Studiul cromosomilor metafazici umani şi efectuarea cariotipului
Cromosomii au un grad maxim de condensare şi sunt dispuşi într-un singur plan în
cursul metafazei, care este etapa optimă de studiu; studiul cromosomilor metafazici se face în următoarele etape: Obţinerea celulelor în diviziune prin: - analiza directă a unor ţesuturii care se divid activ, cum ar fi: măduvă osoasă, gonada masculină, tumori; - culturi celulare: * culturii de scurtă durată (72 ore): sânge periferic, limfocite T, măduvă osoasă roşie; * culturii de lungă durată (peste 7 zile): fibroblaşti (piele, fascii, embrioni), celule amniotice, celule din vilozităţile coriale, tumori solide. Tehnica utilizată în cercetările noaste a fost cultura de limfocite din sângele per- iferic: a). Recoltarea sângelui periferic şi punerea în cultură: - se prelevă sânge periferic prin puncţie venoasă; pentru a se împiedica coagularea, se recoltează pe heparină; - se trece sângele, în condiţii de asepsie1, pe mediu de cultură specific (bio Merieux 1996, îmbogăţit cu ser uman AB); pentru stimularea diviziunilor se utilizează fitohemaglutinină (PHA); - se incubează la 37 grade C‚ 72 de ore. b). Prelucrarea culturii: 1). blocarea diviziunilor în metafază (cu substanţe care inhibă formarea fusului de diviziune - colchicina); 2). hipotonizarea celulelor (centrifugare, eliminarea supernatantului şi resuspendare în soluţie hipotonă de KCl): dilată celulele şi dispersează cromosomii; 3). fixarea celulelor (alcool etilic absolut si acid acetic glacial în raport de 3:1) întrerupe activitatea vitală a celulei păstrând structura morfologică; 4). etalarea celulelor pe o lamă microscopică pentru a dispune cromosomii în acelaşi plan; 5). colorarea (cu soluţie Giemsa timp de 2 – 3 minute); 6). examinarea la microscop - reperarea şi analiza cromosomilor pentru a evidenţia eventuale anomalii de număr si mozaicuri cromosomice (linii celulare cu număr diferit de cromosomii) sau anomalii de structură. 1 caracterizată prin absența microbilor. 7). fotografierea şi decuparea cromosomilor. 8). cariotiparea - dispunerea sistematizată a cromosomilor unei singure celule somatice, pe baza lungimii, poziţiei centromerului sau a altor criterii morfologice (constricţii secundare, sateliţii, benzii), precis codificate prin standarde internaţionale. Pentru identificarea cromosomilor umani am utilizat: a). Criterii morfologice cantitative: 1). Lungimea cromosomului: absolută (microni) şi relativă (%) din lungimea unui set hap1oid. După lungime cromosomii pot fi: mari, mijlocii, mici. 2). Poziţia centromerului – cromosomii pot fi: metacentrici: Ic=46-49; submetacentrici: Ic=29-45; unde, indicele centromeric: Ic=p/(p+q) x 100. acrocentrici: Ic=17-30; b). Criterii morfologice calitative: 1). sateliţii - pe braţele scurte ale acrocentricilor (13, 14, 15, 21, 22, excepţie cromosomul Y); 2). constricţii secundare - segmente cromosomice despiralizate, slab colorate - pe braţele lungi ale cromosomilor 1, 6, 9, 16.
c) Autoadiografia – marcarea cromosomilor cu timidina tritiata și examinarea lor
radiografica
d). Marcajul în benzi.
Prin tehnicii speciale, pe cromatide se pot evidenţia zone colorate sau necolorate numite benzi, cu distribuţie precisă (determinată de structura internă - eucromatină şi heterocromatină - a cromosomului)‚ specifică fiecărui cromosom, identică la cromosomii omologi şi la toţi indivizii speciei. Marcajul în benzi permite identificarea precisă a perechilor de omologi din cadrul grupelor, identificarea unor anomalii de structură prea mici pentru a fi detectate prin colorarea obişnuită, (vezi fig. 19). Denumirea benzilor - după metoda folosită / localizarea: - benzi Q = colorare cu quinacrină (fluorescente în lumină UV); - benzi G = colorare Giemsa, după tratament cu alcali, enzime proteolitice sau soluţii saline concentrate; benzile Q fluorescente au aceeaşi dispoziţie cu benzile G colorate; - benzi R = „reverse”, obţinute prin denaturare termică a ADN-ului sau prin colorare cu acridin orange - inverse benzilor Q şi G; - benzi C = centromerice - evidenţiate în zona centromerului; - benzi T = telomerice. Nomenclatura benzilor: se numerotează de la centromer spre telomer pe fiecare din braţe; ex. 1q21.1 - cromosomul (1), braţul lung (q), regiunea (2), banda (1), subbanda (1). La cromosomii metafazici umani, prin tehnica descrisă mai sus, apar 400-500 benzi (Gorduza et al., 2003). Caracteristicile grupelor de cromosomi umani (fig. 5.1): Grupa A cuprinde primele trei perechi de cromosomii (1, 2 şi 3). Sunt cromosomii mari (9,08 - 7,06 microni); perechile 1 şi 3 sunt metacentrice, pe când 2 este ceva mai submetacentrică. Grupa B cuprinde perechile 4 şi 5. Sunt cromosomi mari (6,55 -6,13 microni) şi submetacentrici; Cromosomul 4 se replică precoce în faza S a interfazei, deci este mai bogat în eucromatină, decât cromosomul 5 care se replică tardiv; această caracteristică permite identificarea lor autoradiografică. Grupa C conţine perechile de cromosomii 6 - 12 şi unul sau ambii cromosomii X în funcţie de sexul genetic. Grupa cuprinde 15 cromosomii la bărbat şi 16 la femeie. Sunt cromosomii mijlocii (5,84 - 4,46 microni) şi submetacentrici (perechile 8,9,10 şi 12 sunt submetacentrice, pe când perechile 6,7,11 şi X sunt aproape metacentrice). Cromosomul 9 are o constricţie secundară evidentă pe braţul lung. Gonosomul X are 5,80 microni; în metafazele marcate prin tehnica R prezintă două benzi pericentromerice marcate intens care delimitează un mic "x" în centrul cromosomului. Grupa D conţine perechile de cromosomii 13, 14 şi 15; sunt cromosomii mijlocii (3,64 - 3,36 microni) şi acrocentrici. Toţi prezintă sateliţi pe braţele scurte (13ps, 14ps, 15ps) şi câte o regiune pe braţele scurte şi trei pe cele lungi, cu excepţia cromosomului 15 care are doar două. Sunt foarte asemănători şi din această cauză se diferenţiază prin marcajul în benzi diferit. Cromosomii 14 şi 15 se replică precoce în faza S, pe când cromosomul 13 se replică tardiv. Grupa E conţine perechile 16, 17 şi 18. Cromosomul 16 este mijlociu (3,23 microni) şi este metacentric; prezintă o regiune pe braţul scurt şi două pe cel lung. Cromosomii 17 şi 18 sunt mici (2,85 – 2,76 microni) şi submetacentrici; sunt foarte asemănători (au câte o regiune pe braţul scurt şi două pe cel lung) din această cauză se diferenţiază prin marcajul în benzi diferit. Grupa F conţine perechile 19 şi 20; sunt cromosomii mici (2,52 - 2,33 microni) şi sunt metacentrici (au câte o singură regiune pe ambele braţe). Se deosebesc prin marcajul în benzi diferit. Grupa G conţine perechile 21, 22 şi gonosomul Y la bărbat. Sunt cromosomii mici (1,83 – 1,68 microni) şi acrocentrici. Cu excepţia gonosomului Y (1,96 microni), cromosomii grupei G prezintă sateliţi pe braţele scurte (21ps, 22ps). Având număr diferit de cromosomi la cele două sexe (4 la femeie şi 5 la bărbat), numărarea cromosomilor din grupa G permite stabilirea sexului genetic. Toţi cromosomii au câte o regiune pe ambele braţe şi se deosebesc doar prin marcajul în benzi.