Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
DE BIOLOGIE CELULAR I
MOLECULAR
- mult mai mari dect celulele procariote, organizare mult mai complex
- membrana plasmatic, citoplasm, organitele intracelulare, nucleul, citoschelet
(forma i deplasarea celulelor)
- nucleu - cea mai mare parte a materialului genetic (sinteza acizilor nucleici)
- ribozomi - sinteza proteinelor, sinteza i transferul lipidelor spre diferite organite,
aisg. homeostazia calciului, plierea proteinelor i controlul calitativ, adiia covalent
a zaharurilor la nivelul lanurilor polipeptidice n curs de sintez
- aparatul trans Golgi are loc sortarea glicoproteinelor
- lizozomii compartimentele degradative ale celulei
- peroxizomii - procese metabolice cum ar fi oxidarea acizilor grai i detoxifierea
celulelor de peroxidul de hidrogen
- mitocondriile sintetizeaz ATP, contin ADN mitocondrial
prin hidroliza acizilor nucleici n mediu acid se formeaz baze azotate + pentoze +
acid fosforic
a)- bazele azotate care intr n compoziia ADN pot fi baze purinice (adenina,
guanina) sau baze pirimidinice (timin, citozin)
prin stabilirea unor legaturi fosfodiesterice ntre deoxiribonucleotide -> caten ADN
toate legturile internucleotidice au aceeai orientare de-a lungul unui
lan polinucleotidic, astfel c fiecare caten are o anumit polaritate
structura unei catene este scris ntotdeauna n direcia 5' 3'
n succesiunea ATGC guanina are gruparea OH de la C5' neangajat
ntr-o legtur fosfodiesteric, iar timina are gruparea OH de la C3' liber
A-T
G-C
baze de la nivelul unei spire este de 12, iar pasul elicei este de 4,56 nm
ADN polimeraza
- adaug dNTP-uri succesiv, la captul 3' al unei molecule de ARN primer
(10-20 de nucleotide) sintetizat de ADN primaz
- atacul nucleofil al gruprii OH de la captul 3' al moleculei primer
asupra unei molecule de dNTP aliniat n ordinea dictat de secvena
ADN template monocatenar cu care formeaz legturi de hidrogen
- nu poate iniia sinteza de novo a unei catene de ADN
-are aciune autocorectoare 3-5 (proofreading) ndeprtnd nucleotidele
greit ncorporate n catena n curs de sintez. Acest lucru permite
conservarea informaiei genetice. Factorul de eroare pentru ncorporarea
greit a unei nucleotide ntr-o caten de ADN nou sintetizat este de
1/109 baze
ADN ligaza
CLONAREA
TIPURI DE CLONARE
CLONAREA ADN
CLONAREA ADN
Clonarea ADN permite izolarea i manipularea unor fragmente din genomul unui
organism prin inserarea lor n vectori autonomi care se replic independent de
ADN-ul celulei gazd
Subclonarea presupune transferul unui fragment de ADN clonat dintr-un vector n
altul, fiind utilizat pentru
investigarea unor regiuni scurte dintr-un fragment clonat de dimensiuni mari
pentru transferul unei gene ntr-un vector care permite expresia n anumite
specii
Vectorii de expresie
sunt utilizai pentru expresia proteinei codificate de gena de interes ntr-un anumit sistem
promotor T7
start,
Vectorul conine un promotor T7, un situs pentru legarea ribozomilor (RBS), un codon
un MCS n care este clonat gena de interes i un codon stop. Expresia proteinei are loc n
tulpini de E. Coli care produc T7 ARN polimeraza dup ce au fost n prealabil induse cu IPTG
(izopropiltiogalactopiranozid).
ELECTROFOREZA ADN
fragmentele de ADN mai mari (ntre 3000- 10000 nucleotide) se pot separa prin electroforez
n gel de agaroz
concentraia gelului de agaroz gelurile mai concentrate sunt folosite pentru migrarea
fragmentelor de ADN mai mici
voltajul o dat cu cresterea voltajului aplicat, fragmentele de ADN mai mari vor migra
proporional mai rapid dect cele mai mici. Rezolutia cea mai buna la migrarea fragmentelor mai
mari de 2 kb se obine prin meninerea unui voltaj de max. 5 V/cm (valoarea n cm se refer la
distana dintre electrozi)
la migrarea unei probe de ADN plasmidial n gel de agaroz se pot observa trei benzi care
corespund mai multor forme ale moleculei de ADN:
forma circular relaxat ADN circular rezultat prin unirea capetelor lanului linear
forma de cerc desfcut se desfac dou spire ale formei lineare i se reunesc
capetele
forma suprancolcit - mult mai compact comparativ cu forma relaxat de aceeai
lungime
ENZIME DE RESTRICTIE
enzimele de restricie sunt endo-deoxiribonucleaze care acioneaz asupra unei secvene
specifice de ADN bicatenar prin hidroliza unor legturi fosfodiesterice pe cele dou catene de
ADN
nucleazele existente n diferite organisme au rolul de a distruge moleculele de ADN strin
ADN-ul celulei gazd este protejat de atacul acestor enzime deoarece prezint n mod
normal o modificare a structurii situsurilor specifice acelei enzime
enzimele de restricie se obin astzi fie prin clonare, fie prin extractie din organismele
gazd
numele lor reprezint o parte a numelui speciei i genului din care au fost extrase i
uneori un indicativ al tulpinii sau al mutantului testat
Enzima
Situs de
recunoatere
Specie
Obinere
Apa I
GGGCCC
CCCGGG
Acetobacter
pasteurianum
E. coli
Bam HI
GGATCC
CCTAGG
Bacillus
amyloliquefaciens
E. coli
Bgl II
AGATCT
TCTAGA
Dpn I
GATC
CTA*G
Eco RI
GAATTC
CTTAAG
Kpn I
GGTACC
CCATGG
E. coli
Bacillus globigii
E. coli
Artificiala, inginerizata
genetic
Escherichia coli tulpina
Y13
E. coli
E. coli
Klebsiella pneumoniae
pe baza acestui principiu, vectorii de clonare pot fi linearizai n urma restriciei dirijate
cu una sau mai multe enzime de restricie i n respectivul loc pot fi inserate gene ale
cror capete restricionate sunt compatibile cu capetele nou-generate ale vectorului
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
Bcl
5'-TGATCA-3'
3'-ACTAGT-5'
Bgl II
5'-AGATCT-3'
3'-TCTAGA-5'
San 2A
5'-GATC-3'
3'-CTAG-5'
REACTIA DE LIGARE
Reactia de ligare presupune reunirea a doua sau mai multor fragmente de ADN printr-o
legatura covalenta in prezenta enzimei ADN ligaza. Aceasta reactie presupune formarea unei
legaturi fosfodiesterice intre captul 3'-OH al unei nucleotide si 5' fosfat al alteia