Studiul cariotipului uman normal

Definitie
Diagrama care arata dispunerea ordonata a cromozomilor metafazici dintr-o
celula somatica, in functie de anumite criterii: morfologia, indici de lungime.
Morfologia cromozomilor umani
La om, in celulele somatice diploide exista 46 de cromozomi grupati in 22
de perechi de autozomi si 1 pereche de cromozomi sexuali: XX pentru sexul
feminin si perechea XY pentru sexul masculin;
Studiul cromozomilor se realizeaza in prometafaza mitozei, deoarece sunt
dispusi in acelasi plan si sunt bine individualizati
Sunt bicromatidici, fiind formati din doua cromatide unite prin centromer;
Se compara cromozomi din aceeasi metafaza, pentru ca au acelasi grad de
condensare
Organizarea moleculara a cromatinei: nucleozomul, solenoidul, domeniul pliat
in bucle laterale(fibra de 300nm), domeniul de 700nm.
Analiza cromatinei la microscopul electronic evidentiaza un sistem
ierarhizat de fibre de cromatina alcatuite din ADN, histone si proteine nonhistonice;
Aceste proteine au rolul de a compacta genomul de 2m lungime in nucleul
cu diametrul de 10m
Elementele morfologice ale cromozomului
Cromatidele - Doua subunitati filamentoase identice intre ele, unite la
nivelul centromerului;
Centromerul
Bratele cromozomului

 Telomerele
Satelitii
Centromerul
Locul in care cromatidele surori sunt atasate printr-un complex multiproteic
formand constrictia primara
Centromerul imparte cromatidele in doua brate notate conventional cu pbratul scurt si q bratul lung
In functie de pozitia centromerului, care se defineste prin indicele
centromeric(Ic=p/p+q), cromozomii pot fi clasificati in 3 categorii:
Metacentrici: Ic=0,35-0,50
Submetacentrici: Ic=0,25-0,35
Acrocentrici: Ic=0,15-0,25
Telocentrici:Ic=0(patologici)
Telomerele
Structuri specializate formate din ADN repetitiv si proteine, care asigura
stabilitatea cromozomilor si previn atasarea lor cap la cap;
Formate prin repetitia in tandem a unui nucleotid 5-TTGGG-3
complementara cu catena 3-AACCC-5 care formeaza o proeminenta
Aceasta proeminenta duce la replicarea incompleta a telomerelor cu
scurtarea constanta si progresiva a acestora care duce la un moment critic
in care are loc oprirea proliferarii
Oprirea proliferarii duce la senescenta si apoptoza celulara
Palindroame telomerice
Catena 53(bogata in G) se extinde dincolo de catena 35(bogata in C)

 Prelungirea monocatenara 3 se pliaza spre regiunea bicatenara formand o

bucla care patrunde intre cele doua catene;
Aceasta bucla este acoperita de proteine specifice(shelterin) care formeaza
o calota in jurul telomerului si il stabilizeaza impotriva degradarii.

Rolul telomerelor
Mentinerea stabilitatii si integritatii structurale a cromozomului(cromozomi
lipiciosi)
Asigurarea replicarii complete a capetelor cromozomului(prin intermediul
telomerazei)
Stabilirea arhitecturii tridimensionale a nucleului
Telomeraza
2009-Premiul Nobel pentru descrierea rolului telomerazei-complex
ribonucleotidic format din:

parte proteica-TERT,

reverstranscriptaza

subunitate ARN-TERC

Aceasta enzima este intotdeauna activa in celulele germinale, celule stem si

leucocite

 Absenta in celulele somatice-celulele pierd secvente telomerice si la un

moment vor fi distruse.
Alte elemente morfologice
Satelitii
Apar la cz. acrocentrici
Contin ADN inalt repetitiv
Elementul de leg. al satelitilor contine ARN ribozomal
In interfaza localizati langa nucleol-sateliti nucleolari
Constrictiile secundare: cz. 1,9,16
Situsurile fragile: situs X-fragil-repetitii trinucleotidice CGG preterminal pe
q.

Lungimea relativa a cromozomului

L.r.c=(Lungimea cromozomului studiat/L22A+LX)1000
Nu se compara doi cromozomi din metafaze diferite
Cz. Mari Lrc=80-90, perechile 1-5
Cz. Medii Lrc=40-60, perechile 6-18, X

 Cz. Mici Lrc=15-30, perechile 19-22,Y

Stabilirea lungimii cz permite numerotarea acestora in ordinea
descrescatoare a lungimii lor
Cromozomii sunt asezati in cariotip in 7 grupe notate cu litere de la A la G
A:1-3 Large metacentric 1,2 or submetacentric
B: 4,5 Large submetacentric, all similar
C: 6-12, X Medium sized, submetacentric - difficult
D: 13-15 medium-sized acrocentric plus satellites
E: 16-18 short metacentric 16 or submetacentric 17,18
F: 19-20 Short metacentrics
G: 21,22,Y Short acrocentrics with satellites. Y no satellites.

Benzile cromozomiale
Prin tratamente specifice(digestie enzimatica, denaturare termica) si/sau
incorporarea unor coloranti specifici pentru ADN(Giemsa Quinacrina),
cromozomii metafazici apar alcatuiti dintr-o serie de benzi transversale de
intensitati diferite
Model diferit al numarului, pozitiei, dimensiunilor si intensitatii benzilor
pentru fiecare cromozom
Identice pentru toate celulele organismului;
Marimea benzilor: intre 5 si 10 Mb.
Factori implicati in formarea benzilor
ADN repetitiv -in zonele in care apare cromatina este mult cutata, fixand o
cantitate mai mare de colorant bazic(aspect heterocromatic sau
fluorescent)
Compozitia de baze azotate (A-T -fluorescenta intensa;G-C - fluorescenta
slaba)
Proteinele histonice(A-T au afinitate pentru lizina-condensare; C-G afinitate
pentru arginina-aspect normal)
Tehnici de bandare
Intre 1950 si 1960 cromozomii umani au fost studiati folosind coloratiile
Giemsa sau Wright.
Prin aceste tehnici cromozomii au putut fi numarati cu precizie si grupati
laolalta pe baza similaritatii de marime si froma, dar nu au putut fi
individualizati in cadrul aceluiasi grup.
Din anii 1970 dezvoltarea tehnicilor de bandare a permis identificarea
precisa a fiecarui cromozom si paret cromozomiala.
Benzile G si Q

 Sunt zone bogate in heterocromatina

Au putine gene active
Sunt compacte si se replica tardiv spre sfarsitul fazei S
Au ADN bogat in A-T(55-60%) si secvente repetitive LINEs(long interspersed
repeated sequence) au lungimea de 6-7 kb, se afl n circa 100.000 copii,
dispersate n genom; se cunosc familia L1 (sau Kpn 1) i The 1. Ca i
secvenele Alu par s multiplice prin retrotranspoziie. Secvenele LINEs au
foarte probabil rol n mperecherea corect a cromozomilor omologi n
meioz, condiie esenial pentru schimbul egal de segmente cromozomice.
Se consider c prin mperechere incorect ntre secvene identice dar din
poziii i uneori cromosomi diferii se pot produce (prin CO
inegal) recombinri aberante care genereaz mutaii i deci boli genetice.
Concordanta intre bandarea G si Q
Bandare G
Cea mai frecvent utilizata
Necesita un pretratament de hidroliza enzimatica a proteinelor nonhistonice care tin legate filamentele de ADN intre ele
Colorare cu Giemsa
Se coloreaza centromerul si bratele
Bandare Q
Coloratia quinacrin mustar(bandarea Q)

Quinacrina se ataseaza in regiunile bogate in perechile G-C, care se afla in

zonele cromozomiale dense unde nu se afla prea multe gene.

Nu necesita pretratament. Dupa colorare cromozomii sunt observati la

microscopul optic cu lumina UV

 Cz. Philadelphia(t9/22) in LMC.

Benzile R
Contin eucromatina, mai putin condensate
Gene structurale active
ADN se replica precoce, la inceputul fazei S
Bogate in G-C(60%)
Secvente repetitive SINEs(short interspersed repeated sequences) sunt
secvene scurte de 100-400 p.b., existente n circa 500.000 de copii (3-5%

din genom), dispersate n cromosomi;ele sunt reprezentate n special

defamilia Alu; Funcia lor nu este cunoscut; s-a presupus c ar avea un rol
n iniierea replicrii n diferite puncte ale ADN. Secvenele Alu pot aciona
ca elemente transpozabile.
Consecinte importante fenotipice ale mutatiilor in aceste zone
Discordanta intre bandarea G si Q si bandarea R
Bandarea R
Denaturare termica menajata
Colorare Giemsa si acridin orange
Evidentiaza telomerele rezistente la coloratie(remaniate prin mutatie)
Proprietatile benzilor cromozomiale in bandarea G si R - Comparatie
Benzi intunecate-bandare G
Colorare intensa a benzilor bogate in perechi AT corespunzatoare benzilor
G si Q
Condensare precoce dar replicare tardiva
Putine gene cu dimensiuni mari, datorita prezentei unui mare numar de
introni
Benzi palide-bandare R
Colorare slaba cu G si Q
Bogate in perechi GC
Condensare tardiva si replicare precoce
Bogate in gene de dimensiuni mici localizate in manunchiuri(cluster)
Benzile C

 Situate in regiunea centromerica

Alcatuite din heterocromatina constitutiva
Pe bratele q ale cromozomului Y, constrictii secundare si satelitii
acrocentricilor
Modificarile nu produc efecte fenotipice
Denaturare cu NaOH, renaturare termica, colorare Giemsa
Bandare T
Bandarea telomerica (sau terminala) a fost raportata pentru prima data de
Dutrillaux care a folosit doua tipuri de denaturare termica controlata
urmate de colorarea cu Giemsa sau acridin orange.

Benzile T sunt de fapt un subset de benzi R deoarece sunt mai mici decat
benzile R si sunt situate strict telomeric

Bandarea NOR
Cromozomii sunt tratati cu solutie de nitrat de argint care se ataseaza la
Regiunea Organizatorilor nucleolari(NOR), adica la nivelul constrictiilor
secundare ale cromozomilor acrocentrici.
Comparatie intre bandarile G, Q, R si C

Bandarea NOR

Tehnici de generatia a III-a

Tehnici de marcaj de inalta rezolutie ce identifica 550-850 benzi pe genom
haploid

 Se studiaza cz in prometafaza, profaza

Necesita blocarea sintezei de ADN, pentru sincronizarea celulelor, apoi
reluarea acesteia pana la sfarsitul profazei cand este oprita din nou
Tehnici de generatia a IV-a
Tehnici de citogenetica moleculara:
FISH
Colorare cromozomiala(M-fish si SKY)
CGH
MLPA
QF-PCR
Tehnici de generatia a IV-a
Principiul metodelor: hibridizarea prin complementaritate intre o sonda
ADN marcata si o tinta de ADN genomic.
Sonda- fragment de ADN monocatenar de 50-300 nucleotide
complementar unei regiuni cromozomiale.
Sondele pot fi pan-centromerice, centromerice specifice, specifice unu
locus dat, specifice unui cromozom
Tintele reprezinta fragmentul genomic analizat de sonda si pot fi:
ADN din cz metafazici(FISH), intregul cromozom(chromosome painting),
intregul genom(CGH)
Tehnici de generatia a V-a
Microretele cu sonde non-polimorfice(CGH array)
Microretele cu sonde polimorfice de tip SNP

Metoda cariotipului
Metode directe
Pentru tesuturile cu multe diviziuni(multe celule in metafaza)
Nu necesita culturi celulare
Celule MO, trofoblast(dg. prenatal)
Recoltare: punctie biopsie sternala, femurala, biopsia trofoblast
Centrifugare
Recoltare sediment
Blocare metafazica-colchicina(inhiba fusul de diviziune)
Soc hipotonic-sol hipotona de KCl/citrat de sodiu
Fixare-alcool metilic/acid acetic glacial 3/1
Colorare: Giemsa, orceina acetica, reactiv Schiff
Ex microscopic la MO cu imersie
Fotografiere metafaze
Realizarea cariotipului
Metode indirecte
Recoltare fibroblasti, limfocite, celule amniotice-necesita culturi celulare
Stimulare mitotica-fitohemaglutinina
Mediu de cultura: artificiale cu AB si ser(sangvin, bovin, fetal de vitel)
Timp cultura: limfocite-48h, fibroblasti-72h, cel. Amniotice-12h.
Blocare metafaze
Soc hipotonic

 Fixare
Colorare
Ex.MO si fotografiere

Importanta cariotipului
Avorturi repetate in cadrul unei familii
Mortalitatea perinatala si neonatala
Copii nascuti cu malformatii congenitale multiple
Indivizi cu retard mental si deficiente motorii
Greutate mica la nastere
DSD
Tratament citostatic sau radioterapie
Persoane expuse profesional sau accidental la radioactivitate

 Persoane cu modificari ale dermatoglifelor

Tulburari comportamentale