Sunteți pe pagina 1din 46

NOIUNI FUNDAMENTALE

DE BIOLOGIE CELULAR I
MOLECULAR

ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE

- membran celular, citoplasm, perete celular


- suprafaa celulelor procariote poate s fie acoperit de pili (permit ataarea celulelor
la anumite suprafee) sau flageli (micri ondulatorii - deplasarea celulelor n ap)
- nu prezinta nucleu si nici organite intracelulare
- genomul celulelor - un singur cromozom
- conin plasmide, care se pot replica independent de cromozomul celulei gazd

Fig.1 Reprezentarea unei celule procariote

ORGANIZAREA CELULELOR EUCARIOTE

- mult mai mari dect celulele procariote, organizare mult mai complex
- membrana plasmatic, citoplasm, organitele intracelulare, nucleul, citoschelet
(forma i deplasarea celulelor)
- nucleu - cea mai mare parte a materialului genetic (sinteza acizilor nucleici)
- ribozomi - sinteza proteinelor, sinteza i transferul lipidelor spre diferite organite,
aisg. homeostazia calciului, plierea proteinelor i controlul calitativ, adiia covalent
a zaharurilor la nivelul lanurilor polipeptidice n curs de sintez
- aparatul trans Golgi are loc sortarea glicoproteinelor
- lizozomii compartimentele degradative ale celulei
- peroxizomii - procese metabolice cum ar fi oxidarea acizilor grai i detoxifierea
celulelor de peroxidul de hidrogen
- mitocondriile sintetizeaz ATP, contin ADN mitocondrial

Fig. 2. - Reprezentarea schematic a unei celule eucariote

FLUXUL GENETIC INFORMATIONAL


n 1950 Francis Crick a sugerat existena unui flux informaional
unidirecional ntre ADN, ARN i proteine. Aceast idee a devenit dogma central a
biologiei moleculare. Conform acestei dogme, att n celulele procariote ct i n
celulele eucariote ADN este transcris ntr-o molecul de ARN mesager, apoi
mesajul genetic este tradus conform codului genetic ntr-o secven de aminoacizi
corespunztoare unui lan polipeptidic. De-a lungul timpului s-a constatat c acest
lucru nu este respectat ntotdeauna.

Fig.3.- Fluxul informaiei genetice

I. ACIZI NUCLEICI (ADN, ARN)


I. FUNCIE
II. STRUCTURA CHIMIC
III. CONFORMAIA TRIDIMENSIONAL
IV. BIOSINTEZ

ACIDUL DEOXIRIBONUCLEIC (ADN)


I. FUNCIE
stocarea, conservarea si transmiterea informaiei genetice = conine instruciunile
care vor permite unei celule s ndeplineasc un anumit rol n organism

II. STRUCTURA CHIMIC


catene polinucleotidice realizate prin stabilirea unor legturi covalente ntre
nucleotide

prin hidroliza acizilor nucleici n mediu acid se formeaz baze azotate + pentoze +
acid fosforic
a)- bazele azotate care intr n compoziia ADN pot fi baze purinice (adenina,
guanina) sau baze pirimidinice (timin, citozin)

Fig.2. Structura bazelor purinice

Fig.3. Structura bazelor pirimidinice

b)- pentoza - D2-deoxiriboza

Fig.4. Structura D2-deoxiribozei

prin stabilirea unor legturi N-glicozidice ntre gruparea semiacetalic a


pentozei i atomul de azot din poziia 9 a unei baze purinice sau din poziia 1 a
unei baze pirimidinice -> nucleozide

Fig.5. Structura nucleozidelor

esterii fosforici ai nucleozidelor la gruparea hidroxil de la atomul de carbon din poziia


5' sau 3' din pentoz -> nucleotide
acizii nucleici conin nucleozid-5-fosfai

Fig.6. Structura nucleotidelor

prin stabilirea unor legaturi fosfodiesterice ntre deoxiribonucleotide -> caten ADN
toate legturile internucleotidice au aceeai orientare de-a lungul unui
lan polinucleotidic, astfel c fiecare caten are o anumit polaritate
structura unei catene este scris ntotdeauna n direcia 5' 3'
n succesiunea ATGC guanina are gruparea OH de la C5' neangajat
ntr-o legtur fosfodiesteric, iar timina are gruparea OH de la C3' liber

A-T
G-C

Fig.7. Structura unei catene ADN

Fig.7. Structura unei catene ADN

III. STRUCTURA TRIDIMENSIONAL


Watson i Crick au elaborat un model tridimensional al macromoleculei de ADN: dou
lanuri polideoxiribonucleotidice antiparalele se rsucesc elicoidal i n acelai sens n
jurul unui ax comun formnd o elice dubl cu orientare dreapt. Inelele glucidice conectate
prin legturi fosfodiesterice constituie scheletul extern al dublului helix, n timp ce bazele
azotate cu caracter hidrofob sunt orientate spre interior i perpendicular pe axa helixului

Fig.8. Structura ADN

ADN poate s adopte mai multe conformaii:


conformaia B (descoperit de Watson i Crick) reprezentat de o elice dubl cu
orientare

spre dreapta, cu pasul de 3,6 nm, care cuprinde 10 perechi de baze

azotate la nivelul unei spire;


conformaia A, elice dubl cu orientare dreapt, mult mai compact, n care
pasul elicei

este de 2,8 nm i numrul de baze de la nivelul unei spire este de 11;

conformaia Z (zig-zag) corespunztoare unei elice cu orientare spre stnga,


numrul de

baze de la nivelul unei spire este de 12, iar pasul elicei este de 4,56 nm

Fig.9. Conformaia ADN

IV. ORGANIZAREA GENOMULUI LA PROCARIOTE (E. COLI)


o singur molecul de ADN (nucleoid) = un singur cromozom
cromozomul bacterian este format din domenii, alctuite din 50-100 Kb, ale
cror capete sunt strns reunite cu ajutorul unor proteine ancorate la nivelul membranei
celulare
(proteine HU )
proteinele HU sunt dimeri bazici i sunt asemntoare histonelor ->
compactarea ADN

Fig.10. - Reprezentarea schematic a cromozomului bacterian de E. coli

V. ORGANIZAREA GENOMULUI LA EUCARIOTE


organizat n mai muli cromozomi (46 la om) - nucleu
mpachetarea ADN se face sub forma unei structuri nucleoproteice complexe - cromatin
cromozomii i modific gradul de condensare n diferite stadii ale ciclului celular variind ntre
forma foarte compact n metafaz la forma difuz din interfaz
compactarea cromozomilor - existena mai multor nivele de organizare a cromatinei
majoritatea proteinelor din cromatin sunt histone

mas molecular mic (10-20 KDa)


30% aminoacizi bazici lizin, arginin
cinci clase de histone: H2A, H2B, H3, H4 i H1

condensarea i decondensarea cromatinei este dependent de modificri chimice la


nivelul histonelor cum ar fi de exemplu, acetilarea resturilor de lizin din regiunile Nterminale n timpul transcrierii

Fig.11. Organizarea ADN la eucariote

fiecare cromozom reprezint o molecul de ADN


cromozomii sunt formai din gene segmente individuale de ADN care conin
instruciunile necesare pentru sinteza unei proteine care are un rol bine determinat n
celula care o produce
gena conin secvene de ADN denumite exoni (expressed regions) i introni
(intervening sequences)
eliminarea intronilor are loc prin procesul de splicing al ARN mesager
discontinuitatea genelor este o trstur caracteristic organismelor superioare

Fig.12. Structura cromozomului la eucariote

Fig.13. Structura unei gene

VI. BIOSINTEZA ADN


procesul de biosintez a ADN se numete replicare
pp. desfacerea duplexului de ADN parental i sinteza unor catene complementare
cu fiecare dintre cele dou catene parentale -> dou molecule identice de ADN
replicarea ncepe la nivelul unor regiuni specifice de ADN denumite ORI (origine
de
replicare), se desfoar sub aciunea ADN polimerazei i ncepe de la nivelul unui
primer ARN sintetizat sub aciunea primazei

Iniierea procesului de replicare la nivelul secvenei ORI

proces semiconservativ - rezult dou molecule de ADN identice, fiecare


coninnd o caten nou-sintetizat i o caten parental
proces semidiscontinuu - sinteza catenei complementare cu catena 35 se face
continuu, n direcia 53. Sinteza catenei complementare cu catena 53 se face
discontinuu, dar tot n direcia 53

Replicarea ADN este un proces semidiscontinuu

Replicarea ADN este un proces semiconservativ

enzime implicate in procesul de replicare:


ADN primaza catalizeaz reacia de formare a primerului ARN de la
nivelul cruia va ncepe sinteza ADN sub aciunea ADN polimerazei
helicazele sunt proteine care se deplaseaz rapid de-a lungul
moleculei de ADN separnd cele dou catene ale dublului helix
proteinele de stabilizare a ADN monocatenar (proteinele SSB = single
stranded binding protein) se leag la catena de ADN expus fr a
masca bazele azotate care rmn astfel disponibile pentru replicare
topoizomerazele rezolv problemele topologice aprute n cursul
desfacerii duplexului de ADN

ADN polimeraza
- adaug dNTP-uri succesiv, la captul 3' al unei molecule de ARN primer
(10-20 de nucleotide) sintetizat de ADN primaz
- atacul nucleofil al gruprii OH de la captul 3' al moleculei primer
asupra unei molecule de dNTP aliniat n ordinea dictat de secvena
ADN template monocatenar cu care formeaz legturi de hidrogen
- nu poate iniia sinteza de novo a unei catene de ADN
-are aciune autocorectoare 3-5 (proofreading) ndeprtnd nucleotidele
greit ncorporate n catena n curs de sintez. Acest lucru permite
conservarea informaiei genetice. Factorul de eroare pentru ncorporarea
greit a unei nucleotide ntr-o caten de ADN nou sintetizat este de
1/109 baze

ADN ligaza

- reunete fragmente de ADN rezultate n urma replicrii


- catalizeaz formarea unei legturi fosfodiesterice ntre gruparea
hidroxil de la captul 3' al unui fragment de ADN i gruparea 5' monofosfat a
altuia
- enzima necesit prezena unui donor al unui rest de acid adenilic (ATP
la eucariote) care se fixeaz la captul 5' monofosfat al fragmentului de ADN
- prin atacul nucleofil al gruprii OH din captul 3' al celuilalt fragment se va

Fig.14. Mecanismul de actiune al proteinelor SSB

Fig.15. Mecanismul de actiune al ADN ligazei

etapele procesului de replicare


desfacerea legturilor de hidrogen dintre bazele de pe catene diferite i
expunerea acestora
proteinele SSB impiedic formarea structurilor secundare
sinteza primerului ARN sub aciunea primazei
sinteza unor fragmente de ADN (fragmente Okazaki) sub aciunea ADN
polimerazei
polimerizarea nucleotidelor are loc ntotdeauna n direcia 5' - 3'
sinteza unor fragmente de ADN sub aciunea ADN polimerazei
excizia primerului ARN
repararea breelor prin intervenia unei alte ADN polimeraze i sub aciunea ADN
ligazei

CORECTAREA ERORILOR DE REPLICARE


bacteriile sunt capabile s se divid la fiecare 30 de minute
n cazul n care ADN polimeraza nu poate s corecteze eficient erorile de replicare
care apar la nivelul catenelor nou sintetizate, intervine un sistem de corectare a
erorilor
acest sistem difer de celelalte sisteme de reparare a ADN prin faptul c
nu recunoate nucleotidele greit ncorporate, ci sesizeaz tensiunile care
apar la nivelul dublului helix de ADN datorit necomplementaritii bazelor
complexul proteic de corectare a erorilor de replicare intervine numai la
nivelul catenelor recent sintetizate care conin resturi de adenin nemetilate
complexul de corectare a erorilor de replicare este reprezentat de
proteinele MutS i MutL
corectarea erorilor de replicare este foarte important deoarece asigur
conservarea informatiei genetice de la nivelul ADN

Fig.15. Corectarea erorilor de replicare la E. Coli

MECANISME DE REPARARE A ACIZILOR NUCLEICI


Repararea leziunilor de la nivelul ADN se face cu ajutorul unor enzime specifice care
recunosc i ndeprteaz bazele sau nucleotidele modificate
Recunoaterea, excizia i repararea regiunilor modificate de la nivelul ADN este un
proces foarte complex care implic cel puin 18 factori de natur proteic
Repararea ADN prin excizia bazelor azotate se face prin recunoaterea bazelor
modificate de ctre o glicolaz ADN specific care cliveaz legtura N-glicozidic dintre baza
modificat i pentoz cu formarea unui situs apurinic sau apirimidinic. Prin aciunea unei
endonucleaze va apare o bre care va fi reparat n etapa urmtoare de ctre ADN polimeraz i
ADN ligaz
Repararea ADN prin excizia nucleotidelor se face prin intervenia unei endonucleaze
care va ndeprta fragmentul de ADN care conine baza modificat mpreun cu un anumit numr
de nucleotide care o ncadreaz. Repararea se va face prin intervenia ADN polimerazei i ADN
ligazei
Xeroderma pigmentosum este o boal autozomal recesiv, caracterizat printr-o
sensibilitate extrem la lumin i prin dezvoltarea a numeroase tumori la nivelul pielii. Bolnavii
prezint o deficien la nivelul mecanismelor de reparare a ADN prin excizia nucleotidelor

Fig.16. - Mecanismul de reparare a ADN


prin excizia bazelor

Fig.17. - Mecanismul de reparare a ADN


prin excizia nucleotidelor

CLONAREA

TIPURI DE CLONARE

CLONARE = a crea copii identice

Clonarea ADN clonarea genelor, tehnologia ADN recombinant se refer la


transferul unui fragment de ADN de interes dintr-un organism ntr-un element genetic
cu capacitate de autoreplicare (multiplicare), de ex. un plasmid
Clonarea reproductiv tehnologie utilizat pentru a genera un animal care va
avea ADN nuclear identic cu al unui alt animal care trieste n prezent sau a existat
n trecut (ex. Oaia Dolly)
Clonarea terapeutic clonarea embrionilor producerea embrionilor umani
care vor fi utilizai n cercetare n scopul tratrii unor boli incurabile
CLONA reprezint un individ distinct din punct de vedere genetic sau un set de indivizi identici

CLONAREA ADN

CLONAREA ADN

Clonarea ADN permite izolarea i manipularea unor fragmente din genomul unui
organism prin inserarea lor n vectori autonomi care se replic independent de
ADN-ul celulei gazd
Subclonarea presupune transferul unui fragment de ADN clonat dintr-un vector n
altul, fiind utilizat pentru
investigarea unor regiuni scurte dintr-un fragment clonat de dimensiuni mari
pentru transferul unei gene ntr-un vector care permite expresia n anumite
specii

ETAPELE SUBCLONRII ADN


Izolarea plasmidului care conine ADN de interes;
Digestia cu endonucleaze de restricie;
Separarea fragmentelor rezultate n urma digestiei cu endonucleaze de
restricie prin electroforez n gel de agaroz;
Purificarea fragmentelor dorite ;
Ligarea fragmentului de interes cu un nou vector pentru obinerea unei
molecule noi, recombinante;
Transferul plasmidului recombinant obinut ntr-o tulpin de E. coli
(transformare)
care permite multiplicarea acestuia;
Selecia bacteriilor transformate;
Analiza plasmidului recombinant (digestie cu enzime de restricie,
secveniere

Fig.18. Etapele clonrii ADN

APLICATII ALE CLONRII ADN


secventierea ADN
izolarea i analiza promotorului unei gene i a altor elemente de control
investigarea funciei proteinelor prin producerea unor cantiti mari a formelor
normale sau mutante ale acestora
identificarea mutaiilor care provoac anumite boli
biotehnologia producerea comercial la scal larg a unor proteine sau a altor
molecule cu importan biologic

VECTORI DE CLONARE. VECTORI DE EXPRESIE

Vector vehicul ADN utilizat pentru transferul materialului genetic

Vectorii de clonare au urmtoarele caracteristici


conin o regiune ORI i se replic independent de genomul celulei gazd
conin un marker de selecie (de exemplu o gen care confer rezisten la un
anumit antibiotic sau o gen care permite supravieuirea celulelor n anumite condiii
de cretere). Printre cele mai cunoscute gene care confer rezisten la un antibiotic
se numr ampr care codific - lactamaza, o enzim care degradeaz antibioticele
din clasa penicilinelor (de ex. ampicilina) i tetA care codific o protein ce
funcioneaz ca o pomp transmembranar care pompeaz tetraciclina n exteriorul
celulei
conin o secven MCS (Multiple cloning site) n care se poate insera fragmentul de
ADN de interes cu ajutorul enzimelor de restricie

1.Plasmidele au fost utilizate primele ca vectori de clonare. Sunt molecule


circulare extracromozomiale mici, cu dimensiuni cuprinse ntre 2-200 Kb care exist
n copii multiple (pn la cteva sute) n celulele gazd de E. coli

Fig.19. - Reprezentarea schematica a unui plasmid

2. Bacteriofagii sunt virusuri care infecteaz celulele bacteriene. Dintre


bacteriofagii care sunt utilizai ca vectori de clonare menionm bacteriofagul care
permite clonarea unor fragmente de ADN bicatenar i bacteriofagul M13 care permite
izolarea ADN clonat sub form monocatenar. Pornind de la aceti fagi s-au creat o
serie de vectori comerciali cum ar fi de exemplu EMBL3 i DASh.

Fig.20. Utilizarea bacteriofagilor in tehnologia ADN recombinat

3.Cosmidele sunt obinute prin fuziunea


unor plasmide de dimensiuni mari cu
anumite secvene de ADN din bacteriofagul
. Permit clonarea unor secvene de ADN
foarte mari (pn la 45000 de perechi de
baze). Cosmidele conin:
origine de replicare ORI
markeri de selecie
un situs MCS la nivelul cruia va fi
inserat gena dorit prin digestie cu enzime de
restricie
un situs cos care reprezint secvene de
ADN din bacteriofagul necesare pentru
mpachetare

Fig.21. Utilizarea cosmidelor in tehnologia ADN recombinat

Vectorii de expresie

sunt utilizai pentru expresia proteinei codificate de gena de interes ntr-un anumit sistem

conin pe lng elementele descrise la vectorii de clonare i un promotor adiacent regiunii

n care a fost inserat gena de interes

de multe ori expresia proteinelor exogene n E. coli se face utiliznd un plasmid cu

promotor T7

start,

Vectorul conine un promotor T7, un situs pentru legarea ribozomilor (RBS), un codon

un MCS n care este clonat gena de interes i un codon stop. Expresia proteinei are loc n
tulpini de E. Coli care produc T7 ARN polimeraza dup ce au fost n prealabil induse cu IPTG
(izopropiltiogalactopiranozid).

Fig.22. Expresia proteinelor cu ajutorul vectorilor de expresie

ELECTROFOREZA ADN

moleculele de ADN la pH fiziologic sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat


probele cu ADN migreaz ctre polul pozitiv la aplicarea unui cmp electric
densitatea de sarcin este uniform de-a lungul secvenei astfel c n cazul fragmentelor liniare
migrarea va fi invers proporional cu mrimea acestor fragmente
fragmentele de ADN de dimensiuni mici (mai mici de 500 de nucleotide) pot fi separate prin
electroforez n gel de poliacrilamid

fragmentele de ADN mai mari (ntre 3000- 10000 nucleotide) se pot separa prin electroforez
n gel de agaroz

evidenierea - cu ajutorul bromurii de etidiu


proprietatea de a se insera ntre bazele azotate i de a forma complexe necovalente de ADN
gelurile pot fi vizualizate cu o lamp UV
limita de detecie a ADN este de 0,1 0,5 ng

FACTORI CARE INFLUENTEAZA MIGRAREA ADN N GEL DE AGAROZ


mrimea fragmentelor de ADN - fragmentele de ADN linear migreaza in gelul de agaroz cu o
mobilitate care este invers proportionala cu masa moleculara

concentraia gelului de agaroz gelurile mai concentrate sunt folosite pentru migrarea
fragmentelor de ADN mai mici

bromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din ADN modificnd


mobilitatea acestuia

voltajul o dat cu cresterea voltajului aplicat, fragmentele de ADN mai mari vor migra
proporional mai rapid dect cele mai mici. Rezolutia cea mai buna la migrarea fragmentelor mai
mari de 2 kb se obine prin meninerea unui voltaj de max. 5 V/cm (valoarea n cm se refer la
distana dintre electrozi)

la migrarea unei probe de ADN plasmidial n gel de agaroz se pot observa trei benzi care
corespund mai multor forme ale moleculei de ADN:
forma circular relaxat ADN circular rezultat prin unirea capetelor lanului linear
forma de cerc desfcut se desfac dou spire ale formei lineare i se reunesc

capetele
forma suprancolcit - mult mai compact comparativ cu forma relaxat de aceeai
lungime

Fig.23. Migrarea ADN plasmidial in gel de agaroza

ENZIME DE RESTRICTIE
enzimele de restricie sunt endo-deoxiribonucleaze care acioneaz asupra unei secvene
specifice de ADN bicatenar prin hidroliza unor legturi fosfodiesterice pe cele dou catene de
ADN
nucleazele existente n diferite organisme au rolul de a distruge moleculele de ADN strin
ADN-ul celulei gazd este protejat de atacul acestor enzime deoarece prezint n mod
normal o modificare a structurii situsurilor specifice acelei enzime
enzimele de restricie se obin astzi fie prin clonare, fie prin extractie din organismele
gazd
numele lor reprezint o parte a numelui speciei i genului din care au fost extrase i
uneori un indicativ al tulpinii sau al mutantului testat

exist 3 clase de enzime de restricie:


CLASA I cu activitate de restricie i modificare
CLASA II recunosc secvene de 4,5,6 nucleotide
CLASA III activitate de restricie i modificare
enzimele din clasa a II-a recunosc secvene palindromice (secvene n care ordinea bazelor de pe
una din catene este opus cu cea a bazelor de pe catena complementar)

Fig.24. Structura unui palindrom

Fig.24. Tipuri de secvente recunoscute de cele 3 clase de enzime de restrictie

n urma restriciei unui fragment de ADN bicatenar, pot rezulta fragmente de


ADN cu capete drepte sau capete coezive
Tabel. Enzime de restricie

Enzima

Situs de
recunoatere

Specie

Obinere

Apa I

GGGCCC
CCCGGG

Acetobacter
pasteurianum

E. coli

Bam HI

GGATCC
CCTAGG

Bacillus
amyloliquefaciens

E. coli

Bgl II

AGATCT
TCTAGA

Dpn I

GATC
CTA*G

Eco RI

GAATTC
CTTAAG

Kpn I

GGTACC
CCATGG

E. coli
Bacillus globigii
E. coli
Artificiala, inginerizata
genetic
Escherichia coli tulpina
Y13

E. coli

E. coli
Klebsiella pneumoniae

dintre enzimele prezentate n tabelul de mai sus


Dpn I, Hinc II i Pvu II sunt exemple de endonucleaze ce genereaz
fragmente de ADN cu capete drepte

Apa I i Kpn I sunt endonucleaze care genereaz fragmente cu capete coezive


fragmentele de ADN cu capete compatibile sau cu capete drepte se pot liga ntr-o etap
ulterioara obinndu-se astfel molecule noi de ADN recombinat

pe baza acestui principiu, vectorii de clonare pot fi linearizai n urma restriciei dirijate
cu una sau mai multe enzime de restricie i n respectivul loc pot fi inserate gene ale
cror capete restricionate sunt compatibile cu capetele nou-generate ale vectorului

enzimele de restricie care produc capete coezive cu aceai extensie formeaz o


familie de enzime. Dei aceste enzime au secvene de recunoatere diferite, fragmentele
de ADN rezultate pot fi ulterior ligate n prezena ADN ligazei
Bam H I

5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'

Bcl

5'-TGATCA-3'
3'-ACTAGT-5'

Bgl II

5'-AGATCT-3'
3'-TCTAGA-5'

San 2A

5'-GATC-3'
3'-CTAG-5'

REACTIA DE LIGARE

Reactia de ligare presupune reunirea a doua sau mai multor fragmente de ADN printr-o
legatura covalenta in prezenta enzimei ADN ligaza. Aceasta reactie presupune formarea unei
legaturi fosfodiesterice intre captul 3'-OH al unei nucleotide si 5' fosfat al alteia

T4 ADN ligaza a fost extrasa din bacteriofagul T4

Fig.25. Reactia de ligare