TEHNICI DE EVIDENTIERE

A CROMOZOMILOR UMANI
 CARIOTIPUL UMAN NORMAL
Cariotip = (diagramă) aranjarea sistematizată standardizată a crz.
unei celule somatice, fotografiaţi la microscop în timpul metafazei
mitozei (crz. maxim de condensare și colorabilitate), ținând cont de
număr, formă, indici de lungime sau altă caracteristică
reprezentativă pt. recunoașterea unui crz.
NUMĂRUL CROMOZOMILOR UMANI
Celulele somatice umane (celule diploide): 46 crz
Gameţii (celule haploide): 23 crz
Fuzionarea celor 2 gameţi haploizi în timpul fecundaţiei reface nr. diploid
şi realizează 23 de perechi de cromozomi omologi:
− identici ca dimensiune, formă şi conţinut genic
− diferiţi ca origine (un membru al fiecărei perechi provine de la mamă, iar
celălalt membru provine de la tată)
− 22 perechi de crz = somatici (autozomi) = identici la ambele sexe
− 1 pereche de crz = crz sexuali (gonozomi) = diferiți la cele două sexe:
XX la femeie şi XY la bărbat
X şi Y = omologi ca funcţie, diferiți morfologic !

Șansa ca un spermatozoid ce poartă crz X sau Y să fecundeze un ovul este

aproximativ egală, aşa cum şi numărul de produşi de concepţie de sex masculin şi
feminin este aproximativ egal.
 În realitate, se nasc mai mulţi copii de sex masculin deşi în timpul copilăriei şi
maturităţii sex ratio = 1:1
 MORFOLOGIA CROMOZOMILOR UMANI

• Analiza corectă a morfologiei crz este realizată în metafaza diviziunii, când

aceştia sunt bine individualizaţi, se află dispuși în acelaşi plan (placa
metafazică) și sunt bicromatidici (două cromatide unite la nivelul
centromerului)
• Se compară crz din aceeași metafază → au același grad de condensare
• Materialul din care sunt formaţi crz (ADN şi proteine histonice) = cromatină
• Gradul de condensare colorare a crz nu se realizează uniform (se observă
mai ales în profază şi telofază) → cromatina prezintă două stări funcţionale
alternative şi reversibile: eucromatina şi heterocromatina
Elemente morfologice comune tuturor crz
(! prezente obligatoriu): cromatidele, centromerul, telomerele
Cromatidele - structuri longitudinale identice (cromatide-
surori), unite la nivelul centromerului;
Centromerul
− locul în care cromatidele surori sunt atasate printr-un complex multiproteic
formând constricția primară;
− împarte crz în două: braţul lung (q) şi braţul scurt (p);
− poziție variabilă dar constantă pentru acelaşi crz

 În funcţie de poziţia centromerului crz pot fi:

 metacentrici: centromerul localizat median,cele 2 braţe sunt de lungimi aprox. egale;
 submetacentrici: centromerul plasat în afara regiunii mediane, un braţ mai lung decât
celălalt;
 acrocentrici: centromerul plasat foarte aproape de unul din capete, crz apare format
din 2 braţe inegale (unul foarte lung şi altul foarte scurt).
Telomerele
• struct. specializate alc. din ADN repetitiv si proteine
• repetiții în tandem a unui nucleotid 5’-TTAGGG-3’ (complementară cu
catena 3’-AATCCC-5’) menținute de telomeraze
Rolul telomerelor
• menținerea stabilității și integrității structurale a crz (previn atasarea
lor cap la cap);
• asigură replicarea completă a capetelor crz (telomeraza)
• stabilesc arhitectura tridimensională a nucleului
Alte elemente morfologice cromozomiale:

Satelitii
• elemente morfologice facultative prezente la crz.
acrocentrici din gr. D și G cu excepția crz. Y
• contin ADN inalt repetitiv
• elementul de leg. al satelitilor contine ARN ribozomal
• în interfaza localizati lângă nucleol: sateliti nucleolari
Constrictiile secundare
• tipice, la nivelul porțiunii terminale a brațelor scurte ale
crz. acrocentrici din gr. D și G
• regiunea juxtacentromerică a brațului lung al crz. 1,9,16
Situsurile fragile
• regiuni la nivelul cărora se produc mai frecvent rupturi
cromozomiale, maj fără manifestări fenotipice;
• Excepție situs X-fragil (Xq27.3/FRAXE) = repetitii
trinucleotidice CGG preterminal pe q = debilitate mintală
Caracterizarea morfologică a crz. metafazici - criterii ISCN
(International System for Human Cytogenetic Nomenclature)
A. CRITERII CANTITATIVE:

1. Lungimea relativă (Lr) = raportarea lungimii crz (suma lungimii braţelor

sale p+q) la lungimea totală a unui set haploid de crz (suma lungimii
celor 22 de autosomi + X):

Lr = p+q/(22 autosomi + X) × 1000

crz. mari Lr = 80-90 (per. 1-5);
crz. medii Lr = 40-60 (per. 6-18, X);
crz. mici Lr = 15-30 (per. 19-22,Y).

2. Raportul braţelor (R) = raportarea dimensiunii braţului lung (q) la

dimensiunea braţului scurt (p):
R = q/p
crz. metacentrici R = 1−1.7;
crz. submetacentrici R = 1.8−3;
crz. acrocentrici R ˃ 3.
3. Indicele centromeric (Ic) = raportul dintre
lungimea braţului scurt (p) şi lungimea totală a crz:
Braţ scurt
Ic = (p/p+q) × 100
crz. metacentrici Ic = 0,35-0,50
crz.submetacentrici Ic = 0,25-0,35
crz. acrocentrici Ic = 0,15-0,25
Braţ lung

Perechea 1 Perechea 16

Perechea 17
Perechea 4

11
Perechea 13 Perechea 22
4. Indicele morfologic (Im) = raportul dintre lungimea totală a crz şi raportul
brațelor:
Im = p + q / q/p

B. CRITERII CALITATIVE: sateliții, constricțiile secundare, situsuri

fragile.

Crz sunt asezati in cariotip in 7 grupe notate cu litere de la A la G:

A: 1-3 mari metacentrici 1 și 3 sau submetacentric 2

B: 4,5 mari submetacentrici, similari
C: 6-12, X mijlocii, submetacentrici
D: 13-15 mijlocii acrocentric, pot prezenta sateliți
E: 16-18 mici metacentrici 16/ mici submetacentrici 17,18
F: 19-20 mici metacentrici
G: 21,22,Y mici acrocentrici
 METODE CITOGENETICE
DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ

Etape principale:
 obținerea de celule în diviziune (mitoză)
 blocarea mitozei în metafază
 obținerea preparatelor cromozomiale și analiza lor la
microscop

Metode:
 directe (fără culturi)
 indirecte (culturi celulare)
Metode directe
• nu necesita culturi celulare
• pt. țesuturi cu activ. mitotică intensă (multe celule in metafaza): m.o,
trofoblast (dg. prenatal)
• rezultate rapide (3-12 ore) dar calitatea crz mai slabă
Etape:
• recoltare: punctie biopsie sternala, femurala, biopsie trofoblast
• centrifugare
• recoltare sediment
• blocare metafazica – colchicina (inhiba fusul de diviziune)
• hipotonizare - sol.hipotona de KCl/citrat de sodiu
• fixare - alcool metilic/acid acetic glacial 3/1
• colorare: Giemsa, orceina acetica, reactiv Schiff
• ex microscopic la MO cu imersie
• fotografiere metafaze
• realizarea cariotipului
Metode indirecte
• necesita culturi celulare: de scurtă durată (limfocite din sânge
periferic, m.o) sau de lungă durată (fibroblaști din țesut conjunctiv,
celule epiteliale fetale din lichid amniotic (dg. prenatal))
Etape:
• recoltare fibroblasti, limfocite, celule amniotice
• stimulare mitotica - fitohemaglutinina
• medii de cultura: artificiale cu AB si ser (sangvin, bovin, fetal de
vitel)
• timp cultura: limfocite-48h, fibroblasti-72h, cel. Amniotice-12h.
• blocare metafazica – colchicina (inhiba fusul de diviziune)
• hipotonizare
• fixare
• colorare
• ex microscopic la MO cu imersie
• fotografiere metafaze
• realizarea cariotipului
Tehnici de bandare
• Tehnici de generația I (1950−1960): crz umani, fără tratament
special, coloratii Giemsa/Wright → crz uniform colorați:
• numarati cu precizie si grupati laolalta pe baza similaritatii de
marime si forma,
• nu pot fi individualizati in cadrul aceluiasi grup.

• Tehnici de generația II (1970) = tehnici de bandare:

tratamente (denaturare termică, digestie enzimatică) + încorporare
coloranți specifici ADN = succesiune de benzi transversale
alternative intens colorate și palide de-a lungul crz metafazici
Alternanța de benzi clare cu benzi întunecate:
• identică la crz omologi
• diferită pt. crz aparţinând diferitelor perechi de crz omologi (model
diferit al nr.,pozitiei, dimensiunilor si intensitatii benzilor pt fiecare
crz) = permit identificarea precisa a fiecarui crz
Factori implicati in formarea benzilor
• ADN repetitiv - in zonele in care apare cromatina este mult cutata, fixand o
cantitate mai mare de colorant bazic (aspect heterocromatic sau
fluorescent);
• compozitia de baze azotate (A‒T = fluorescență intensa; G‒C = fluorescență
slaba);
• proteinele histonice (A‒T au afinitate pt. Lys = condensare; C‒G afinitate pt.
Arg = aspect normal).
Bandare Q (coloratia quinacrin mustar)

21
Bandarea R
• denaturare termica menajata + colorare Giemsa si acridin orange
• evidentiaza telomerele rezistente la coloratie (remaniate prin mutatie)
Proprietatile benzilor crz in bandarea G si R
Benzi intunecate - bandare G
• colorare intensa a benzilor bogate in perechi A‒T
corespunzatoare benzilor G si Q
• condensare precoce dar replicare tardiva
• putine gene cu dimensiuni mari, datorita prezentei unui
mare nr.de introni
Benzi palide - bandare R
• colorare slaba cu G si Q
• bogate in perechi G‒C
• condensare tardiva si replicare precoce
• bogate in gene de dimensiuni mici localizate in
manunchiuri (cluster)
24
Comparație bandări G ‒ R

25
Bandarea C
• denaturare cu NaOH,
renaturare termica,
colorare Giemsa
Benzi C
• situate in regiunea
centromerica
• heterocromatina
constitutiva
• pe bratele q ale crz Y,
constrictii secundare si
satelitii acrocentricilor
• modificarile nu produc
efecte fenotipice
Bandarea NOR
• crz tratati cu solutie de nitrat de argint care se ataseaza la
regiunea organizatorilor nucleolari (NOR), adica la nivelul
constrictiilor secundare ale crz acrocentrici.
Comparatie intre bandarile G, Q, R si C
Tehnici de generația a III-a (1977) = tehnici de marcaj de inalta rezolutie
• studiaza crz in primele faze ale diviziunii (profaza, prometafaza) când
sunt mai puțin condensați = fiecare banda poate fi subdivizată în
m.multe subbenzi → identifica 550-850 benzi pe genom haploid
• necesita blocarea sintezei de ADN, pentru sincronizarea celulelor, apoi
reluarea acesteia pana la sfarsitul profazei cand este oprita din nou
Tehnici de generatia a IV-a (1991) = tehnici de citogenetica
moleculara
• FISH
• M-FISH (Multiplex FISH) si SKY (Spectral Karyotyping) =
chromosome painting
• CGH (Comparate Genomic Hybridization)
• MLPA
• QF-PCR
Principiul metodelor: hibridizarea prin complementaritate intre o sonda ADN
marcata si o tinta de ADN genomic.
Sonda: fragment ADN monocatenar de 50-300 nucleotide complementar unei
regiuni cromozomiale; (pot fi pan-centromerice, centromerice specifice,
specifice unui locus dat, specifice unui crz)
Tintele: fragmentul genomic analizat de sonda si pot fi: ADN din crz metafazici
(FISH), intregul cromozom (chromosome painting), intregul genom (CGH)
Tehnici de generatia a V-a
• Microretele cu sonde non-polimorfice (CGH array)
• Microretele cu sonde polimorfice de tip SNP
Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)

 metode ce combină tehnicile citogenetice convenţionale cu cele de

inginerie genetică moleculară.

 Tehnica FISH se bazează pe capacitatea unei porţiuni de ADN

monocatenar de a se lega de o secvenţă complementară care poate
fi localizată oriunde pe o placă metafazică. Spre deosebire de alte
metode folosite în analiza crz tehnica FISH poate să fie aplicată şi
celulelor aflate în interfază.

 In această tehnică proba de ADN este conjugată cu nucleotide

modificate care după hibridizare cu ADN provenit de la pacient
permite regiunii unde a avut loc hibridizarea să devină vizibilă în
lumină UV.
 tehnică larg utilizată în prezent în scopul diagnosticării clinice
(rezultatele se obţin f. rapid).
33
Tehnica SKY