ACIZI NUCLEICI (ADN, ARN)

Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt molecule informaţionale care permit stocarea, transmiterea şi
exprimarea mesajului genetic.
Structura
Acizii nucleici sunt formaţi din catene polinucleotidice realizate prin stabilirea de legături
covalente între nucleotide. Prin hidroliza acizilor nucleici în mediu acid se formează baze
azotate, pentoze şi acid fosforic.
a) - bazele azotate care intră în compoziţia ADN pot fi baze purinice (adenina, guanina) sau baze
pirimidinice (uracil, timină, citozină).
ADN conţine timină, iar ARN conţine uracil.
b) - pentozele se găsesc sub formă ciclică, β-furanozică
- ADN conţine D2-deoxiriboză
- ARN conţine D2-riboză.
- prin stabilirea unor legături N-glicozidice între gruparea semiacetalică a pentozei şi atomul de
azot din poziţia 9 a unei baze purinice sau din poziţia 1 a unei baze pirimidinice -> nucleozide
- esterii fosforici ai nucleozidelor la gruparea hidroxil de la atomul de carbon din poziţia 5' sau 3'
din pentoză -> nucleotide
- acizii nucleici conţin nucleozid-5'-fosfaţi
- prin stabilirea unor legaturi fosfodiesterice între deoxiribonucleotide -> catenă
- toate legăturile internucleotidice au aceeaşi orientare de-a lungul unui lanţ
polinucleotidic, astfel că fiecare catenă are o anumită polaritate
- structura unei catene este scrisă întotdeauna în direcţia 5'→ 3'
Proprietati fizico-chimice
Stabilitatea acizilor nucleici este dată de interacţiile hidrofobe şi de tip dipol-dipol dintre bazele
azotate. Legăturile de hidrogen determină specificitatea de interacţie dintre bazele azotate.
În prezenţa acizilor tari, cum ar fi acidul percloric, acizii nucleici suferă un proces de hidroliză
completă, cu formarea de baze azotate, pentoze şi acid fosforic. La pH = 3-4 are loc hidroliza
legăturilor glicozidice şi acizii nucleici devin apurinici.
In condiţii alcaline sau la temperaturi cuprinse între 95-100°C are loc procesul de denaturare a
acizilor nucleici care constă în ruperea legăturilor de hidrogen dintre cele două catene de ADN şi

1
suprimarea interacţiilor van der Waals. În timpul acestui proces are loc tautomeria bazelor
azotate şi trecerea acestora la forma enolică.
Denaturarea ADN este reversibilă. Prin restabilirea valorilor de pH sau temperatură la valori
fiziologice are loc procesul invers, de renaturare, în urma căruia cele două catene de ADN vor
reforma dublul helix.
In condiţii alcaline ARN este foarte susceptibil la hidroliză. Gruparea –OH din poziţia 2' a
pentozei execută un atac nucleofilic asupra legăturii fosfodiesterice şi are loc formarea unui
fosfodiester ciclic 2'-3' care va suferi o nouă hidroliză cu formarea unui monofosfat în poziţia 2'
sau 3'.
Bazele azotate din structura acizilor nucleici absorb în UV. Maximul de absorbţie al acizilor
nucleici este la 260 nm şi este diferit de maximul de absorbţie pentru proteine care este la 280
nm. Această proprietate poate fi utilizată pentru detecţia, cuantificarea şi evaluarea purităţii
probelor care conţin acizi nucleici.

Structura ADN
Watson şi Crick au elaborat un model tridimensional al macromoleculei de ADN: două lanţuri
polideoxiribonucleotidice antiparalele se răsucesc elicoidal şi în acelaşi sens în jurul unui ax
comun formând un dublu helix cu orientare spre dreapta. Inelele glucidice conectate prin
legături fosfodiesterice constituie scheletul extern al dublului helix, în timp ce bazele azotate cu
caracter hidrofob sunt orientate spre interior şi perpendicular pe axa helixului.

2
 Acizii ribonucleici
Acizii ribonucleici au funcţii şi structuri diferite în celulă :
A. ARN mesager (ARNm) este sintetizat în nucleu pe baza informaţiei genetice din ADN
prin procesul de transcriere. Este o moleculă monocatenară liniară, de lungime variabilă.
Succesiunea tripletelor de nucleotide (codoni) din ARNm va dicta succesiunea aminoacizilor
dintr-un lanţ polipeptidic.
ARNm monocistronic (monogenic) conţine informaţia pentru sinteza unui singur lanţ
polipeptidic. ARNm policistronic (poligenic) conţine informaţia necesară pentru sinteza mai
multor lanţuri polipeptidice.
B. ARN de transfer (ARNt)
ARNt nuclear (nu şi cel mitocondrial) are o conformaţie în formă de “frunză de trifoi” cu patru
zone de perechi complementare şi trei necomplementare expulzate în formă de buclă. La capătul
5' cele mai multe molecule de ARNt au acid guanilic. La capătul 3' prezintă secvenţa CCA.
ARNt conţine anticodonii (regiuni complementare cu codonii din ARNm). Încorporarea
aminoacizilor în lanţul polipeptidic în curs de sinteză are loc pe baza recunoaşterii codon-
anticodon care va duce la stabilirea unor legături de hidrogen între bazele complementare din
codon şi anticodon).

Structura ARNt
C. ARN ribozomal (ARNr) – are funcţii catalitice.
D. ARN nuclear de mici dimensiuni (ARNsn) intervine în eliminarea intronilor din ARNm
transcript primar.

3
 Structura ADN si a ARN

PROCESUL DE REPLICARE
Procesul de biosinteză a ADN se numeşte replicare.
În timpul procesului de replicare are loc desfacerea duplexului de ADN parental şi sinteza unor
catene complementare cu fiecare dintre cele două catene parentale, în final obţinându-se două
molecule identice de ADN. Sinteza ADN se desfăşoară sub acţiunea ADN polimerazei şi începe
de la nivelul unui primer ARN sintetizat sub acţiunea primazei. Replicarea începe la nivelul unor
regiuni specifice de ADN denumite ORI ( origine de replicare).
Procesul de "templating" este procesul în care nucleotidele de pe o catenă de ADN sunt
”copiate” într-o secvenţă complementară de ADN sau ARN. Acest proces presupune
recunoaşterea fiecărei nucleotide de pe ADN template (matriţă) de către o polimerază care va
adăuga nucleotide complementare, nepolimerizate, la lanţul polinucleotidic în curs de sinteză.
Replicarea ADN este un proces semiconservativ. În urma acestui proces vor rezulta două
molecule de ADN identice, fiecare conţinând o catenă nou-sintetizată şi o catenă parentală.
Replicarea ADN este un proces semidiscontinuu – pe una dintre catene sinteza are loc continuu,
pe cealalta discontinuu.,

4
 PROCESUL DE TRANSCRIERE
Sinteza ARN mesager se face pe baza informaţiei specificată de o secvenţă de ADN, prin
procesul de transcriere. ARN mesager conţine informaţia necesară pentru sinteza unui lanţ
polipeptidic. Sinteza ARN se face în direcţia 5'→3' şi este catalizată de către ARN polimerază.
Există numeroase diferenţe între sinteza ADN şi ARN:
- ARN este sintetizat din ribonucleozid trifosfaţi, iar ADN din deoxiribonucleozid
trifosfaţi;
- ARN conţine uracil, iar ADN conţine timină;
- sinteza ARN nu presupune existenţa unui primer. ARN polimeraza poate iniţia sinteza de
novo a unei molecule de ARN dar nu are acţiune autocorectoare. Astfel, creşte rata
erorilor de încorporare greşită a nucleotidelor (1/104) care este în general tolerabilă;
- sinteza ARN este foarte selectivă, numai anumite regiuni ale genomului fiind transcrise.

Procesul de transcriere
Etapele procesului de transcriere sunt următoarele:
A. Iniţierea sintezei catenei de ARN are loc de la nivelul situsului de start prin formarea
primei legături fosfodiesterice între două NTP-uri de către ARN polimerază. ARN polimeraza se
leagă la capătul 5' al unei gene într-o regiune specifică denumită promotor. Promotorul la
procariote este format din două regiuni foarte bine conservate alcătuite fiecare din câte şase
nucleotide –casetele – 35 (TTGACA) şi – 10 (TATAAT) – (situate la 35 de nucleotide, respectiv
10 nucleotide înaintea situsului de start (reprezentat de nucleotidele de la nivelul cărora începe
transcrierea propriu-zisă).

5
Promotorul orientează ARN polimeraza într-o anumită direcţie şi determină astfel care dintre
cele două catene de ADN va servi ca template (catena antisens, negativă) pentru sinteza ARN.

II. Sinteza ARNm are loc în direcţia 5'→3' până in momentul in care ARN polimeraza întâlneşte
o a doua secvenţă specială – secvenţa stop – la nivelul căreia polimeraza se opreşte eliberând atât
cele două catene de ADN cât şi catena de ARN nou sintetizată. Helixul ADN-ARN este format
din aproximativ 12 perechi de baze. Dublul helix de ADN se reface permanent după ce o regiune
este transcrisă.
III.Finalizarea procesului de transcriere se poate face prin două tipuri de mecanisme.
- mecanism este dependent de proteina Rho
- mecanism ndependent de rho – presupune sinteza unei secvente bogate in G si C care
formeaza o structura secundara hairpin
PROCESUL DE TRANSLATIE
Sinteza proteinelor (translaţia) are loc în citoplasmă, la nivelul ribozomilor. Ribozomii sunt
complexe ribonucleoproteice alcătuite din două subunităţi, o subunitate ribozomală mare şi o
subunitate ribozomală mică.
Subunitatea ribozomală mare catalizează formarea legăturilor peptidice. Ribozomii prezintă
patru situsuri de legare pentru ARN (un situs de legare a ARNm, situsul A la care se leagă
aminoacil – ARNt, situsul P pentru peptidil – ARNt, situsul E – la nivelul căruia se leagă ARNt
după încorporarea aminoacidului corespunzător în catena polipeptidului în curs de sinteză).
Sinteza proteinelor se desfăşoară în mai multe etape:
A. Iniţierea translaţiei presupune intervenţia unor factori de iniţiere (de ex. eIF2) care au rol atât
în poziţionarea moleculelor aminoacil – ARNt la nivelul situsurilor A şi P, cât şi în prevenirea
asocierii premature a subunităţilor ribozomale. În această etapă situsul P leagă o moleculă de
aminoacil – ARNtmet (aminoacidul iniţiator la eucariote este metionina). După legarea

6
următorului aminoacid legat de ARNt corespunzător la nivelul situsului A, conform informaţiei
din ARNm, va avea loc formarea primei legături peptidice.
B.Elongarea lanţului polipeptidic reprezintă adăugarea succesivă a aminoacizilor în lanţul
polipeptidic în curs de sinteză. Această etapă necesită prezenţa factorilor de elongare (EF-TU la
procariote, EF-I la eucariote).
C. Terminarea sintezei proteice are loc în momentul în care ribozomul întâlneşte unul dintre
codonii stop (UAA, UAG, UGA). Sub influenţa factorilor de eliberare peptidiltransferaza
catalizează adiţia unei molecule de apă în locul unui aminoacid la peptidil-ARNt. Prin această
reacţie este eliberat lanţul polipeptidic în citoplasmă. Ribozomul va elibera apoi molecula
ARNm care va fi degradată în citoplasmă. Ulterior ribozomul disociază în cele 2 subunităţi
componente care se pot asambla pe o alta moleculă de ARNm pentru a începe sinteza altei
proteine.

PURIFICAREA PLASMIDELOR
Această metodă presupune liza celulelor în condiţii alcaline şi în prezenţa unui detergent, sodiu
dodecilsulfat (SDS).
Este utilizată pentru purificarea plasmidelor din culturi bacteriene deoarece, în condiţii alcaline,
are loc doar denaturarea ADN genomic. ADN plasmidial, de dimensiuni mici, rămâne în formă
circulară şi nu suferă procesul de denaturare.
Prin neutralizare, în prezența acetatului de potasiu, are loc precipitarea proteinelelor, debriurilor
celulare şi a ADN genomic sub forma unor macrocomplexe care sunt învelite în SDS.
După centrifugare, ADN plasmidial poate fi purificat din supernatant prin precipitare cu alcooli.

7
 Extractia și purificarea ADN plasmidial

Extracția și purificarea ARN

Moleculele de ARN (ARN ribozomal, ARN de transfer și ARN mesager) sunt instabile și se
degradează destul de ușor, mai ales în prezența RN-azelor, enzime care sunt stabile la
temperaturi destul de ridicate și se pot replia după denaturare termică.
Extracția și purificarea ARNm

8
ARNm din celulele eucariote conține la capătul 3' o secvență poliadenilică (poly(A)) de
aproximativ 250 baze și poate fi purificat prin cromatografie de afinitate. În prezența soluțiilor
tampon cu conținut mare de săruri (NaCl sau KCl 0,3-0,5M) această secvență va hibridiza cu
oligo(dT)-celuloza sau poli(U)-sefaroza. Moleculele de ARN ribozomal sau ARN de transfer nu
conțin această secvență astfel că nu se vor lega la matrixul cromatografic.
ELECTROFOREZA ADN
Electroforeza ADN presupune migrarea moleculelor de ADN, într-un anumit mediu, sub
acțiunea câmpului electric. Moleculele de acid nucleic sunt încărcate negativ datorită grupărilor
fosfat, astfel că la aplicarea unui câmp electric acestea vor migra către polul încărcat pozitiv.
Migrarea probelor cu ADN se face într-un mediu suport reprezentat, de obicei, de un gel obținut
prin polimerizarea agarozei sau a poliacrilamidei.
În general, electroforeza ADN se face în sisteme orizontale, în care gelurile de agaroză sau
poliacrilamidă sunt imersate în sistemul tampon. Probele cu ADN, plasate la nivelul godeurilor,
se vor deplasa sub acțiunea câmpului electric către polul pozitiv.

9
Migrarea electroforetică a ADN se face în prezența unui marker de masă moleculară (colecție de
fragemente de ADN de mărimi cunoscute).
Polimerii folosiți la prepararea gelurilor pentru separarea probelor de ADN prin electroforeză
sunt agaroza și poliacrilamida.
Bromura de etidiu este colorantul cel mai utilizat pentru geluri de agaroză sau de poliacrilamidă
în care au fost separate probe cu acizi nucleici. Se intercalează între catenele de ADN sau ARN
bicatenar, stabilind interacții de tip necovalent. Fluorescența bromurii de etidiu crește de
aproximativ 25 de ori după interacțiunea cu molecule bicatenare de ADN și de aproximativ 21
de ori după legarea la moleculele de ARN bicatenar. Acest compus se leagă la nivelul
moleculelor de ADN monocatenar sau tricatenar. In vivo, acționează ca agent mutagen.
Vizualizarea se face la un transiluminator dotat cu lampă UV – roz portocaliu.
SYBR Green este un colorant foarte sensibil pentru acizii nucleici, cu background scăzut în gel
de agaroză sau poliacrilamidă. Vizualizarea se face, ca și în cazul bromurii de etidiu, la
transiluminatoare dotate cu laser sau lampă UV - verde.

Sinteza ADN in vitro. Tehnica PCR

Prin tehnica PCR (polymerase chain reaction, reacţia în lanţ a polimerazei) se pot
amplifica in vitro regiuni specifice dintr-o secvenţă de ADN.
Delimitarea secvenţelor amplificate se face cu ajutorul a două secvenţe oligonucleotidice
sintetice denumite primeri, care se vor ataşa la secvenţele complementare din molecula de ADN
template şi vor iniţia procesul de amplificare de către ADN polimerază în prezenţa celor patru
deoxinucleotidtrifosfaţi (dNTP).
Secvenţele de ADN sintetizate în cursul unei reacţii de PCR se numesc ampliconi.
Fiecare etapă este optimizată în funcţie de ADN template şi în funcţie de perechea de
primeri care se foloseşte pentru amplificare.
1, Denaturarea ADN se face la 94°C timp de 15 secunde -
2 minute. În această etapă are loc separarea celor două catene de ADN.
2. Hibridizarea (annealing-ul) primerilor la secvenţele complementare de ADN
monocatenar are loc la temperaturi cuprinse între 40-60°C, timp de 15-60 secunde.

10
 3. Sinteza ADN se face sub acţiunea ADN polimerazei la 72°C timp de 1-2 minute, în
funcţie de mărimea secvenţei care se va amplifica şi în funcţie de viteza de polimerizare a
enzimei utilizate.

Principiul PCR

Factorii care influenteaza reactia PCR

Dintre factorii care influenţează desfăşurarea reacţiei PCR enumerăm:
- Secventele primer;
- ADN polimeraza utilizată si concentratia acesteia;
- Prezenta ionilor de Mg2+;
- Calitatea și cantitatea ADN template utilizat în reactie;
- Prezenta unor activatori sau a unor inhibitori in mediul de reactie;
Secvenţele primeri

11
 • Primerii sunt secvenţe oligonucleotidice sintetice care se ataşează la secvenţele
complementare din molecula de ADN template şi iniţiază procesul de amplificare sub
acţiunea ADN polimerazei în prezenţa celor patru tipuri de dNTP-uri.
• Primerii trebuie să îndeplinească anumite condiţii:
¬ trebuie să fie constituiţi, în general, din 18-25 nucleotide;
¬ trebuie să conţină un procent de 50-60% G şi C ;
¬ între temperaturile de topire (melting) ale celor doi primeri nu trebuie sa fie o diferenţă mai
mare de 5ºC;
Temperatura de topire (melting temperature) reprezintă temperatura la care modificarea
absorbanţei este 50% din cea totală, corespunzătoare unei denaturări complete.
Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C
¬ temperatura de annealing se calculează astfel încât să fie mai mică cu 5ºC sub temperaturile de
melting ale celor doi primeri;
¬ se evită complementaritatea primerilor care ar duce la formarea unor dimeri şi implicit la
apariţia unor artefacte;
¬ la capete este bine ca primerii să conţină nucleotidele G şi C;
Concentraţia ionilor Mg2+
În general,pentru reacţiile PCR se utilizează concentraţii Mg 2+ cuprinse între 0,5 şi 2,5
mM. Prezenţa EDTA poate perturba bunul mers al reacţiei, prin chelatarea ionilor Mg2+.
Cantitatea de template utilizată în reacţia PCR
Dacă se utilizează
- o cantitate prea mică de ADN template - amplificare scăzută
- cantităţi prea mari de ADN template - amplificarea nespecifică a ADN.
Prezenţa unor inhibitori sau activatori ai reacţiei PCR
Inhibitori – detergenti, EDTA.
Dintre activatori – glicerolul.

Real time PCR

12
Real time PCR este o metodă care combină tehnica PCR cu utilizarea moleculelor fluorescente
reporter pentru a monitoriza producerea ampliconilor în timpul reacţiei de PCR. Metoda prezintă
o sensibilitate excelentă, este foarte specifică, reproductibilă și prezintă un risc scăzut de
contaminare a probelor.
Metodele chimice pentru detecție în real time PCR au fost clasificate în două categorii:
• cu molecule care se intercalează la nivelul ADN bicatenar;
• cu oligonucleotide marcate cu fluorofori: probe pentru hidroliza – probe Taqman

PCR DIGITAL
• PCR digital reprezintă o alternativă pentru tehnica PCR în timp real cantitativ.
• PCR digital – 2 tipuri:
A. PCR digital în microcamere
B. PCR digital în emulsie
• Prin PCR digital sunt numărate individual moleculele de ADN amplificat, ceea ce
permite o cuantificare absolută a acestora. Se face o repartiție a probelor negative (cele
care nu conțin produs amplificat) și a celor pozitive (care conțin ADN amplificat). Fracția
probelor negative va genera un număr absolut pentru moleculele țintă din probă fără să
fie necesar un control sau un standard.

Principiul PCR digital

Tehnica IMAC

13
Această tehnică de purificare a proteinelor se bazează pe afinitatea ionilor metalici de Zn2+, Cu2+,
Ni2+, Co2+ pentru aminoacizii histidină şi cisteină din proteine, în soluţii apoase.
Dintre liganzii care interacţionează cu ionii divalenţi se pot menţiona:
NTA, acid nitrilotriacetic, coordinează ionii Ni2+ cu patru valenţe, în timp ce două valenţe sunt
disponibile pentru interacţia cu inelul imidazolic din resturile de histidină;
CM-Asp, carboximetil aspartat, este un alt ligand tetradentat care este disponibil în formă
comercială ca şi rășină încărcată cu Co2+;

Interacția ionilor Ni2+ cu proteine cu His-tag

Firma Clontech comercializează pentru purificarea proteinelor cu His-tag rășini TALON care
utilizează o tehnologie patentată în care sunt folosite rășini cromatografice cu Co2+.
Etape de lucru
- Echilibrarea coloanei
- Aplicarea probei cu proteine
- Spalarea coloanei – solutie tampon cu imidazol – cantitate mica
- Eluarea proteinei cu His-tag – solutie tampon cu cantiate mare de imidazol
Imidazolul competitioneaza cu proteinele cu His-tag pentru Ni2+

SEPARAREA PROTEINELOR PRIN GEL FILTRARE

- Separarea se face pe baza diferentelor de mase moelculare

14
- Matrixul este inert din punct de vedere chimic
- Beads-urile cromatografice prezinta pori de anumite dimensiuni – moleculele de
dimensiuni mici sunt retinute la nivelul porilor si sunt eluate ultimele de pe coloana
cromatografica

15