ADN

Structura (primară, secundară, configurația spațială

« terțiară »)
Replicare (inițiere, elongare, terminare)
Reparare ADN (tipuri de leziuni, metode de reparare)

Conf. Dr. Elena Petrescu

Șef lucr. Dr. Gabriela Bordeianu
 Generalități
• Informația genetică este stocată și transmisă prin
intermediul acizilor nucleici: ADN (acid
deoxiribonucleic) și ARN (acid ribonucleic).

• Din punct de vedere chimic acizii nucleici sunt

polinucleotide, nucleotidul reprezentând unitatea
repetitivă.

• Un nucleotid este o structură complexă alcătuită

din trei elemente: o bază azotată, o pentoză si o
grupare fosfat.
 Bazele azotate
• Bazele azotate care intră în
alcătuirea nucleotidelor sunt de două
tipuri : baze purinice și pirimidinice;
• bazele purinice sunt adenina (A) și
guanina (G) și bazele pirimidinice
sunt citozina (C), uracilul (U) si
timina (T).
 Structura ADN
• O pentoză (numită și zahăr) este o structură
heterociclică formată din 5 atomi de carbon (penta).
Pentozele care intră în alcătuirea nucleotidelor sunt
riboza și un derivat al acesteia deoxiriboza (căreia îi
lipsește gruparea OH la C2).
• Gruparea fosfat provine de la acidul fosforic.
 Baze-nucleozide-nucleotide
• Compușii obținți în urma asamblării celor trei componente se numesc:
- nucleozide dacă o bază azotată este legată de o pentoză;
- nucleotide dacă la un nucleozid se atașează 1/2/3 grupări fosfat.
• O bază azotată atașat la carbonul anomeric (cel care nu aparține ciclului) al unei pentoze (printr-o legatură N-
glicozidică) formează un nucleozid. Într-un nucleozid atomii aparținând bazei azotate sunt numerotați cu cifre
arabe, iar atomii aparținând pentozei cu cifre arabe prim.
• Denumirile nucleozidelor corespunzătoare pentru cele 5 baze azotate sunt:
 Structura nucleotidelor

• Atașarea unei grupări fosfat la

gruparea 5’–OH (printr-o leg.
esterică) a unui nucleozid duce la
formarea unui nucleotid.
 • Denumirea unui nucleotid conține numele nucleozidului (baza azotată și pentoză)
Denumirea și a numărului de grupări fosfat atașate (MP monofosfat, DP difosfat, TP
trifosfat).
nucleotidelor • Dacă nucleotidul conține deoxiriboza în fața acestuia se găsește prefixul “deoxi”
notat cu “d”.
 Stocarea informației genetice
Acizii nucleici sunt polinucleotide cu structuri și roluri funcționale diferite și pot fi
clasificați în:
- ADN sau acizi deoxi ribonucleici care reprezintă forma de depozit a informației
genetice;
- ARN sau acizi ribonucleici care reprezintă forma de transmitere și traducere a
informației genetice.
• Informația genetică poate fi utilizată în două moduri:
- poate fi copiată integral cu apariția unei noi molecule de ADN identică cu cea
inițială (replicare);
- poate fi copiată doar parțial cu apariția unei molecule de ARN (transcriptie).
Transcripția este urmată de un proces de traducere care determină apariția unei
noi moleculele de data aceasta a unei proteine. Acest proces se numeste
translatie.
• “Dogma centrală” a biologiei moleculare consideră că informația genetică trece
de la ADN la ARN și se materializează prin apariția unei proteine.
 Structura ADN
• Localizarea ADN (la eucariote):
- în nucleu, separat de restul celulei prin membrana nucleară;
- ADN este asociat cu proteine, formând un complex numit
cromatină (în cursul diviziunii celulare se separă în 46
cromozomi);
- < 1% din ADN-ul total al unei celule este prezent în
mitocondrii – codifică mai multe proteine implicate în lanțul
respirator.
• Structura ADN a fost descoperită de către James Watson și
Francis Crick în 1953.
(→ premiul Nobel pentru medicină în 1962)
• ADN = dublu helix alcătuit din două lanțuri polinucleotidice
răsucite în jurul unui ax comun, asociate între ele.
 ADN-structura
• ADN este o moleculă dublu catenară
(formată din două lanțuri numite catene) de
dimensiuni foarte mari și care conține
întreaga informație genetică în succesiunea
nucleotidelor care îl alcătuiesc.
• ADN-ul prezintă, asemănător proteinelor, o
organizare complexă în care se disting mai
multe niveluri și anume: structura primară,
secundară și “terțiară”.
Structura primară

• Este generată de secvența de nucleotide și

realizată de legătura fosfodiesterică ce se
stabilește între gruparea 3’ OH a unui deoxi
nucleotid și gruparea 5’ fosfo a deoxi
nucleotidului următor.
• Prin secvența se înțelege felul și ordinea
nucleotidelor citite, în mod convențional, în
direcția 5’->3’.
• Nucleotidele ce alcătuiesc structura ADN sunt
deoxiribonucleotide alcătuite din:
- baze azotate : A, T, G, C
- pentoza : deoxiriboza
- gruparea fosfat
 ADN
• Lanțul polinucleotidic rezultat din legarea mai
multor nucleotide se caracterizează prin:
- legătura 5’-3’ fosfodiesterică care determină
apariția unui lanț (schelet) pe care se inseră bazele
azotate. Aceasta legatură poate fi hidrolizată de
enzime numite endo respectiv exonucleaze.
- are sarcină electrică negativă conferită de ionizarea
grupării fosfat la pH fiziologic
• O catenă ADN este caracterizată de:
- polaritate: o extremitate 5’ și una 3’
- direcție: dinspre capătul 5’ spre capătul 3’
 • Structura secundară a ADN arată ca acesta este format
din două lanțuri polinucleotidice helicoidale (numite
catene) care se răsucesc spre dreapta, în jurul unui ax
Structura comun rezultând o structură dublu helicoidală numită
și dublu helix.

’’secundara’’ • Aceasta structură este realizată de două tipuri de

legături:
- legăturile de hidrogen ce se stabilesc între bazele
azotate complementare situate pe lanțuri diferite
orientate antiparalel;
- legăturile hidrofobe (Van der Waals) ce se stabilesc
între moleculele bazelor azotate ale aceluiași lanț.
 ADN-dublu helix - caracteristici

- dublu helix delimitează o zonă situată în afara celor două

lanțuri și o zonă situată între cele două lanțuri.
- scheletul fiecărei catene este alcătuit din legătura
fosfodiesterică (pentoză + fosfatul) orientată spre
exterior.
- în interior se găsesc față în față baze
purinice/pirimidinice care sunt orientate aproape
perpendicular pe axa dublului helix și între care se
formează legături de hidrogen.
- legăturile de hidrogen sunt între anumite baze și anume
T și A între care se stabilesc 2 legături de hidrogen și G
și C între care se stabilesc 3 legături de hidrogen. Aceste
baze poartă denumirea de baze complementare.
 ADN-dublu helix - caracteristici
- cele două catene nu sunt identice ci complementare deoarece unei baze apartinând
unui lanț îi corespunde baza complementară situată față în față pe cel de al doilea
lanț;
- cele două catene sunt orientate antiparalel adică extremitate 3’a unui lanț este față
în față cu capătul 5’ al celui de al doilea lanț;
- între suprafețele formate de planurile bazelor (care sunt așezate stivuit una peste
alta) se formează legături hidrofobe care stabilizează dublul helix. Dublul helix
apare ca o scară în spirală în care treptele sunt reprezentate de planurile bazelor
complementare și în care 10 perechi de baze alcătuiesc 10 trepte ale ale unei spire
complete ale scării.
 Structura “terțiară”

Configurația spațială a ADN

• Lanț polinucleotidic liniar (neramificat) format
dintr-un număr foarte mare de nucleotide
depozitat într-o formă ordonată, strânsă,
compactată care să permită accesul rapid la
informația genetică cât și pentru a se încadra în
spațiul restrâns al celulei.
• flexibilitatea structurală a lanțului îi permite
moleculei de ADN să adopte o structură mult
mai compactată decât forma dublu helicată.
 ADN - cromatina - cromozomi
La eucariote (celule care au depozitată informația genetică
în nucleu)
- ADN-ul este liniar și asociat cu complexe proteice formând
cromatina. În perioadele de repaos (în afara perioadei de
diviziune) materialul genetic se găsește sub forma amorfă
dispersat în tot nucleul. În timpul diviziunii cromatina
condensează, se organizează în 46 cromozomi asociați câte 2 în
23 perechi (cromozomi bicromatidici). Fiecare cromozom
conține o singură molecula de ADN liniar cu lungimi diferite de
la un cromozom la altul, care este aranjată ordonat, împachetată,
cu ajutorul proteinelor.
- Acestea îndeplinesc pe lângă rolul structural în aranjarea
spațială și roluri de reglare în precesul de replicare, transcripție.
- Proteinele ce servesc la împachetarea ADN-ului sunt proteine
histonice și nehistonice.
 Histonele

• sunt proteine bazice ce prezintă numeroase resturi de Lys și

Arg care la pH fiziologic se prezintă sub formă ionizată având
sarcină +. Sarcina + formează legături ionice cu sarcinile –
prezente la gruparea fosfat din scheletul exterior al dublului
helix, fixând astfel dublul helix al ADN-ului pe suprafața lor.
• există 5 tipuri de histone notate H1, H2a, H2b, H3 si H4;
• histonele H2a, H2b, H4 si H5 se asociază câte două de același
fel rezultând un octamer asemanător unui mosor (cilindru) în
jurul căruia (pe suprafața căruia) se înfășoară molecula de ADN
de două ori în mod asemănător felului în care se înfășoară ața
pe mosor. Acest complex format din octamer și ADN-ul fixat
poarta numele de nucleosom și are un diametru de 10 nm.
 Histonele
- între doi nucleozomi porțiunea de ADN liberă
este asociată cu histona H1 care se pare ca are
rolul de a proteja dublul helix de acțiunea
endonucleazelor (enzime ce rup legătura
fosfodiesterică situată în interiorul lanțului
polinucleotidic).
- Lanțul de nucleozomi este la rândul lui spiralat
rezultând o structură numită polinucleozom sau
nucleofilament cu diametrul de 30 nm. Aceste
nucleofilamente formează la rândul lor bucle care
sunt fixate (pentru a nu se încurca) pe proteine
nehistonice mari, care formează axul unui
cromozom (asemănător cu o perie de spălat
eprubete).
 Denaturarea ADN
•Când o moleculă de ADN bicatenar este supusă la
creșterea temperaturii → cele două catene se separă
datorită ruperii legăturilor de H dintre bazele azotate.
•Procesul poate fi urmărit experimental prin
măsurarea absorbției luminii UV (bazele azotate
absorb la λ = 260 nm) − ADN monocatenar are o
absorbanță mai mare față de ADN bicatenar.
•Când ADN este încălzit, temperatura la care ½ din
structura dublu-catenară s-a pierdut este definită ca
temperatură de fuziune, Tm (melting temperature).
•Răcire lentă → cele două catene ADN
complementare pot reconstitui dublul helix, proces
numit renaturare.
20
 Degradarea ADN
•Nucleaze (DNaze) catalizează scindarea hidrolitică a legăturilor fosfodiesterice din ADN
•Exonucleazele degradează acizii nucleci la una din cele două extremități, îndepărtând
câte un nucleotid – pot acționa în direcția 5’→3’ sau în direcția 3’→5’
•Endonucleazele degradează acizii nucleici la nivelul unor situsuri specifice în interiorul
unor molecule de ADN monocatenar sau dublu-catenar
•Endonucleazele de restricție recunosc și scindează ADN-ul dublu-catenar la nivelul
unor secvențe specifice (numite secvențe de recunoaștere sau situsuri de restricție)
- sunt produse în mod natural de către bacterii → rolul lor biologic este de a recunoaște și
scinda ADN-ul străin (ex. ADN-ul unui virus infecțios – bacteriofag)
- utilizate în tehnologia ADN recombinant și pentru diagnostic molecular

21
 Replicare = Sinteza ADN

• Sinteza ADN se mai numește și

replicare și înseamnă copierea integrală
a ambelor catene ale ADN-ului.
• În urma sintezei o catenă parentală este
păstrată, conservată, în fiecare nou
dublu helix sintetizat, motiv pentru care
se spune ca replicarea este
semiconservativă.
 Replicarea ADN
Replicarea este un proces amplu
desfășurat pe mai multe etape
succesive:
A. inițierea replicării cu separarea
celor două catene și formarea furcii
de replicare;
B. elongarea – sinteza propriu-zisă a
noilor catene ADN;
C. încheierea procesului
Replicarea ADN
Pentru realizarea replicării este nevoie de o serie de elemente:
1. modelul după care se va sintetiza noua catenă ADN
(fiecare din cele două catene numite catene matrite).
2. deoxinucleotidele pentru asamblarea în noul lanț,
conform informației din “matriță’’ -dATP, dGTP, dCTP,
dTTP
3. Prezența unei “amorse”, numită și primer – secvența
scurtă de ARN care are rolul de a furniza o grupare 3’
OH liberă la care să poată fi atașat primul nucleotid.
4. ADN polimeraze – atașare succesivă a câte un
deoxiribonucleotid, printr-o legătură fosfodiesterică.
Atașarea nucleotidelor nu necesită energie, acestea fiind
gata activate sub formă de dNTP.
 Replicarea ADN
• Nucleotidul ce urmează a fi atașat formează mai întâi
o pereche complementară cu baza de pe matriță, după
care se formează o legătură fosfat între gruparea 5’ a
nucleotidului atașat și gruparea 3’OH de la capătul
lanțului în creștere cu eliminarea unei grupări
pirofosfat (PPa).
• Pe lângă funcția de sinteză, ADN -polimeraza prezintă
o funcție suplimentară exonucleazică. Prin această
funcție ele sunt capabile să hidrolizeze legătura nou
formată. În urma acțiunii exonucleazice nucleotidul
marginal poate fi îndepărtat. Această acțiune
suplimentară servește funcției de corectare în cazul
adaugării unui nucleotid greșit “necomplementar” (C
atasat greșit adică CA în loc de TA).
 Inițierea replicării
• Este un proces ce are loc în două etape:
a) desfacerea dublului helix și
b) construirea primerului.
b) Desfacerea dublului helix.
• Pentru ca replicarea să aibă loc este necesară desfacerea
dublului helix și separarea celor 2 catene ale ADN –ului
parental.
•  Desfacerea dublului helix este realizată prin ruperea
legăturilor de H, dintre bazele complementare, cu consum
de ATP, în prezența unei enzime numită helicaza, în
anumite regiuni numite ori (origin of replication). La
procariote există o singură regiune ori, la eucariote însă,
replicarea începe simultan în mai multe puncte ori ale
helixului.
 Construirea primerului
• ADN polimeraza poate iniția sinteza lanțului complementar pe o
catenă matrița cu ajutorul unui primer - fragment de ARN scurt,
oligonucleotidic, situat la începutul catenei matriță, care să
furnizeze gruparea OH liberă la capătul 3’. Acest hidroxil
funcționează ca acceptor al primului deoxiribonucleotid “adus și
atasat” de către ADN polimeraza.
• Primerul este sintetizat de o ARN polimeraza (primaza) (la
eucariote primaza este Pol ) complementar și antiparalel cu
catena matriță rezultând un fragment în care la A de pe matrița
corespunde U pe primer.
• Pe masură ce cele două catene sunt separate în vederea copierii
apar supra-spiralări în direcția de înaintare, aceasta fiind blocată
la un moment dat.
• Există enzime specifice care desfac aceste supra-spiralări
(rezultate prin “înghesuirea” numărului de spire) și îndepărtează
tensiunea creată de acest fenomen, numite topoizomeraze.
• Acestea au acțiune dublă:
- endonucleazică adică rup legatura fosfodiesterică de pe una sau pe ambele catene pentru a permite derăsucirea acestora;
- ligazică, de resigilare, adică refac legaturile rupte dupa îndepărtarea supraspiralării.
• Sunt cunoscute două topoizomeraze:
- Topoizomera I – care rupe o singură catenă permițând trecerea celeilalte prin breșa făcută, nu necesită ATP pentru
acțiunea lor și la eucariote îndepărtează atât suprahelicarile + cât și pe cele -.
- Topoizomeraza II – care rupe ambele catene permitand rotirea capetelor libere si derasucirea acestora, ca ulterior acestea
sa fie resigilate cu consum de ATP(la eucariote).
 Elongarea
• Prin elongare se intelege adaugarea de deoxiribonucleotide, cate una pe rand, la capatul
3’OH a catenei nou sintetizate, actiune realizata de enzime numite ADN polimeraze.
• Secventa de deoxiribonucleotide adaugate este dictata de secventa din matrita si
complementara cu aceasta.
 Elongarea
• Caracteristici ale elongarii:
- necesita primer furnizor de 3’OH
- se sintetizeaza doua catene
o una care se deplaseaza in directia furcii de replicare si care este sintetizata in mod continuu,
numita catena conducatoare (leading)
o cea de a doua care se deplaseaza in directia opusa deplasarii furcii, numita catena “intirziata”
(lagging), este sintetizata in mod discontinuu. Pe aceasta catena sunt sintetizati mai multi
primeri din loc in loc (discontinuu).
 DNA polymerases in eukaryotes
• Există mai multe tipuri de ADN
Polymerase Function Exonuclease activity
polimeraze:
Pol α Primase activity None - la Pk – I, II, III
Synthesizes RNA primers
of Okazaki fragments
- la Ek – α, β, γ, δ, ε, etc.

Pol β DNA repair None

Pol γ DNA replication in 3’ to 5’
mitochondria

Pol δ Replication of the leading 3’ to 5’

and lagging strand

Pol ε Replication (sometimes it 3’ to 5’

takes the place of Pol δ)
DNA repair

32
 Sinteza semi-discontinuă a ADN
•Moleculele de ADN sunt dublu-catenare și cele două catene sunt antiparalele
•Replicarea ADN are loc pe ambele catene simultan și ADN polimerazele pot acționa numai în sensul 5’→3’ =>
cele două catene ADN nou sintetizate nu pot crește în același sens concomitent, într-o manieră continuă

•Cele două catene ADN sunt replicate în moduri diferite:

- una dintre catene (catena “leading”) este replicată într-o manieră continuă în sensul 5′→3′, spre furca de replicare
– de către Pol δ (la Ek), Pol III (la Pk)
- cealaltă catenă (catena “lagging”) este replicată într-o manieră discontinuă, sub formă de fragmente scurte de 150-
200 nucleotide la Ek (1000-2000 nt la Pk), tot în sensul 5′→3′, dar depărtându-se de furca de replicare (fragmente
Okazaki)
•Sinteza fiecărui fragment Okazaki este inițiată de Pol α prin subunitatea sa cu activitate de primază → primerii
ARN sunt elongați de către Pol δ (Pol α nu are activitate de corectare 3’→5’ exonucleazică, deci nu este adecvată
pentru replicarea cu înaltă fidelitate a ADN)
33
Excizia primerilor ARN și înlocuirea lor cu ADN:
•Pe măsură ce replicarea avansează, primerii ARN sunt excizați din fragmentele Okazaki prin acțiunea ADN
polimerazei I (la Pk), având activitate 5’→3’ exonucleazică
•Pe măsură ce îndepărtează ribonucleotidele, Pol I le înlocuiește cu deoxiribo-nucleotide, utilizând activitatea sa
5’→3’ polimerazică (elonghează fragmentul Okazaki precedent)
•ADN ligaza unește fragmentele Okazaki adiacente prin formarea unei legături fosfodiesterice (energia este
furnizată de scindarea ATP în AMP + PPi)

34
• La Ek, polimerazele nu au activitate 5'→3' exonucleazică pentru a degrada
primerii ARN → enzime separate (FEN-1 = flap endonuclease-1 și RNaza H)
degradează ARN → Pol δ completează golurile rămase în urma îndepărtării
primerilor
Replicarea catenei leading și a catenei lagging

36
 Proteine implicate în replicarea ADN
ADN polimeraze Adaugă nucleotide în catena de ADN nou sintetizată în
sensul 5’→3’, citind catena matriță în sensul 3’→5’

Primaza Sintetizează primerii ARN

Helicaza Separă catenele ADN parentale, prin desfacerea dublului
helix (ruperea legăturilor de H dintre bazele azotate
complementare)

Proteine SSB Previn reasocierea monocatenelor ADN

Topoizomeraze Îndepărtează tensiunile asociate suprarăsucirii dublului
helix (cauzată de înaintarea furcilor de replicare)

Enzime care FEN-1 și RNaza H (la eucariote)

îndepărtează primerii
ARN

ADN ligaza Unește, prin formarea unei legături fosfodiesterice, două

fragmente ADN care sunt asociate la aceeași matriță

37
 Eliminarea erorilor de împerechere (fidelitatea replicării
ADN)
•Este extrem de important ca secvența nucleotidică a ADN să fie replicată cu cât mai puține erori
posibil.
•Erorile de împerechere pot duce la apariția de mutații cu consecințe severe.
•Pentru a asigura fidelitatea replicării, multe ADN polimeraze au, pe lângă activitatea polimerazică, o
activitate de verificare a corectitudinii replicării (proofreading) și de corectare a erorilor (funcție
3’→5’ exonucleazică).
•Pe măsură ce fiecare nucleotid este adăugat, ADN polimeraza verifică dacă acesta este cel corect
(complementar cu nucleotidul corespunzător din catena matriță).
•Dacă nucleotidul nu este cel corect, activitatea 3’→5’ exonucleazică a ADN polimerazei îl
îndepărtează.
•Apoi, prin activitatea 5’→3’ polimerazică a aceleiași enzime, este adăugat nucleotidul corect.
38
• La E. coli: rata erorilor în cursul replicării este de una la 109 -1010 nucleotide adăugate
• ADN polimerazele inseră un nucleotid greșit la 104-105 nucleotide corecte
• Activitatea de corectare îmbunătățește acuratețea reacției de polimerizare de 102- 103 ori → ADN polimerazele
lasă în urmă o eroare la fiecare 106-108 baze adăugate
• Acuratețea suplimentară este asigurată de un mecanism care repară erorile de împerechere rămase după
replicare (MMR – mismatch repair)

39
 Repararea ADN
• Moleculele de ADN pot suferi leziuni sub acțiunea unor agenți genotoxici diverși:
- Factori chimici – prezenți în alimente, țigări, medicamente, aerul poluat sau generați în cursul metabolismului celular
- Factori fizici: radiațiile – radiații ionizante (radiația cosmică, radiațiile X utilizate în investigațiile medicale) și radiațiile
UV

Tipuri de leziuni ADN:

• Modificarea bazelor azotate
- dezaminare – cauzată de agenții dezaminanți (ex. acidul nitros derivat din nitriți)
- lezare oxidativă – cauzată de speciile reactive de oxigen
• Pierderea bazei azotate (datorită hidrolizei legăturii N-glicozidice dintre bază și deoxiriboză) → formarea unui situs
apurinic/apirimidinic
• Dimerii de timină – conexiune covalentă formată între două baze pirimidinice adiacente din aceeași catenă ADN (sunt
cauzați de radiațiile UV)
• Rupturi catenare – monocatenare sau dublu-catenare (cauzate de radiațiile ionizante)
40
41
 Mecanisme de reparare a leziunilorADN
• Menținerea integrității informației înscrise în ADN este esențială pentru organism
• Există mai multe mecanisme de reparare a leziunilor ADN:
- Reparare prin excizia bazei (BER) – în cazul modificării bazelor azotate
- Reparare prin excizia nucleotidelor (NER) – când leziunea este mai severă și produce o distorsiune a
catenei ADN (ex: dimerii de timină)
- Recombinarea omologă – repară rupturile ADN dublu-catenare
• Dacă mecanismele de reparare eșuează și leziunile ADN rămân nereparate, acestea pot duce la:
- moarte celulară
- modificări permanente ale informației genetice numite mutații (modificări ale secvenței de nucleotide):
- mutații în celulele germinale → boli genetice;
- mutații în celulele somatice → implicate în oncogeneză.
42
Etapele principale ale mecanismelor de reparare
a ADN (exemplificare pentru NER):
•Proteine specifice recunosc leziunea ADN sau
distorsiunea în helixul ADN cauzată de leziune
•Regiunea ce conține leziunea este îndepărtată sub
acțiunea unor endonucleaze și exonucleaze
•Golul rămas în catena lezată este completat de către
o ADN polimerază de reparare care utilizează catena
intactă, nelezată, ca matriță
•Continuitatea catenei reparate este asigurată de o
ADN ligază
•În cazul rupturilor dublu-catenare – recuperarea
corectă a informației gentice este realizată prin
utilizarea, ca matriță intactă, a cromatidei surori sau
a cromozomului omolog 43
 Replicarea ADN

• https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw