Vesterberg, care implică o reacţie dintre oligo-amine diferite (tetra-, penta-şi hexa-
amine) cu acid acrilic;
•procesul de sinteză chimică propus de Soderberg și colab. care implică co-polimerizarea de
amine, aminoacizii şi dipeptide cu epiclorhidrină;
•abordarea Pogacar-Grubhofer, care a utilizează etilenimina şi propilendiamina pentru reacţii
ulterioare cu propansulfona, vinil sulfonatul de sodiu şi clormetil fosfonatul de sodiu.

Transportul electroforetic cauzează acestor AMFOLIȚI

TRANSPORTORI (Carrier Ampholyte, CA) stivuirea în
funcţie de pI-lor, astfel încât se realizează un gradient de
pH care crește de la anod la catod, și care este stabilizat.
La începutul unei migrării, mediul de separare are un pH
uniform, este egal cu pl-ul mediu al amfoliților
transportori. Astfel, cei mai mulți amfoliți au o sarcină
netă şi o mobilitate netă. Amfolitul cel mai acid migrează
în apropierea anodului și se concentrează într-o zonă la
care valoarea pH-ului său este egală cu pI, în timp ce cel
mai bazic amfolit se deplasează adiacent și în apropierea
catodului.
Un amfolit mai puţin acid migrează adiacent şi ușor catodal într-o zonă stablită
de pH-ul său și astfel toți componenții sistemului ating o stare de echilibru.
După finalizarea acestui proces de aranjare (stivuire), unii amfoliți transportori
tind să se deplaseze în zone cu pH mai mare sau mai mic prin procese de
difuziune în cazul în care sistemul nu se află într-un echilibru izoelectric. Dar,
aşa cum imediat ce aceștia intră în aceste zone, amfoliții transportori devin
încărcați electric iar tensiunea electrică aplicată îi forțează să se întoarcă
înapoi în poziţia lor de echilibru.

Formarea unui gradient de pH

-Amfolitii transportori sunt:
- molecule mici (300-1000 Da)
- compușii amfoteri (acizi&bazici) cu pI
distinct
- acționează ca agenți de tamponare
- Floteaza în gel
In camp electric se ordoneaza in functie
de pI
Denumiri comerciale: Ampholine,
BioLyte etc.
O diagramă a formării unui gradient de pH,
într-un câmp electric, cu ajutorul amfoliților
transportori. În momentul aplicării unui câmp
electric, amfoliții încărcați negativ migrează
spre anod, în timp ce aceia încărcați pozitiv
migrează spre catod iar viteza lor de migrare
depinde de mărimea sarcinii lor nete.
Moleculele de amfoliți transportori cu cele
mai mici valori ale pI migrează spre anod în
timp ce moleculele de amfoliți cu valoarea pI
cea mai mare va migra spre catod. Ceilalți
amfoliți se vor alinia în funcţie de pI şi vor
determina pH-ul mediului, creându-se astfel
un gradient stabil, unde pH-ul creşte treptat
de la 3 la 10, de exemplu. Cum amfoliții
purtători au o greutate moleculară mică, ei
posedă o viteză mare de difuziune în gel.
Acest fapt presupune că în momentul în care
difuzează mai departe de valoarea lor de pl,
ei sunt obligați din considerente
electroforetice de pH să migreze înapoi în
mod constant şi rapid. Procesul este
deosebit de important atunci când se
realizează gradienți de pH foarte plați,
deexemplu, cuprins între 4,0 şi 5,0, folosiți
pentru obținerea unei rezoluţii înalte
 Focalizarea izoelectrică cu gradienți de pH imobilizați (Immobilized pH
gradients, IPG)).

Se realizează cu tampoane, un set de şase acizi slabi şi baze neamfotere, având o

compoziţie chimică generală, CH2=CH-CO-NH-R, unde R reprezintă fie două grupării
carboxil diferite slab acide, cu pK-uri de 3,6 respectiv 4,6, sau patru grupări terţiare
amino, cu pK-uri de 6,2, 7,0, 8,5, şi 9,3 (disponibile sub denumirea comercială de
Immobiline, figura alăturată).

gradientii de pH imobilizați (IPG) sunt

realizati prin amestecarea a două tipuri de
de acrilamidă modificată chimic
(Immobiline), una cu având proprietăți de
tamponare acide și o alta cu proprietăți de
tamponare bazice.
 Gradienţii (Imobilinele) imobilizaţi de
pH sunt preparaţi prin amestecarea a
două soluţii de polimerizare diferite,
într-un sistem generator de gradient
asemănător celui utilizat la obținerea
gradienților de pori. În principiu, se
utilizează două soluţii care conţin
monomer de acrilamidă şi catalizatori
de polimerizare ai matricei de gel.
Imobilinele se utilizează în soluţii stoc,
cu concentraţii de 0,2 moli/L, soluția
mai densă conținând glicerol. Astfel, în
timpul reacției de polimerizare,
grupările carboxilat și amino se leagă
covalent la matricea liniară de gel

Reprezentarea grafică a unei rețele de

poliacrilamidă copolimerizată cu imobiline.
 STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DIN POLIACRILAMIDĂ
PRIN FOCALIZARE IZOELECTRICĂ

Proteinele, ca molecule amfotere, posedă sarcini nete pozitive, negative, sau neutre în
funcţie de pH-ul de mediului în care se află dizolvate. Sarcina per ansamblu a unei proteine
particulare este determinată de resturile de aminoacizi acizi sau bazici ionizabili de pe
catenele polipeptidice și de grupările protetice. Grupările carboxilice acide (-COOH), din
proteine sunt neionizate în soluţii acide şi disociază în formă anionică (-COO-), la valorile ale
pH-ului mai mari, de mai sus de pH=3,0. Grupările amino (-NH2) şi alți compuși de bază din
proteine, cum ar fi guanidinele, sunt neîncărcate electric la un pH alcalin, dar devin cationi la
un pH mai în jur de 10,0 (de exemplu,-NH3+). pH-ul la care o catenă polipeptidică disociază
este afectat de compoziția totală a proteinei și de proprietățile mediului în care se află
dizolvată. Ca urmare, fiecare grupare individuală ionizabilă dintr-o proteină are un punct
aproape unic de disociere.
Sarcina netă a unei proteine este suma algebrică a tuturor sarcinilor sale, pozitive şi
negative. După cum s-a mai amintit în acest capitol, există un pH specific pentru fiecare
proteină la care sarcina netă care o posedă este egală cu zero. Această valoare este
denumită pH izoelectric (pI) este o proprietate caracteristică fizico-chimică specifică fiecărei
proteine. În cazul în care numărul de grupări acide dintr-o proteină depăşeşte numărul de
grupări bazice, pI-ul proteinei va avea o valoare scăzută a pH-ului. Pe de altă parte, în cazul
în care numărul grupărilor bazice sunt mai numeroase decât cele acide, pl-ul va fi înalt.
Proteinele arată variaţii considerabile ale punctelor izoelectrice, dar valorile pl-urilor se
încadrează de obicei, în intervalul de pH cuprins între 3 și 10.
În general, IEF se efectuează în condiţii nedenaturante, fiind o tehnică de înaltă
rezoluţie. Deseori, rezoluţia a două proteine diferite se realizează la valori ale
pI-ului lor de doar 0,02 unităţi de pH, sau mai puţin. Din cauza acestei înaltei
rezoluţii, probe de proteine care par a fi omogene atunci când sunt testate prin
alte mijloace poate fi adesea separate în mai multe componente prin IEF. Astfel,
microheterogenitatea poate fi un indiciu dat de diferenţe în structura primară,
existența unor izomeri conformaționali, a unor diferenţele de tipuri şi de număr
de grupări prostetice, sau de denaturare a proteinei.

În funcție de proprietățile proteinei

(proteinelor) luate în studiu și în funcție de
scopul urmărit, trebuie avut în vedere:
- compoziția chimică, concentrația și
structura gelului (de poliacrilamidă ori
agaroză);
- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau
plat);
- condițiile de separare (IEF, CA-IEF).
 REZOLUȚIA DE SEPARARE ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ

Conform teoriei focalizării izoelectrice şi rezultatelor experimentale, diferenţa

de pI (ΔpI) între două benzi de proteine adiacente rezolvate prin această
tehnică este direct proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de pH
şi invers proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de tensiune
(intensitatea câmpului electric aplicat) conform relației:

ΔpI = (gradient de pH / gradient de voltaj)1/2

Astfel, în focalizarea izoelectrică, un domeniu îngust de pH şi o tensiune înaltă, aplicată, conduce

la o rezoluţie înaltă (un ΔpI mic). În plus faţă de aceşti doi factori, o rezoluţie bună este favorizată
de substanţe cu coeficienţi de difuzie scăzuți. De asemenea, vitezele ridicate de schimbare a
mobilităţii, cu un pH apropiat de punctele lor izoelectrice conduc la o rezoluție înaltă. Cele mai
multe dintre proteine îndeplinesc ultimele două criterii, dar aceşti factori nu sunt, desigur, sub
controlul experimentatorului. Schimbarea distanței dintre electrozi pentru o tensiune dată şi
alegerea unui domeniu de pH, va schimba în aceeaşi măsură atât pH-ul cât şi gradienţii de
tensiune, astfel încât, cu excepţia cazului în care intervalul amfoliților transportori sau tensiunea
electrică aplicată sunt de asemenea, modificați nu au drept consecinţă o modificare în rezoluţie.
APARATURA UTILIZATĂ ÎN FOCALIZAREA
IZOELECTRICĂ
 SEPARAREA PROTEINELOR PRIN
ELECTROFOREZĂ BIDIMENSIONALĂ PE GEL DE
POLIACRILAMIDĂ
PREGĂTIREA PROBEI ÎN VEDEREA 2-D PAGE

Pretratarea probelor în vederea 2-D PAGE implică solubilizarea, denaturarea şi

eliminarea completă a interacţiuniilor dintre proteine. Deşi este de dorit, nu există o
metodă unică de pregătire a probelor care poate fi universal aplicată din cauza
diversității probelor care sunt analizate prin electroforeză bidimensională. O procedură
ideală pentru solubilizarea probei în vederea 2D PAGE trebuie să conducă la
perturbarea tuturor complexelor proteice legate necovalent şi a agregatelor
polipeptidice din soluţii cu obținerea unor componente individuale. Cu toate acestea,
indiferent de metoda aleasă de preparare a probei, cel mai important aspect este cel
de reducere la minimum a modificărilor structurale ale proteinelor și care ar putea
conduce la spoturi artefactuale pe hărţile 2D. Probele care conţin uree nu trebuie să fie
încălzite deoarece, în acest caz, tratamentul termic poate conduce la procese de
carbamoilare a proteinelor datorită izocianatului format prin descompunerea ei, acest
proces generând o mare heterogenitate a proteinelor. În general, probele trebuie să fie
supuse unei minime manipulări și se păstrează pe tot parcursul, la rece
SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZA BIDIMENSIONALĂ PE GEL DE
POLIACRILAMIDĂ

Prima dimensiune a 2D PAGE implică separarea proteinelor prin focalizare izoelectrică

care se realizează pe geluri cilindrice (T=3-5%), turnate în tuburi de sticlă capilare (cu
diametrul intern de 1-1,5 mm) sau pe stripuri. În mod uzual, gelurile conţin uree 8 M şi
un detergent neionic sau zwitterionic. Detergentul inclus are de obicei o concentrație de
2% (masă/volum), aceasta putând fi adesea redusă până la 0,5% fără a afecta modul de
separare. Gelurile conțin de asemenea amfoliți sintetici transportori care generează
gradientul de pH-ul necesar procesului de separare într-o concentrație de 2%
(masă/volum). Din acest punct de vedere, sunt disponibili o varietate de amfoliți
sintetici, majoritatea acestora fiind potriviți în 2D PAGE.
Adesea este folosită o gamă amplă de amfoliți (pH 3-10), cu toate că, un amestec de
amfoliți dintr-un domeniu de pH=4-8 poate oferi, de multe ori, rezultate excelente după
cum în gelurile cilindrice utilizate în IEF, gradientul final de pH rareori se poate extinde
peste 7,5.
A doua dimensiune poate fi realizată fie pe sisteme orizontale, fie pe sisteme verticale.
Pentru set-up-urile orizontale, de laborator se pot utiliza geluri gata de utilizare ori
geluri de poliacrilamidă cu SDS (cu o grosime de 0,5 mm așezate pe un film GelBond
PAG) care sunt plasate pe placa de separare cu sistem de răcire a unităţii de
electroforeză orizontală.
Gelurile de poliacrilamidă supuse anterior separării prin focalizare
izoelectrică echilibrate, sunt plasate de-a lungul gelului care va fi
utilizat în a doua dimensiune. Scopul echilibrării gelurilor separate
în primă dimensiune prin focusare izoelectrică este cel de a pregăti
proteinele focalizate pentru transferul lor în a doua dimensiune a
gelului de SDS-PAGE. Această operațiune implică incubarea timp
de aproximativ 30 minute a gelului folosit la focusare într-o soluție
tamponată care conține SDS, uree și glicerol. Această operațiune
este necesară deoarece proteinele care au fost inițial separate pe
baza sarcinii lor electrice intrinsece trebuie să fie echilibrate cu un
detergent anionic care oferă sarcina electrică obligatorii separării
în cea de a doua dimensiune (proteinele focalizate la valorile lor de
pI sunt neîncărcate electric) și pentru a asigura ca masa
polipeptidică reprezintă caracteristica primară a separării în cea de
a doua dimensiune. Surfactantul anionic SDS este ales în acest
scop. SDS formează complexe cu proteinele într-un raport de
aproximativ 1,4 g SDS/g proteină, care supra-acoperă sarcina
intrinsecă a proteinei, acordând o sarcină electrică net negativă
complexelor SDS-proteină și dând astfel polipeptidelor
aproximativ aceeași formă hidrodinamică .
 Metode de disrupție a celulelor

Metoda de liză Procedura Aplicații

Liză osmotică Soluție hipoosmotică
Liză prin îngheț-dezgheț Mai multe cicluri de înghețare-încălzire
(de exemplu, înghețare cu azot lichid)
Liză cu detergenți Detergenți cationici/anionici
Liză enzimatică Digestie enzimatică a peretelui celular
(cu celulaze, de exemplu)
Sonicare Dezintegrare prin ultrasonicare
Măcinare Mojar cu pistil (măcinare cu nisip de
cuarț sau cu azot lichid)
Celule de presiune Presiune înaltă (French Press)
Omogenizare Moară de dezintegrare cu bile de sticlă
(bead-beater); dispozitiv de poterizare
Culturi de celule tisulare
Culturi de celule tisulare; multe procariote
Culturi de celule și celule fungice
Țesuturi de plante, celule fungice și
bacteriene
Țesuturi animale, celule bacteriene
Semințe de plante și rădăcini, țesuturi
animale, microorganisme
Microorganisme
Microorganisme, șesuturi vegetale sau
animale

Structura chimică a detergentului

Nonidet P 40 (4-Nonil fenil-polietilen
glicol). Alte denumiri ale acestui
compus: Imbentin-N/52, NP 40.
A B

Structurile chimice ale A, fenilmetilsulfonilfluorurii (PMSF); B,

Pefabloc SC (4-(2-Aminoetil) benzen sulfonilfluorură hidroclorică,
sinonim AEBSF hidroclorură); C, pepstatinei (X-Val-Val-Statil-Ala-
Statină).
 Echilibrarea gelurilor supuse focalizării
izoelectrice în detergent (SDS)

Transferul gelurilor de poliacrilamidă

supuse anterior separării prin focalizare
izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate
cu SDS în sistem orizontal

Transferul gelurilor de poliacrilamidă

supuse anterior separării prin focalizare
izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate
cu SDS în sistem orizontal
 Avantajele electroforezei 2D în studiile de proteomică care
nu sunt uşor furnizate prin abordări alternative include:
(1) maturitatea metodologiei;
(2) accesibilitatea;
(3) înalt transfer de probă;
(4) detectarea unor proteine post-translațional modificate,
inclusiv proteine fosforilate sau glicozilate;
(5) detectarea unor fragmente de proteine.

Este important să se recunoască limitele electroforezei 2D în

cazul proteomicii. Acest lucru este crucial pentru ca un
experiment să poată fi proiectat într-un mod corespunzător. În
plus este necesară concentrarea atenţiei asupra zonelor care
necesită o dezvoltare tehnică ulterioară
 (1) dificultăţile cu separarea proteinelor prin focusare izoelectrică la valori extreme ale pH-
ului (<3, >10), mai ales a proteinelor bazice care reprezintă o proporție semnificativă din
proteomul predicționat total în cazul celor mai multe organisme eucariote. Proteinele bazice au
tendinţa de a forma dungi pronunţate, mai degrabă decât pete discrete, din cauza efectelor
electroendosmotice, a migrării agenţilor reducători, precum ditiothreitolul şi datorită potenţialei
hidrolize a acrilamidei la valori bazice de pH. Aceste efecte pot fi parţial depăşite prin
alimentarea continuă cu DTT în timpul focalizării izoelectrice, combinat cu includerea de glicerol
sau izopropanol pentru a suprima electroendosmoza ori prin folosirea de agenți care impiedica
reformarea punților disulfitice.

(2) dificultăţi cu separarea prin focusare izoelectrică a proteinelor membranare,

hidrofobe;
(3) dificultăţi la separarea proteinelor foarte mici (<10 kDa) sau extrem de mari, cu
mase moleculare> 200 kDa;
(4) o insuficientă sensibilitate a detecției proteinelor. O provocare majoră pentru toate
tehnicile de proteomică este cea de dezvoltare a unor abordări analitice pentru a face faţă
gamei dinamice mare a proteinelor de expresie.
 VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI
BIDIMENSIONALE

Electroforeza bidimensională pe geluri de poliacrilamidă în sistem BN/SDS

Electroforeza bidimensională pe geluri de poliacrilamidă în sistem BAC/SDS

Structura chimică a detergentului cationic

clorură de benzildimetil-n-hexadecilamoniu
(BAC, 16-BAC) utilizat în BAC/SDS PAGE.
 Proteinele hidrofobe, precum proteinele legate de membrană, se separă într-o primă
dimensiune pe un gel acid la un pH=2,1 în prezenţa detergentului cationic 16-BAC, când
pironina Y este utilizată drept marker de migrare electroforetică și de finalizare a separării.
Urmează apoi o electroforeză în prezență de SDS. O rezoluţie decentă se va obține dacă profilul
de separare în 16-BAC diferă diferă în mod substanţial față de cel obținut în prezențșă de SDS.

Structura chimică a compusului Pironină Y,

utilizat ca marker de migrare și finalizare a
separării în BAC-PAGE.
 ELECTROFOREZA PREPARATIVĂ

recuperarea proteinelor dintr-un gel de poliacrilamidă este de o importanţă

crescândă. Pentru a obține o rezoluție și o recuperare optimă a
componentelor țintă prin aplicații preparative ale electroforezei pe gel este
necesară o alegere cu grijă a următorilor parametrii: compoziția și
concentrația gelului, dimensiunile lui, încărcarea probei, gradientul de voltaj,
durata electroforezei și viteza de migrare

1. amestecul de proteine (sau de alți macroioni) este în primul rând

separat prin migrare electroforetică pe un gel de poliacrilamidă; în
continuare zonele sunt localizate, decupate, mărunțite iar materialul
este apoi eluat sau eliberat din gel prin migrare electroforetică.

2. compușii care sunt separați pe un gel cilindric sunt lăsați să migreze

până la capătul gelului, într-o cameră de unde sunt eluați cu un tampon
de (eluție) transport către un monitor UV și în continuare către un
colector de fracțiuni. Tamponul de eluție poate fi livrat pentru sisteme
atât continue, cât și discontinue (eluție intermitentă).
 Electroeluția proteinelor din gelul de poliacrilamidă
Electroeluția, ca metodă de recuperare a proteinelor din geluri excizate, după PAGE, devine
din ce în ce mai populară datorită excelentei recuperări şi reproductibilității crescute, fără a se
utiliza un sistem ori un aparat scump.
Factorii care afectează recuperarea proteinelor din gel.
În tehnologia de electroeluție a proteinelor din gel, după PAGE, eficienţa de recuperare
depinde de:
(1) gelul de concentrare şi sistemul tampon (pH, putere ionică, prezenţa/absenţa agenţilor
disociativi) din PAGE;
(2) sistemul tampon pentru electroeluție, tensiunea aplicată şi timpul de eluţie
(3) natura proteinelor individuale care urmează să fie recuperate, de exemplu, pI şi masa
moleculară.
Condiţiile optime ale PAGE şi ale electroeluției ulterioare, nu sunt neaparat valabile pentru
toate proteinele. Ele depind de tipul de proteină motiv pentru care condiţiile corespunzătoare
fiecărei specie proteică trebuie să fie determinate individual, în experimente preliminare.
Alegerea concentraţiei de gel și sistemul tampon se examinează în detaliu pentru fiecare proteină.
 În general, sistemul de tampon pentru electroeluție este în concordanţă cu tamponul
pentru PAGE ori este oarecum modificat. Sistemele tampon pentru PAGE pot fi
clasificate în cele realizate pentru condiţii nedisociative ori disociative. În condiţii
nedisociative, în cazul în care proteina de interes își poate menţine, probabil, activitatea
biologică, natura intrinsecă a proteinei (pI, masa moleculară, hidrofobicitatea, etc.)
defineşte sarcina netă şi solubilitatea proteinei în mediul tampon dat. Prin urmare, ar
trebui să fie evitate utilizarea de tampoane de electroeluție la pH-uri din jurul pI a
proteinei analit, deoarece migrarea electroforetică a proteinelor încetineşte considerabil
la pI ca urmare a pierderii sarciniielectrice nete, iar uneori, multe proteine precipită în
matricea de gel, rezultând astfel un randament scăzut de protein extrasă, chiar şi după o
electroeluție prelungită.
Pentru o electroeluție eficientă a proteinelor, pH-ul tamponului de electroeluție
trebuie să difere cu cel puţin o unitate de pH față de pI-ul proteinei, atât timp cât se
conservă activitatea biologică în condiţiile date.
 Proceduri premergătoare electroeluției
Localizarea proteinei de interes
Pretratamentul gelului excizat- piesa excizată de gel
este scufundată în tampon de electroeluție şi
echilibrată pentru câteva minute, înainte de eluare
Metode de electroelutie
Capturarea proteinei eluate pe membrane
semipermeabile

Electroeluția în tuburi de dializă

 Metodă Probă și cantități (exemple) Tip PAGE Tampon de eluție Putere electrică
Membrană
Tub de dializă - + SDS fosfat de sodiu, 0,1M (pH=7,4)-SDS, 20-200 V (100mA)
0,1%
Verticală Hemoglobină/DNP-albumină; - SDS, T%=7,5% Tris, 12,5mM-glicină, 96mM 25-35 mA per tub
globulină marcată fluorescent, etc (pH=8,3) (140-180 V)
7-20 mg (cca. 2 ml)
Verticală dimer β-tubulină marcată + SDS, T%=5-10% 2.5 mM Tris-glycine (pH 8.3)- 1-2 mA per tub
fluorescent, etc. SDS, 0.1% (350-400V)
ca. 1 mg
Orizontală Proteine de membrană, colorate + SDS, T% = 8,75% Tris, 25mM- glicină, 192mM 10 V/cm (70 mA)
(Mr=3000-19000) (pH=8,3) – SDS, 0,l%
Pasaj H-2Kk radiomarcată (Mr=12000- + SDS, gradient, T% = 5- NEMb 50mM -acetat (pH 8.5)- 1 W (4-7mA)
68000) 20% 0.001% SDS

Pasaj proteină radiomarcată (Mr=65000) + SDS NH4HCO3, 50mM-SDS, 0,1% [Tris- 50 și 80V
1µg-1mg acetat, 50mM (pH=7,8) – SDS, 0,1%c]

Gradient discontinuu de ATP-citrat liază colorată și proteine + SDS Tris, 25mM-glicină, 75mM (pH=8,8) - 4,0 mA
conductivitate colorate DTEd 1mM-glicerol, 40%. Captare:
0,1-0,5µg (două fragmente de gel) NaCl, 2M
Stivuire în stare staționară Hormon de creștere uman - SDS, T%=6% Electroforeză zonală multifazică. 6-7mA/cm2, apoi 3-
radiomarcat Sistem tampon 2950.0.X 3,5mA/cm2

Stivuire în stare staționară, Proteina de legare a retinolului + SDS, T%=15% Le: NEM, 23mM- HCl, 10mM 4 mA per tub
cu Sephadex G-25 0,3-4mg (1-5ml) (pH=8,0);Tf: Tris, 30mM-6ACAg,
500mM (pH=9,1) –SDS, 0.1%
Sh: Tris, 3 mM-6ACA, 50 mM
(pH=9,1)- SDS, 0.1%

Stivuire în stare staționară, Albumină necolorată, etc. (cca. +/- SDS Pentru geluri alcaline, L: Tris, 378 250-300 V
cu ionului frontal 0,5ml de gel) mM – HCl, 124mM (pH=8,5)-
concentrat sucroză, 10%; T: Tris, 2,5mM-glicină,
10mM (pH=8,5)
 Eluţia acizilor nucleici din geluri de agaroză

Reprezentarea schematică a protocolului de extracție a fragmentelor de ADN

după electroforeză pe gel de agaroză
ELECTRODIALIZA PREPARATIVĂ A
PROTEINELOR DIN GELURI DE AMIDON

Prezentarea schematică a aparaturii

utilizate la electrodializa gelului de amidon.
Se observă sacul de dializă suspendat în
tamponul din rezervor. În detaliu se
prezintă fragmentele de gel de amidon
aflate într-un sac de tip plasă, introdus în
sacul de dializă
 GELURI COMPOZITE DE
AGAROZĂ/POLIACRILAMIDĂ
Deși cel mai mic procent de acrilamidă care permite gelificarea este de aproximativ
3% (concentrație sub care polimerul rămâne sub formă lichidă), în realitate, gelurile de
acrilamidă realizate cu mai puţin de 4% acrilamidă:bisacrilamidă sunt extrem de dificil
de manipulat. Cu toate acestea, tehnica PAGE în condiții nedenaturante s-a dovedit a fi
cea mai efectivă în caracterizarea unor interacții proteină-DNA ori interacţii proteină-
RNA, în mod clar datorită caracteristicilor de sarcină electrică favorabilă, adică,
datorită sarcinilor preponderent negative ale acizilor nucleici oligomerici. În astfel de
studii, activitatea potenţială de legare a DNA sau RNA de proteinele de recunoașter
este monitorizată ca o schimbare a mobilității electroforetice a acidului nucleic marcat,
fie izotopic, fie fluorescent

Reprezentarea schematica a unei matrice

compozită, agaroză-poliacrilamidă. Fibrele
groase de agaroză sprijină structura fragilă de
poliacrilamidă, foarte puțin concentrată. Astfel
de matrici compozite permit o rezoluţiei fină a
fragmentelor mai mici de acizi nucleici intr-un
interval mare mase moleculare
Demonstrarea tăriei mecanice a unui gel compozit.
 IZOTACOFOREZA
Izotacoforeza sau electroforeza de dizlocuire, după cum a fost denumită la un moment dat, este o
dezvoltare mai recentă a principiului descris în 1920, fiind o metodă de separare în funcție de
sarcina electrică. Ea se utilizează pentru separarea particulelor care se deosebesc în special prin
încărcătura electric netă și nu prin dimensiuni fizice, vitezele de separare ale fracțiunilor din
probă, după ce separarea este completă, când s-a atins o stare de echilibru, sunt egale, de unde și
denumirea acestei metode. În această tehnică electrolitul dintre cei doi electrozi nu este o
singură soluție uniformă, ci este formată dintr-o secvență discontinuă de soluții diferite
(figura de mai jos), în care ionii acestora migrează cu aceeași viteză (iso = egal, tachos = viteză,
phoresis = migrare).
Izotacoforeza este similară ”stivuirii”, concentrării în faza staționară sau
electroforezei zonale în sisteme multifazice. În practică, totuși se face distincție
între aceste metode. Concentrarea în faza staționară se realizează în două moduri:
•Concentrarea selectivă (selective stacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt incluse în fronul mobil, iar celelalte componente rămân în afara
acestuia (unstacked). Este de altfel cazul izotacoforezei;
•Excluderea selectivă (selective unstacking) prin care componentul/componentele
de interes sunt excluse selectiv din frontal mobil, iar celelalte componente sunt
incluse în acesta.
Utilizarea unui contraion comun de tamponare, care defineşte pH-ul şi, prin
urmare, mobilitatea efectivă precum şi ordinea de migrare a zonelor în starea
staționară, sub formă stivuită reprezintă o caracteristică a separării
izotacoforetice. Acest proces este de altfel reprezentativ sistemului
discontinuu de electroliți din stadiul de concentrare (stivuire) descris de
Ornstein (1964) şi Davis (1964). În ultimă instanță această procedură este un
proces de izotacoforeză. Totuși, în disc-electroforeză, analiza efectivă este
derivată din a doua etapă, care este o electroforeză zonală, procesul
izotacoforetic fiind folosit în acest caz, pur şi simplu pentru a concentra zonele
de proteine, în scopul îmbunătăţirii rezoluţiei de separare în etapa a doua, de
electroforeză zonală.
De multe ori prin izotacoforeză se subînțelege numai tehnica capilară, dar
procesul se poate realiza și în geluri de poliacrilamidă ori agaroză, geluri cu
porii mari, și în astfel de condiții se pot separa proteine cu masa moleculară
de până la 500.000 Da.
 CARACTERISTICILE PROCESULUI DE SEPARARE PRIN
IZOTACOFOREZĂ

 Migrarea tuturor ionilor se realizează cu aceeași viteză;

 Separarea componentelor se realizează sub un model de tren
ionic;
 Apariția efectelor de îngustare a zonei;
 Efectele de reglare a concentrației.
Principala pre-necesitate pentru o separare izotacoforetică este
sistemul dicontinuu de tampon care conține un electrolit frontal și
unul, terminal. Dintre anionii din probă care se doresc a fi
determinați anionii frontali trebuie să aibă cea mai mare mobilitate
iar anionii terminali trebuie să aibă cea mai mică mobilitate decât
componentele probei.
 Separarea componentelor printr-un model de tren ionic

Deoarece toți ionii sunt forțați să migreze cu aceeași viteză, tăria

câmpului electric este mai mare în aria ionilor cu mobilitate mai mică
și este mai redusă în domeniul ionilor mai mobili. În timpul acestei
migrații se formează zone pure alăturate ale probei alcătuite din
analiți individuali. La echilibru, ionul cu cea mai mare mobilitate
migrează în front, ceilalți migrând în spatele lui în ordinea scăderii
mobilității:
mL->mA->mB->mT-

unde m reprezintă mobilitatea, L-, simbolizează ionul frontal, T-, ionul

terminal, A- și B- fiind ioni din cadrul probei. Zona cu cea mai mare
mobilitate posedă cea mai mică tărie a câmpului electric, iar zona cu
cea mai mică mobilitate prezintă cea mai înaltă tărie ionică a
câmpului. Produsul tăriei ionice și a mobilității fiecărei zone este
astfel constant
Schema de principiu a unui ansamblu izotacoforetic de tip analitic
 APLICAȚII ALE IZOTACOFOREZEI

Izotacoforeza este utilizată frecvent în separarea şi detecția analiților într-o gamă largă de
aplicaţii de la cele farmacologice şi genetice până la analiza și depistarea unor toxine din
alimente. Detecția, în ITP poate fi realizată prin măsurarea schimbărilor de conductivitate, de
absorbanţă UV sau de intensitate a fluorescenţei.
Identificarea este de obicei procesul de determinare a identităţii unuia sau a mai multor
analiţi care au provocat o schimbare observabilă în semnal la detector. Acest proces poate fi
dificil atunci când există mai mulți analiţi de interes ale caror proprietati nu sunt apriori
cunoscute. Pentru astfel de aplicaţii, identificarea trebuie să se bazeze pe o abordare mai generală
a caracteristicilor fizico-chimice, precum masa, sarcina electrică, constantele de disociere, sau
mobilitățile electroforetice

Aplicații ale izotacoforezei în separarea penicilinelor.

Izotacoforeza analitică. Acidul ascorbic (vitamina C, figura A) este prezent în mod natural în
multe alimente și deseori adăugat în altele. Ocazional, se utilizează izomerul mai ieftin, acidul
izoascorbic (figura B), care nu are acțiune vitaminică, fiind distinctibil față de izomerul natural
prin diverse metode analitice, printre care și prin izotacoforeză. Panelul (a) arată analiza unei
probe comerciale de suc de fructe în timp ce panelul (b) arată același suc de fructe la care s-a
adăugat o cantitate cunoscută (4 nmoli) de acid izoascorbic.
Un dispozitiv care pune în aplicare microchip-
ul izotacoforetic dotat cu un sistem de detecție
prin fluorescență indusă de laser.
 AVANTAJELE IZOTACOFOREZEI
Izotacoforeza este o tehnica electroforetică neliniară utilizată la
separarea unei mari varietăți de compusi ionici, de la molecule
mici, cum ar fi ionii de metal, ori pentru separarea unor
moleculele mari precum proteinele.
Spre deosebire de electroforeza "liniară", în care se separă
benzile de solut în zone continue și care se dispersează prin
difuziune sau dispersie, izotacoforeza formează zone auto-
îngustate, adiacente, de substanţă pură din soluţie a cărei
concentraţie depăşește adesea domeniul de mg/ml.
 ELECTROFOREZA CAPILARĂ

Electroforeza capilară (capillary electrophoresis, CE), s-a dezvoltat ca tehnică la sfârşitul anilor
1980 şi a crescut constant în popularitate de atunci. În forma sa cea mai simplă şi mai frecvent
utilizată, CE reprezintă o întoarcere la metoda originală descrisă de Tiselius, dar popularitatea sa
nu se bazează numai pe această simplitate inerentă, ci și cu privire la avantajele suplimentare date
de viteză, versatilitate și costuri reduse. Fiind în esenţă o metodă analitică, ea și-a găsit
aplicabilitatea în separarea biopolimerilor, cum ar fi peptide, proteine, oligonucleotide, ioni de
metale și ioni anorganici, precum şi în analiza de produse farmaceutice ori în monitorizarea
calităţii apei

ELECTROFOREZA CAPILARĂ ESTE O METODĂ DE SEPARARE A

COMPONENTELOR UNUI AMESTEC LICHID PE BAZA MOBILITĂŢI LOR
DIFERITE ÎN INTERIORUL UNUI CÂMP ELECTRIC.
ACEASTĂ METODĂ SE APLICĂ LA MOLECULE CARE POSEDĂ
SARCINĂ FIE POZITIVĂ, FIE NEGATIVĂ ŞI CARE MIGREAZĂ ÎNTR-UN
CÂMP ELECTRIC CU VITEZE DIFERITE.
SEPARAREA DIFERITELOR COMPONENTE DINTR-UN AMESTEC ESTE
DEPENDENTĂ DE TIMP ȘI DEPINDE DE DOI FACTORI PRINCIPALI:
MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ ŞI FLUXUL
ELECTROENDOOSMOTIC.
 Parametrii de migrare în electroforeza capilară

(1) Mobilitatea electroforetică efectivă. Mobilitatea (migrarea)

electroforetică efectivă se referă la mişcarea de moleculele
încărcate electric într-o soluţie de electroliţi considerată a fi
"imobilă", spre electrodul de semn opus. Într-adevăr, o moleculă
încărcată, într-un câmp electric, este supusă la o forţă care este
proporţională cu sarcina efectivă a acestuia (q) şi câmpul electric
care este aplicat (E). Speciile neutre nu sunt separate cu excepţia
cazului în care există unele asocieri cu ionii de electrolit în sine,
care să conducă la diverse forţe atractive. Mobilităţile diferite
sunt desemnate ca (+) sau (-) în funcţie de sarcina pe care o
poartă moleculele. Pentru speciile care nu au o sarcină netă,
mobilitatea este zero.
(2) Mobilitatea aparentă. Mobilitatea aparentă corespunde vitezei
efective de migrare a moleculelor din interiorul capilarului. Ea
reprezintă suma mobilităţilor electroforetice ale unei specii de
molecule și a fluxului electroosmotic. Astfel, în electroforeza capilară,
timpul necesar pentru un solut să migreze depinde de mobilitate sa
electroforetică şi de mobilitatea fluxului.
(3) Injecția probei. În electroforeză capilară, există două modalităţi
principale pentru injectarea probei: injecţia hidrodinamică şi
electromigrarea. Injectare hidrodinamică poate utilizea presiunea sau
vacuum-ul. Ea nu poate fi utilizată pentru electroforeza capilară în gel
sau în prezenţa unor soluţii tampon vâscoase, care necesită perioade
mai lungi de injectare. Injecţia la presiune este metoda cea mai
comună în care volumul de injecţie este limitat la 1-2% din volumul
total al capilarului. Injectarea poate fi realizată prin presiune
gravitașională, aceasta fiind o metodă care constă în ridicarea pur şi
simplă a probei. Metoda permite ajustarea volumului de probă care
poate fi injectat cu o precizie mai mare decât cea realizată la
presiune/vacuum. Metoda electromigrării este mult mai puţin
frecventă.
 APARATURA UTILIZATĂ ÎN
ELECTROFOREZA CAPILARĂ

Schema de principiu al unui aparat de electroforeză capilară. Sunt

prezentate părțile principale ale sistemului. Liniile continue indică
condițiile de separare, în timp ce liniile discontinue indică condițiile
de injecție electrocinetice.
 ELECTROENDOSMOZA ÎN ELECTROFOREZA CAPILARĂ
În condiții ideale de electroforeză în absenţa oricărui mediu suport, mobilitatea oricărui ion
este guvernată de forţa de propulsie generată de câmpul electric iar efectul de întârziere este
rezultanta vâscozității sale, care, în termen general este o funcţie de masa moleculară şi
forma sa. În aceste condiții, secțiunea transversală mică a tubului capilar aduce în discuție
fenomenul de electroendosmoză, proces ușor ignorat în electroforeza convenţională.
Electroforeză capilară se realizează în mod normal în tuburi capilare fabricate din silice
topită. Grupările silanol negative prezente în acest material dau naştere unei suprafeţe
încărcate cu sarcină negativă (cu potenţial zeta, ζ), care este responsabilă de fenomenul de
electroendoosmoză. Această suprafaţă încărcată cu sarcină conduce la o distribuţie distinctă
a speciilor cationice din oricare soluţie ionică aflată într-un tub capilar

Electroforeza capilară zonală: (a) mecanismul de

separare prin care se arată mobilitatea
electroforetică a ionilor pozitivi (μM+) și a celor
negativi (μM−); N reprezintă o moleculă neutră.
(b) Ordinea de migrare a ionilor.
 VARIANTE ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE
Ca tehnică de diagnostic, electroforeza capilară se bazează pe diferenţa de mobilităţi între două
substanţe distincte supuse unui câmp electric. Prin urmare, ea este complementară cromatografiei lichide și
joacă un rol important în cadrul diferitelor tehnici analitice disponibile în prezent.
Electroforeza zonală capilară
Electroforeza zonală capilară (CZE) este cea mai simplă formă de electroforeză, fiind în esență o
electroforeză în mediu liber unde migrarea analiților în soluție, realizată sub influența unui câmp electric,
este afectată de raportul sarcina biomoleculei/mărimea ei, fiind opusă forțelor fricționale din soluția de
electrolit.

Focalizarea izoelectrică capilară

Focusarea izoelectrică este o tehnică bine-stabilită pentru separarea moleculelor amfotere precum sunt
cele ale proteinelor și care poate fi ușor adaptată la mediul capilar. Tehnica se bazează pe formarea unui
gradient de pH prin utilizarea unor molecule amfotere cunoscute sub denumirea de amfoliți, compuși, în
general caracterizați drept poliamine sntetice alifatice ori acizi polcarboxilici sau polisulfonici. Aplicarea
unui câmp electric la un amestec de amfoliți conduce la formarea unui gradient de pH după cum amfoliții se
așează într-o ordine conform punctului lor izoelectric. Amfoliții sunt ținuți în mediul suport prin utilizarea
unei soluții catodice cu pH înalt (obișnuit hidroxid de sodiu) și o soluție anodală cu un pH scăzut precum cea
de acid fosforic. După cum proteinele sunt molecule amfotere, ele vor avea un comportament de manieră
identică și vor fi concentrate într-o poziție dictată de punctullor izoelectric. Rezoluția înaltă asociată cu
această metodă este datorată de faptul că o moleculă amfoteră care difuzează din poziția ei corespunzătoare,
în zone cu pH mai mare sau mai mic este readusă la linia de bază corespunzătoare pH-lui ei izoelectric.
 Cromatografia electrocinetică capilară micelară

Una dintre limitările evidente ale electroforezei este că, aproape prin definiţie, gama de
molecule care pot fi separate este limitată la acele care pot transporta o sarcină electrică.
Cromatografia electrocinetică capilară micelară este o versiune a electroforezei capilare care
combină fenomenul de curgere electroendoosmotică, cu o formă de cromatografie de partiţie
pentru a extinde gama de molecule care pot fi separate pentru a le include și pe cele care nu
posedă sarcină. După cum s-a arătat mai sus, potenţialul zeta de pe peretele unui capilar
neacoperit combinat cu diametrul mic al acestui capilar, în sine, duce la producerea unui flux
electroendoosmotic semnificativ.
Cromatografia electrocinetică capilară
micelară. Micelele încărcate negativ sunt atrase
spre anod, dar, datorită marii amplitudini a
curgerii electroendoosmotice are loc o
deplasare înspre capătul catodic al capilarului.
Moleculele încărcate pozitiv sunt retardate
(întârziate) prin asocierea cu micelele încărcate
negativ; moleculele neutre posedând o
mobilitate intermediară se partiţionează între
fazele micelară şi electrolit în timp ce
moleculele încărcate negativ sunt respinse din
micele
APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE

 Analize genetice;
 Analize de produse farmaceutice (care conţin baze
azotate);
 Produse farmaceutice care conțin centre chirale
(enantiomeri);
 Analize ale unor contra-ioni în dezvoltarea unor noi
medicamente;
 Caracterizarea unor proteine și a unor proteine
terapeutice;
 Analiza de carbohidrați pentru determinarea
modificărilor post-translaţionale.
 ELECTROFOREZA DE AFINITATE
Electroforeza de afinitate, în sens larg, include toate metodele utilizate în biochimie și
biotehnologie în care un anumit tip de interacțiune specifică are loc între un component
din proba supusă electroforezei și un alt component prezent în constituția mediului
suport, denumit ligand specific. Cu ceste metode, unele înrudite cu imunoelectroforeza,
altele, cu cromatografia de afinitate, se detectează componentele dintr-o probă care
prezintă afinitate pentru un ligand, se determină omogenitatea sau heterogenitatea
legării componentului/componentelor de ligand, modificările induse de diverse
tratamente și uneori cantitatea de component/componente care leagă specific ligandul,
sau se elfectuează studii cantitative privind formarea complexelor component-ligand (în
speță, proteină-ligand).
Ligandul poate fi liber sau imobilizat în mediul suport. Dacă masa sa moleculară este
foarte mică în raport cu masa moleculară a proteinelor țintă, modificările electroforetice
vor fi relativ mici sau chiar neglijabile, în special dacă și sarcina ligandului este mică
sau zero (de exemplu substratele cu masă moleculară mică și inhibitorii enzimatici).
Efectele asupra mobilității electroforetice vor fi mai evidente dacă ligandul și proteinele
țintă sunt cu mase moleculare relativ apropiate, sau dacă ligandul are fie o sarcină
electrică mare, fie o structură ramificată, care să permită interacțiunea simultană cu mai
multe molecule țintă de proteine. În aceste cazuri interacțiunea se va concretiza printr-o
scădere sau creștere semnificativă a mobilității electroforetice a proteinelor sau prin
apariția unui precipitat.
Toate aceste posibilități stau la baza diferitelor metode aparținând
electroforezei de afinitate. Cele mai cunoscute metode sunt :
•Imunoelectroforeza încrucișată;
•Imunoelectroforeza tip rachetă;
•Imunoelectroforeza zonală;
•Electroforeza încrucișată;
•Imunoafinoelectroforeza încrucișată;
•Afinoelectroforeza bidimensională;
•Afinoforeza;
•Electroforeza de afinitate propriu-zisă (care este asemănătoare ca
principiu cromatografiei de afinitate).
 IMUNOELECTROFOREZA
Imunoelectroforeza reprezintă o metodă care combină electroforeza în mediu
stabilizat cu reacția antigen-anticorp. Această asociere, între rezoluția proprie și
specificitatea reacțiilor imunochimice, permite caracterizarea calitativă și cantitativă
a amestecurilor complexe de proteine. Imunoelectroforeza este o denumire
generică pentru o serie de metode biochimice de separare şi caracterizare a
proteinelor care au la bază preocedee electroforetice şi reacţii cu anticorpi. Toate
variantele de imunoelectroforeză necesită imunoglobuline, anticorpi care
reacţionează cu proteinele separate sau caracterizate.
Ilustrarea principiului care stă la baza
utilizării fenomenului de imunodifuzie și
imunoelectroforeză. Într-o matrice de gel,
în care este stabilit un gradient de
concentraţie de anticorpi care scade liniar
într-o direcţie dată, iar concentrația de
antigen creşte în gradient din direcție
opusă, se va forma o bandă de precipitat
perpendicular pe direcția gradientului, într-
un punct de concentraţie a antigenului
respectiv a anticorpului aproximativ egală.

Când sunt prezenți la concentraţii aproximativ egale, antigenul şi anticorpul vor precipita
ca un agregat
 ELECTROIMUNOANALIZA MONODIMENSIONALĂ

Electroimunoanaliza monodimensională (sinonime: imunoelectroforeza tip rachetă, cu

peak-uri, electroimunodifuzia, electroforeza încrucișată simplă). Antigenul, aplicat într-o
în godeul gelului placă, este forţat imediat spre gelul care conține anticorpi, conurile
(rachetele) formate au o suprafaţă aproape proporţională cu cantitatea de antigen.
Lungimea conului (peak-ului) va da, în general, o aproximare suficient de exactă a
concentrației de antigen

Reprezentarea schematică a tehnicii de

electroimunoanaliză și imaginea unui gel după
imunoelectroforeză tip rachetă.

Prin compararea înălţimii rachetei din probele de testat

(necunoscute) cu cele formate de standardele cunoscute, dilutate
corespunzător, se pot determina concentraţiile unor antigeni
specifici. În acest scop se realizează o curbă semilogaritmică log
concentrație proteică de antigen (dată în mg/ml sau U.I./ml) și
înălțimea rachetelor (dată în mm).
ELECTROIMUNOANALIZA BIDIMENSIONALĂ

Imunoelectroforeza încrucișată a unor

antigene și a unui antiser. Într-o primă
dimensiune proteinele sunt separate printr-o
electroforeză de tip standard. Proteinele astfel
separate sunt supuse unei migrări într-o a
doua dimensiune, la un unghi de 90 față de
prima dimensiune. Gelul conține în a doua
dimensiune un antiser, care generează un
model de imunoprecipitare ca cel prezentat în
figură.
 Tampoane utilizate în imunoelectroforeză
acid 5,5-dietilbarbituric/5,5-dietilbarbiturat de sodiu

Aditivi utilizați în imunoelectroforeză

Prezenţa sau absenţa unor cationi bivalenți sau a unor agenți complexanți
în sistemul electroforetic este de mare importanţă. Astfel, prezența Ca2+
conduce la obținerea unor linii de precipitare mai ascuțite în multe
sisteme antigen-anticorp în conformitate cu tehnica descrisă de Laurell.
De mai mare importanță sunt însă diferenţele calitative (zone mai clare şi
mobilităţi relative modificate) observate în electroforeza după adăugarea
sau eliminarea Ca2+, din cauza faptului că acesta modifică afinităţile
multor proteine pentru cationi bivalenți. De regulă, se utilizează 1-2 mM
lactat de calciu.
 Aplicații ale imunoelectroforezei calitative și cantitative

Imunoelectroforeza calitativă se utilizează la investigarea creșterii globulinelor gama. Astfel,

în cazul unei gamapatii monoclonale se constată creșterea unei proteine specifice (paraproteină).
Ea este în primul rând remarcată prin electroforegramă, după care este identificată imunologic cu
un imunoser specific. Paraproteinele monoclonale sunt caracteristice mielomului multiplu.
Imunoelectroforeza cantitativă este o metodă bazată pe o “migrare asistată” a antigenului,
putându-se considera o variantă a electroforezei de afinitate. Ea a fost introdusă de Laurell
prin anii 1965-1966, fiind cunoscută drept imunoelectroforeza model Laurell sau
imunoelectroforeza tip rachetă.
CONTRAIMUNOELECTROFOREZA
Contraimunoelectroforeza, denumită uneori și imunoelectroforeză
supraîncrucișată este o tehnică de laborator utilizată la evaluarea legării
unui anticorp de antigenul său. Metoda, care nu trebuie confundată cu cea
de imunoelectroforeză încrucișată, este similară cu imunodifuzia, dar la
care se adaugă un câmp electric aplicat unui mediu de difuzie, de obicei
un gel de agar sau de poliacrilamidă.
Demonstrarea prezenței antigenului Australia. Două seruri pozitive (Au) se depun în godeurile
situate la partea catodică, în timp ce anticorpul uman anti-Au se introduce în godeurile situate
pe partea anodală. Se observă că reacția de identitate indică specificitatea reacției antigen-
anticorp
Cele trei principii ale imunoelectroforezei: A, Contraimunoelectroforeza după Bussard
(1959): într-un gel de agaroză care manifestă o electroendosmoză mare, tamponul este
stabilit la un pH=8,6, astfel că anticorpii nu posedă nici o sarcină netă. Proba şi anticorpii
sunt plasați în godeuri şi se mișcă unul faţă de celălalt: antigenele care posedă sarcină
migrează electroforetic iar anticorpii se mișcă prin intermediul fluxululuielectroosmotic. B,
Electroforeză zonală/imunodifuzie în conformitate cu Grabar şi Williams (1953): la început
se realizează o electroforeză zonală într-un gel de agaroză, urmată de difuziunea
fracţiuniilor de antigen spre anticorpul care se află depus în godeurile realizate paralel cu
direcția câmpului electric; C, Tehnica tip “rachetă”, în conformitate cu protocolul dezvoltat
de Laurell (1966), precum şi metodele conexe acestuia: antigenele migrează într-un gel de
agaroză, care conţine o concentraţie determinată de anticorp. Ca şi în metoda
contraimunoelectroforetică anticorpii nu posedă sarcină datorită tamponului ales, astfel,
că în mementul în care proba (antigenul) migrează, ea se va lega la anticorp până la un
raport la care concentraţiile corespund punctului de echivalenţă al imunocomplexului.
 Imunoelectroforeza încrucișată. Tehnica a fost pusă la punct de către Bog-Hansen, în
perioada 1973-1980 și este utilizată la separarea, identificarea și caracterizarea
glicoproteinelor cu ajutorul lectinelor și a anticorpilor specifici.
Metoda are aplicabilitate în cercetare (de exemplu la studiul interacțiilor anticorpilor
monoclonali) ori în clinică (în laboratorul de diagnostic al maladiilor în care sunt implicate
glicoproteine anormale).
Afinoelectroforeza bidimensională. Tehnica are la bază același principiu ca și
imunoelectroforeza încrucișată, dar spre deosebire de aceasta anticorpii specifici se găsesc
într-o membrană de nitroceluloză. Metoda se caracterizează printr-o rezoluție foarte bună și
este o metodă de perspectivă.
Afinoforeza. A fost pusă la punct de către Shimura și Kasai. Tehnica are la bază
interacțiunea dintre un ligand macromelecular solubil cu sarcină electrică mare (afinofor) și o
proteină. Complexul proteină-afinofor se remarcă printr-o mobilitate electroforetică
substanțial mai mare decât al proteinei libere.
Electroforeza de afinitate propriu-zisă. Este analogă cromatografiei de afinitate. În această
tehnică, ligandul este imobilizat într-un gel astfel că proteina țintă, în cursul electroforezei,
este împiedicată și astfel întârziată datorită interacțiunii specifice.
Se poate remarca faptul că nu există o delimitare netă între variantele asemănătoare
imunoelectroforezei și variantele asemănătoare cromatografiei de afinitate, deoarece
imobilizarea ligandului, în cazul variantelor cromatografice nu este necesar să fie completă,
mai ales pentru liganzii mari.
 METODE DE DETECȚIE A PROTEINELOR DUPĂ
ELECTROFOREZĂ MONO/BIDIMENSIONALĂ PE GELURI
DE POLIACRILAMIDĂ
Căutarea unor metode de a vizualiza proteinele
rezolvate prin electroforeza pe oricare suport, de la benzi
de acetat de celuloză la geluri de poliacrilamidă datează de
la originile electroforezei în sine.
Odată cu introducerea disc-electroforezei, la
începutul anilor 1960, cea mai frecvent utilizată colorație a
proteinelor s-a realizat cu amido black. Cum nevoia de
metode de colorare cu sensibilitate înaltă şi colorare
uniformă a crescut pentru a satisface cerinţele de
cuantificare proteine în geluri, colorația cu amido negru a
devenit improprie. Colorantul amido black nu are
sensibilitate necesară, calitatea variază de la lot la lot iar de
multe ori proteinele se colorează multicromatic
 pentru vizualizarea proteinelor separate prin electroforeza pe
benzi de acetat de celuloză, Fazekas St Groth și colaboratorii
(1963) au testat sistematic un numar mare de tehnici standard de
colorare utilizate în industria textilă convenabili ca potențiali
coloranți ai proteinelor după electroforeză. În 1963 ei au introdus în
practica electroforetică un colorant acid, Coomassie Brilliant Blue
250, tradițional utilizat pentru colorarea lânei, colorant convenabil
din punct de vedere al gradului crescut de sensibilitate, a marii
intensități a culorii și a absorbanței peakului. În anul 1965, Meyer şi
Lambert au aplicat cu succes metoda de colorare cu Coomassie
Blue descrisă de St. Groth la detectarea unor proteine din salivă,
separate prin electroforeza pe benzi de gel din acrilamidă. Succesul
experimentului de colorare i-a condus pe cercetători în a conchide
că "Commasie Brillant Blue și-ar putea găsi o aplicare în cadrul
investigațiilor altor fluide biologice prin electroforeză în gel de
poliacrilamidă".
 Metodele de detecție a proteinelor

Acestea includ protocoale bazate pe:

coloranți organici;
săruri de metale anorganice;
marcare fluorescentă de grup;
capacităţi specifice de legare proteină-ligand;
detecția unei activități enzimatice;
colorare specifică de grup:
o glicoproteine;
o fosfoproteine;
o lipoproteinelor
imunocolorarea cu anticorpi.
Alternativ, proteinele care sunt marcate cu izotopi, fie
înainte (pre), fie postelectroforetic pot fi vizualizate prin
utilizarea unor detectori autoradiografici şi fluorografici
cu impresionarea unui film de radiații X.
o metodă specială de detecție a proteinelor
depinde de numeroşi factori, inclusiv, cel mai important,
modulul experimental abordat. Alte consideraţii includ
uşurinţa şi reproductibilitatea procedurii de vizualizare,
precum şi gradele de sensibilitate şi de precizie
necesare în cuantificare.
Deşi au fost descrise o multitudine de protocoale
de colorare-vizualizare a proteinelor/enzimelor, nici una
nu este total ideală, deseori fiind necesară utilizarea
combinată a tehnicilor de colorare a proteinelor şi/sau
marcarea acestora.
Coomassie Brilliant Blue, un colorant anionic trifenilmetanic este utilizat în două forme:
Coomassie R-250 (de culoare roșie) și Coomassie G-250 (de culoare verde), ultimul
având două grupări metil adiționale

În prezența unui mediu acid, acești coloranți se leagă de grupările amino a

proteinelor prin interacții electrostatice și hidrofobe. În protocoalele originale
gelurile sunt plasate pentru o perioadă de timp într-o soluție de colorare de 0,1%
colorant Coomassie dizolvat într-un amestec de metanol, 45% (v/v), apă, 45% (v/v)
și acid acetic 10%; background-ul se decolorează într-un amestec alcătuit din
metanol, 25% (v/v), apă, 65% (v/v) și acid acetic 10% (deseori se utilizează același
amestec de solvenți).
 ALȚI COLORANȚI ORGANICI UTILIZAȚI ÎN EVIDENȚIEREA
POSTELECTROFORETICĂ

Fast Green FCF (food green 3), ușor

de utilizat în densitometria cantitativă.

colorarea proteinelor în geluri de

SDS-PAGE comparabilă ca
sensibilitate cu colorația CBB:
utilizarea acidului 1-(2-hidroxi-4-
sulfo-1-naftilazo)-2-hidroxi-3-
naftoic (acidul calconcarboxilic,
NN).
 COLORAȚIA “STAINS-ALL”

o tehnică sensibilă utilizată la caracterizarea electroforetică a gelurilor compozite de

agaroză-acrilamidă, precum și a gelurilor de poliacrilamidă care conțin acid hialuronic. În
plus, Stains-all diferenţiază fosfoproteinele, cum ar fi cazeina, de proteinele nefosforilate.
Metoda este potrivită pentru colorarea diferenţiată a acizilor nucleici şi a proteinelor,
după cum urmează:
ARN (albastru-violet),
ADN (albastru, abs= 675nm),
proteine (roşu, abs= aprox. 510nm),
mucopolizaharidele acide-culori variate.

Structura chimică a colorantulului cationic carbocianinic – bromură de (l-etil-2-[3-(l-

etil-nafto[l,2-d]tiazolin-2-iliden)-2-metilpropenil]nafto[1,2-d] tiazoliu, denumit
colorant total sau Stains-all (formula brută, C30H27BrN2S2)
 COLORAȚIA CU CUPRU

Colorația reversibilă cu cupru este o metodă realizată într-o singură etapă

pentru detectarea rapidă a proteinelor fracţionate prin SDS-PAGE. În această tehnică
nu este necesară o etapă de decolorare. Colorarea se bazează pe interacţiunea
ionilor de cupru cu poliacrilamida şi cu proteinele separate. Tehnica de colorare
implică precipitarea ionului de cupru în gel care astfel devine verde opac, în timp ce
SDS previne legarea ionului de cupru la proteine, rezultând astfel o imagine negativă.
În final se evidențiază benzi clare de proteine pe un fundal semiopac albastru-verzui
de poliacrilamidă. Benzile proteice sunt vizualizate în mai putin de 5 minute.
Sensibilitatea colorației reversibile este cuprinsă între 0,5ng și 12ng/bandă proteică.
Colorarea nu interferă cu tehnicile ulterioare de electroeluție a proteinelor și nu
modifică proprietăţile biologice ale acestora.
Gelurile colorate reversibil cu ioni de cupru pot fi decolorate în 20-25 de
minute, înainte de transferul sau electroeluția proteinelor din gel. Un dezavantaj
major totuși, este că această colorație nu este compatibilă cu gelurile native

În cazul BSA sensibilitatea metodei ajunge la 0,5-10 ng proteină/bandă, fracțiile proteice fiind vizibile
după o separare pe un gel de poliacrilamidă cu T=12%. În cazul gelurilor cu o concentraţie mai mică de
12% sensibilitatea scade din cauza creșterii dimensiunilor porilor, cu consecință în creșterea procesului de
difuziune a benzilor de proteine.
 COLORAȚIA NEGATIVĂ IMIDAZOL-SDS-ZINC

Un complex al sării de zinc, al SDS și imidazolului precipită în gelul de poliacrilamidă

și formează un background alb opac, dar care rămâne incolor în prezența spotului
proteic. Zonele proteice devin astfel vizibile ca un background închis la culoare.
Sensibilitatea detecției (care este de ordinul a câtorva nanograme) este cuprinsă între
cea a CBB și colorația cu argint.
Evidențierea fosvitinei după colorare reversibilă cu imidazol-zinc
 Coloratia argentică (silver staining)

• De 100 X mai sensibila decat coloratia cu

coloranti organici
• Metoda simpla, ieftina. Se poate realiza
prin:
– Reducere fotochimica
– Formare de argint amoniacal
• Metoda ce adimite supracolorarea gelurilor
colorate initial cu CBB
 COLORAȚIA CU ARGINT

Detecția proteinelor prin colorație cu argint este larg utilizată deoarece

sensibilitatea ei este de aproximativ 1 ng per spot, costurile pentru reactivi
sunt relativ scăzute și, deși presupune o procedură multistadială, rezultatele
sunt disponibile relativ repede.
Ideal spoturile sunt brun-închise spre negru pe un background ușor bej.

Principiul protocolului de colorare cu azotat de argint este următorul:

în prima etapă proteinele sunt fixate;
SDS-ul și componentele tamponului sunt îndepărtate prin spălare cu o
soluție de etanol, 40% și acid acetic, 10%.
Următoarea treaptă combină legarea încrucișată a proteinelor din matricea
de gel cu ajutorul glutardialdehidei/formaldehidei și de sensibilizare cu tiosulfat de
sodiu în prezență de acetat de sodiu.
După un număr de spălări cu apă distilată la intervale exacte de timp, gelul
se plasează într-o soluție care conține azotat de argint 0,25% și o cantitate mică de
formaldehidă. Dezvoltarea se realizează cu formaldehidă la o valoare bazică de pH,
creată cu ajutorul carbonatului de sodiu. Reacția este stopată prin plasarea gelului
într-o soluție de acid acetic, 5% ori într-o soluție de EDTA 1,5%.
 Fosfoproteinele
• Colorare in rosu a proteinelor sub actiunea bromurii de
1 etil 2,3 –(1 eilnafto-(1,2d) tiazolin-2-iliden)2-metil-
propenil-nafto-(1,2d)-tiazol denumit colorant total
• Fosfoproteinele se coloreaza in albastru

Lipoproteinele
Precolorare cu Sudan Black

Glicoproteinele
Colorare cu sulfit de fucsina (reactiv Shiff) in conditii oxidante realizate cu
acid periodic;
Colorare argentica
Colorare cu Alcian blue (glicoproteinele acide)
Colorare cu izocianat de fluoresceina (FTIC)- lectinebenzi fluorescente
EZBlue™ Gel Staining Reagent
 COLORAȚIA FLUORESCENTĂ

Coloranții fluorescenți prezintă un mare domeniu de linearitate dinamică, de peste

4 ori magnitudine față de colorațiile clasice, cu rezultate înalt reproductibile
deoarece colorația fluorescentă este o metodă de tip endpoint. De la introducerea
colorării cu Nile Red în ultimii ani, au fost dezvoltați o varietate de coloranți cu
diverse și marcante sensibilități și proprietăți, precum familia coloranților Sypro®
(Orange, Red, Tangerine și Ruby)

Structura chimică a colorantului hidrofob

Nile red.
PREMARCAREA PROTEINELOR CU FLUOROFORI
Reprezentarea schematică a îmbunătăţirii confidenței în schimbările de abundenţă a
unor proteine. folosind tehnologia multi-fluorescentă DIGE.
 Alți fluorofori frecvent utilizați la marcarea
proteinelor înainte de electroforeză includ:
 clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5-
sulfonil (dansil);
 4-fenilspiro [furan-2 (3H)-l’-ftalan]-3,3’-
diona (fluorescamina);
 2-metoxi-2,4-difenil-3-(2H)-furanona
(MDPF);
 N-(7-dimetilamino-4-metilcumarinil)-
maleimida (DACM) (Yamamoto și colab.,
1978);
 o-ftaldialdehida
Electrotrensferul proteinelor pe membrana (western
blotting, immunoblotting)-evidentierea specifica
TRANSFERUL PROTEINELOR DIN GELURI PE ALTE MEDII SUPORT
• Proteins migrate to the membrane
following a current (I) that is generated by
applying a voltage (V) across the
electrodes, following Ohm’s law:
• V=IxR
• where R is the resistance generated by
the materials placed between the
electrodes (that is, the transfer buffer, gel,
membrane, and filter papers)
separarea amestecurilor de proteine pe baza
dimensiunilor utilizând gel-electroforeza;
transferul eficient al proteinelor separate pe un
suport solid;
detectarea specifică a unei proteine ţintă cu
anticorpi corespunzători.
O prezentare generală a procedurii de Western Blotting. Separarea
proteinelor din amestecuri prin electroforeză, transferul de pe gel
pe o membrană de blott-are şi detecția proteinei ţintă, care devine
vizibilă doar în faza finală, după cum se observă o bandă de pe linia
3. Linia 1: standarde de masă moleculară precolorate. Liniile 2 și 3:
amestecuri de proteine
O diagramă care prezintă o serie de aplicații ale proteinelor
imobilizate
Schema logică a unei metode de
transfer a proteinelor de pe gel pe
membrană urmată de etapa de
detecție
 Încărcare Tipul de legătură stabilit cu
Tip de membrană
electrică proteinele
Nitroceluloză Negativă Electrostatică/Interacție hidrofobă
Acetat de celuloză Negativă Electrostatică
Celuloză
Pozitivă Electrostatică şi covalentă
diazobenziloximetilată
Nylon Pozitivă Electrostatică
DEAE-celuloză Pozitivă Ionică
Celuloză activată cu BrCN Covalentă
Difluorură de poliviniliden Interacție hidrofobă
Timp de transfer Peste noapte 1 oră
Tensiune aplicată 30V 100V
Intensitate 90mA 350mA
Protein transfer systems
 METODE DE DETECŢIE A PROTEINELOR PE MEMBRANĂ DUPĂ TRANSFER
ELECTROFORETIC

Transferul proteinelor pe membrană (denumit western blotting) reprezintă o tehnică de rutină,

deosebit de utilizată în detectarea şi caracterizarea proteinelor. Metoda prezintă avantajul
specificităţii anticorpilor care conduc la identificarea fără dubii a proteinelor după separarea lor
prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă şi transferate pe o membrană. Western blotting-ul
implică recunoaşterea secvenţială dintre trei componente: proteina ţintă, anticorpul primar
care recunoaște proteina ţintă şi un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul primar şi
generează un semnal detectabil. După legarea proteinelor la o membrană, situsurile nelegate
sunt inactivate (membrana este blocată), incubată cu un anticorp primar, apoi cu un anticorp
secundar şi în final, spălată. Anticorpul primar se leagă la proteina de interes în timp ce anticorpul
secundar este pregătit pentru detecţie.
Anticorpul secundar poate fi marcat cu un radioizotop, un fluorofor, sau cu o enzimă, în marea
majoritate peroxidaza din hrean (horseradish peroxidase- HRP) sau fosfataza alcalină (AP)
O lungă perioadă de timp, radioizotopii au reprezentat singura cale de marcare a probelor de
anticorpi secundari şi astfel utilizaţi în aplicaţiile de transfer ale proteinelor. Ultimii ani au
dezvăluit noi metode mai puţim periculoase şi mai fezabile decât cele radioactive, care conduc la
rezultate comparabile în ceea ce priveşte sensibilitatea lor. Tehnicile curente de detecţie după
transfer pe membrană includ metode bazate pe detecţia emisiei de lumină (chemiluminiscenţă,
bioluminescenţă, chemifluorescenţă şi fluorescenţă), detecţie prin autoradiografie, ori
colorimetrie.
 Detecţia prin chemoluminiscenţă

Chemiluminescenţa reprezintă producerea unei cuante

de lumină detectabilă rezultată în urma unei reacţii
chimice. În detecţia pe membrane de transfer, reacţiile sunt
catalizate de către o enzimă precum fosfataza alcalină ori
peroxidaza conjugată cu un anticorp. Semnalul luminos
poate fi capturat prim impresionarea unui film de tipul celor
utilizate la captura radiaţiilor X sau de către sisteme video
de captare a imaginilor. Beneficiile detectării semnalelor
chemiluminescente de către un sistem de preluare a
imaginilor sunt numeroase. Astfel, domeniul de linearitate
dinamică a sistemelor video este de 2 până la 5 ori
magnitudine mai sensibile comparativ cu sistemele de
impresionare a filmului fotografic. Aceste sisteme video
digitale de preluare a imaginii oferă pe lângă o sensibilitate
crescută şi o economicitate în sensul eliminării
achiziţionării continue de film ori consumabile de
prelucrare al acestuia.
Tehnica chemiluminescentă este uşor de
adaptat la procedurile de western blotting
existente deoarece utilizează anticorpi
conjugaţi cu enzimă, pentru a genera semnalul
luminos. Treptele de blocare şi spălare sunt
comune celor utilizate în în tehnicile de western
blotting. Cele mai multe metode
chemiluminescente necesită puţine componente
necesare în generarea semnalului luminos. În
cazul chemiluminescenţei luminolului,
substratul este oxidat chimic de către HRP cu
producţia unui compus aflat în stare excitată.
În cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul
luminos se produce în momentul în care produsul excitat se întoarce la
starea sa de bază. Semnalul este vizualizat prin expunerea membranei pe
un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziţie a imaginii. Pe
lângă luminol sunt, disponibile comercial şi alte substrate
chemiluminescent precum substratele bazate pe acridan (este cazul
Lumigen PS-3 (care utilizează AP sau HRP ca enzimă reporter) ori
substraturi pe bază de 1-2-dioxetan (care utilizează AP ca enzimă
reporter) Emisia de lumină poate fi crescută de până la 1000 de ori prin
adăugarea unor amplificatori cu structură fenolică. Amplificatorul diferă
de tipul de kit utilizat. Detecţia chemiluminescentă prezintă ca avantaje,
viteza şi sensibilitatea. Timpul mediu de expunere de 30 secunde până la
15 minute. Timpul scurt este principala îmbunătăţire faţă de metoda
bazată pe detecţia cu 125I, care necesită până la 48 de ore de expunere pe
film foto.
Prin această metodă se pot detecta cantităţi de
ordinul picogramelor de proteină mai sensibile
decât majoritatea metodelor colorimetrice şi
sunt aproximativ egale cu cele radioizotopice.
Este important a se nota că sensibilitatea
detecţiei este oarecun dependentă de afinitatea
antigenului şi a anticorpilor primar şi secundar
care poate varia considerabil de la o probă
proteică la alta. Detecţia chemiluminescentă nu
prezintă în plus dezavantajul celei
radioizotopice în ceea ce prezintă riscul de
expunere la iradiere, costul crescut în ceeea ce
priveşte măsurile de protecţie faţă de
reziduurile radioactive în ceea ce priveşte
contaminarea mediului. Nu în ultimul rând,
membranele utilizate în cazul metodelor
chemiluminescente pot fi utilizate de mai multe
ori prin spălare şi rebandarea proteinelor,
proces care nu este posibil în cazul tehnicilor
de detecţie colorimetrice.
 Detecţia prin bioluminescenţă

Membrana PVDF este

Bioluminescenţa este un fenomen de emisie de lumină de către
preferabilă în detecţia
multe organisme. Sistemele bioluminescente diferă în structura şi
bioluminescentă deoarece
funcţia enzimelor şi cofactorilor implicaţi în proces alături de
membrana de
mecanismul reacţiilor de generare a luminii. Bioluminescenţa
nitroceluloză poate conţine
poate fi exploatată ca metodă de detecţie pe membrane. Detecţia
substanţe ce inhibă
prin bioluminescenţă implică incubarea membranei care conţine
activitatea luciferazică şi
un antigen legat/complex anticorp-enzimă în prezenţa unui
astfel sunt posibile
substrat bioluminogenic, cu măsurarea simultană a luminii
interferenţe în analiză.
emise. Substratul în acest sistem de detecţie este un derivat al
luciferinei. Detecţia luminii este realizată într-o cameră
fotoevidenţiere iar proteinele sunt vizualizate ca spoturi
luminoase. Din punct de vedere al sensibilităţii şi a vitezei de
realizare, tehnica este similară celei de chemiluminescenţă dar nu
este generalizată datorită numărului mic de substrate
bioluminogenice comercializate.
 Detecţia chemifluorescentă

Chemifluorescenţa reprezintă a conversie enzimatică a unui substrat

într-un produs fluorescent. Compuşii fluorogenici (substanţe
nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi convertite în produşi
fluorescenţi) sunt utilizaţi cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu
AP ori HRP. Enzima clivează o grupare fosfat a unui substrat
fluorogenic cu producerea unui compus înalt fluorescent. Fluorescenţa
poate fi detectată prin utilizarea unui sistem de preluare a imaginii
astfel, cuantificată de către un program.
Chemifluorescenţa poate conduce la produşi de reacţie
fluorescenţi stabili, astfel membranele pot fi analizate în
condiţiiile de timp convenabile.
Metoda este compatibilă pentru recolorări şi spălări.
 Detecţia prin fluorescență

În cazul detecţiei fluorescente, anticorpul secundar este

marcat cu un fluorofor precum fluoresceină (FITC), Texas
Red, rhodamine (TRITC), ori R-phycoerythrin. Principalul
avantaj în detecţia fluorescenţei este faptul că domeniul
dinamic linear este de circa 10 ori mai mare decât în detecţia
prin chemiluminescenţă cu o reducere a sensibilităţii de
numai 2–4 ori.
Detecţia fluorescentă a proteinelor legate de
membrane poate conduce uneori la o mai bună
linearitate şi la cuantificări mai bune în limitele
de detecţie. Detecţia fluorescentă poate fi
deasemenea multiplex. Legarea mai multor
fluorofori coloraţi la diverşi antigeni conduce la
detecţia simultană a mai multor proteine ţintă
pe aceeaşi membrană.
 Autoradiografia

Pentru multe aplicaţii radioizotopii pot fi utilizaţi pentru a marca probele

(în cazul membranelor rezultate din transfer este vorba de anticorpul
secundar) Radioizotopii cei mai utilizaţi în ştiinţele biologice sunt 35S,
32P, 33P, 14C, şi 125I. Pentru a detecta radioactivitea, metoda cea mai

utilizată este autoradiografia pe filme de radiaţii X. Autoradiografia

conduce la o relaţie bună între sensibilitate şi rezoluţie fără o investiţie
mare. Pentru intensificarea semnalului autoradiografic se utilizează
scintilatori. Există sisteme de analiză a fosforului care oferă o alternativă
la metodele de detecţie pe film. Marele avantaj al metodei constă într-o
relaţie lineară între intensitatea semnalului şi cantitatea de proteină.
 Detecţia colorimetrică

O serie de substrate sunt convertite la un precipitat colorat de către o

serie de enzime precum HRP ori AP, enzime uzual conjugate la
anticorpul secondar. Cele mai comune sisteme utilizează substraturi
precum 5-bromo-4- chloro-3-indolil fosfat/Nitroblue Tetrazoliu
(BCIP/NBT) pentru AP ori diaminobenzidina (DAB) sau 4-cloro-1-
naftol (4CN) pentru HRP. În momentul acumulării de precipitat pe
bandă, se dezvoltă un semnal colorat pe membrană. Reacţia enzimatică
poate fi monitorizată şi stopată în condiţiile în care semnalul are o
intensitate dorită pentru a preveni zgomotele de fond.
Metoda este cea mai simplă dintre toate tehnicile de
evidenţiere, semnalul detectabil fiind rodul legării
anticorpului secundar la un anticorp specific proteinei
de interes
 Metode de detecţie a proteinelor
după transferul pe membrană
Comparaţie între metodele de detecţie a proteinelor după transfer pe membrană
Reprezentarea schematică a
Avantaje Dezavantaje
metodei
 marcarea poate reduce
 mai rapidă, deoarece este
imunoreactivitatea anticorpului
utilizat doar un singur anticorp;
primar;
 nu apar procese de
 anticorpii primari marcați
reactivitate încrucișată cu anticorpul
sunt mai scumpi;
secundar;
 o flexibilitate scăzută în
 este posibilă marcarea
alegerea anticorpului primar marcat;
dublă, prin marcare diferită a
 un semnal de amplificare
anticorpilor primari;
mic;
 anticorpul secundar poate
amplifica semnalul;
 sunt disponibili o varietate
de anticorpi secundari marcați;
 un anticorp secundar poate  anticorpii secundari pot
fi utilizat cu mai mulți anticorpi produce colorații nespecifice;
primary;  sunt necesare măsuri
 marcarea nu afectează suplimentare comparativ cu metoda
imunoreactivitatea anticorpilor directă;
primary;
 schimbarea anticorpului
secundar permite schimbarea
metodei de detective;
 DETECTAREA ENZIMELOR ÎN GELURI

Detectarea activităţilor enzimatice după electroforeză în gel şi stabilirea exactă a benzilor

individuale proteice produse astfel datorită activităţii catalitice specifice rămâne o ţintă
fascinantă. Acest lucru a fost bine evidenţiat de numărul mare de studii focusate în acest scop. Cu
o vedere spre trecut este interesant de observat legăturile intime dintre metodele de evidenţiere
postelectroforetice de cele histochimice din care, majoritatea metodelor de evidenţiere au
provenit. În acelaşi timp, noi enzime continuă să fie descoperite, de unde noi probleme în
evidenţierea lor postelectroforetică.
Singurele probleme sunt întâmpinate din cauza faptului că activitatea enzimatică trebuie
demonstrată după rezolvarea gelului. Separarea proteinelor native care îşi menţin activitatea
nativă în timpul procesului electroforetic este una din metodele posibile. Alternativ, separarea
poate fi realizată în condiţii denaturante de exemplu în prezenţa dodecilsulfat de sodiu (SDS),
urmată de renaturarea în scopul recuperării activităţii enzimatice maxime. În orice instanţă,
activitatea poate fi determinată direct pe gel ori după transfer pe un suport potrivit. Alegerea
tehnicii electroforetice specifice va depinde de proprietăţile individuale ale enzimelor, de alţi
componenţi ale probei ori de rezoluţia maximă atinsă în condiţii native deoarece proteinele native
nu pot fi la fel de bine rezolvate precum cele denaturate.
Astăzi, detecţia activităţilor enzimatice sunt în mod uzual
realizate pe geluri plate verticale, mai mult decât pe geluri
cilindrice. Compararea proprietăţilor de migrare este mai uşor
realizată şi este de preferat în condiţii identice, faţă de cele
realizate în condiţiile gelurilor cilindrice. Pe de altă parte,
acoperirea cu tampon-substrat care conţine enzime auxiliare,
substrat, coenzime, ori alţi cofactori necesari poate fi produsă
maxim numai în cazul gelurilor plate, factori de asemenea
importanţi în detectarea activităţii. Alternativ, transferul pe alte
membrane poate reprezenta o altă alternativă în evidenţierea
postelectroforetică a activităţilor enzimatice.
Separarea electroforetică a protein-enzimelor poate fi însoţită de două trăsături diferite.
Este vorba de:
a. sarcina intrinsecă a proteinei, proprietate ce poate fi utiliza în procesul de migrare
electroforetică, sau de
b. sarcina extrinsecă, care poate fi indusă prin utilizarea unui tampon/tratament
adecvat.
Separarea pe baza sarcinii intrinseci, în electroliţi cu o singură valoare a pH-ului ori
prin focusare izoelectrică reprezintă alegeri atractive din cauza faptului că astfel se menţine
proteina în starea ei nativă, cu păstrarea activităţii, ce poate în acest mod determinată direct.
Electrofocusarea este în particular utilizată deoarece prin ea se rezolvă izoforme apropiate.
Separarea bazată pe sarcinile extrinseci are la bază denaturarea şi legarea SDS la
situsurile hidrofobe ale proteinei. Pornind de la aceasta, treapta de maturare este necesară după
electroforeză.
 Electroforeza în prezenţă de SDS reprezintă
una dintre cele mai comune forme de electroforeză în
gel. Ea se bazează pe separarea în funcţie de
mărimea proteinei la care domeniile hidrofobe ale
fiecărei molecule proteice interacţionează cu catena
alifatică a SDS, care sunt repartizate ca sarcini
extrinseci pe întreaga suprafaţă a proteinei.
Din nefericire, cele mai multe enzime sunt
inactivate de către SDS, numai un număr restrâns
reţinând activitatea chiar în prezenţa detergentului.
 PREPARAREA PROBEI ŞI ELECTROFOREZA EI

Înaintea oricărei separări şi localizări este necesar a cunoaşte proprietăţile enzimei luate în studiu,
precum:
pH-ul optim,
 necesităţile în cofactori, inclusiv a unor activatori cationici şi a cosubstratelor.
detergenţii, agenţii de oxidare sau alţi factori detrimentali care pot influenţa activitatea
enzimatică precum pH-ul şi mediul ionic trebuie monitorizaţi cu stricteţe, atât în timpul preparării
probei cât şi în timpul procesului electroforetic.
Este bine de notat că prezenţa coloranţilor de evidenţiere a migrării pot ei însuşi să denatureze
ireversibil o serie de enzime. Înaintea electroforezei este esenţial a se determina concentraţia
proteică şi a se efectua un test convenabil al activităţii enzimatice. O cantitate de 1 până la 10 g
de proteină pură reprezintă optimul în timp ce amestecurile de proteine pot conţine până la 100
g.
Este important a alege o cantitate optimă de soluţie proteică care să prezinte o activitate bine-
decelată în urma procesului de evidenţiere postelectroforetică, o cantitate prea mică făcând
dificilă identificarea enzimei în timp ce o încărcare mare va conduce la suprapunerea benzilor şi
la o distorsiune a lor.
Electrofocusarea este pe departe mult mai sensibilă la supraîncărcare, după cum proteina va
distorsiona în gradientul de pH.
În condiţiile în care toate informaţiile pertinente sunt obţinute,
este necesar un experiment pilot în determinarea activităţii
enzimatice. În acest scop, este preparat un gel care conţine toate
componentele necesare în timpul procesului de separare
electroforetică. Proba este plasată într-un godeu şi lăsată să
difuzeze în matricea gelului, fără migrare electroforetică. Metoda
de detecţie este astfel testată fără separare electroforetică, în
scopul stabilirii prezenţei sau absenţei agenţilor denaturanţi ori a
inhibitorilor în gel.
Dacă testele preliminarii relevă o inactivare a enzimei,
trebuie aleasă şi testată o altă strategie de evidenţiere în scopul
menţinerii activităţii enzimatice în timpul procesului
electroforetic.
Cele mai comune şi nedorite componente inhibitorii ale unei activități
enzimatice analizate pe gel de poliacrilamidă sunt:
 iniţiatorii reacţiei de polimerizare, persulfatul şi riboflavina,
 monomerul de acrilamidă nepolimerizat şi
 acidul acrilic, deseori prezent în amestecul de polimerizare. Există o serie
de căi în limitarea a efectului acestor componente. De exemplu, pre-
electroforeza gelului de separare, singur, înaintea polimerizării gelului de
concentrare va elimina iniţiatorii reacţiei de polimerizare care au capacitatea
de a oxida grupările tiol deseori implicate în actul catalitic.
O altă tehnică este aceea de a adăuga acid cisteic la tamponul de migrare,
care va "curăţa" gelul de peroxizi datorită faptului că acest acid va migra
alături de ionul lider, conducător.
Alternativ, gelurile subţiri (de 1 mm sau mai mici) pot fi imersate şi umectate
într-un tampon care conţine ditiotreitol în scopul îndepărtării oxidanţilor.
Eliminarea acidului acrilic poate fi realizată prin recristalizarea monomerului
de acrilamidă chiar înaintea polimerizării.
 PRINCIPIILE LOCALIZĂRII “IN SITU”A ENZIMELOR

Captura simultană a produsului reacţiei enzimatice.

Produsul reacţiei este cuplat cu un reactiv care
conduce la obţinerea unui produs colorat.
 Această tehnică este utilizată în toate cazurile în care
enzima rămâne activă în prezenţa reactivilor de
colorare.
 Marele ei avantaj este reprezentat de faptul că
procedura este realizată într-o singură treaptă, fără o
difuzie substanţială a enzimei în gel.
Postincubarea cuplată a substratului.
Această tehnică necesită o metodologie în două trepte.
Incubarea enzimei prezente în gel cu substratul este urmată
de incubarea cu un reactiv ce permite formarea unui produs
secundar colorat şi insolubil.
În cazul acesta, difuziunea se manifestă în timpul perioadei
iniţiale de incubare a gelului cu substratul.
Metode autocromice. Evoluţia
activităţii enzimatice poate fi
urmărită în mod direct prin
observarea modificărilor
proprietăţilor optice precum
absorbţia luminii sau fluorescenţa,
produsă de substrat sau de către
produsul de reacţie. O serie de
substrate sau coenzime îşi
modifică proprietăţile optice în
lumină vizibilă sau ultra violetă în
timpul reacţiei enzimatice.
Schimbarea fluorescenţei serveşte
de asemenea ca indicator în cazul
metodelor autocrome.
Analiza indicator-matrice.
Enzimele de cuplare auxiliare şi substratele
cu masă moleculară mare necesită o
incubare a gelului cu un strat care conţine o
matrice indicatoare, un gel suplimentar,
indicator. Incubarea de tip sandwich a gelului
de separare şi indicator conduce la
localizarea activităţii enzimatice. O variantă a
acestei tehnici o reprezintă incubarea după
separare cu o matriţă/membrană pe care
proteina a fost transferată şi imobilizată.
Astfel, după separare, proteina este
transferată din gel pe membrană prin tehnicile
descrise ca Western blotting.
Copolimerizarea substratului în gelul de separare.
Substraturile cu masă moleculară mare precum polimerii
carbohidraţi, proteinele sau acizii nucleici pot fi copolimerizaţi
în gelul de separare. Acest procedeu poate totuşi influenţa
separarea enzimei. În timpul electroforezei, activitatea
enzimatică poate fi stopată prevenindu-se astfel acţiunea ei
asupra substratului, de exemplu prin utilizarea unor inhibitori
reversibili precum SDS. După separare, gelul este spălat în
tampon fără detergent, ceea ce conduce la renaturarea sa.
O altă cale de prevenire a activării enzimei în timpul
procesului de electroforeză este reprezentată de incubarea
cu diverşi agenţi chelatori care leagă ionii metalici esenţiali.
După finalizarea procesului de separare gelul este incubat în
tampon care conţine cationul esenţial într-o concentraţie mai
mare decât cea a agentului chelator, şi prin aceasta se
restabileşte activitatea.
 Oxidoreductaze-
Detecţia directă a enzimelor NAD- şi NADP-
dependente prin conversia coloranţilor tetrazolici la
formazani

Aplicarea cu succes a acestei metode necesită ca sensul reacţiei enzimatice să

conducă la oxidarea substratului cu reducerea concomitentă a coenzimei
(formarea de NADH ori NADPH) Echivalenţii de reducere sunt apoi transferaţi
spre colorantul tetrazolic, reacţie de cele mai multe ori mediată de fenazin
metosulfat; astfel prin reducerea sării de tetrazoliu rezultă formazan, colorat şi
insolubil. Stoichiometria transferului necesită un echivalent de reducere la o
pereche de electroni transferaţi pentru formarea unui formazan din sărurile
monotetrazolice şi doi echivalenţi pentru sărurile ditetrazolice. Astfel, sărurile
monotetrazolice precum MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazoliu, tiazolil blue) sunt mult mai sensibile decât sărurile de sărurile
de ditetrazoliu. De exemplu, NBT (clorura de 2,2'-di -p-nitrofenil-5,5'-difenil-3,3'-
(3,3'-dimetoxi-4,4'-difenilen) tetrazoliu, în condiţiile reducerii incomplete,
conduce la un formazan de culoare roşie, în timp ce forma total redusă este
albastră.
 N

N+
CH3OSO3
CH3

Structura fenazin metosulfatului (N-Metilfenazin metilsulfat).

Compusul are rolul de a cupla transferul de electroni dinspre
NAD(P)H spre sărurile de tetrazoliu, făcînd astfel posibilă
urmărirea reducerii NAD(P)+.

Exemplu: -Glicerofosfat Dehidrogenaza

Amestecul de reacţie, 50 ml, este astfel preparat să conţină 25 mg de NAD+, 15 mg de

clorură de nitroblue tetrazoliu (NBT), 1 mg de fenazin metosulfat (PMS), 5 ml de -
glicerofosfat sare de sodiu, 1 M, pH 7,0 şi 10 ml de tampon Tris-HCI 0,2 M, pH 8,0. Gelul,
care conţine enzima, se incubează la 37°C până când apar benzile albastre. Gelul se clăteşte
cu apă, apoi se fixează într-un amestec etanol/acid acetic/glicerol/apă (5:2:1:4).
Este necesar a se utiliza un control pentru a arăta dependenţa culorii de substrat şi nu ca
efect al reducerii datorate luminii ori a oxidării produse de oxigen.
Formulele generale ale sărurilor de mono- (A) şi di-tetrazoliu (B)
 Evidenţierea alcool
dehidrogenazei, EC 1.1.1.1
• un alcool + NAD+ <=>
o aldehidă sau o
cetonă + NADH+H+

• NAD+, 1 mg/ml,
• PMS, 0,02 mg/ml,
• Nitro blue tetrazoliu,
0.2 mg/ml,
• Etanol, 0.1 M
 Schema reacţiei de identificare
postelectroforetică a Glutamat-Piruvat
Transaminazei.
L-Alanina + -cetoglutarat piruvat + L-glutamat
L-glutamat + APAD+ -cetoglutarat + APADH + NH3
PMS
APADH + MTT APAD+ + MTT-formazan

APAD= 3-acetilpiridin adenin dinucleotid,

APADH, forma redusa a 3-acetilpiridin
adenin dinucleotid. Se utilizează cuplul
redox APAD/ APADH datorită unui
potenţialul redox mai favorabil decât
NAD/NADH
 hemolytic uremic syndrome (HUS)

Proteinele (toxinele) Shiga

reprezintă o familie de toxine înrudite,
aparținând la două grupe majore, Stx1 si
Stx2, exprimate de gene considerate a fi o
parte a genomului profagilor lambda.
Toxinele sunt denumite după
Kiyoshi Shiga (1871-1957), primul care a
descris originea bacteriană a dizenteriei
cauzate de Shigella dysenteriae. Cele mai
frecvente surse de toxina Shiga sunt
bacteriile S. dysenteriae și grupul toxigen
Shiga a Escherichia coli (STEC), care
include serotipurile O157:H7, O104:H4,
precum și alte tulpini de E. coli
enterohemoragice.
Toxinele Shiga acționează prin inhibiția
sinteza proteinelor în interiorul celulelor
țintă printr-un mecanism similar cu cel
prezentat de toxina din ricin. Astfel, după
pătrunderea în celulă prin intermediul unui
macropinozom, proteina scindează o
nucleobază adenină specifică din ARN 28S
al subunității 60S ribosomale, ceea ce
conduce la stoparea (blocarea) sintezei
proteinelor.
 E. coli O157:H7 is a foodborne pathogen that causes food
poisoning.

Electroforeza pe gel de agaroză în câmp electric pulsator

(Pulsed-field gel electrophoresis , PFGE), este utilizată la identificarea
tulpinilor E. coli O157: H7 izolate.
O altă tehnică denumită multilocus variable number of tandem
repeats analysis (MLVA) este de asemenea utilizată pentru a clasifica
precis atunci când este dificil să se diferențieze între ele tulpinile de E
coli izolate prin PFGE.
Imunotestele/analizele enzimatice
(enzyme immunoassays, EIA),
sunt teste concepute pentru a
detecta antigeni sau anticorpi prin
intermediul unei enzime care
declanșează o schimbare de
culoare. Toate imunotestele
enzimatice utilizate în diagnosticul
serologic sunt cunoscute sub
numele de teste imunoenzimatice
în fază solidă. Aceste teste
presupun imobilizarea antigenelor
sau anticorpilor pe suprafețe
solide, cum ar fi granule din
plastic sau godeurile plăcilor de
microtitrare.

Direct Antigen EIA

 Competitive EIA
Noncompetitive EIA
Capture EIA