Citogenetică

Cromozomii umani. Cariotiparea. Testul Barr

Cromozomii
➢ Corpusculi intens colorați, prezenți în nucleul celular, purtători al informației genetice
➢ prezenți în perechi în celulele somatice (celule diploide), respectiv într-un singur set în celulele
germinale (celule haploide)
➢ număr fix, 23 perechi: 46,XX la femei, respectiv 46,XY la bărbați

Telomere

Constricții secundare
proximale pe 1,9,16
Cromozomii
Structura cromozomilor în metafază:
➢ două cromatide surori, dispuse paralel, care se unesc la nivelul centromerului; au structură
heterogenă sub formă de benzi, specifice fiecărui cromozom și identice la toți indivizii speciei
Elementele componente:
➢ Centromer - constricția primară la nivelul căreia se unesc cromatidele; au rol în fixarea pe fusul
de diviziune prin 2 kinetocori; marker cromozomial; compus din ADN repetitiv
➢ Brațele cromozomilor - scurt p și lung q; în funcție de poziția centromerului față de telomere
cromozomii pot fi metacentrici, submetacentrici sau acrocentrici
➢ Telomerele - capetele cromozomilor; compuse din repetiții TTAGGG; se deteriorează cu
fiecare ciclu celular; rol de stabilizare a cromozomilor
➢ Sateliții - prezenți la capătul brațelor scurte a cromozomilor acrocentrici, conțin ADN înalt
repetitiv
➢ Constricții secundare terminale la acrocetricii cu sateliți și proximale pe brațele lungi la cr.
1,9,16.
Cromozomii
Clasificări multiple în funcție de:

➢ tipul de cromozomi
➢ Autozomii = cromozomi somatici perechile 1-22
➢ Gonozomii = cromozomii sexuali X și Y
➢ mărime
➢ mari grupele A și B
➢ mijlocii grupele C și D
➢ mici grupele E, F și G
➢ poziția centromerului
➢ metacentrici perechile 1,3, grupele E (16) și F
➢ submetacentrici perechea 2, grupele B, C , E (17,18)
➢ acrocentrici grupele D și G
Cromozomii
➢ Sunt clasificați în grupe (vezi carte de lucrări), în funcție de mărimea lor și de poziția
centromerului
Cromozomii
Ultrastructura cromozomilor:
➢ Primul nivel de împachetare: Nucleozomul = 8 molecule de histone înconjurate de o secvență
ADN cu lungimea de 168 pb, care se înfășoară de 1,65 ori în jurul histonelor
➢ Fibra elementară = succesiune de nucleozomi; d=11 nm
➢ Fibra cromatină sau solenoidul= cuprinde fibra elementară strâns împachetată; d=30 nm
➢ fibra cromatină formează bucle cu lățimea de 250 nm, care se împachetează apoi în cromatide

Din punct de vedere biochimic cromatina conține:

➢ ADN 13-17%
➢ ARN 8-15%
➢ Proteine 68-79% histone și nehistone

În microscopia electronică cromatina este:

➢ Eucromatină- puțin densă, palid colorată, conține gene

➢ Heterocromatină – densă, intens colorată, genetic "inactivă"
Ultrastructura cromozomilor

Sursa: www.nature.com
Cromozomii
Cromozomii
Cariotipul uman
= reprezintă aranjarea ordonată, sistematizată a cromozomilor unei celule în funcție de diverse criterii
(ex. mărimea lor, poziția centromerului, benzi specifice, similaritatea în perechi, etc.)

Se poate efectua din orice țesut sau celulă în diviziune:

➢ măduva hematogenă (leucemii)

➢ tumori solide (cancere)
➢ celule în meioză din gonade

Se poate efectua din celule stimulate să se dividă in vitro:

➢ limfocite sânge periferic (metoza uzuală)

➢ Fibroblaști (necesită culturi speciale, îndelungate)
➢ celule din vilozitățile coriale (diagnostic prenatal)
➢ celule din lichidul amniotic (diagnostic prenatal)
Cariotipul uman
Indicațiile efectuării cariotipului:

➢ Sindroame plurimalformative, cu sau fără dizabilitate intelectuală (aici intră și suspiciunea unor
anomalii gonozomale precum Turner și Klinefelter, etc)
➢ Dizabilitate intelectuală de cauză necunoscută, cu sau fără dismorfism
➢ Părinții copiilor cu anomalii cromozomiale (identificarea unei anomalii echilibrate)
➢ Nou-născuți morți
➢ Cupluri cu avorturi recurente, sterilitate primară, nou-născuți morți
➢ Stări intersexuate
➢ Unele hemopatii maligne - leucemia mieloidă cronică
➢ Expunere la radiații (profesional, accidente nucleare)
➢ Diagnostic prenatal- când există suspiciuni la testele noninvazive, ecografie fetală
Cariotipul uman
Contraindicații sau limitări - nu se efectuează deoarece, de obicei, nu prezintă modificări
/modificările sunt prea mici pentru a fi vizibile în aceste situații:

➢ Boli monogenice
➢ Boli poligenice multifactoriale (malformații congenitale unice ce au de obicei determinism
poligenic multifactorial, bolile comune ale adultului: HTA sec, DZ tip 2, obezitate, etc)

Principiul tehnicii: se obțin culturi, stimulate in vitro, de celule din sângele periferic (de obicei, dar
posibil și din alte surse) care sunt supuse unor procese successive de hipotonizare, fixare, etalare pe
lame, degradare chimică și bandare (Giemsa, alte bandări). Acestea sunt examinate la microscop,
salvate și prelucrate cu ajutorul unor programe informatice.
Cariotipul uman
Etapele cariotipării:

➢ Se recoltează sânge venos (1 - 2 ml la adulți; 0,5-0,7 ml la copiii mici) în eprubete cu heparină

➢ Se adaugă proba de sânge pe un mediu de cultură îmbunătățit cu fitohemaglutinină (pentru
stimularea mitozelor)
➢ Incubarea culturii la 37°C pentru 48-72 ore
➢ Se scoate cultura de la incubator, se adaugă colcemid (statmokinetic utilizat pentru blocarea
mitozelor în metafază)
➢ Hipotonizarea cu clorură de potasiu KCl 0,55% pentru dispersarea cromozomilor
➢ Fixarea cu amestec de alcool metilic - acid acetic glacial în proporție de 3:1, 3 etape
succesive cu păstrarea probelor la congelator între etape (rol de a conserva structura
morfologică a celulei)
➢ Picurarea suspensiei pe lame cu ajutorul unei pipete
➢ Degradarea resturilor celulare cu enzime proteolitice (tripsină)
➢ Colorarea cu soluție Giemsa
➢ Examinarea lamelor la microscop cu imersie, salvarea și prelucrarea mitozelor
reprezentative cu ajutorul unui soft
Cariotipul uman

Imagine preluată de pe https://slideplayer.com

Erată: 1- 2 ml de sânge
Cariotipul uman - Tipuri de bandări
Bandarea Q - Quinacrină - primul tip de bandare descris, nu se mai folosește. După colorare cu
quinacrină și examinare în lumină UV se observă benzi fluorescente care dispar rapid (microscopie cu
imunofluorescență)
Bandarea G - Giemsa - după denaturare chimică (tripsinizare) și colorare cu soluție Giemsa se
obțin benzi colorate care alternează cu cele deschise la culoare (microscopie cu imersie),
colorează intens regiunile bogate în AT (heterocromatină)
Bandarea R – Reverse - după denaturare termică (85-87°C) și colorare cu soluție acridin orange se
obțin benzi cu dispoziție inversă decât la bandarea G, corespund regiunilor bogate în CG
Bandarea C – Centromer – după denaturare - renaturare chimică și termică, urmate de colorare
Giemsa centromerele cromozomilor apar intens colorate, iar brațele necolorate
Bandarea T- Telomere – se obțin benzi telomerice după colorare cu Giemsa și sol. Hoechst
(acționează pe regiunile bogate în CG), extrem de dificilă
➢ Banda = parte a cromozomului care prin metode specifice apare mai întunecată sau mai clară,
putând fi deosebită de segmentele adiacente. Cuprinde aproximativ 5-10 mil. perechi de baze
ADN, poate conține câteva sute de gene. Un cariotip uzual are 450-550, poate ajunge până la
850 benzi.
Cariotipul uman - exemple
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cariotipul uman
Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
● reprezintă un cromozom X inactivat
● descoperită de către Barr și Bartram în 1949
Ipoteza Lyon (1961): pornind de la premisa că femeia are doi cromozomi X,
iar bărbatul numai unul, iar nivelul enzimelor codate de genele de pe
cromozomul X este similar la cele două sexe,Mary Lyon postulează:
 un cromozom X din cei doi se inactivează precoce în viața intrauterină,
inactivarea fiind definitivă și întâmplătoare (fie cel matern, fie cel patern, în
proporții variabile)
 același X, matern sau patern, se inactivează în toate celulele fiice ale acelor
celule
Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
Consecințele inactivării cromozomului X:
 Compensarea dozajului genic: proteinele codificate de gene de pe
cromozomul X sunt cantitativ similare la cele două sexe ex.G-6-PD, glob.
antihemofilică
 Mozaicismul: femeile prezintă un mozaicism pentru genele legate de X (în
unele celule prezintă X matern activ, în altele X patern activ)  Variabilitatea
fenotipică a bolilor legate de X: de la forma ușoară (dacă X-ul cu mutație este
într-un procent mic de celule) la forme severe (dacă X-ul cu mutație este într-
un procent mare de celule)

! unele gene scapă inactivării

Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
Indicații:
 ambiguitate sexuală
 marasm neo-natal cu pierdere de sare
 dizabilitate intelectuală ne-explicată
 fetițe: cu talie mică, limfedem neo-natal al extremităților, dismorfism,
amenoree primară, pubertate întârziată; hernie inghinală; prezența unei
afecțiuni legate de X; familii doar cu fete, etc.
 băieți cu ginecomastie, criptorhidie, absența dezvoltării caracterelor
sexuale secundare, etc.
 Altele (vezi carte de lucrări)
Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
Principiul tehnicii:
 Se recoltează celule ale mucoasei bucale prin raclare blândă, dimineața pe
nemâncat, nespălat dinți; se etalează pe două lame
 Scufundare succesivă în băi de alcool 95%-70%-50%
 Hidrolizare în HCl 5N
 Colorare cu albastru de toluidină
 Examinare la microscopie sub imersie a cel puțin 100-200 celule (500 în
mozaicisme)

Corpusculul Barr = formă triunghiulară sau plan convexă, cu baza lipită de

membrana internă a nucleului și vârful orientat spre centrul nucleului, d =
0,7-1,2 μm, intens bazofil.
Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
Cromatina sexuală sau corpusculul Barr
Interpretare (după examinarea a 100-200 celule, uneori mai mult):
 prezența unui corpuscul Barr în procent de 15-35% - test pozitiv
 prezența unui corpuscul Barr în procent de 5-15% - test ambiguu
 absența corpuscului Barr - test negative
Nr. corpuscul Barr = nr. cromozomi X - 1
Particularități:
 Test pozitiv (1 corpuscul Barr) la băieți = sdr. Klinefelter
 Test negativ la băieți = normal
 Test pozitiv (1 corpuscul Barr) la fetițe = normal
 Test negativ la fetițe = sdr. Turner
 Test pozitiv (2 corpusculi Barr) la fetițe = sdr. Triplu X
 Test pozitiv (3 corpusculi Barr la băiat) = 49, XXXXY
Referințe bibliografice
1. Maria Claudia Jurca. Lucrări practice de Genetică Medicală, Ed.
Universității din Oradea, 2020, pag. 19-32
2. Marius Bembea. Genetica., Ed. Universității din Oradea, 2001, pag. 95-105.