ARN POLIMERAZELE, TIPURI I FUNCII

Contents
Generaliti .................................................................................................................................3 ARN polimeraza la procariote .....................................................................................................5 ARN polimerazele la eucariote ....................................................................................................8 Bibliografie ............................................................................................................................... 11

Generaliti
Procesul de transcriere genetic este catalizat de o clas special de enzime numite ARN polimeraze. La organismele procariote eixst cte o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, aceasta realiznd sinteza tuturor tipurilor de ARN din celul. La eucariote, majoritatea celulelor dein cte 3 specii moleculare de ARN polimeraze, fiecare dintre ele sintetiznd anumite specii de ARN. ARN-polimeraza are capacitatea de a recunoate cu mare exactitate secvene specifice de baze azotate de pe matria de ADN, realiznd polimerizarea unor ribonucleozid -trifosfai liberi aliniai pe matri n virtutea complementaritii dintre bazele azotate . ARN-polimeraza catalizeaz formarea de legturi fosfodiesterice ntre ribonucleotidele succesive. Majoritatea procariotelor conin o singur ARN -polimeraz (cel mai bine fiind studiat cea de la E.coli), n timp ce n celulele eucariote au fost identificate trei tipuri de ARNpolimeraze, cu localizare nuclear (fie n nucleoplasm fie la nivelul nucleolului), specializate n sinteza unui anumit tip de ARN. ARN-polimeraza are capacitatea de a iniia sinteza de novo a unei catene ARN fr a fi necesar existena unui primer; ea citete catena de ADN pe care o copiaz n sensul 35, iar sinteza ARN se realizeaz n sensul 53. In acest mod, ribonucleozid -trifosfaii sunt adugai pe rnd la nivelul gruprii 3OH a ribonucleotidei anterioare, n urma reaciei de polimerizare fiind eliberate grupri pirofosfat. Transcrierea realizat de ARN -polimeraz este, n esen, asemntoare cu replicarea i prezint etapele de iniiere, elongare i terminare. Procesul de transcriere ncepe atunci cnd ARN-polimeraza se leag la nivelul unei regiuni specifice, numit promotor, localizat la extremitatea 5' a secvenei genice ce va fi transcris. Fenomenul debuteaz la nivelul aa numitului punct de start al transcrierii i se desfoar pn cnd ARN-polimeraza ajunge la nivelul unei secvene de terminare (terminator sequence) (fig.37). Aceast aciune definete o unitate transcripional care se ntinde de la promotor la secvena terminator i se refer de obicei la ARNm.

ARN polimeraza la procariote

Aceast enzim este una dintre cele mai mari proteine din celula bacterian, avnd o greutatea de 480 kd, un diametru de aproximativ 100 Angstromi i fiind vizibil i la microscopul electronic. O celul de E.coli conine n medie 7000 de molecule de ARN polimeraz. Holoenzima este format din 4 tipuri de subuniti: , b, b i . Subunitatea este dimerizat, formul general a enzimei fiind 2a . Subunitatea este codificat de gena rpoA i este dimerizat. Ea are un prim rol n asamblarea tuturor subunitilor enzimei, proces ce se desfoar n ordinea: 2 2- 2-- 2---. Fiecare monomer de este format din 3 regiuni: CTD reprezint domeniul carboxi-terminal al subunitii i se ataeaz direct la ADN, recunoscnd secvena UP din structura promotorilor. NTD reprezint domeniul amino -terminal al subunitii; nu se ataeaz direct la ADN, ci la subunitatea - linker polipeptidic ce are o structur flexibil i face legtura dintre cele 2 domenii terminale Subunitatea este codificat de gena rpoB i realizeaz formarea propriu-zis a legturilor fosfo-diesterice ntre ribonucleotide, acest proces desfurndu -se ntotdeauna n direcie 5 3. Subunitatea este codificat de gena rpoC i are rol n ataarea iniial, situs nespecific a ARN polimerazei la molecula de ADN. Subunitatea : Celula procariot conine mai multe specii moleculare de subunitate , fiecare recunoscnd anumii promotori i, deci, transcriind anumite gene. Astfel, n celula de E.coli, cele mai des ntlnite specii moleculare de sunt: 70 are o g.m. de 70 kd i codificat de gena rpoD; acest recunoate cele 2 secvene consensus TTGACA i TATAAT, fiind folosit de celula bacterian n condiii generale de mediu. Ca urmare, marea majoritate a genelor bacteriene sunt transcrise cu ajutorul acestei subuniti 70. 60 are g.m. 60 kd, este codificat de gena rpoN i este folosit de celul n condiii de privare de azot. 32 are g.m. de 32 kd, este codificat de gena rpoH i este folosit de celul n condiii de oc termic; cu ajutorul acestei subuniti sunt transcrise genele de oc termic. 24 are g.m. 24 kd, nu este cunoscut gena codificatoare i este folosit de celul n condiii de oc termic extrem; se pare c 24 particip la transcrierea u nui set de gene ce determin o moarte celular programat, o sinucidere celular (asemntoare proceselor de apoptoz de la celulele eucariote). 5

Procesul de iniiere debuteaz la nivelul unei secvene specifice de ADN numit promotor care interacioneaz cu enzima ARN-polimeraza. Secvena promotor ce precede orice gen a fost izolat pe baza experimentelor realizate la E.coli, prin amestecarea ARN-polimerazei cu ADN i apoi tratarea amestecului cu enzime care diger ADN dar las intact regiunea la care s-a legat ARN-polimeraz. n final, dup digestia enzimatic i ndeprtarea ARN polimerazei, a fost determinat ordinea nucleotidelor din secvena de ADN rmas (aproximativ 50-60 pb). Al doilea element esenial realizrii transcrierii este r eprezentat de ARN-polimeraz. Cea mai studiat enzim de acest tip este ARN-polimeraza de la E.coli. La aceast bacterie s-a evideniat faptul c exist aproximativ 7.000 molecule de enzim per celul, viteza de sintez fiind de 40 ribonucleotide/ secund la 37oC. Viteza de transcriere este comparabil cu cea de traducere (aproximativ 15 aminoacizi/secund), dar este cu mult mai mic dect viteza de replicare (800 nucleotide/secund). ARN polimeraza dependent de ADN sau transcriptaza este de fapt un comple x enzimatic cu structur cuaternar. ARN polimerazele, indiferent de origine, au n general aceleai trei funcii eseniale: aleg catena purttoare de informaie recunosc nceputul i sfritul mesajului genetic rspund la aciunea unor factori de reglare pozitiv sau negativ.

n ceea ce privete structura chimic, ARN-polimeraza de la E.coli are o mas molecular de 465 kDa i este alctuit din patru subuniti majore (2 subuniti i cte o subunitate i ') la care se mai adaug o subunitate . S-a demonstrat c miezul enzimatic al ARN-polimerazei poate realiza sinteza de ARN dar nu poate iniia n mod corect procesul de transcriere pentru care este obligatorie asamblarea i a factorului . Dup ce procesul de transcriere a fost iniiat, iar lungimea catenei de ARN a ajuns la 8-9 ribonucleotide, factorul se desprinde de holoenzim, apoenzima continund 6

singur sinteza ARN. Iniial, ARN-polimeraza recunoate i se leag la nivelul regiunii 35, considerat de unii autori ca fiind situsul R ("recognition"), dup care contactul cu ADN se extinde i la regiunea 10 (situsul B, de legare strns). Segmentul din ADN ce va fi transcris va suferi o denaturare fiziologic n zona de start a transcrierii: la nivelul su cele dou catene complementare se separ prin desfacerea punilor de hidrogen dintre, aproximativ, 12 pb situate ntre regiunea 10 i punctul de start i se formeaz astfel un ochi de transcriere (bucl de transcriere sau vezicul de transcriere = transcription bubble). Aceast denaturare local a ADN este favorizat de faptul c regiunea 10 este bogat n AT. Se spune n acest caz c ARN-polimeraza formeaz mpreun cu ADN un complex promotor deschis. De asemenea, pe lng rolul de a sintetiza efectiv sinteza ARN, ARN -polimeraza realizeaz n plus derularea duplexului n direcia de naintare a veziculei de transcriere i respiralizarea ADN n urma acesteia. Lungimea regiunii de ADN temporar denaturat variaz n funcie de faza de sintez a ARN, de la 12 pb la 20 pb, dar mrimea regiunii hibride ADN-ARN (intermediar de transcriere) este mult mai mic. Dup desfacerea localizat a legturilor de hidrogen dintre cele dou catene ale ADN ncepe sinteza ARN, prima ribonucleotid fiind, de regul, purinic (AMP sau GTP). Deseori, n procesul de iniiere a transcrierii, regiunea promotor este mult mai mult dect un situs de legare pentru ARN polimeraz. Ea conine informaia pentru legarea, n unele cazuri, a factorilor de reglare accesorii, de tipul AMPc CAP (adenozin-monofosfat ciclic catabolite activation protein = CAP = proteina receptoare a AMPc= CRP). Iniierea transcrierii face s fie ataat la matri primul NTP care ofer gruparea 3'-OH ce va fi pus n legtur de ctre ARN-polimeraza cu gruparea 5'- fosfat a nucleotidului urmtor prin reacia ce poart numele de atac nucleofilic. Subunitatea a enzimei catalizeaz formarea legturii fosfodiesterice i astfel ncepe procesul de elongaie a monocatenei poliribonucleotidice, finalizat printr-o molecul de ARN. Sinteza catenei ARN, adic transcrierea genetic se realizeaz n direcia 5'3', aceasta fiind direcia de elongaie, matria de ADN fiind citit totdeauna n direcia 3'5', astfel c matria i produsul de transcriere sunt antiparalele. Spre deosebire de ADN-polimeraz care are numai specificitate de direcie, ARNpolimeraza are i specificitate de secven recunoscnd promotorul genei care trebuie s funcioneze la un moment dat. Incheierea procesului de transcriere se poate realiza la bacterii prin do u mecanisme: unul care este determinat doar de secvena de ADN i altul care necesit prezena unor proteine specifice. In cazul anumitor procariote, la captul unor gene transcrise se afl secvene de nucleotide ce corespund regiunii de terminare, care determin formarea la nivelul ARNm corespunztor a unei structuri de tip trunchi i bucl (stem and loop).

n cazul celui ce-al doilea mecanism de terminare a transcrierii este implicat o protein specific numit factorul rho. Aceasta se ataeaz la ARNm n curs de formare i se deplaseaz de-a lungul moleculei n urma ARN-polimerazei. Atunci cnd aceasta ajunge la nivelul regiunii de stopare a transcrierii, ARN-polimeraza i ncetinete foarte mult activitatea de polimerizare astfel c factorul rho poate s interacioneze cu ARN-polimeraza. Factorul rho are aciune helicazic specific asupra hibrizilor ADN-ARN formai n cursul transcrierii, rezultatul final al activitii sale fiind detaarea ARNm de matri i ncheierea transcrierii.

ARN polimerazele la eucariote

n sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfoar n mod similar cu cel de la procariote. Exist totui o serie de diferene. Astfel, n timp ce la procariote exist o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, la eucariote exist, n majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3 ARN polimeraze de la eucariote sunt nrudite i structural i funcional. Cu toate acestea, cele 3 enzime iniiaz transcrierea de la promotori diferii i transcriu gene diferite : - ARN polimeraza I transcrie n mod special gene ce codific pentru ARN ribozomal - ARN polimeraza II transcrie mai ales gene ce codific ARN mesager - ARN polimeraza III transcrie mai ales ARN de transfer i o serie de molecule mici de ARN, de exemplu ARN nuclear mic i nucleolar mic Alte diferene importante apar i n ceea ce privete factorii de transcriere. Astfel, dac la procariote iniierea transcrierii necesit doar facotrul , la eucariote debutul a cestui proces necesit mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali. n general, structura promotorilor pentru ARN polimeraza I i III este mai simpl dect a promotorilor pentru ARN polimeraza II, dei i aceste 2 enzime necesit factori de transcriere. Aa cum s-a menionat deja, localizarea nuclear a acestor enzime este variat: prima este localizat la nivelul nucleolului, iar celelalte dou se gsesc n nucleoplasm. Toate cele trei enzime sunt agregate macromoleculare, de cel puin 500 kD, avnd mai multe subuniti polipeptidice (8-14 subuniti). La eucariote, pe lng ARN-polimerazele nucleare au mai fost identificate i ARN-polimeraze care funcioneaz la nivelul organitelor citoplasmatice (mitocondrii i cloroplaste), dar acestea sunt de dimensiuni mai mici i sunt asemntoare enzimelor bacteriene. Nici una dintre cele trei tipuri de ARN-polimeraze de la eucariote nu recunosc promotorul n mod direct ci prin intermediul unor factori de transcriere, iniiindu -se astfel procesul de transcriere. Factorii de transcriere au aceleai funcii pentru toate tipurile de ARN polimeraze, numrul lor fiind mai mare n cazul ARN-polimerazei II; ei au fost grupai n trei categorii: 8

 factori generali necesari pentru iniierea sintezei ARN indiferent de tipul de promotor. Ei interacioneaz cu ARN-polimeraza formnd un complex macromolecular localizat n jurul punctului de start i determinnd situsul de iniiere. Factorii generali de transcriere mpreun cu ARN-polimeraza alctuiesc aparatul de transcriere; factori suplimentari din amonte (upstream factors) sunt proteine de legare la ADN ce recunosc anumite secvene de nucleotide comune mai multor promotori (elemente de consens) localizate n faa (spre captul 5) punctului de start. Activitatea acestor factori nu este supus unor mecanisme reglatoare, ei acionnd la nivelul oricrui promotor ce conine situsul de legare corespunztor. Ei au efect de cretere a eficienei iniierii i determin funcionarea promotorilor la un nivel adecvat. Setul specific de asemenea factori necesari pentru o exprimare optim este caracteristic fiecrui promotor; factorii inductibili funcioneaz ntr-o manier similar factorilor suplimentari dar ei au un rol reglator. Aceti factori sunt sintetizai sau activai n anumite momente sau n anumite esuturi i sunt responsabili de controlul n timp i spaiu al transcrierii. Promotorul reprezint un alt element esenial procesului de iniiere a transcrierii, el coninnd regiunile de recunoatere pentru ARN-polimeraz i pentru factorii de transcriere. Promotorii ce conin situsurile pentru factorii generali i pentru cei suplimnetari din amonte vor fi transcrii n orice tip de celul, ei fiind responsabili de exprimarea genelor cu funcionare constitutiv. Iniierea specific a transcrierii de ctre ARN-polimeraza II necesit intervenia i a altor elemente de control, cum sunt factorii inductibili. Acetia pot interaciona att cu factorii suplimentari ct i cu cei generali (interaciunea este de tip protein-protein) precum i cu secvene de nucleotide localizate n faa punctului de start al transcrierii. Prima secven dintre cele menionate (centrat pe nucleotida din poziia 30, raportat la situsul de start) este denumit cutia Hogness, cuprinde o secven de 7 nucleotide TATAAAA i este echivalent cutiei Pribnow de la procariote (Young, 1991). Aceast secven este esenial pentru iniierea transcrierii ea fiind regsit, cu aceeai succesiune de nucleotide, la majoritatea genelor de la eucariote. Din acest motiv, aceast secven, ca de altfel i secvenele 75 i 90, au fost denumite secvene consens, avnd caracter de generalitate. La nivelul cutiei TATA se leag direct factorul TBP, iar aceast secven mpreun cu regiunea iniiator din imediata vecintate a punctului de start sunt responsabile de asigurarea startului corect al transcrierii de ctre ARN-polimeraza II. A doua secven, centrat pe nucleotida din poziia 75, se numete cutia CAAT ea fiind, de asemenea, o secven consens (5 GGCCCAATCT 3). Sensibilitatea la mutaii a acestei secvene sugereaz faptul c ea joac un rol important n determinarea puterii unui promotor. Pe lng cele dou secvene menionate, n zona 90 a majoritii promotorilor se gsete aa numita cutie GC, cu secvena consens GGGCGG. Deseori, la nivelul multor promotori exist copii multiple ale acestei secvene, ele putnd funciona n ambele orientri. 9

5.1.2.3. Terminarea transcrierii la eucariote Dac la procariote aspectele legate de nc heierea transcrierii sunt relativ clare, la eucariote lucrurile nu stau la fel. Astfel, nu se cunoate cum are loc acest proces n cazul genelor eucariote nefiind identificate semnalele de terminare a transcrierii. Experimentele efectuate cu ARN-polimeraza II au evideniat c aceast enzim, atunci cnd ajunge n regiunea 3 a genei transcrise, determin sinteza unei secvene AAUAAA (conform matriei de ADN) dar, se pare c sinteza ARN continu i dup aceast secven. In final, o enzim special taie produsul de transcriere la o scurt distan dup secvena AAUAAA, dup care, o alt enzim independent de matri (poliA polimeraza), adaug o serie de nucleotide cu adenin (aproximativ 200), utiliznd ca surs de nucleotide ATP, formnd coad a poliA (poliadenilat) la nivelul creia se leag proteine specifice. Deoarece coada poli A lipsete n cazul ARNm pentru histone, nseamn c aceasta nu este esenial pentru transcriere. Se pare c aceast secven, adugat dup ce procesul de transcr iere s-a ncheiat, ar fi implicat n asigurarea stabilitii moleculei de ARN n celul (Ross, 1995).

10

Bibliografie
1. Stoica I., Vassu T., Ssrman E., 2002 Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor. Colecia de culturi microbiene. Ed. Arvin Press. 2. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian. Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti. 3. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne. 4. Jun MA, 2006, gene Expresion and Regulation, Ed. Higher Education Press 5. http://www.referate4all.ro/referate-Medicina/Exprimarea_informatiilor_genetice842 6. http://alexaionescu.wordpress.com/tag/arn-polimeraza/ 7. http://voifidoctor2.files.wordpress.com/2013/02/93008957.pdf

11