Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Acizii nucleici sunt substante organice macromoleculare, care reprezinta cei mai
polimeri din lumea vie, constituite din 3 tipuri de substante chimice:
baze azotate(purinice si pirimidinice)
pentoze (glucide)
radical acid fosforic
a) Baza azotata
-dintre cele 3 componente ale nucleotidelor, doar bazele azotate confera specificitate in cadrul
fenomenului ereditar deoarece pentozele si radicalul fosforic sunt comune tuturor
macromoleculelor de ADN din lumea vie
-sunt de 2 tipuri: purinice si pirimidinice
atomi de C
4 atomi de N
-au dimensiuni mai mari
-prezinta un atom de H la N9
-sunt: adenina (A) si guanina (G) comune ADN-ului si ARN-ului
b)
-
Pentoza=zahar pentozic
si
ARN
-prin legarea unei molecule de baza azotata cu o molecula de pentoza, in pozitiile N9-C1 sau
N3-C1, cu eliminarea unei molecule de apa, va rezulta o molecula
de nuclezida
- intre nucleotidele macromoleculelor se stabilesc legaturi
intracatenare si intercatenare
-prin atasarea unui radical acid fosforic la atomul C3 sau C5 al
pentozei, cu eliminarea unei alte molecule de apa, se va forma o
molecula de nucleotida legaturi covalente intracatenare,
fosfodiesterice
-atat in ADN cat si in ARN in cadrul structurii primare
(monocatenare) nucleotidele alcatuiesc, prin radicalii lor
glucidofosforici, un adevarat schelet sau coloana de care sunt legate
bazele azotate;
-deoarece in fiecare tip de acid nucleic exista 4 tipuri de baze
azotate, rezulta ca fiecare tip de acid nucleic contine 4 tipuri de nucleotide
-legaturile dintre nucleotide apartinand celor 2 catene polinucleotidice sunt intercatenare si
se realizeaza intre bazele azotate purinice si pirimidinice
de
106 si 5x 106
106 daltoni,
daltoni
-cele doua balustrade ale scarii sunt reprezentate printr-un schelet glucido-fosforic, iar
treptele scarii sunt reprezentate prin baze azotate intre care se stabilesc punti de hidrogen de
natura electrostatica de tip A=T (duble) sau C=G(triple) si invers;
- legaturile de hidrogen se formeaza si se dezorganizeaza cu usurinta fara sa necesite surse
energetice speciale. Acest fapt explica modul in care se desfasoara replicarea ADN, transcrierea
informatiei din
ADN sau repararea ADN etc,
-structura bicatenara a ADN prezinta de regula o mare stabilitatefizica, asigurata astfel:
a. pe verticala, de puntile fosfodiesterice intracatenare;
b. pe orizontala, de puntile de hidrogen intercatenare.
-prin asezarea in interiorul
moleculei a bazelor azotate si a puntilor
de hidrogen, acestea sunt protejate de
actiunea diferitilor factori de mediu,
asigurandu-se stabilitatea moleculei si
implicit a informatiei genetice, conferita
de ordinea de nucleotide dintr-o catena;
-datorita faptului ca pot exista
numai patru tipuri de legaturi (A=T,
C=G, respectiv T=A, G=C), se asigura
reproducerea cu mare fidelitate a
informatiei genetice in urma procesului
de replicare
-sensul de legare a nucleotidelo
prin intermeiul radicalilor fosfat A difera
intre cele 2 catene; astfel, daca intr-o
catena sensul este C5 -> C3, in catena
complementara va fi C3 -> C5
-intrucat cele doua catene ale moleculei de ADN sunt complementare, succesiunea bazelor
azotate dintr-o catena determina succesiunea bazelor din catena antiparalela;
-pasul elicei (o rotatie completa a celor doua catene in jurul axului) este de 34; deoarece la
un pas al elicei se afla 10 nucleotide, distanta dintre 2 perechi alaturate de nucleotide este de 3,4
A
-diametrul elicei, la tipul B al ADN, este de 19 A (fata de valoarea de 20A stabilita initial)
-dublul helix prezinta rasucire spre dreapta(dublu helix dextrogir) fiind usor asimetric si
prezinta 2 scobituri: scobitura mare si scobitura mica; acestea reprezinta locul unde actioneaza
factorii mutageni;
- caracteristicile structurale finale ale
ADN dublu catenar sunt dictate insa de
moleculele de dezoxiriboza (D) care se
aseaza, cu oxigenul inelului orientat in sus,
in cadrul unei catene si orientat in jos, in
cadrul catenei complementare; din cauza
acestui aranjament opus al moleculelor de
dezoxiriboza in cele doua catene, si
deoarece dezoxiriboza se leaga la o pozitie
excentrica a bazei azotate, intreaga
molecula de ADN este obligata sa se
rasuceasca, sa se spiralizeze, rezultand nu
o structura dreapta bicatenara ci una
spiralata dublu helix, in care fiecare
pereche succesiva de baze azotate se
intoarce cu 36 in directia acelor de
ceasomic (rasucire dextrogira), iar dublul helix face un tur complet de 360 la fiecare 1 0 percchi de
baze.
3. TIPURI DE ADN
- forma clasica de ADN descrisa de Watson, Crick si Wilkins, caracteristica zonelor cu
eucromatina, reprezinta tipul B de ADN; in alte conditii, duplexul de ADN se poate afla
sub alte forme structurale
a) Tipul A
- este intalnit la concentratii saline mari si in cazul unei deshidratari partiale;
- este prezent in vivo, in regiunile dublu catenare din molecula de ARN unde prezenta grupei
hidroxil-2 impiedica adoptarea formei B, precum si in duplexurile hibride ADN-ARN (avand o
catena de ADN si o catena complementara de ARN)
- in structurile relativ compacte ale ARN, similare formei A, bazele azotate sunt inclinate fata de
axul elicei si sunt mai multe perechi de baze pe pas al elicei;
b) Tipul B
c) Tipul Z
- singurul tip de ADN cu rasucire spre stanga, fiind in contrast cu forma clasica, respectiv cu Tipul B
-este o forma compacta, avand cele mai multe perechi de baze pe o rotatie a moleculei
- numele provine de la forma in zigzag a catenei fosfo-glucidice
-prezinta o singura scobitura
- este intalnit la polimerii care au o secventa de baze purinice si pirimidinice alterate
- a fost intalnit in conditii in vitr, in unele cazuri neobisnuite, folosind concentratii ridicate de saruri
- se pare ca este posibila existenta unei tranzitii de la forma B la forma Z: iin anumite conditii, o
portiune din molecula de ADN care prezinta dubletele G=C/C=G poate fi convertita in forma Z, pe
cand alte regiuni raman in forma clasica B, caracteristica celulelor vii;
- in vitro, tipul Z este caracterizat prin existenta unor secvente de baze purinice si pirimidinice
alaturate, repetate;
Tipul de ADN
A
B
Z
Directia de rotatie
Perechi
a
baze pe pasRotatia pe perechi Diametrul moleculei
moleculei
elic elice
baze
(A)
Dreapta
11
+34.7
23
Dreapta
10
+34,0
19
Stanga
12
-30
18
d)
de
Fenomenul
denaturare
i)
Denaturarea
- prin incalzirea unei solutii de ADN la o temperatura de 85-95 C sau prin mentinerea la o
concentratie ridicata de saruri, legaturile de hidrogen dintre cele 2 catene complementare se pot
rupe; procesul este denumit denaturare, rezultand ADN denaturat monocatenar;
- temperatura de denaturare (punctul de topire al ADN) difera de la o specie la alta si este
dependenta de procentul de legaturi triple de hidrogen (C=G) si proportionala cu procentul
acestora in molecula de ADN;
- daca solutia de AND monocatenar este racita brusc, cele 2 catene nu se mai reunesc (nu se mai
refac puntile de hidrogen), rezultand ADN monocatenar;
ii)Renaturarea
- renaturarea reprezinta capacitatea catenelor complementare de a reface dublul helix;
- procesul are loc printr-o racire treptata, lenta, care permite refacerea puntilor de hidrogen si
reasocierea catenelor, rezultandADN renaturat;
-procesul de renaturare se produce in 2 etape:
In prima etapa, o catena de ADN din solutie se imperecheaza cu alta catena la intamplare,
formandu-se scurte regiuni bicatenare;
Ulterior, in etapa urmatoare, regiunea de baze imperecheate se extinde de-a lungul
moleculei, intreaga molecula devenind bicatenara;
iii) Hibridizarea
- implica refacerea unui dublu helix, pornind de la catene de ADN de origine diferita sau de la o
catena de ADN si o catena de ARN;
-se poatea realiza pe 2 cai:
Hibridizarea lichida: cele 2 preparate de ADN monocatenar sunt amestecate in solutie
Hibridizarea de filtru: prin imobilizarea pe un filtru de hibridizare
- pe baza unor experimente de hibridizare si stabilind procentul de realizare a secventelor dublu
catenare, se poate observa inrudirea dintre specii (rol in stabilitrea relatiilor filogenetice dintre
specii), fiind totodata o metoda de lucru utilizata in tehnologia ADN recombinat;
genomul unor
virusuri precum si mici molecule in nucleul unor eucariote;
- ca si ADN, pentru a-si indeplini functiile, ARN formeaza punti de hidrogen intre bazele azotate din
anumite regiuni, constituind astfel o structura secundara care imbraca forme ca bucle, cute
interne caracteristice, dupa care pot fi identificate anumite tipuri de ARN;
- constituie circa 85% din cantitatea totala de ARN din celula, fiind localizat in ribozomi, unde este
asociat cu proteinele;
- are o masa moleculara de circa 5 x
105
g) microARNs
- regleaza exprimarea ARN-m: degradeaza ARN-m sau inhiba translatia lui
- se afla in citoplasma
h)
XIST
ARN
-inactiveaza unul dintre cei doi cromozomi X din celulele vertebratelor de sex feminin
studiul ciclului celular a relevat existenta unei naumite constante a dinamicii cantitatii de
ADN in celule
- in interfaza, exista mai multe perioade:
perioda G1
o primul gol sintetic, cand cantitatea de ADN din celula ramane constanta
o cromozomii sunt monocromatidici, fiecare este format dintr-o macromolecula de
ADN formata din 2 cromoneme (2C)
perioada S
o de sinteza, in care are loc replicarea ADN care se incheie cu dublarea cantitatii de
ADN
o cromozomii devin bicromatidici, formati din doua macromolecule de ADN ce contin 4
cromoneme (4C)
perioada G2
o al doilea gol sintetic, in care se prezerva cantitatea dubla de ADN (4C)
- in timpul diviziunii celulare ( doua etapa a ciclului celular) cantitatea de ADN este variabila
in diferite faze ale procesului:
profaza si metafaza: cromozomii sunt bicromatidici, iar cantitatea de ADN din celula
este aceeasi cu cantitatea de ADN a celulei care a intrat in diviziune
anafaza: cromozomii redevin monocromatidici (prin
Dupa separarea catenelor, devin
clivarea longitudinala a celor bicromatidici), migreaza spre
expuse bazele lor azotate, astfel
polii celulei si in final (la sfarsitul telofazei) rezulta doua
incat noi nucleotide
celule fiice cu acelasi numar de cromozomi si aceeasi
complementare sa poata forma
cantitate de ADN ca si celula mama;
cu ele punti de hidrogen. Pentru
- diviziunea meiotica, care se desfasoara in organele
reprducatoare ale organismului pornind de la celule diploide
aceasta intervine enzima AND(2n), determina formarea celulelor haploide (n) si reduce la
polimeraza care ocupa pozitia la
jumatate numarul de cromozomi si respectiv, cantitate de
locul unde va incepe sinteza noii
ADN; astfel, in timp ce celulele somatice au o cantitate dubla
catene. Ca AND-polimeraza sa se
de ADN, celulele gametice vor avea doar jumatate; cantitatea
situeze la locul unde incepe
de ADN se dubleaza in urma singamiei gametilor si formarii
sinteza, intervine un scurt
zigotului diploid;
fragment de ARN numit ARN- Watson si Crick au emis ipoteza replicarii ADN dupa model
primer, complementar
semiconservativ: conform acestui model, initial are loc ruperea
fragmentului initial al catenei de
puntilor de H, rezultand aDN monocatenar; ulterior, fiecare catena
AND matrita;
originala serveste drept matrita (templat) pentru sinteza unei catene
noi; vor rezulta 2 molecule noi, fiecare avand o catena veche si o
Imediat dupa ocuparea pozitiei de
catena nou-sintetizata;
initiere a sintezei, AND-olimeraza
- deoarece puntile de H complementare intre bazele azotate
determina adaugarea, nucleotide
(nucleotide) din cele 2 catene pot fi numai A=T C=G si invers,
dupa nucleotide, in ordinea
secventa nucleotidelor in cele doua molecule rezultate este identica
ca in secventa de nucleotide din molecula originala; astfel, cele 2
exacta complementara catenei
molecule, respectiv cele 2 fiice rezultate, vor avea aceeasi
ADN matrita
constitutie genetica cu molecula, respectiv celula initiala;
AND-polimeraza catalizeaza atat
formarea puntilor de hydrogen
intre nucleotida nou venita si
nucleotidele complementare din
ADN matrita, cat si reactia dintre
radicalul fosfat legat de C5 al
- deci, daca se separa catenele perechi ale unei molecule de ADN, fiecare catena poate fi utilizata
ca model (matrita) pentru producerea catenei complementare; fiecare catena matrita si cu cea
noua, complementara, vor forma impreuna o noua moelcula de ADN dublu helix, copie identica a
moleculei originare;
- in procesul de replicare intervin mai multe tipuri de enzime:
1. EXONUCLEAZA intervine in indepartarea unui nucleoid, a unei secvente a unui nucleoid
sau a unor enzime;
- la eucariote, replicarea ADN incepe simultan in mai multe regiuni situate de-a lungul moleculei de
ADN numite repliconi sau ochiuri de replicare care functioneaza simultan in timpul perioadei S;
repliconul este un fragment de ADN alcatuit din 30.000-70.000 perechi de nucleotide, la nivelul
caruia are loc replicarea moleculei de ADN, in doua directii diferite; genomul viral sau genomul
bacterian contine un singur replicon, pe cand genomul celulei eucariote contine mai multi
repliconi;
-replicarea ADN incepe de la furca de replicare, constituita dintr-o secventa de nucleotide (circa
300 de perechi, dupa unii autori); aceasta constituie o regiune unde are loc o trecere de la
duplexul parenta la noile duplexuri fiice replicate;
2. ADN-TOPOIZOMERAZA taie si apoi leaga catene de ADN, reducand tensiunea din acestea,
facand posibila desfacerea celor doua catene ale moleculei;
- la furca de replicare, actioneaza complexul PRIMOZOM, constituit din doua enzime diferite ADNPRIMAZA si ADN-HELICAZA
3. ADN-HELICAZA desface puntile de hidrogen dintre cele 2 catene; regiunea monocatenara
rezultata este complexata cu o proteina tip SSB (single-strand binding-protein), care
stabilizeaza regiunea cu ADN monocatenar, impiedicand refacerea puntilor de hidrogen;
astfel, in urma actiunii ADN-helicazei, pe un anumit segment cele doua catene de ADN sunt
separate si pot fi identificate ca bucle ce constituie unitati replicative (la procariote)
sau repliconi (la eucariote);
- sinteza a doua catene noi are loc diferit pe cele doua catene matrita, originale deoarece enzima
ADN-polimeraza, implicata in polimerizarea nucleotidelor, poate atasa un nou nucleotid numai la
capatul 3 liber al moleculei de pentoza;
- modelul acceptat in prezent este modelul replicarii discontinue, propus de Okazaki
1. Catena veche 3-5 serveste ca matrita pentru sinteza unei catene complementare noi,
catena 5-3, denumita catena leading (catena directoare sau catena principala);
Deoarece noua catena prezinta liber capatul 3-OH, la care pot fi adaugate noi nucleotide,
sinteza sa are loc in mod continuu, sub actiunea enzimei ADN-POLIMERAZA III, pe baza
ordinii dictate de catena matrita a legaturilor de specificitate tip A=T sau C=G;
Dupa sinteza are loc rasucirea catenei nou-formate fata de cea originala, formandu-se
structura bicatenara;
2. Catena initiala 5-3 serveste ca matrita pentru sinteza unei catene complementare noi,
catena 3-5', denumita catena lagging (catena discontinua, segmentara, intarziata)
Deoarece catena noua nu are liber capatul 3-OH, sinteza este discontinua, avand loc dupa
un alt mecanism, de la furca de replicare spre capatul liber al catenei, ducand la formarea
de fragmente Okazaki;
Enzima de initiere a sintezei este ADN-PRIMAZA sub actiunea careia este sintetizat un
PRIMER ADN alcatuit din cateva nucleotide
Pornind de la primerul ADN, sub actiunea enzimei ADN-POLIMERAZA III, are loc atasarea de
nucleotide noi, de la furca de replicare catre capatul liber al catenei lagging, formandu-se
un fragment Okazaki
Cel de-al doilea fragment Okazaki va ajunge in dreptul primerului fragmentului Okazaki
sintetizat anterior;
Fragmentul Okazaki este un fragment de ADN, alcatuit din cateva mii de nucleotide(10002000) la procariote si 100-200 de nucleotide la eucariote
Dupa sinteza unui fragment Okazaki, ADN-POLIMERAZA III este inlaturata; al doilea
fragment Okazaki sintetizat va ajunge in dreptul
primerului primului fragment Okazaki sintetizat anterior;
Ultima etapa in replicatia ADN
Imediat actioneaza enzima ADN-POLIMERAZA I, avand loc
consta in indepartarea ARNatasarea ultimului nucleotid, care ajunge langa primerul
primer si completarea golului
fragmentului Okazaki sintetizat anterior
Dupa aceasta, sub actiunea unei exonucleaza sintetizate
cu ADN. Acest process este
anterior are loc indepartarea primerului ADN de la
asigurat de un alt tip de ADNfragmentul Okazaki sintetizat anterior, proces urmat de
polimeraza care catalizeaza
indepartarea ADN-POLIMERAZEI I
descompunerea ARN
Cele doua fragmente Okazaki alaturate sunt unite sub
actiunea enzimei ADN-LIGAZA, dupa care are loc
primerului si inlocuirea lui cu
rasucirea catenei nou-sintetizate in jurul catenei matrita;
dezoxiribonucleotide.
ssb proteina de legare la monocatena; astfel, monocatenele sunt mentinute separat, avand
loc initierea propriu-zisa a replicarii
toate ADN polimerazele cunoscute nu pot initia sinteza, adican u pot realiza sinteza ,,de novo
a unei catene polinucleotidice; singurul lucru pe care acestea il pot realiza este acela de a
utiliza un capat 3-OH (numit si capat primer 3-OH) al unei catene polinucleotidice
preexistente si de a cataliza asa-numitul atac nucleofilix al acestei grupari OH asupra primei
legaturi fosforice dintre primul si cel de al soilea fosfat de la capatul 5 al nucleotidului aliniat
pe matrita ADN, nucleotid unit prin punti de hidrogen cu cel complementar acestuia;
multa vreme nu s-a stiut cine ofera ADN-polimerazei capatul 3-OH spre a se realiza initierea
replicarii; s-a constata insa ca ARN polimerazele, enzimele care catalizeaza sinteza de catene
poliribonucleotidice (ARN) pe matrita ADN, spre deosebire de orice ADN polimeraza, au
capacitatea de a initia sinteza de novo a unui mic segment ARN (oligoribonucleotid) numit
aRN primer, la capatul 3 al matritei; acest ARN primer este complementarmatritei si are
orientarea de la 5 la 3, adica este antiparalel matritei; ultimul sau ribonucleotid ofera ADN
polimerazei III capatul primer 3-OH si aceasta ataac cu el fosfatul de la C5 al primului
deoxiribonucleotid trifosfat aliniat pe matrita in virtutea complementaritatii de baze azotate;
acest prim deoxiribonucleotid va fi legat covalent la ARN primer, printr-o legatura fosfodiesterica cu eliminarea unei molecule de apa si a doua grupari fosfat, adica a pirofosfatului
(P~P); acest deoxiribonucleotid atasat covalent la primer are, la randul sau, un capat liber 3OH care va fi de acum capat primer, utilizat de ADN polimeraza III in catalizarea reactiei de
formare a celei de a doua legaturi fosfodiesterice samd pana cand are loc sinteza replicei, pe o
anumita lungime (circa 1000-2000 nucleotide)
un asemenea segment al replicei, legat la ARN primer, poarta numele de fragment Okazaki;
acelasi algoritm este realizat in sinteza celui de al doilea fragment Okazaki, in sinteza celui de
al treilea samd pana cand va fi copiata complementar intreaga matrita ADN;
segmentele Okazaki trebuie unite intr-o catena unica, dar numai dupa ce are loc excizia
primerilor ARN din fragmentele Okazaki; aceasta excizie este realizata de catre ADN
polimeraza I si o asemenea activitate se numestye activitate exonucleazica; excizia se face
prin hidroliza puntilor fosfodiesterice de la nivelul nucleotidelro unite in ARN primer;
tot ADN polimeraza I excizeaza si nucleotidele gresit imperecheate din catena replica, care
trebuie umplute vu deoxiribonucleotide corect imperecheate din catena replica; excizia
primerilor ARN, ca si a bazelor gresit imperecheate,lasa goluri in catena replica, care trebuie
umplute cu deoxiribonucleotide corect imperecheate cu nucleotidele matritei; umplerea lor se
realizeaza printr-o reactie de polimerizare de deoxiribonucleotide care este catalizata de
aceeasi enzima ADN polimeraza I, care a creat aceste goluri prin activitatile sale
exonucleazice;
in urma acestor prelucrari, replica este alcatuita din fragmente Okazaki formate doar din
deoxiribonucleotide, dar aceste fragmente sunt insa separate; replica nu poate ramane
astfel ,adica fragmentata, fragmentele Okazaki trebuie unite intr-o catena replica unitara si
continua, prin formarea a cate unei singure legaturi fosfodiesterice intre ele, lucrul acesta
neputand sa fie realizat de ADN polimeraza I
in procesul de unire a celor 2 fragmente Okazaki intervine o alta enzima, care are capacitatea
de a cataliza formarea unei singure legaturi fosfodiesterice intre doua fragmente Okazaki si
aceasta enzima se numeste ADN-ligaza, sau simplu, ligaza; ligaza asigura unirea
fragmentelor Okazaki intr-o catena replica continua care ramane atasata la matrita sa prin
puntile de hidrogen, rezultand astfel cate un dublu helix nou, pe fiecare dintre catenele
matrita ale dublului helix initial;
cercetarile ulterioare au condus la o mai buna intelegere a procesului de replicare, de la
nivelul bifurcatiei de replicare; s-a constat ca ADN polimerazele au specificitate de directie, in
sensul ca ele se deplaseaza pe ambele matrite ADN de la 3 la 5, iar polimerizarea de
nucleotide o realizeaza de la 5 la 3; bifurcatia de replicare este initiata la capatul moleculei
bicatenare liniare de ADN si continua progresiv, cu desfacerea treptata a legaturilor de
hidrogen, spre celalalt capat;
ADN polimeraza III asigura sinteza unei catene replici, in mod continuu (catena replica leading
= conducatoare sau inaintata), cu un singur eveniment de primare (de sinteza a ARN primer)
- viteza de transcriptie a noilor nucleotide in timpul replicarii moleculei de ADN este mare (circa
1000 de nucleotide pe secunda pe genom); la aceasta viteza au loc erori de imperechere,respectiv
de atasare a unor nucleotide noi, intr-un procent de 1 eroare/100.000 perechi nucleotide; astfel:
10
10
- in celula eucariota, prezenta nucleozomilor determina anumite particularitati ale replicarii ADN:
fragmentele Okazaki sunt de circa 10 ori mai scurte (100-200 de nucleotide) fata de cele de
la procariote
primerul ADN este mai scurt (10-20 nucleotide)
viteza de replicare este mai mica (50 de nucleotide pe secunda fata de 500 de nucleotide
pe secunda la procariote)
nucleozomii fibrei de cromatina raman atasati pe portiunile catenei matrita conducatoare,
pe cealalta catena fiind structurati nucleozomi noi, pe baza proteinelor histonice
componente, sintetizate concomitent cu replicatia ADN;
prezenta unor repliconi multipli reduce tmpul total de replicare a intregii molecule de ADN
OBS: necesitate existentei mai multor repliconi rezulta din urmatorul exemplu:
Cel mai lung cromozom de la Drosophila Melanogaster contine 7 x
10
nucleotide;
cele mai grele spre exteriorul miscarii de rotatie, cele mai usoare spre interior (intr-o
ultracentrifugare se introduc eprubete care contin solutia de analizat, iar pe timpul centrifugarii
eprubetele sunt dispuse orizontal, astfel ca dupa centrifugare componentele din solutie care au
masa mare se dispun spre baza eprubetei, iar cele cu masa mai mica spre gura eprubetei)
- gradientul de densitate paote duce la separarea moleculelor dintr-o solutie in functie si de
compozitia lor in izotopi; astfel, daca este ultracentrifugata o solutie cu un amestec de molecule de
ADN dintre care uneel au incoroporat numai 14N (usor) si altele numai 15N (greu), cele 2 tipuri de
molecule ADN se vor separa in benzi distincte in eprubetele de centrifugare (cele cu 14N in banda
superioara, iar cele cu 15N intr-o banda inferioara)
- in experimentul lor, Meselson si Stahl au cultivat initial bacterii Escherichia coli intr-un mediu
cu 15N si datorita acestui fapt moleculele de ADN au incorporat in radicalii fosfat numai 15N
- dupa cateva generatii, Meselson si Stahl au schimbat mediul de cultura cu unul care
continea numai 14N; au luat apoi la diferite intervale de timp probe de cultura, au extras ADN si l-au
centrifugat
- in probele luate de la prima generatie e bacterii cultivate in 14N au identificat formarea unei
benzi de ADN intermediare intre benzile normale caracteristice ADN cu 15N si cea caracteristica cu
aDN 14N, fapt ce a demonstrat ca moleculele de ADN ale descendetilor contineau un amestec de ADN
originar si ADN nou sintetizat;
- in ADN extras de la a doua generatie au identificat 2 benzi, una in pozitia intermediara ca si
cea identificata in prima proba analizata si alta corespunzatoare pozitiei benzii caracteristice ADN cu
14
N; aceste rezultate au demonstrat ca, pe masua ce sunt copiate, catenele de ADN raman intacte;
- Meselson si Stahl au interpretat rezultatele experimentului in modul urmator: dupa o runda
de replicatie, fiecare molecula fiica de ADN era hibrida, posedand o catena ,,grea parentala si o
catena ,,usoara nou sintetizata; cand aceste molecule hibride de ADN se replica, fiecare dintre ele
contribuie cu o catena ,,grea pentru a forma o molecula hibrida si cu o catena ,,usoara pentru a
forma o molecula de ADN cu ambele catene ,,usoare; astfel acest experiment a confirmat clar
predictia emisa de Watson si Crick privind replicatia ADN dupa model semiconservativ;
- procesul replicatiei ADN este uimitor in toate organismele, dar probabil cel mai greu de
imaginat in celulele umane; suma tuturor genelor in celulele umane este estimata la aproximativ 3
miliarde de perechi de baze, iar si mai uimitor este ca o singura catena dintr-o molecula de ADN
contine peste 250 de milioane de perechi de baze azotate; cu toate acestea, numarul de erori in
replicatie este extrem de mic, raportat la dimensiunile imense ale ADN nuclear; o eroare are loc in
medie o data la 10-100 de miliarde de baze azotate incorporate in catenele nou formate ale ADN;
- calitatile fiintelor vii se intemeiaza in ultima analiza pe 2 entitati: pe aceea pe care biochimistii o
numesc proteina si pe aceea pe care geneticienii o numesc gena (ADN); prima este unitatea de
executie chimica, care confera structura corpurilor vii, cea de-a doua este unitatea ereditara care
dirijeaza, in egaal masura, reproducerea unei functii si variatia ei;
S
S
1. Dogma centrala
- este principiul fundamental al geneticii moleculare, care sintetizeaza modul in care informatia
genetica din molecula de ADN este transcrisa in secventa de aminoacizi din catena polipeptidicam
in timpul procesului de sinteza proteica;
- retrovirusurile fac o exceptie de la ,,Dogma centrala; ele sunt virusuri cu ARN, pe care il
convertesc in ADN cu ajutorul unei enzime specifice (REVERS-TRANSCRIPTAZA) care transcrie
informatia genetica in sens invers, de la ARN-viral la ADN; acest ADN se poate integra in ADN-ul
celulei gazda;
- cel mai cunoscut retrovirus este virusul HIV (virusul imunodeficientei umane), care provoaca la
om boala SIDA
- functia heterocatalitica a materialului genetic, explicata prin dogma centrala a geneticii, arata
circuitul informatiei genetice in celula; el are loc in 2 etape:
In prima etapa, secventa de nucleotide din molecula de ADN este transcrisa intr-o secventa
complementara de nucleotide la nivelul acizilor ribonucleici; in cazul sintezei de ARNmesager, acesta este procesul de transcriptie, respectiv transcrierea informatiei genetice
din secventa de nucleotide de ADN, intr-o secventa complementara de nucleotide (ARNmesager)
In cea de-a doua etapa, procesul de translatie (traducere), secventa de nucleotide din
molecula de ARN-m este transcrisa in secventa de aminoacizi a unei catene polipeptidice,
cu ajutorul codului genetic, avand loc sinteza proteica
- codul genetic reprezinta corespondenta dintre secventa de nucleotide din molecula de acizi
nucleici, in secventa de aminoacizi din catena polipeptidica; stabileste corespondenta dintre
fiecare aminoacid si o succesiune de 3 nucleotide
- in anul 1944, O.T. Avery si colaboratorii au demonstrat rolul ADN in transformarea genetica la
bacterii; imediat, s-a emis ipoteza existentei unei relatii intre acizii nucleici si proteine, realizata
prin functionarea unui cod genetic, unitatile de codificare fiind reprezentate de cele patru baze
azotate (respectiv patru nucleotide) din constitutia ADN;
- deoarece in molecula de ADN se afla patru tipuri de baze azotate (respectiv patru tipuri de
nucleotide), iar molecula proteica este constituita din 20 de tipuri de aminoacizi proteici, rezulta ca
un grup de trei baze azotate alaturate (trei nucleotide), constituie unitatea de codificare a unui
aminoacid in molecula proteica
Nr. de baze azotate implicate in Nr. de combinatii posibile determinate
Nr. de aminoacizi proteici
stabilirea pozitiei unui aminoacidde existenta a 4 tipuri de baze azotate
1
4
20
2
16
20
3
64
20
- codonul reprezinta un grup de trei nucleotide alaturate din molecula de ARN-m, care determina
pozitia unui aminoacid in molecula de proteina sau sfarsitul sintezei proteice; in prezentarea
caracteristicilor codului genetic, se obisnuieste sa fie utilizati codonii din molecula de ARN-m;
- codonul este unitatea functionala a codului genetic care este alcatut din 64 de codoni; acestia
reprezinta totalitatea combinatiilor, in grupe de cate 3, a celor 4 tipuri de nucleotide;
- fenomenul de colinearitate reprezinta corespondenta dintre secventa nucleotidelor din molecula
de ADN sau ARN-m si secventa aminoacizilor din molecula proteica;
- din cei 64 de codoni ai codului genetic:
61 de codoni codifica diferiti aminoacizi (codoni sens)
3 sunt codoni nonsens, care nu specifica vreun aminoacid, dar joaca un rol
important in citirea mesajului genetic purtat de ARNm, intrucat ei marcheaza
sfarsitul acestui mesaj genetic; de aceea se numesc si codoni stop: UAA, UGA,
UAG
2 codoni AUG si GUG care codifica metionina, respectiv valina sunt si codoni cu
semnificatia de inceput de sinteza
Codul genetic este nesuprapus si fara virgula (neacoperit)
- doi codoni alaturati nu prezinta nucleoizi comuni (nucleotide comune)
- intre doi codoni alaturati nu se afla nucleotizi fara sens, adica ,,semne de punctuatie
biochimica; citirea informatiei genetice se realizeaza continuu;
Codul genetic este degenerat(redundant)
- fiind mai multi codoni decat aminoacizi, acelasi aminoacid poate fi codificat de mai
multi codoni
- acesti codoni sunt numiti sinonimi
- adica un aminoacid poate fi codificat de 2 sau mai multi codoni: Fenilalanina: UUU
UUC
codoni)
Serina (6
Codoni stop
- exista 3 codoni stop: UAA, UGA, UAG, care, la eucariote determina sfarsitul mesajului
genetic si nu pozitia unui aminoacid in catena polipeptidica
- AGA si AGG sunt codoni STOP in mitocondrii
- AUA si GUA sunt codoni START
Codoni ambigui
- exista 2 codoni ambigui (AUG si GUG probabil) care dependent de pozitia lor in
molecula de ARN-m determina pozitia unor aminoacizi diferitil ambii codoni se pot gasi
la inceputul moleculei de ARN-m sau in interiorul acesteia (dar nu terminal, unde se afla
unul din cei trei codoni stop)
- AUG: la inceput: metionina-formiata
la mijloc: metionina (AUA, AUG, AUU- in mitocondrii)
- GUG: la inceput: metionina formiata
la sfarsit: valina
- In general, dupa terminarea sintezei proteice, primul aminoacid din catena polipeptidica
sintetizata este inlaturat
Codul genetic este universal si are origine foarte veche
- aceiasi codoni determina pozitia aceluiasi aminoacid la organisme diferite, cu vechime
filogenetica diferita;
Codul genetic a evoluat in timp
- dovada sunt unele exceptii de la codul genetic, exceptii intalnite la organisme foarte
vechi filogenetic, precum si in codul genetic de la mitocondriil aceste exceptii se refera
in special la codonii de tip stop care initial au avut un rol in determinismul unui anumit
aminoacid;
- la procariotul Mycoplasma capricolum: UGA -> triptofan
- la unele ciliate Tetrahymena sp, Paramoecium sp, Euplotes octocarinatus: UAA+UAG ->
glutamina
- codonul AUA care codifica izoleucina in genomul nuclear, la mitocondtrii codifica
aminoacidul metionina;
3. Biosinteza proteica
- biosinteza proteinelor are loc in 2 etape principale, transcriptia si translatia, la nivelul carora pot
actiona diferite mecanisme de control;
- dupa ce a fost sintetizata, catena polipeptidica (care prezinta structura primara), pargcurge o
serie de modificari post-translationale, in urma carora va deveni activa metabolic;
Transcriptia = transcrierea
- consta in transferul informatiei genetice din secventa de nucleotide a uneia din catenele de ADN
(de obicei, din catena 3-5) sau din catena de ARN-viral in catena de ARN-m;
- procesul implica participarea unui variat echipament enzimatic format din holoenzime ARNpolimeraze; aceste complexe derasucesc si desfac puntile de hidrogen din ADN, recruteaza
ribonucleotidele si le potrivesc pe baza de complementaritate cu bazele azotate perechi din
secventa de ADN
- informatia genetica se transcrie dintr-o secventa de nucleotide in alta secventa de nucleotide
- procesul de transciptie se realizeaza cu ajutorul enzimei ARN-POLIMERAZA;
- codonul de initiere a sintezei unei unitati de transcriptie (a unei molecule de ARN-m) se afla in
general pe catena 3-5, fiind de obicei TAC (mai rar CAC);
- codonul care indica sfarsitul procesului de transcriptie este un codon complementar codonilor
stop din codonul genetic al ARN-m, respectiv ACT, ATT, ATC;
- unitatea de transcriptie este o portiune din molecula de acid nucleic care contine informatia
genetica pentru sinteza unei molecule de ARN-m; intre doua unitati de transcriptie alaturate, se
afla secvente de ADN non-informational; marimea unei unitati de transcriptie difera la procariote
de eucariote;
la procariote, o unitate de transcriptie contine informatia genetica a mai multor gene,
fiind deci implicata in sinteza mai multor catene polipeptidice; in acelasi timp, unitatea
de transcriptie de la procariote contine numai secvente informationale; deci, ARNm
codifica mai multe proteine de care celula are nevoie la momentul respectiv
la eucariote, o unitate de transcriptie contine informatia genetica a unei singure gene,
fiind deci implicata in sinteza unei singure catene polipeptidice; la nivelul moleculei de
ADN, intr-o unitate de transcriptie se afla atat secvente informationale (exoni), cat si
secvente non-informationale (introni); astfel, in urma procesului, la eucariote, rezulta un
ARN-precursor care contine atat exoni cat si introni; inaintea inceperii celei de-a doua
etape a sintezei proteice (procesul de translatie) este necesara maturarea ARN-m;
procesul de maturare a ARN-m are loc prin eliminarea intronilor si asamblarea exonilor,
cu ajutorul unor enzime, dintre care fac parte ENDONUCLEAZELE si LIGAZELE; procesul
prezinta importanta in reglajul genetic al sintezei proteice la eucariote; eucariotele
contin 3 tipuri de ARN-polimeraze (I, II, III) in loc de una singura cum au celulele
faza de alungire:
-
se poate realiza direct prin intalnirea unui codon ,,stop in cadrul secventei transcrise
din ADN sau indirect prin interventia unui factor proteic de terminare;
la eucariote, ARN-polimeraza
continua sa functioneze in timp ce
ARNm se desprinde prin interventia
unor substante cu rol de semnal;
proaspatul ARNm nu poate fi utilizat
imediat, fiind inactiv; el va suferi
procese de maturare prin care se
asigura cresterea stabilitatii sale si
transformarea intr-o molecula activa
din punct de vedere biologic; are loc
in nucleu; asigura copierea unei
singure gene, intr-un format cu
dimensiuni mult mai mari decat
produsii finali, adica ARNm matur
care sa functioneze la nivelul
ribozomilor, locul sintezei proteinelor;
Translatia
- consta in transferul informatiei genetice din secventa de nucleotide a ARN-m in secventa
de aminoacizi din catena polipeptidica; are loc, deci, traducerea mesajului genetic, dintr-o
secventa de nucleotide intr-o secventa de aminoacizi;
- implica participare ARNt si ARNr; procesul incepe atunci cand moleculele de ARNr din
ribozomi se leaga de capatul unui ARNm transcris; mai multi ribozomi se pot deplasa de-a lungul
aceluiasi ARNm, formand impreuna complexul numit polizom; odata ce ARNm s-a legat, ribozomul
se deplaseaza de-a lungul moleculei de ARNm cu pasi ce acopera un codon (3 nucleotide) si cu
fiecare pas facut de ribozom se adauga cate un aminoacid in lantul catenei polipetidice; aceasta
inaintare inceteaza la intalniera unui codon STOP cand ribozomii se desprind si elibereaza catena
polipetidica sintetizata
- daca ADN-ul poate fi comparat cu un institut de arhitectura care poseda planurile alcatuirii
corpului vietuitoarelor, ribozomii sunt adevaratii zidari;
- pentru ca translatia sa aiba loc trebuie mai intai ca toti factorii implicati sa ajunga la locul
sintezei proteice:
ARNm recunoaste locul sintezei datorita primelor nucleotide ale sale care formeaza o
secventa de initiere; ea atrage cele 2 subunitati ale ribozomului care acum se cupleaza
prinzand itnre ele capatul moleculei ARNm; la eucariote, ARNm incepe cu codonul AUG care
corespunde metioninei; deci primul aminoacid al moleculei proteice va fi metionina care
ulterior poate fi inlaturata
Intre timp, in citoplasma aminoacizii sunt pregatiti pentru sinteza in 2 faze:
In prima faza aminoacizii sunt activati prin reactia cu aTP care le va dona energie
(a)
Apoi, aminoacidul activat se ataseaza unei molecule de ARNt (b) AMP va fi
,,reincarcat cu energie prin fosforilare la nivelul mitocondriilor, deci este
reciclabil; un anumit aminoacid se ataseaza numai la acea molecula de ARNt
care la polul opus are anticodonul corespunzator, adica un grup de 3 nucleotide
complementare codonului (ARNt care ataseaza lizina contine anticodonul UUC)
Acum poate incepe etapa translatiei (traducerii), adica sinteza propriu-zisa a proteinei; ea
presupun trecerea ARNm printre subunitatile ribozomului ca o banda magnetica prin
dispozitivul de citire al unui casetofon; in spatiul dintre cele 2 subunitati este loc numai
pentru 2 codoni ai ARNm;
- sinteza proteica se realizeaza stadial, din ARNm se citeste cate un codon la fiecare stadiu,
incepand din capatul 5 spre capatul 3; fiecare codon este recunoscu de catre anticodonul
corespunzator din ARNt care poarta un aminoacid corespunzator codonului din ARNm;
ARN-m
ribozomi
- in acest fel, primul complex aminoacil-ARN-t1 (care a transportat metioninaformiata), ajunge la locusul P de pe suprafata ribozomului, locusul A devenind liber;
- aici va veni acel complex ARN-t2-AA2, al carui anticodon este complementar codonului
ARN-m din locusul A;
- dupa aducerea unui nou aminoacid in locusul A, se formeaza o legatura dipeptidica intre
primii 2 aminoacizi, sub actiunea celei de a doua enzime, E2=PEPTID-POLIMERAZA
- procesul are loc in acest fel, cu decodificarea informatiei genetice din molecula de ARN-m
pana ce se ajunge la ultimul codon, unul din codonii STOP; in acest caz, nu mai este aduc nici
un aminoacid la catena polipeptidica sintetizata;
- atunci cand codonul STOP ajunge in dreptul locusului A, pe suprafata ribozomului se va
atasa un facto RF (factor de eliberare) care se leaga de ARNm in pozitia A a ribozomului; la
capatul catenei polipeptidice sintetizate, in loc sa se lege un aminoacid, se leaa o molecula de
apa;
- producerea unui numar exagerat de exemplare este prevenita prin distrugerea ARNm
utilizat; dupa ce molecula de ARNm a iesit dintr-un ribozom, cele 2 unitati ale ribozomului se
despart si se vor reuni in jurul secventei de initiere al altei molecule de ARNm;
Modificari post-translationale
- in urma sintezei proteice, rezulta o catena polipeptidica, in care aminoacizii se afla intr-o
succesiune caracteristica; aceasta reprezinta structura primara a catenei polipeptidice, forma in
care proteina este de obicei inactiva;
- catenele polipeptidice se pot rasuci in spirala sau se pot plia, formand strctura secundara
- pentru a deveni activa, catena polipeptidica poate fi modificata prin parcurgerea uneia
sau a mai multor cai specific, aceasta fiind fosforilata sauflicozilata enzimatic, ori digerata partial
sub actiunea enzimelor peptidaze
fosforilarea implica aditia uneia sau a mai multor grupari carbohidrat;
- in alte cazuri, proteina sintetizata va fi digerata partial sub actiunea peptidazelor, pentru
a deveni activa;
C
si