CURSUL 7

PROCESUL DE REPLICARE I TEHNICA PCR

7.1. Procesul de replicare Ptrunderea n tainele reaciei PCR care a reprezentat fundamentul tehnicilor de biologie molecular necesit cunoaterea temeinic a procesului de replicare care a inspirat aceast tehnic. Replicarea ADN este un proces fundamental care are loc n toate celulele organismelor ii i st la baza ereditii biologice. Prin acesta se realizeaz copierea! mai precis duplicarea! moleculelor de ADN. "odelul dublu helical al ADN propus de #atson i Cric$ sugereaz mecanismul replicrii%semiconser ati conform cruia catenele complementare ale dublului heli& parental acioneaz ca nite tipare pentru sinteza a dou noi molecule fiice de ADN. Astfel! fiecare nou duple& a fi format dintr%o caten parental i o caten fiic complementar. 'n ()*+! A.,ornberg! a izolat din -.coli o enzim ce catalizeaz sintetiza ADN! denumind%o ADN polimeraza .. Aceasta este reprezentat de o caten polipeptidic de (/0 $Da i catalizeaz reacia1
lim erazaI ( dNMP ) n + dNTP ADNpo ( dNMP ) n +( + PPi

ADN polimeraza . pentru a sintetiza catena fiic necesit1 cele patru nucleotide n stare acti at dN2P1 dA2P! d32P! d22P i dC2P i a ionilor "g45 un oligonucleotid complementar 6primer7 la care enzima adaug deo&iribonucleotide la gruparea 08%9: liber! deoarece toate ADN polimerazele cunoscute au numai capacitatea de a elonga o caten pree&istent de ADN sau de ARN i sunt incapabile s iniieze sinteza de novo a unei noi catene. Astfel! acestea n procesul de replicare sunt asociate cu enzime numite primaze care realizeaz sinteza unui primer la ni elul fiecrei origini de replicare % ADN tipar monocatenar sau bicatenar scindat la cel puin un situs. ADN polimeraza catalizeaz formarea unei legturi fosfodiesterice numai dac baza nucleotidului care urmeaz a fi adugat este complementar bazei de pe catena matri i formeaz o pereche de baze tip #atson%Cric$. Altfel spus! ADN este replicat de ADN polimeraze ADN dependente. ;. Cairns! studiind cromozomul la -.coli n timpul replicrii prin autoradiografie utiliz<nd timidin tritiat 6=ig >.(A7 a demonstrat c forma ADN n (

replicare este de forma literei theta 6?7. Deci n timpul replicrii! ADN i menine forma circular! ns catenele ADN se despiralizeaz ser ind drept tipare n ederea sintezei catenelor fiice. @n situs dintr%un cromozom la care apare simultan despiralizarea dublului heli& ADN i sinteza catenelor ADN fiice 608%*8 i *8%087 poart numele de furc de replicare sau origine de replicare 6 locus ori7.

=igura >.(. 9riginea replicrii la procariote A7 i eucariote A7 'n funcie de tipul de celul! originile de replicare sunt segmente de ADN unice care conin mai multe uniti repetiti e scurte ce sunt recunoscute de proteine multimere specifice denumite B9rigin Ainding ProteinsC. Da procariote e&ist de regul o singur furc de replicare sau locus ori 6origin of replication7 6=ig. >.(A7. 'n schimb! la eucariote! un cromozom are de E/ de ori mai mult ADN fa de unul procariot iar pe un cromozom e&ist mai multe origini ale replicrii una la fiecare 0% 0// $pb! pentru a face fa timpului de 0%Fh c<t dureaz replicarea 6=ig. >.(A7. >.(.(. Replicarea ADN semidiscontinu

ADN polimerazele necesit e&istena unei grupri 08%9: libere la care s adauge nucleotide! deci sintetizeaz ADN numai n direcia *8%08. 2otui! cele dou catene ale duple&ului ADN sunt replicate simultan prin a ansarea furcii de replicare. Dac inem cont c cele dou catene ADN parentale sunt antiparalele i c replicarea are loc semiconser ati ! este greu de presupus c ADN polimerazele sintetizeaz ADN numai n direcia *8%08. Ge aHunge la concluzia c cele dou catene sunt replicate diferit. Catena care se alungete continuu n direcia *8%08! complementar cu catena 08%*8 parental n prezena ADN polimerazei se numete catena leading 6=ig. >.47. Catena parental *8%08 este copiat discontinuu n fragmente O A!A I! tot n direcia *8%08 care sunt ulterior sudate de ctre o ADN ligaz i se numete caten lagging 6=ig.>.47. Analiz<nd fragmentele 9$aza$i s%a constatat c la captul lor *8e&ist nite segmente ARN cu o lungime de ( I E/ ribonucleotide complementare cu matria ADN.

=igura >.4. Replicarea semidiscontinu a ADN Da -.coli s%a constatat c sunt prezente dou enzime care pot cataliza formarea primerilor ARN i anume ARN polimeraza ADN dependent i primaza. Prin studii realizate cu inhibitorul ARN polimerazei ADN dependent! s%a demonstrat c primaza sintetizeaz primerii fragmentelor 9,AJA,. iar iniierea catenei leading este stimulat c<nd ambele enzime sunt prezente! acestea acion<nd sinergic. Dup sinteza catenelor fiice! primerii ARN sunt ndeprtai iar golurile rmase sunt umplute de aciunea ADN polimerazelor i ligazei. >.(.4. -nzimele i proteinele implicate n procesul de replicare 0

Procesul de replicare este e&trem de comple&! n desfurarea acestuia fiind necesar cooperarea mai multor proteine i enzime! constituind o main de replicare multienzimatic la ni elul furcii de replicare! responsabil de sinteza ADN. Da -.coli! n despiralizarea duple&ului ADN sunt implicate proteinele Rep! helicaza .. i proteinele GGA. Pro"eina Rep! are o structur monomer a <nd E* $Da i separ duple&ul ADN prin deplasarea sa de%a lungul tiparului catenei leading! n direcia 08%*8! consum<nd 4 moli A2P la fiecare pereche de baze separat. Helica#a II! este tot o enzim monomer de >* $Da care se deplaseaz de%a lungul catenei lagging n direcia *8%08! acion<nd sinergic cu Rep la furca de replicare. Pro"einele SS$ au o structur tetramer! fiecare subunitate a <nd () $Da fiind implicate n mpiedicarea respiralizrii catenelor matri ADN. Proteinele GGA n elesc cooperati catenele matri ADN monocatenare. 9 dat cu replicarea catenelor! acestea sunt eliberate de proteinele GGA. ADN poli%era#a I are trei situsuri catalitice acti e ntr%o singur caten polipeptidic! funcia sa principl fiind de a corecta greelile n replicarea ADN i secundar polimerazic1 % are funcie 08%*8 e&onucleazic! ndeprt<nd nucleotidele mperecheate greit de la captul 08 al unei catene ADN n cretere! a <nd rol n procesul de reparare! cresc<nd fidelitatea replicrii ADN 6mai puin de o eroare la (/+ pb7K % are funcie *8%08 e&onucleazic scindeaz legturi fosfodiesterice terminale sau foarte aproape de captul *8! ndeprt<nd primerii ARN sau corecteaz erori n replicare % % are acti itate polimerazic umpl<nd golurile lsate de ndeprtarea primerilor prin combinarea acti itii polimerazic cu cea *8%08 e&onucleazic poate deplasa o cresttur dintr%un duple& ADN spre captul 08 fr modificarea sec enei nucleotidelor moleculei. -nzima ADN polimeraza . poate fi scindat de proteaze n dou fragmente inegale1 % % un fragment de 0E $Da cu toat acti itatea *8%08 e&onucleazic original un fragment de E> $Da numit fragment ,D-N9# ce poart toat acti itatea polimerazic i cea 08%*8 e&onucleazic. Da - coli s%au descoperit alte dou polimeraze i anume ADN poli%era#a II &i III care seamn cu ADN polimeraza . . Au fost greu detectabile deoarece acti itatea nsumat a celor dou polimeraze reprezint mai puin de *L din acti itatea ADN polimerazei .. 2ulpiniile de - coli mutante crora le lipsete ADN F

polimeraza .. nu prezint defecte n procesul de replicare i reparare! astfel c funcia acestei polimeraze rm<ne necunoscut. 'n schimb! la mutanii polimerazei ... s%a constatat ncetarea replicrii! constat<ndu%se c aceast enzim este responsabil de replicarea ADN la -.coli fiind implicat at<t n sinteza catenei leading c<t i a catenei lagging. ADN polimeraza ... este format din trei subuniti MN?! subunitatea M a <nd acti itate polimerazic cataliz<nd sinteza ADN direcionat de un tipar i n prezen de dN2P n direcia *8%08! necesit<nd un primer cu grupare 08%9: liber iar subunitatea N a <nd o acti itate 08%*8 e&onucleazic! repar<nd greelile din timpul replicrii! mrind fidelitatea procesului de 4// de ori. ADN liga#a catalizeaz sinteza unei singure legturi fosfodiesterice ntre gruparea 08%9: de la captul unui segment ADN i gruparea *8 fosfat de la captul altui segment. Reacia este consumatoare de energie! la -.coli reacia de sintez este cuplat cu hidroliza NAD5 la N"N5 i A"P! pe c<nd la eucariote necesit hidroliza A2P. Celulele eucariote conin cel puin patru tipuri de ADN polimeraze1 M! O! P i Q. ADN poli%era#a ' este prezent n toate celulele! particip<nd la replicarea ADN. -ste o enzim multisubunitar i adaug nucleotide n direcia *8%08 pe baza unui tipar ADN. Acti itatea polimerazic ariaz cu iteza proliferrii celulare! dar procesi itatea este limitat la (// nucleotide! fiind polimeraza catenei lagging. De asemenea! este asociat cu acti itatea primazei! nu are acti itate e&onucleazic ne fiind astfel implicat n corecii ale ADN. ADN poli%era#a ( are dimensiuni mici i acti itatea ei polimerazic nu ariaz cu iteza creterii celulare! ea fiind implicat n procesul de reparare al ADN. ADN poli%era#a ) este prezent doar n mitocondrie unde replic ADN mitocondrial. 'n schimb! ADN poli%era#a * are o procesi itate nelimitat put<nd replica ntreaga lungime a tiparului! fiind replicaza catenei leading. Are acti itate 08%*8 e&onucleazic corectoare i pierde primaza asociat. Transcrip"a#a in+ers, Retro irusurile 6 irusuri tumorale! irusul imunodeficienei! etc7 sunt irusuri ale eucariotelor i prezint ca material genetic ARN. Pe l<ng ARN! acestea au n echipamentul enzimatic o DNA poli%era#, RNA dependen", 6transcriptaz in ers7. Aceast enzim a fost descoperit n ()>/ de 2emin i Aaltimore i s%a demonstrat c acioneaz similar cu polimeraza . sintetiz<nd ADN n direcia *8%08 pornind de la un primer! dar tiparul este ARN.

2ranscriptazele in erse ale enzimatice n plus1

irusului mieloblastozei a iene i a

irusului

sarcomului Rous sunt dimeri MO cu "" de E* i )* $Da i au dou acti iti % e&oribonucleazic! prin care degradeaz specific ARN din hibridul ARN%ADN 6RNaza :!de la hibrid7 % o acti itate ADN polimerazic ADN dependent 'n timpul infeciei cu un retro irus! transcriptaza in ers transcrie ARN iral pe o caten complementar ADNc form<nd un hibrid ARN%ADN! dup care enzima degradeaz ARN i replic ADNc form<nd un duple& ADN care infecteaz gazda. 2ranscriptazele in erse sunt foarte utilizate n tehnici de biologie molecular precum Real%2ime PCR! care pornete de la ARN e&tras din celule i esuturi. 7.-. Te.nica PCR 2ehnica PCR 6Polimerase Chain Reaction7 a fost elaborat de ctre ,. "ullis i echipa sa de cercettori n anul ()+* i reprezint metoda care a cunoscut cea mai rapid i spectaculoas dez oltare din istoria biochimiei i a biologiei moleculare. 'n ())( a aprut primul numr dintr%o re ist dedicat n e&clusi itate acestei tehnici1 PCR-Methods and Applications, iar lui ,. "ullis i%a fost decernat n anul ())0 premiul Nobel pentru Chimie. 2ehnica a a ut un impact maHor asupra biologiei moleculare i o serie ntreag de interpretri asupra conceptului de baz au dus la introducerea mai multor ino aii at<t la ni elul etapelor acesteia! c<t i la ni elul aparaturii utilizate n ederea realizrii practice a acesteia. 2ehnica PCR! n spatele unei simpliti de principiu i de realizare practic! ascunde numeroase piedici capabile de a introduce erori n rezultatele obinute. @tilizarea sa presupune nelegerea logic a etapelor care trebuie parcurse pentru obinerea unor rezultate finale corespunztoare scopului n care este utilizat! o dotare corespunztoare a laboratorului i o e&perien ast de lucru. 7.-.1. Principiu reac/iei PCR @na dintre proprietile ADN polimerazelor este c pot sintetiza ADN numai n cazul n care sinteza pornete de la ni elul unui primer. Aceast proprietate este indispensabil stabilitii informaiei genetice. Dac numai simpla prezen a ADN monocatenar ar fi suficient pentru realizarea replicrii! atunci celulele s%ar confrunta cu o situaie e&trem de gra n care mai multe sec ene de ADN s%ar sintetiza ntr%o manier aleatorie! fr nici un control. E

'n prezena unor primeri sintetici! capabili s hibridizeze la capetele sec enei de amplificat i a ADN polimerazelor! prin reacia PCR are loc amplificarea prin replicri succesi e a sec enei ADN int. Numrul de copii ale sec enei alese pentru amplificare este dublat la fiecare replicare! acesta cresc<nd deci e&ponenial odat cu fiecare ciclu de replicare. 7.-.-. E"apele reac/iei PCR 9 reacie PCR parcurge n trei etape diferite 6=ig. >.07 i anume1 denaturarea ADN matri! hibridizarea 6anelarea7 primerilor pe baz de complementaritate la sec ena int i sinteza unei noi catene a nd drept matri catena de eche de ADN 6matri7. 1. Dena"urarea ADN %a"ri/,. 'n aceast etap are loc o denaturare termic a macromoleculei de ADN dublucatenare. Astfel! temperatura amestecului de reacie! care conine i ADN matri! este ridicat p<n la )*RC! aceasta duc<nd la ruperea punilor de hidrogen stabilite pe baz de complementaritate ntre cele dou catene. 'n soluie om regsi ADN monocatenar. -. Hi0ridi#area 1anelarea2 pri%erilor. 'n cea de%a doua etap are loc hibridizarea primerilor oligonucleotidici sintetici la catena de ADN! pe baz de complementaritate. Primerii sunt molecule monocatenare! scurte de ADN! desemnai artificial pe baz de complementaritate cu sec ena din ADN ce urmeaz a fi amplificat. :ibridizarea primerilor se efectueaz prin scderea temperaturii amestecului de reacie pn< la o aloare care permite refacerea punilor de hidrogen dintre acetia i catena matri. 3. Sin"e#a unei noi ca"ene ADN. 'n cea de%a treia etap are loc sinteza unei noi catene de ADN pornind de la primeri cu aHutorul unei ADN polimeraze i n prezena deo&inucleotidelor trifosfai 6dN2P7! la o temperatur optim polimerazei. Acest lucru a duce la obinerea unor noi catene de ADN complementare cu matria. Da finalizarea acestei etape moleculele de ADN apar sub form dublucatenar n amestecul de reacie. Noi catene ADN pot fi sintetizate prin reluarea celor trei pai! iar acest lucru reprezint intrarea ntr%un nou ciclu de amplificare. =iecare caten nou sintetizat de ine matri pentru un nou ciclu de amplificare! astfel nc<t sec ena int de ADN este selecti amplificat dup fiecare ciclu de reacie. Produsul de reacie sau amplicon conine la capete sec enele primer folosite la amplificare.

>

=igura >.0. -tapele reaciei PCR Primii produi rezultai prin copierea catenelor originale au o lungime diferit fa de catenele pe care ADN polimeraza le sintetizeaz n continuare. 'n al doilea ciclu de amplificare produii pot a ea de asemenea o lungime nedeterminat. 'ncepnd cu al treilea ciclu de amplificare fragmentele obinute or a ea o lungime definit! corespunztoare poziiei primerilor! respecti distanei dintre acetia. 'ncep<nd cu cel de%al patrulea ciclu de amplificare numrul de copii al sec enei int de interes a crete e&ponenial 6=ig. >.F7. 'n final om a ea n amestecul de reacie apro&imati 64n %J7&S copii ale ale sec enei de interes! unde n este numrul de cicluri de amplificare! J produii cu lungime nedefinit i S numrul de copii al sec enei originale. De remarcat i faptul c! n practic! dup un numr finit de cicluri de amplificare! acumularea produilor de reacie intr ntr%o faz de platou. Deci! procesul e&trem de eficient de amplificare! nu este chiar nelimitat! e&ist<nd o serie ntreag de factori care fac ca eficiena acestuia s nu fie ma&im. Dup circa 0/ de cicluri de amplificare! cantitatea de polimeraz acti ncepe s se diminueze! n special datorit denaturrii termice! i de asemenea! aloarea acti itii enzimatice totale cunoate o scdere. @n alt factor limitant este i +

rehibridarea catenelor matri cu o

itez mai mare atunci c<nd concentraia

ampliconilor depete o anumit aloare. Acest lucru a duce la scderea eficienei de hibridizare a primerilor. De asemenea! dup F/%F* de cicluri are loc i o scdere a concentraiei de dN2P i a eficienei tamponului de reacie. 2oi aceti factori or conduce! dup F* de cicluri! la un declin accentuat al acumulrii de ampliconi i la intrarea ntr%o faz staionar! de platou a reaciei PCR.

=igura >.F. Amplificarea e&ponenial a sec enei ADN int 7.-.3. Co%ponen"ele de 0a#, ale reac/iei PCR Rezultatele reaciei PCR sunt dependente de mai multe componente care se adaug n amestecul de reacie. Cantitatea i concentraia optim a acestora este determinat e&perimental. (. "atria ADN1 poate fi reprezentat de ADN genomic sau ADNc 6caz particular ARN total I R2%PCR7. 4. 2amponul de reacie1 se pot folosi mai multe tipuri de tampoane ale cror componente ariaz n funcie de tipul de polimeraz utilizat. Cel mai comun tampon folosit conine 2ris%:Cl 6p: +!07! ,Cl i gelatin. 2ampoanele de reacie pot include sau nu clorura de magneziu. 'n cazul n care acesta nu este inclus n tamponul folosit atunci ea trebuie adugat obligatoriu! separat! n amestecul de reacie. Prezena ionilor de magneziu n amestecul de reacie este e&trem de important deoarece ei sunt acti atori ai ADN polimerazei! optimizeaz temperatura de melting 62m7 a ADN dublu catenar i faciliteaz interacia primer%matri. Cantitile insuficiente de ioni de "g45 duc la amplificri slabe! iar cantitile crescute conduc la cumularea de produi de amplificare nespecifici.

0. Deo&inucleotide trifosfat 6dN2P71 sunt li rate fie sub forma a patru soluii stoc indi iduale! fie sub forma unui amestec al celor patru nucleotide. Goluiile sunt aHustate la o aloare optim de p:. Concentraiile optime de dN2P depind de mai muli factori cum ar fi1 concentraia de clorur de magneziu! stringena reaciei! concentraia primerilor! lungimea fragmentului ce urmeaz s fie amplificat i numrul de cicluri de reacie. 'n optimizarea unei reacii PCR concentraia de dN2P a fi determinat empiric. Concentraii crescute de dN2P pot inhiba ADN polimeraza! iar concentraiile sczute conduc la obinerea unei fideliti mai mari de reacie. 'n anumite scopuri se pot utiliza nucleotide marcate sau modificate. F. ADN polimeraza1 la realizarea reaciei PCR s%a folosit iniial fragmentul ,lenoT al ADN polimerazei . din E. Coli. @lterior au fost descoperite i utilizate ADN polimeraze termostabile. % Taq/A plitaq ADN poli eraza ! a fost izolat din Ther "s aq"atic"s! apoi modificat i clonat n E.coli. Uiteza optim de polimerizare este de 0*%(// nucleotide pe secund la o temperatur optim de >/%+/VC. -nzimele au o acti itate *8%08 e&onucleazic care permite nlturarea nucleotidelor care sunt situate n faa lanului de cretere. A pliTaq polimeraza are aceleai proprieti cu Taq polimeraza dar este produs n E.Coli prin recombinare genetic. Reproductibilitatea i puritatea acesteia este mult mai mare dec<t a Taq polimerazei simple. -&ist i o ariant Gtoffel a acestei polimeraze creia i lipsete un fragment de 4+) de aminoacizi de la captul N%terminal. Acest lucru conduce la lipsa acti itii *8%08 e&onucleazice! ceea ce conduce la o bun amplificare a matrielor ADN circulare 6e&. ADN plasmidial7. -nzima este de dou ori mai stabil la temperaturi nalte dec<t Taq polimeraza i aceasta permite utilizarea ei n amplificarea unor matre bogate n 3C. Tth ADN poli eraza I a fost izolat din Ther "s ther ophil"s! modificat i clonat n E.Coli. 'n prezena ionilor de "n45 poate fi folosit ca i re erstranscriptaz! iar n prezena ionilor de "g45 i reia acti itatea ADN polimerazic. Deci enzima poate fi utilizat la obinerea ADNc pornind de la ARN! n acelai tub de reacie. Pentru asta trebuie adaugai n amestecul de reacie at<t ioni de "n45! c<t i de "g45. @lterior! ionii de "n45 trebuie chelatai pentru a permite reluarea acti itii ADN polimerazice a enzimei. *. Apa ultrapur1 se utilizeaz e&clusi ap ultrapurificat! nuclease%free! li rat de firme specializate.

(/

E. Primerii1 desemnarea primerilor este un proces e&trem de sensibil de care depinde reuita reaciei PCR. Da alegerea acestora trebuie respectate c<te a reguli generale1 % lungimea primerilor trebuie s fie cuprins ntre 4/ i 0* de nucleotide! acest lucru permi<nd selectarea unei temperaturi de hibridizare ridicate. % primerii trebuie s conin un numr apro&imati egal din cele patru baze azotate! e it<ndu%se pe c<t posibil regiunile cu repetiii de nucleotide. Respectarea acestei reguli a conduce la eliminarea regiunilor cu structuri secundare 6structuri hairpin7. % perechile de primeri trebuie alese astfel nc<t s nu prezinte complementaritate la ni el intra% i interindi idual! acest lucru permi<nd reducerea la minim a posibilelor interacii dintre primeri 6dimeri de primeri7. % distana dintre doi primeri la ni elul matriei trebuie s fie mai mic de /!*%( $pb! dar s%a obser at o eficien foarte sczut a reaciei n cazul n care lungimea produsului de amplificare depete /!0 $pb. % pentru utilizarea acestora n condiii bune trebuie stabilit cu e&actitate temperatura optim de hibridizare. Acest lucru se poate realiza e&clusi e&perimental prin realizarea unei reacii PCR n gradient de temperatur. 7.-.4 Para%e"rii de "i%p &i de "e%pera"ur, Aparatura i tehnica a suferit multe modificri de%a lungul timpului i a fost pretabil la automatizare abia n momentul introducerii polimerazelor termostabile. Da ora actual se folosesc aparate de PCR total automatizate! n care etapele de temperatur se parcurg automat. 'n prima etap trebuie realizat o denaturare a matriei ADN. Acest lucru presupune ridicarea rapid a temperaturii la )*VC pentru o perioad de timp suficient pentru separarea total a dublei catene. 2emperatura ridicat din timpul etapei de denaturare! repetat la fiecare ciclu de reacie! poate conduce la degradare parial a matriei i implicit la unele erori de ncorporare a nucleotidelor. 'n cea de%a doua etap are loc hibridizarea primerilor. 2emperatura scade rapid de la )*VC la o aloare determinat practic! n laborator! prin reacia de PCR n gradient de temperatur. 'n general temperaturile de hibridizare ariaz ntre */ i EFVC. 9 temperatur de anelare sczut conduce la hibridizri nespecifice i ulterior la obinerea unor produi parazii de amplificare. 9 temperatur crescut de hibridizare

((

poate duce la absena acestui proces. Ualoarea de temperatur depinde e&clusi de structura primerilor i de lungimea acestora. -tapa a treia! de e&tensie a primerilor! se realizeaz la >/%>4VC! care reprezint temperatura optim de acti itate pentru ADN polimerazele termostabile. 2impul lsat pentru aceast etap amplificat. 'n practic este prezent i o etap final de amplificare! la >4VC! n care are loc e&tensia total a tuturor ampliconilor acumulai. Numrul optim de cicluri care trebuiesc parcurse ariaz ntre 4+ i F/. @n numr mai mare de cicluri este posibil! dar poate conduce la apariia unor erori i la acumularea n cantiti crescute a produilor de reacie nespecifici. 7.-.5 Reac/ia PCR 6n gradien" de "e%pera"ur, 'n ederea elaborrii unei metode ce are la baz tehnica PCR este necesar parcurgerea unei etape e&trem de importante ce const n optimizarea temperaturii de hibridizare a primerilor prin realizarea unei reacii PCR n gradient de temperatur. 'n aceast reacie! ADN matri este hibridizat concomitent la temperaturi diferite cu aceeai primeri! n scopul stabilirii temperaturii optime care s permit eliminarea amplificrilor parazite i realizarea cu un randament ma&im a reaciei PCR. 2otodat! n decursul unei astfel de reacii de optimizare! pot fi ariate cantitile de primeri! inter alele de timp n care sunt parcurse treptele de temperatur! c<t i numrul de cicluri de amplificare. Produii de amplificare ai unei reacii PCR 6ampliconii7 sunt analizai prin electroforez n gel de agaroz 4L n prezen de bromur de etidiu ce permite izualizarea benzilor de ADN n @U. 'n funcie de profilul! numrul i intensitatea benzilor ADN rezultate n urma reaciei PCR se stabilete temperatura optim de hibridizare a primerilor. 2amponul de electroforez este reprezentat de 2A- (W 62R.G F/ m"! acid acetic F/ m"! -D2A 4 m"7 care se prepar ca soluie (/W i este diluat nainte de folosire! tamponul probei se prepar tot n 2A- (W care mai conine conine albastru de bromfenol /!0L i glicerol 0/L. 3elul de agaroz 4L se prepar tot n tampon 2A- (W i dup solubilizarea agarozei se adaug 4l de bromur de etidiu (/ gXml. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o pipet automat. Ge conecteaz tancul la sursa de curent i se pornete electroforeza. "igrarea se desfoar la tensiune constant 60 UXcm7 i la temperatura camerei! timp (4 ariaz n funcie de lungimea fragmentului care trebuie

de F/I*/ de minute! n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. Da finalul migrrii! izualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu aHutorul unui transiluminator n @U. 7.-.7 Aplica/ii ale "e.nicii PCR Y Y Y Y Y Y detectarea infeciilor bacteriene i irale baz pentru tehnica PCR%R=DP prin care se detecteaz mutaii punctiforme i GNPs baz pentru tehnica de sec eniere prin care se pot detecta mutaii punctiforme i GNPs baz pentru genotipare sau analiza fragmentelor marcate fluorescent prin care se realizeaz teste de paternitate i se detecteaz deleii i inserii determinarea pro enienei materilor prime egetale si animale determinarea organismelor modificate genetic

(0