1

Curs 4 Biologie moleculara 12-03-2013

ARN polimeraza ADN dependenta si primaza
In celula de la E.coli aceste 2 enzime sunt implicate in sinteza primerilor ARN de pe catena leading si
lagging. De asemenea, ribonucleaza H, dar si ADN polimeraza I sunt enzime care au rolul, la PK, de a
digera primerii ARN in vederea inlocuirii acestora cu fragmente ADN.
Ultima enzima implicata in finalizarea procesului de replicare este ADN ligaza.
Enzima catalizeaza sinteza unei singure legaturi fosfodiesterice intre gruparea 3OH si gruparea
5fosfat la capetele a 2 fragmente de ADN. Enzima este implicata atat in procesul de replicare, cat si
in procesul de reparare sau recombinare. ADN ligaza nu poate actiona asupra a 2 fragmente de ADN
monocatenar, ci isi poate desfasura actiunea numai la nivelul unui dublu helix care are una dintre
monocatene intrerupta ( dublu helix cu crestatura ). Reactia catalizata de ADN ligaza necesita aport
energetic extern care este furnizat de NAD in cazul PK, respective de ATP in cazul EK si a unor
bacteriofagi.
In cazul E.coli, ADN ligaza este o proteina monomerica care catalizeaza reactia de formare a
legaturilor fosfodiesterice in 3 etape successive:
in prima etapa are loc adenilarea ADN ligazei => gruparea adenil apartinand NAD este transferata
la nivelul gruparii NH din pozitia a unui rest de Lys => un derivate adenilat al enzimei
in cea de-a doua etapa, restul adenil de la nivelul enzimei activate este transferat la extremitatea 5
fosfat libera a unui fragment ADN => se formeaza un intermediar AMP ADN in care AMP este legat
printr-o punte pirofosfat de capatul 5 liber.
in cea de-a treia etapa se formeaza legaturi fosfodiesterice prin atacul gruparilor OH libere asupra
gruparilor 5 fosfat, molecula de AMP fiind eliberata.

Etapele procesului de replicare

Replicarea materialului genetic la bacteriofagul M13
Bacteriofagul M13 prezinta o molecula de ADN circular, monocatena de 6408 nucleotide lungime.
Aceasta molecula o putem denumi si catena plus/sens. In momentul injectarii celulelor de E.coli,
catena plus este copiata, avand loc sinteza unei catene minus/antisens si rezulta, astfel, forma
replicative dublu catenara a bacteriofagului.
In procesul de replicare intervin, la inceput, proteinele SSB care acopera catena plus pe toata
lungimea ei, cu exceptia unui segment palindromic avand o lungime de 57 nucleotide care constituie
o regune hair pin ( ac de par ).

2

ARN polimeraza recunoaste situsul de initiere al replicarii si incepe sinteza unui ARN primer la 6
nucleotide inaintea structurii hair pin. Primerul este extins pana la o lungime de 20-30 nucleotide =>
structura hibrida ADN ARN.
ADN polimeraza recunoaste ARN primerul, se leaga la acesta si extinde catena complementara
(minus) utilizand drept tipar catena plus. La final, datorita faptului ca genomul este circular, primerul
este indepartat datorita actiunii exonucleazice 5- 3 a polimerazei => o forma replicativa dublu
helicala avand una dintre monocatene intrerupta.
Actiunea ADN ligazei reface si ultima legatura fosfodiesterica completand procesul de replicare.

Replicarea la E.coli
Cromozomii de la E.coli se replica prin mecanismul bidirectional ( dupa modelul literei ) pornind de
la un singur punct de la originea replicarii.
Dublul helix ADNccc care reprezinta cromozomii la E.coli este despiralizat prin actiunea REP asupra
catenei leading si a helicazei II asupra catenei lagging, iar monocatenele proaspat separate sunt
invelite de proteine SSB.
Sinteza ambelor catene se face concomitant cu ajutorul unui complex multiproteic in jurul caruia
monocatena tipar a catenei lagging formeaza o bucla. O data cu inaintarea furcii de replicare,
ribonucleaza H, ADN polimeraza I si ADN ligaza actioneaza concomitent pentru a digera si a inlocui
primerii ARN de pe catena lagging. ADN ligaza completeaza legatura fosfodiesterica astfel incat la
terminarea procesului de replicare, atat catena lagging, cat si cea leading vor fi sintetizate in acelasi
timp.
Initierea replicarii
In cazul E.coli, originea replicarii consta dintr-un segment de 245 pb cunoscut sub numele de ORI C.
Intr-o prima etapa, proteina Dna se leaga la un segment de 9 pb care se repeat de 4x de la nivelul
locusului ORI C in prezenta proteinei HU. Se formeaza un complex in care ADN inconjoara un miez
proteic central.
Proteina Dna A desface puntile de H de la nivelul unor segmente de 13 pb bogate in A si T situate in
proximitatea ORI C. In urma procesului de rupere de punti de H rezulta o structura de complex
deschis, iar pentru desfasurarea actiunii proteinei Dna A este necesara prezenta ATP.
In urmatoarea etapa, proteina Dna A faciliteaza legaturile proteinelor Dna B si Dna C la nivelul
regiunilor unde puntile de H au fost desfacute. In ultima etapa a initierii proteina Dna B cu activitate
helicazica, in prezenta proteinelor SSB si a girazei bacteriene despiralizeaza dublul helix ADN in
ambele directii permitand patrunderea primaei si, ulterior, a ADN polimerazei.
Se considera ca la E.coli exista un semnal care initiaza fiecare ciclu de replicare al cromozomilor. Se
pare ca acest semnal este reprezentata de un process de metilare la nivelul secventei de 13pb de la
nivelul locusului ORI C.


3

Sinteza de ADN
Este obligatoriu pentru buna desfasurare a procesului de replicare ca enzimele implicate in acest
process sa poata avea acces la nivelul dubului helix deja despiralizat. In cazul E.coli, sinteza catenei
leading si lagging se desfasoara cu ajutorul unui complex multiproteic care contine 2 ADN polim. de
tip III, primazele, helicazele si proteinele sliding clamp.
Initial are loc la nivelul ambelor catene sinteza primerilor ARN in prezenta ARN polim. ADN
dependente si a precursorilor ribonucleotid trifosfat. Primerii ARN sintetizati sunt complementari cu
ADN matrita.
Ulterior, odata cu inaintarea furcii de replicare se sintetizeaza catena leading in mod continuu si
catena lagging in mod discontinuu cu ajutorul cate unei ADN polim. III pentru fiecare catena.
Helicazele despiralizeaza dublul helix si, impreuna cu topoizomerazele, asigura inaintarea furcii de
replicare. La nivelul catenei lagging ADN este sintetizat sub forma unor fragmente scurte cu lungimi
de cateva sute de nucleotide ( fragmente Okazaki ). In cazul catenei lagging, fiecare fragment Okazaki
va contine la capat un primer ARN. Concomitent cu inaintarea furcii de replicare si cu sinteza catenei
leading, primerii ARN de la capetele fragmentelor Okazaki nou sintetizate vor fi degradati, iar golurile
ramase vor fi acoperite prin actiunea ADN polim. I. Fragmentele Okazaki astfel completate vor fi
legate intre ele prin actiunea ADN ligazei.

Terminarea replicarii
Se stie ca procesul de replicare care se desfasoara la nivelul a 2 furci de replicare care inainteaza in
directii opuse se finalizeaza la nivelul locusului TER dupa o jumatate din lungimea cromozomului fata
de locusul ORI C. Practic, in aceasta regiune TER are loc intalnirea celor 2 furci de replicare care au
pornit din acelasi punct ( ORI C ) si au inaintat in directii opuse.
Topoizom.de tip II actioneaza la finalizarea replicarii pentru a asigura separarea celor 2 molecule de
ADN fiice. Fidelitatea procesului de replicare este asigurata de conlucrarea a aproximativ 20 de
proteine care actioneaza coordonat pentru buna defasurare a procesului de replicare. Pentru
asigurarea fidelitatii replicarii sunt esentiale functiile 3- 5 exonucleazice ale ADN polimerazei I si III.

Replicarea ADN la EK

Exista similitudini foarte mari intre replicarea materialului genetic la PK si EK.
Replicarea materialului genetic la EK se face de-alungul fazei S a ciclului celular, astfel incat in faza G,
celula este tetraploida si se pregateste sa intre in procesul de diviziune mitotica. Decizia ireversibila
daca o celula prolifereaza sau nu este luata in faza G a ciclului celular. Astfel, in anumite conditii
vitrege ( lipsa nutrientilor, contactul strans cu alte celule ), celula poate intra intr-o etapa GO a
ciclului celular in care decizia de proliferare este blocata.

4

ADN polimerazele la EK
In celulele EK au fost identificate 4 ADN polim. Acestea au fost notate cu , , , .
ADN polim. apare in majoritatea celulelor la nivelul nucleului, participa direct la procesul de
replicare ADN. Prin studii cu inhibitori specifici s-a constatat ca activitatea ADN polimerazica a
acesteia variaza cu viteza de proliferare celulara.
Enzima este multisubunitara ( la D. melanogaster -> 4 subunitati ) si sintetizeaza ADN printr-un
mecanism identic cu cel al ADN polim. III de la EK.
ADN polim. este o proteina cu masa moleculara redusa a carei functie nu este pe deplin elucidata.
La fel ca si in cazul ADN polim. s-a constatat ca activitatea polimerazica depinde de viteza cresterii
celulare.
ADN polim. este o enzima localizata la nivelul nucleului care difera de ADN polim. prin faptul ca
poseda o puternica activitate 3- 5exonucleazica. O alta diferenta este prezenta unei procesivitati
practice nelimitate ( in cazul ADN polim. , procesivitatea este de cateva sute de nucleotide ).
Datorita acestor observatii se considera ca ADN polim. este enzima care sintetizeaza catena
leading, in timp ce ADN polim. intervine in sinteza catenei lagging.
AND polim. este intalnita exclusive in mitocondrie, unde probabil participa la replicarea
mitocondriala. Cloroplastele contin o enzima similara ADN polim. .
Observatiile citologice au indicat fapul ca diferitele regiuni ale cromozomilor nu sunt replicate
simultan, ci are loc o activare concomitenta a unor clostere care contin cateva zeci de unitati de
replicare. Fiecare dintre unitatile de replicare prezinta propria origine a replicarii si se replica in mod
independent.
In vazul cromozomilor liniari foarte lungi de la EK apare problema finalizarii procesului de replicare pe
catena lagging ( end replication problem ). Practic, la fiecare runda de replicare, catena lagging este
incomplete sintetizata, iar daca aceasta modificare nu ar fi corectata, regiunile telomerice de la
capetele cromozomilor ar fi din ce in ce mai scurte.
Problema finalizarii procesului de replicare al telomerelor este solutionata cu ajutorul telomerazei.
Enzima are in compozitie o parte proteica si o molecula de ARN. In acest caz, molecula de ARN nu are
rol catalitic, ci rol de primer intern. Astfel, enzima poate sintetiza ADN monocatenar fara ajutorul
unor alte enzime care sa sintetizeze primerii.
La om, secventele telomerice prezinta un motiv repetitive de 6 nucleotide lungime cu secv
5ATTGGG 3. Telomeraza de la om contine o molecula de ARN, care, la un anumit nivel prezinta o
secventa complementara cu motivul repetitive avand lungimea de 1.5 motive repetitive. Aceasta
molecula ARN hibridizeaza specific de la capatul 3al monomerilor => jonctiune primer matrita.
Ulterior, folosind aceasta molecula de ARN, telomeraza sintetizeaza noi secvente de ADN prin
translocari repetate.



5

Repararea ADN
Orice leziune din structura ADN trebuie reparata rapid pentru asigurarea transmiterii corecte a
informatiei genetice de la o generatie la alta.
Mecanismele de reparare au fost studiate si elucidate la organismele PK:
fotoliza dimerilor pirimidinici
in prezenta radiatiilor UV, a razelor X sau apare posibilitatea formarii unor cicluri ciclobutilice
intre 2 resturi de timina dispuse adiacent pe aceeasi catena de ADN => formarea unor dimeri timinici
in mod similar exista si posibilitatea formarii unor dimeri intre resturi de C si T
prezenta acestor tipuri de dimeri distorsioneaza structura locala dublu catenara a ADN,
impiedicand utilizarea corecta a acestei molecule drept tipar pentru replicare sau trascriptie
dimerii timinici sunt indepartati de la nivelul dublului helix prin actiunea unei enzime numita ADN
fotoliaza
la E.coli, enzima are 35 kD si poate lega dimerii pirimidinici intr-un process care se poate
desfasura si la intuneric
in prezenta luminii ( = 300 500 nm ) si a unor agenti cromofori ( de tip FAD H ) legati
necovalent, enzima scindeaza inelul ciclobutilic.
indepartarea radicalilor alchili
expunerea ADN la diversi agenti de alchilare de tipul nitrozoguaninei are ca efect producerea unor
resturi de metilguanina
formarea acestor resturi are potential mutagen pentru ca in replicare vor directiona intrarea
de T pe catena complementara si nu de C.
prezenta O metilguanina de la E.coli este reparata cu ajutorul unei metil transferaze
proteina catalizeaza transferul gruparii CH de la nivelul restului de G la nivelul unui rest de Cis
din structura acesteia => ca urmare a acestui transfer este inactivata, nemaiputand cataliza o a 2-a
reactive similara.
repararea prin excizie
in cazul E.coli, leziunile prezente in macromoleculele de ADN pot fi eliminate cu ajutorul unor
enzime care conlucreaza
complexul enzymatic implicat in mecanismul de reparare este alcatuit din 4 proteine notate cu Uvr
A, Uvr B, Uvr C si Uvr D.
Dimerul Uvr A Uvr B are rolul de a se deplasa de-alungul moleculei de ADN pana cand intalneste o
eroare => Uvr A paraseste complexul, iar Uvr B despiralizeaza molecula de ADN; ulterior, la nivelul
complexului ADN despiralizat, Uvr B se leaga de proteina Uvr C

6

aceasta excizeaza un fragment de 13 nucleotide care contine si zona afectata
proteina Uvr D ajuta la indepartarea segmentului de ADN excizat si a proteinei Uvr C; ulterior, ADN
polimeraza I si ADN ligaza refac dublul helix
repararea utilizand glicozilaza
tot o reparare prin excizie catalizata elimina nucleotidele modificate, respective bazele azotate
necorespunzatoare
glicozilaza se deplaseaza de-alungul fosei minore a dublului helix pana cand intalneste o baza
azotata necorespunzatoare => enzima se leaga la regiunea respectiva, trage in afara restul
nucleotidic avand baza azotata necorespunzatoare si excizeaza legatura N-glicozidica
in cea de-a doua etapa, o endonucleaza ( endonucleaza AP ) scindeaza legaturile fosfodiesterice
ale restului nucleotidic de la nivelul caruia a fost indepartata baza azotata.
ADN polim. I si ADN ligaza refac, in final, structura helicala
Cea mai importanta glicozilaza este uracil N-glicozilaza, care are rolul de a indeparta uracilul din
structura moleculei de ADN ( deoxiuridin trifosfatul este precursor in sinteza deoxiuridin trifosfatului,
iar ADN polimerazele pot insera, in conditii speciale, din greseala, resturi de UMP, deoxiUMP la
nivelul ADN ).