Analiza cromozomilor sexuali la om

Analiza cromozomilor sexuali(X sau Y) se poate efectua in interfaza pe biopsii din piele,
frotiuri din mucoasa bucala sau frotiuri de sange periferic. Dupa colorarea preparatelor se
apreciaza frecventa procentuala a celulelor care prezinta o particular cromatiiniana
numita corpuscul sexual.
CORPUSCULUL SEXUAL X/ CROMATINA SEXUALA
Definitie: Cromatina sexuala este unul dintre cei doi cromozomi X dintr-o celula
somatica feminina normala care se condenseaza si se inactiveaza in interfaza.
Istoric :
- 1949 Barr si Bertram au descoperit un corpuscul heterocromatic in celulele de
pisica si au interpretat acesta ca fiind unul dintre cei doi cromozomi X de la sexul
femel inactivat in interfaza.
- 1961 Mary Lyon explica originea si semnificatia genetica a inactivarii unuia
dintre cei doi cromozomi X
Ipoteza sa a fost ca femeile, care au doi cromozomi X, vor avea nivelul seric al unei
enzime codificata pe cromozomul X dublu fata de barbati, care au un singur cromozom
X. Dozand nivelul seric al enzimei a constatat ca acesta este egal pentru cele doua sexe.
Mary Lyon a emis urmatoarele ipoteze :
1. Cromatina X rezulta prin inactivarea si heterocromatinizarea unuia dintre cei doi X
in interfaza
2. Inactivarea cromozomului X de origine materna sau paterna se face la intamplare si
independent in celule diferite.
3. Inactivarea se realizeaza precoce(pana in ziua a 16-a) si este definitiva(toata viata).
Semnificatia inactivarii cromozomului X :
1. Compensarea de doza- prin fenomenul inactivarii se egaleaza numarul de copii
pentru genele X-lincate la sexul feminin si masculin.
2. Femeile heterozigote pentru genele X-lincate sunt mozaicuri de clone celulare
datorita inactivarii aleatorii a cromozomului X matern sau patern. Studiul sau a pornit
de la polimorfismul G6PDH, care are doua variante alelice A si B, iar in cazul
femeilor heterozigote acestea prezinta populatii celulare diferite care secreta cele
doua variante enzimatice A si B, datorita inactivarii aleatoare a cromozomului X.

Pisicile calico numai de sex feminin

De fapt, cromozomul X nu se inactiveaza in intergime, o mica parte a cestuia ramane

activ conferind un mic avantaj selectiv sexului feminin(o mai buna adaptare si o mai
mare rezistenta la factorii de mediu).
Inactivarea nu intereseaza cromozomul X in intregime : regiunile pseudoautozomale de
la extremitatile cromozomului X(ce contin gene prezente si pe cromozomul Y) raman
active, la fel ca si o serie de gene situate in alti loci. Aproape un sfert dintre genele de pe
cromozomul X inactiv sunt exprimate. Acest fapt explica de ce anomaliile cromozomiale
45,XO si 47,XXY si care altereaza caracteristic doza specifica a genei, produc sindroame
plurimalformative specifice.
Procesul de inactivare este epigenetic si este initiat si controlat de un centru de inactivare
XIC, care a fost identificat pe bratul lung al cromozomului X(Xq13) si care contine 2
gene ce produc ARNnc, numite XIST si TSIX.(XIST- X Inactivation Specific Transcript)
Primul eveniment din cadrul procesului de inactivare a cromozomului X este reprezentat
de imperecherea tranzitorie a celor doua regiuni XIC. Acest fenomen are importanta in
procesul de numarare a cromozomilor X, care va duce la mentinerea activa doar a unuia
dintre cei doi cromozomi X.
Este urmata de o etapa de crestere marcata a expresiei genei XIST, ce codifica o molecula
de ARN necodant lung. Acest ARN XIST imbraca cromozomul X inactiv.
Desi gena XIST este esentiala pentru inactivarea cromozomului X, expresia sa nu este
suficienta pentru realizarea acestui proces complex. De pe catena opusa celei pe care se
afla gena XIST este transcrisa gena TSIX care codifica un ARN cu efect reglator negativ
asupra genei XIST, si astfel pe cromozomul X activ gena XIST este inactivata in timp ce
pe cromozomul X inactiv gena XIST inactiveaza activitatea genei TSIX.
Alte mecanisme care mentin inactivarea cromozomului X sunt :
- metilarea ADN ;
- hipoacetilarea histonei H4
- metilarea H3K9 si H3K27
Exceptiile lyonizarii :
1. In cazul unor anomalii cromozomiale care intereseaza un cromozom X(cum sunt
deletiile unuia dintre cromozomii X sau translocatiile X-autozomale) se observa o
inactivare preferentiala, neintamplatoare a cromozomului X normal
2. Cromozomii X n inel se exprima daca zona ce contine gena XIST este absenta,
cromozomul nu este inactivat si genele continute se exprima.
3. Translocaiile reciproce ntre cromozomul X i un autozom sunt anomalii
cromozomiale de structur echilibrate ce apar ca urmare a ruperii cromozomului
X i a unui autozom, fiecare n cte un singur punct, urmat de schimbul reciproc
de fragmente cromozomiale. Cromozomii astfel obinui se numesc cromozomi
derivati. La femei, cromozomul X normal este inactivat iar cromozomul derivat X
este activ. Inactivarea cromozomului derivat X ar determina att inactivarea
genelor prezente pe fragmentul derivat din cromozomul X ct i a celor situate pe
fragmentul cromozomic derivat de la un autozom, fenotipul n aceast situaie
fiind grav, letal n multe cazuri.
4. Inactivarea nu intereseaza cromozomul X in intregime : regiunile
pseudoautozomale de la extremitatile cromozomului X(ce contin gene prezente si
pe cromozomul Y) raman active, la fel ca si o serie de gene situate in alti loci.
Aproape un sfert dintre genele de pe cromozomul X inactiv sunt exprimate. Acest

fapt explica de ce anomaliile cromozomiale 45,XO si 47,XXY si care altereaza

caracteristic doza specifica a genei, produc sindroame plurimalformative
specifice.
5. Raman functionale genele pentru steroid sintetaza si gena Xg pentru functia
ovariana normala precum si genele pentru functia ovariana dupa menopauza(Xq26) si
genele necesare diferentierii ovariene
Forma: Aspect eliptic atasat de fata interna a membranei nucleare(corpuscul
heterocromatic Barr) pentru celulele epiteliale, nervoase, sau aspect de apendici
perinucleari pentru celulele polimorfonucleare din sangele periferic.
Dimensiuni: 1-2 microni, depinde de stadiul interfazei(in G2 de 2 ori mai mare decat
in G1- prereplicativ)
Numarul : este egal cu numarul cromozomilor X din celula 1
Frecventa: depinde de mai multi factori:
1. Activitatea metabolica
2. Varsta celulei
3. activitatea mitotica
4. Actiunea medicamentelor si hormonilor : scad frecventa aureomicina,
cloramfenicol, testosterone, progesteron . Cresc frecventa ACTH, insulina,
estrogeni.
5. Varsta individului
6. Tipul de tesut examinat.
7. Tehnica folosita
8. Sindroamele gonozomiale.
Studiul cromatinei X in frotiul de mucoasa bucala
Tehnica efectuarii frotiului
- Recoltarea - cu o lama de sticla rodata se racleaza (razuieste) fata interna a
obrazului la adulti iar la copii buza inferioara.Nu se foloseste recoltarea
superficiala deoarece contine o cantitate mare de celule descuamate.Cea de-a
doua recoltare se foloseste intinzandu-se un frotiu celular gros pe o lama de
microscop
- Fixarea frotiului - se efectueaza cu ameste de fixator, cu o durata de 30 minute 12 ore
- Rehidratarea - constituita din patru bai succesive a 5 minute fiecare - alcool 70
grade, alcool 50 grade, apa distilata I, apa distilata II
- Hidroliza - nu este obligatorie dar se efectueaza cu acid clorhidric (HCL)
- Colorarea - se face cu fuxina bazica - colorant CARR
- Examinarea frotiului se face la microscopul cu imersie
Morfologia corpuscului Barr
condensat i intens colorat bazofil (corpuscul BARR);
- este situat cel mai adesea periferic, lipit de faa intern a membranei nucleare
(intranuclear);
- cnd este situat central trebuie difereniat de nucleol (rotund i mai mare, bruncrmiziu n coloraia cu verde de metil pironin) i de cromocentri nespecifici
(mai mici sau mai mari cu form neregulat).
- forma: ovalar, plan convex, discoidal sau triunghiular;
- mrime medie: 1 micron ( 0,3);

Interpretarea testului Barr. Se analizeaza 200-300 de nuclee celulare. Daca se

suspecteaza o aberatie cromozomiala se citesc 1000 de celule. Se stabileste raportul
procentual al celulelor cu corpuscul Barr dintre celulele examinate.
<1% - sex masculin
>4% - sex feminin
1-4%- mozaicuri celulare( se citesc 1000 de celule)
Apendicii perinucleari din PMN
Au fost descrisi in 1954 de catre Davidson si Smith ca fiind formatiuni corpusculare
atasate de partea externa a membranei nucleare cu aspect heteromorf. Sunt grupati in
patru tipuri distincte : tipul A(bat de toba), tipul B( apendice sesil), tipul C(polimorfic) si
tipul D(racheta de tenis).
Interpretarea rezultatelor. Se citesc 500 de neutrofile cu nucleu polilobat iar cand se
suspicioneaza un mozaic se ajunge pana la 2000 de PMN. Se considera ca numai A+B
sunt cromozomi X inactivati. Relatiile procentuale sunt asemanatoare cu testul Barr.
Studiul cromatinei X in frotiul de sange periferic
Tehnica: se evideniaz n nucleul polimorfonuclearelor neutrofile pe frotiuri
colorate cu soluie GIEMSA.
Aspectul cromatinei:
- apendici nucleari de tip A au form de "b de tob" (drum stick) i prezint un
cap ovalar sau rotund legat printr-un filament subire de unul din lobii nucleului
PMN; - apendici nucleari de tip B sau noduli sesili prezint aceeai mrime i form ca
i apendicii nucleari de tip A dar sunt legai direct la nucleu printr-o baz larg de
implantare.
- culoare: intens bazofil, iar marimea este de 1.5 microni
Frecventa - normal la femeie: 1/38 PMN (1/6 -1/98 PMN). PMN polimorfonuclear
Coloratia Giemsa
1. se acopera cu solutie de alcool metilic si se lasa 5 minute pentru fixare;
2. Se scurge alcoolul metilic;
3. Se acopera lamele cu solutie Giemsa diluata, preparata extemporaneu: 3 picaturi
de colorant la 1ml apa, se lasa 25-30 de minute;
4. Spalare la jet de apa;
5. Uscare la aer.
6. se aseaza lamele cu frotiurile pe baia de colorare;

Corpusculul sexual Y
Prin tratarea nucleului interfazic cu quinacrina cromozomul Y apare sub forma de
corpuscul fluorescent, cu diametrul de 0,25-1micron situat la periferia nucleului sau
pericentral.
Corpusculul F(fluorescent) poate fi pus in evidenta in nucleul celulelor mucoasei bucale,
limfocite, fibroblasti, celule din lichidul amniotic, spermatozoizi.
Numarul/pe celula: este egal cu numarul de cromozomi Y din celula.
Nu apare in nucleul celulelor de la o femeie normala.
Frecvena:
- diferit n diferite esuturi ale sexului masculin: 70 - 80% n fibroblati;
45% n spermatozoizi;
- corpusculul F este prezent exclusiv la brbat ntr un singur exemplar; poate fi prezent n
dou exemplare la persoanele cu cariotip 47,XYY.
Interpretare
- Nr. corpusculi F = Nr. cromosomi Y
Cromozomul X
Contine 1529 gene:
Gene regl. feminizante
Gene struct. fem(DAX1)
Gene struct. Masc(R-Tdf)
Gene struct. somatice(G6PD,Xg, fact VIII si IX de coagulare)
Cromozomul Y
Contine 344 gene:
Gene regl. masc(SRY, H-Y)
Gene de fertilitate(AZF1, AZF2)
Gene struct. somatice(PK, receptor interleukina)
Pseudogene(actina, Xg)

Importanta determinarii cromozomilor sexuali

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Diagnosticul sexului genetic

Stari de indeterminism gonadic
Diagnosticul sindroamelor genetice gonozomiale
Diagnosticul prenatal al sexului
Medicina legala
Sportivi de performanta

7. Marker al transplantului

DSD -disorder of sex development

46,XX DSD
Tulburari ale dezvoltarii ovariene:
Ovotestis DSD-cu vechea denumire de hermafroditism
adevarat;
DSD testicular: duplicatia genei SOX9 sau translocatia
genei SRY;
Disgenezie gonadala 46,XX.
Sindroame determinate de excesul de androgeni:
CAH deficitul de 21-hidroxilaza, 11 beta- hidroxilaza, 3betahidroxisteroid dehidrogenaza
Deficitul de P-450 aromataza, denumita si estrogen
sintetaza
Exces de androgeni de sursa materna: aport exogen,
tumori secretante: ovariene, luteom.
46,XY DSD
Tulburari ale dezvoltarii testiculare:
Disgenezie orhitica pura (sdr.Swyer);
Disgenezie gonadala (orhitica) partiala (mutatii WT1,
SOX9, SF-1);
Sindroamele de regresie testiculara.
Tulburari ale biosintezei si actiunii androgenilor:
Defecte ale biosintezei androgenilor defictul de 17hidroxisteroid dehidrogenaza, 5-alfa reductaza, StAR, 3
beta-hidroxisteroiddehidrogenaza, 17,20 liaza, hipoplazia
celuleor Leydig;
Defecte ale activitatii androgenilor sindromul de
rezistenta totala sau partiala la actiunea androgenilor;
Defecte ale receptorului pentru LH;
Defecte ale AMH si AMH-R (hormonul antimullerian si
respectiv receptorul sau).
DSD ce afecteaza cromozomii sexuali:
Sindromul Turner cu toate variantele sale genotipice;
Sindromul Klinefelter si sindromul 47,XYY

 Disgenezie gonadala mixta: 46,XX/46,XY sau 45,X/46,XY.