CURS 2

GENETICA

UMANĂ
 U.M.F IAŞI

B. STRUCTURA GENOMULUI
UMAN

 Genomul uman (GU) =

– conţinutul ADN celular sau
– ansamblul integrat al celor 25 de molecule diferite de ADN (24 în
nucleu: 22 autosomi+X+Y şi 1 în mitocondrii), = 3,2 miliarde de pb
 GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) + un
genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%).
U.M.F IAŞI

2. STRUCTURA GENOMULUI UMAN

GU = un genom nuclear (complex, 99,5% ADN) +

un genom mitocondrial (simplu şi mic, 0,5%).

25.000 gene
U.M.F IAŞI

2.1. GENOMUL NUCLEAR

 Enorm (3,2 miliarde pb),

 Fragmentat: (22A+X+Y) molecule de ADN + proteine
→ cromozomi
 Complex, heterogen:
• ADN nerepetitiv
• ADN moderat repetitiv
• ADN înalt repetitiv
 ADN genic (25%) + ADN extragenic (75%)
 U.M.F IAŞI
2.1. Genomul nuclear
a) ADN GENIC (25%)

 Gena = unitatea de
informaţie genetică →

codifică un produs
primar specific
(proteine sau ARN)

 Structura genelor este

foarte complexă - ADN
genic:
 ADN codant = exoni
(10%)
 ADN necodant (90%) =
introni, secvenţe reglare,
gene nefuncţionale
(pseudogene) sau
fragmente de gene
 U.M.F IAŞI

b) ADN EXTRAGENIC (75%)

 Secvenţe netrasncrise
(necodante);

 Funcţii puţin cunoscute:

- rol “tampon” a mutaţiilor;
- împerecherea corectă a
cromozomilor omologi în meioză şi
schimbul egal (CO) de segmente
cromozomiale → recombinare
genică – sursă de variabilitate !!!.
 Alcătuit din:
 ADN nerepetitiv = secvenţe
unice sau un nr mic de copii
(60%)
 ADN repetitiv (40%).
 U.M.F IAŞI

(1) ADN EXTRAGENIC NEREPETITIV (60%)

 SECVENŢELE UNICE sau
SECVENŢE ÎNTR-UN NR MIC
DE COPII

 DUPLICAŢII
SEGMENTALE (5% GU) –
blocuri (~10Kb) ce
flanchează genele (pe
acelaşi cromozom) ;
rol în sinapsa corectă a
omologilor in meioză * .
 Importanţă:
fiind identice - pot genera
erori de împerechere a
cromozomilor omologi →
CO inegal → mutaţii:
duplicaţii /deleţii genice →
BOLI GENOMICE
 U.M.F IAŞI

(2) ADN EXTRAGENIC REPETITIV (40%)

 ADN moderat repetitiv (~30%):

secvenţe scurte repetate de sute
de mii de ori, dispersate în genom
 (ex SINEs şi LINEs)

 ADN înalt repetitiv (~10%):

secvenţe foarte scurte, repetate în
tandem →→→, de milioane de ori;
3 tipuri:
 ADN satelit
(blocuri HCRT la centromer,
telomere, CS) = rol structural;
 ADN minisatelit
(minisateliţi hipervariabili),
dispersat în toţi cromozomii =
markeri genetici individuali =
folosiţi în “amprenta genetică”
 ADN microsatelit
 U.M.F IAŞI

3. GENOMUL MITOCONDRIAL

 ADNmt – câteva mii de copii

per celulă = 0,5%
 Genomul mitocondrial diferă
de genomul nuclear:
• mic (16.569 pb);
• circular;
• neasociat cu proteine;
• fără ADN repetitiv;
• compact: 97%=secvenţe
codante
• 37 de gene:
• contigue,
• fără introni.
• Codul genetic mitocondrial
diferă puţin de cel nuclear
 U.M.F IAŞI

GENOMUL MITOCONDRIAL

 Genomul mitocondrial al
zigotului provine, prin ovul,
exclusiv de la mamă.
 ADNmt poate suferi mutaţii
germinale sau somatice
 Mutaţiile germinale produc o
serie de boli degenerative în
SNC, SNP, muşchi, etc,
care se transmit maternal:
• de la mamă la toţi descendenţii;
• bărbaţii bolnavi nu transmit boala
 U.M.F IAŞI

 ADNmt poate suferi mutaţii somatice, după

naştere:
 produse de radicalii liberi de O2
(generaţi în mitocondrii);
 favorizate de structura ADNmit
(absenţa histonelor; densitate mare de gene; etc)
 Mutaţiile se acumulează rapid datorită absenţei
mecanismelor de reparare
 Determină scăderea producţiei de energie → boli
degenerative, cancer şi senescenţă
 U.M.F IAŞI

1. APARATUL GENETIC AL CELULEI

(v. LP 1)

APARATUL GENETIC:
structurile celulare care conţin ADN:
nucleul + mitocondriile

(1). NUCLEUL → 99,5% ADN

ADN + proteine → (fibre) CROMATINĂ

↓↑
CROMOZOMI.
Cromatina şi cromozomii = două modalităţi diferite de
organizare morfo - funcţionlă a materialului genetic
în inetrfază şi diviziune.

(2). MITOCONDRIILE → 0.5% ADN,

origine exclusiv maternă.
 U.M.F IAŞI

2. CROMATINA (v. LP )
2.1. EUCROMATINA ŞI
HETEROCROMATINA

• CROMATINA = ADN + proteine

Caracteristici EUCROMATINA HETEROCROMATINA
•Exclusiv în nucleu! Condensare Fin dispersată Puternic condensată
(cromocentri)
• Două tipuri morfo-funcţionale Colorare Slabă Intensă
distincte: Replicare în faza Precoce Tardivă
S
- EUCROMATINA Activitate Activă Inactivă 
genetică
activă genetic
Compoziţie Predomină p.b. C - G; Predomină p.b. A - T; ADN
dispersată chimică ADN nerepetitiv; proteine repetitiv;
nehistonice proteine histonice
- HETEROCROMATINA Rol morfologic Alcătuieşte benzile Alcătuieşte benzile
R pozitive (sau G R negative (sau G pozitive)
inactivă genetic negative)

condensată
(cromocentri)
U.M.F IAŞI

EUCROMATINA ŞI HETEROCROMATINA (v. LP )

 HETEROCROMATINA:

 constitutivă – constantă în structura cromozomilor:

benzi G, benzi C (cen, Yq, p A, CS)

 facultativă – diferită în celule / organisme diferite

(hetrocromatinizarea o formă de reglaj genic)
ex., cromatina sexuală
 U.M.F IAŞI

2.2. CROMATINA SEXUALĂ (v. LP )

 CROMATINA SEXUALĂ - definiţie:

un corpuscul de HCRT, = cromocentru poziţie, mărime,
formă ≠ alţi
cu particularităţi morfologice bine definite, cromocentri
care permite identificare NR cromozomilor sexuali→
- determinarea sexului genetic (XX sau XY);
- anomaliile cromozomilor sexuali (XO, XXX, XXY).
 La femeie: cromatina X (corpusculul Barr)
Morfologie – v.LP
 La bărbat: cromatina Y (corpusculul F)
 U.M.F IAŞI

ORIGINEA CROMATINEI SEXUALE

 CROMATINA X:
rezultă prin inactivarea unui cromozom X (la femeile XX) → va forma
(prin heterocromatinizare) corpusculul Barr

Ipoteza Lyon (1961):

(1) inactivarea cromozomului X este totală; ambele sexe
→ un singur X activ.
(corect = parţială* →regiuni/gene active în ambii cromozomi X)
(2) se produce precoce (i.u) şi este definitivă;
(posibil = uneori reversibilă)
(3) are loc la întâmplare (XM sau XP) şi independent în fiecare celulă
(posibil = uneori ne întâmplătoare)
U.M.F IAŞI

Numărul c. Barr = suma cromozomilor X inactivi

(numărul cromozomilor X = nr. c. Barr + 1)

DIAGNOSTIC Femeie Bărbat

Nr. C. Barr 0 1 2 0 1 2

Sex genetic XX XY
(în stări intersex)
Anomalii de număr XO XXX XXY XXXY
cromozomi sexuali XXYY

în obs. clinice de
disgenezii gonadice
 U.M.F IAŞI

CROMATINA SEXUALĂ

 CROMATINA Y:
reprezintă heterocromatina de pe 2/3 distale braţ lung
cromozom Y
(colorată cu flurocromi – ex., quinacrină – şi vizibilă
la microscop UV ca un corpuscul fluorescent )
corpuscul F)
exclusiv la barbati
Nr. corpusculi F = nr. cromozomi Y
ex., bărbaţii XYY au 2 corpusculi F
 U.M.F IAŞI

2.3. STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A

CROMATINEI

 Analiza cromatinei la
microscopul electronic
evidenţiază un sistem
ierarhizat de
compactare a
moleculei de ADN →
fibre de cromatină,
 de dimensiuni diferite,
 alcătuite din ADN,
histone şi proteine
nehistonice.
 U.M.F IAŞI

1) Filamentul cu nucleozomi (10nm)

 Un segment de ADN (146 pb)

- se înfăşoară (1 tur şi 3/4)
- în jurul unui "miez" histonic,
cilindric (8 mol.) → un
NUCLEOZOM.
 Nucleosomii → legaţi printr-un
segment de ADN liniar (60
p.b.) → FILAMENTUL CU
NUCLEOZOMI
(~ "şirag de mărgele").
 FN - menţinut împachetat de
către histona H1, ce leagă doi
nucleozomi vecini.
 Rată de "compactare" a ADN
nativ este de circa 10:1
 U.M.F IAŞI

2) Fibra de cromatină (30nm)

 Filamentul cu nucleozomi se spiralizează în
solenoid → fibra de cromatină (FC) (30 nm)
Rată de "compactare" a filamentului cu nucleozomi
este de circa 5:1
 3)
U.M.FFibra
IAŞI pliată în bucle laterale (300
nm)
 FC (30 nm) se pliază în
bucle laterale ataşate la
un “schelet” de proteine
nonhistoince → FPBL =
300nm
 O buclă (domeniu crs) –
de ~75Kb – câteva gene =
unitate funcţională (de
transcripţie şi replicare).
 Rată de "compactare" este
de circa 10:1
 U.M.F IAŞI

4) Cromozomul metafazic (300 nm)

 În profază fibra de
cromatină se
condensează (20:1) →
cromatida (700 nm)
unui cromozom
 Cromozomii – grad
maxim de condensare
în metafaza diviziunii
 U.M.F IAŞI

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

sinteză

ADN  FILAMENT  F I B R A  FIBRA  CROMATIDA

CU DE PLIATĂ ← UNUI
NUCLEOSOMI CROMATINĂ ÎN BUCLE CROMOZOM

INTERFAZA DIVIZIUNE

 Fiecare cromatidă are o singură moleculă de ADN

 organizată în mai multe structuri succesive şi ierarhizate,
 compactată de ~ 10.000 ori, pentru a face posibilă:
• localizarea în nucleu
• distribuţia corectă a materialului genetic în diviziune
 U.M.F IAŞI

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

Sinteză

 Buclele fibrei de 300 nm se

fixează neregulat de scheletul
proteic:
 zone cu mici aglomerări =
cromomere
 zone mai laxe

 Prin condensarea cromatidei în

profază,
cromomerele se unesc şi
formează benzi intens
condensate şi colorate (benzi
G + = heterocromatină)
care alternează cu benzi mai
puţin condensate şi mai clare
(benzi R + = eucromatină).
 U.M.F IAŞI

STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ A CROMATINEI

Sinteză

 Fiecare cromozom are o

structură internă
eterogenă
caracteristică
(permite identificarea
lui
precisă)
 U.M.F IAŞI

3. CROMOZOMII UMANI

 CROMOZOMI = organite
nucleare care fixează
intens coloranţi bazici
(“chroma” + “soma”)

 Funcţii:
 Transportă + distribuie
materialul genetic în cursul
diviziunii → stabilitatea
proceselor ereditare.
 Asigură recombinarea
genetică în meioză
 U.M.F IAŞI

3.1. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR UMANI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor: Cromatidele
Centromerul
(1) COMATIDELE Telomerele

- Crz = bicromatidian← după

replicare;
- Cromatidele surori ≡ 1 moleculă
de ADN + Pr
 U.M.F IAŞI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor

(2) CENTROMERUL

 locul de ataşare a cromatidele

surori (prin proteina ISS)
 unic → constricţie primară
 împarte cromatidele în braţele
“p” şi “q”
 poziţie fixă – determinată de o
secvenţă ADN repetitiv (ADN
satelit) identică la toţi
cromozomii) + ADN specific
fiecărui cromozom;
 cromozomi M, SM, A
 U.M.F IAŞI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor

(2) CENTROMERUL

 Rol esenţial pentru

SEGREGAREA
cromozomilor din
cursul diviziunii
celulare:

 La ADN cen se fixează

proteine CENP =
kinetocorii → locul de
fixare a filamentelor
fus de diviziune → ce
vor tracta cromatidele
la poli (în anafază)
 U.M.F IAŞI

a). Elemente comune tuturor cromozomilor

(3) TELOMERELE = structuri

specializate, formate din ADN
repetitiv + proteine asociate, care
“acoperă” şi protejează capetele
cromozomilor.

Funcţii:
 menţinerea integrităţii structurale;
 asigurarea replicării complete;
 poziţionare cromozomilor omologi în
nucleu
 U.M.F IAŞI
b). Elemente caracteristice unor cromozomi

(1) SATELIŢII = mase mici de

heterocromatină ataşate pe braţele scurte
ale cromozomilor acrocentrici (exceptând
Y) = variante normale

(2) CONSTRICŢIILE SECUNDARE= blocuri de

heterocromatină situate pe 1q, 9q, 16q –
lângă centromer = variante normale

(3) SITUSURILE FRAGILE = lacune necolorate

pe cromatidele unor cromozomi.
Majoritatea = variante normale; excepţie
fra Xq27 asociat cu retard mintal
= Sdr. X fragil (RMLX-1:4000 nn)
 U.M.F IAŞI

c). Elemente specifice fiecărui cromozom: BENZILE

 Prin diferite tratament –

se observă pe
cromozomii metafazici o
serie continuă de benzi
longitudinale,
- unele intens colorate
(benzi G)
- ce alternează cu benzi
slab colorate (benzi R)
 U.M.F IAŞI

c). Elemente specifice fiecărui cromozom: BENZILE

 Benzile reflectă
structura
internă,
heterogenă, a
cromozomilor.
 Fiecare
cromozom – are
un model
caracteristic de
benzi →
identificarea sa
precisă.
 U.M.F IAŞI

3.2. TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ

(v LP)

a). Principiile metodelor (!!!)

(1) Obţinerea de celule în diviziune:
 Culturi celulare: limfocite, fibroblaste, celule fetale (←
amniocenteză);
- 0,5 ml sânge periferic (recoltat steril, pe heparină) → mediu
cultură cu PHA (stimulează diviziunile) → 72 ore
 Ţesuturi care se divid activ: măduvă osoasă (← punvţie
medulară), trofoblast (← placentocenteză);
(2) Obţinerea de celule în metafază: blocare cu colchicină
(3) Obţinerea preparatelor: hipotonizare, fixare, etalare
pe lame, colorare, ± tehici de marcaj în benzi.
(4) Analiza preparatelor* → cariotip
 U.M.F IAŞI

EVOLUŢIA
TEHNICILOR DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ
(v LP)
(1) TEHNICI DE GENERAŢIA I
(1956)
- cromozomi uniform
coloraţi;
- identificare imprecisă*

(2) TEHNICI DE GENERAŢIA II

(1970)
- marcaj în benzi G sau R
cromozomi metafazici
(400 benzi);
- identificare precisă
 U.M.F IAŞI

TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ (v LP)

(3) TEHNICI DE
GENERAŢIA III (1977)
- Înaltă rezoluţie:
cromozomi M PM P

pro-matafazici
(550 benzi) sau
profazici
(850 benzi)
- o bandă = 3-5 Mb
 U.M.F IAŞI
TEHNICI DE ANALIZĂ CROMOZOMIALĂ
(v LP)

(4) TEHNICI DE GENERAŢIA IV

(1991)
- citogenetică moleculară
- FISH metafazic
- se pot identifica f. precis
remanierile cromozomiale şi
microdeleţiile
- FISH interfazic
Ce este FISH ?
tehnică de analiză
cromosomică
F fluorescence
I in Hibridare fluorescentă
S situ in situ
H hybridization

Tehnică moleculară Tehnică moleculară

pentru detecţia pentru localizarea
anomaliilor secvenţelor genice
 PRINCIPIUL TEHNICII FISH

•Hibridare (formare de legături de hidrogen) între o sondă specifică

de ADN (marcată fluorescent sau imunohistochimic) şi secvenţa
complementară prezentă într-un anumit segment cromosomic

•hibridizarea se bazează pe legea complementarităţii bazelor

azotate, conform căreia în moleculele de ADN se formează
următoarele perechi:
• A-T
•C-G
 a. Proba şi ADN ţintă

b. Marcarea probei –
indirectă (stg.) şi directă
(dr.)

c. Denaturarea probei şi a
ADN-ului ţintă

d. Hibridarea între probă

şi ADN-ul ţintă

e. Fixarea fluoroforului
la haptenă (marcaj
indirect)

PRINCIPIUL TEHNICII FISH

 AVANTAJELE TEHNICII FISH

 SENSIBILITATE ŞI SPECIFICITATE CRESCUTE

 TIMPUL SCURT DE OBŢINERE A REZULTATELOR DEFINITIVE;
 POSIBILITATEA ANALIZEI DE CELULE ÎN DIVIZIUNE SAU
INTERFAZĂ
 REZOLUŢIE MARE (sonde de până la 40 kb)

DEZAVANTAJELE TEHNICII FISH

 COSTUL RIDICAT AL SONDELOR ŞI REACTIVILOR;

 COSTUL RIDICAT AL APARATELOR FOLOSITE
 GRADUL ÎNALT DE TEHNICITATE