CROMOZOMII

Structurile celulare care contin ADN si cele care

intervin in realizarea functiilor sale (ribozomii si
centriolii) alcatuiesc Aparatul genetic.

Nucleul este elementul principal al aparatului

genetic.

In nucleu fiecare molecula de ADN se asociaza

cu proteine histonice, nonhistonice si mici
cantitati de ARN, formand un complex nucleo-
proteic denumit CROMATINA.
 Interactiunile dintre ADN si proteine au un rol
structural in organizarea supramoleculara a
ADN si un rol functional in mecanismele care
regleaza expresia si replicarea genelor.

 Cromozomii sunt elemente dinamice si

constante ale celulei cu functii genetice
esentiale.

 Exceptand procariotele care au un singur

cromozom circular, la eucariote numarul
cromozomilor este caracteristic fiecarei
specii:
 OM - 46
 MAIMUTA - 42
 CIMPANZEU - 48
 BOVINE - 60
 CAINE - 78
 PISICA - 38
 CAL - 64
 SOARECE - 40
 DROSOPHILA- 8
 Numarul cromozomilor in celula nu respecta
gradul de evolutie biologica si complexitatea
structural functionala a speciei.

 Ca urmare, numarul cromozomilor nu este un

criteriu taxonomic de stabilire a pozitiei
filogenetice, a gradului evolutiei biologice.

 In lumea vie sunt specii inferioare ca evolutie

filogenetica dar cu un numar mare de
cromozomi ( exemplu crapul are 104
cromozomi pe cand omul 46 cromozomi).
 ADN reprezinta cel mai important constituent
al cromozomilor eucariotici, in el gasindu-se
programul genetic al speciei respective.

 Informatia genetica e codificata in

macromolecula de ADN, un polimer linear care
contine milioane de nucleotide. Un milion de
nucleotide inseamna un segment de ADN cu o
lungime de 3,4X10 la puterea 5 nm, adica
0,034cm.

 In cromozomii eucariotelor, ADN-ul reprezinta

13-16 %, ARN-ul 12-13 % iar proteinele
histonice si non histonice 68-72 %.
 HISTONELE
 Sunt proteine bazice cu o mare afinitate pt
ADN prezente la toate eucariotele.

 Genele care codifica histonele au o structura

particulara ( fara introni ) si se afla localizate
pe cromozomii 1,6,12 . Se exprima in faza S a
ciclului celular, sincron cu replicarea ADN.

 La eucariote se deosebesc 5 tipuri de

histone: H1, H2A, H2B, H3, H4. Cu exceptia
H1, celelalte tipuri (in special H3,H4) au o
structura stabila, bine conservata in evolutie.
 H1 - bogata in lizina
 H2A - bogata in leucina
 H2B - bogata in serina
 H3 - bogata in arginina si cisteina
 H4 - bogata in arginina
 Au rol structural in compactarea ADN-ului in nucleu,
intrand in alcatuirea nucleozomilor, particula
fundamentala din structura fibrelor de cromatina.

 Au rol functional fiind implicate in reglarea expresiei

genelor (transcriptie).

 Acetilarea histonelor determina activarea unor gene,

metilarea lor produce represie genica iar fosforilarea
lui H1 provoaca condensarea fibrilelor de cromatina
interfazica in cromozomi si declanseaza mitoza.

 Experimental s-a demonstrat ca histonele

stabilizeaza dublul helix si inhiba sinteza ARN.
 NON HISTONELE
 Sunt proteine acide si neutre, heterogene si putin
abundente ( exceptie face grupul proteinelor HMG- “
high mobility group”).

 Majoritatea au rol functional intervenind specific in

reglarea activitatii genelor ( ex. HMG participa se
pare la reglarea replicarii ADN).

 Unele au rol structural formand matricea

cromozomilor.
 Moleculele de ADN si histonele sufera spiralizari
succesive alcatuind un sistem ierarhizat de fibre de
cromatina.

 La inceputul diviziunii, fibrele de cromatina se

spiralizeaza si se condenseaza suplimentar formand
cromozomii. La sfarsitul diviziunii, acestia se
despiralizeaza si persista in interfaza sub forma
filamentelor de cromatina.

 Deci, cromatina si cromozomii sunt doua modalitati

diferite de organizare morfofunctionala a
materialului genetic in interfaza si diviziune
 CROMATINA
 Asocierea dintre ADN si proteine se numeste
cromatina.
 Prezinta diferite grade de condensare si se prezinta
sub doua tipuri morfofunctionale distincte :
eucromatina si heterocromatina ( clasificare facuta
de E.Heitz in 1928).
Eucromatina:
 este putin condensata si slab colorata
 prezinta mult ADN nerepetitiv bogat in perechi de
baze G-C si proteine nonhistonice
 reprezinta partea activa genetic a cromatinei
 se replica precoce la inceputul fazei S
 alcatuieste benzile R din cromozomi
 Heterocromatina

 este puternic condensata si intens colorata

 prezinta ADN repetitiv bogat in A-T si histone

 desi inactiva genetic indeplineste anumite functii

celulare precum : stabilizeaza centromerul si
telomerele cromozomului, intervine in desfasurarea
meiozei ( in sinapsa cromozomilor omologi ) si
probabil in diferentierea celulara

 este de doua feluri : constitutiva si facultativa

(clasificare facuta de S.Brown in 1975).
 Heterocromatina constitutiva
- Se gaseste constant sub forma condensata

- Nu contine gene functionale si este formata din ADN

inalt repetitiv ( ADN satelit)

- Se gaseste in regiunea centromerului, pe bratul lung

al cromozomului Y, pe bratele scurte ale
cromozomilor acrocentrici si in constrictiile
secundare

- Alcatuieste benzile C din cromozomi

 Heterocromatina facultativa

- Variaza la celule / organisme diferite: in unele

celule, anumite parti sau gene din cromozomi
pot fi active, in alte celule, aceleasi structuri
pot sa nu functioneze fiind sub forma de
heterocromatina

- Aceasta heterocromatinizare poate fi limitata

la un anumit segment din cromozom sau
poate cuprinde tot cromozomul ( exemplu
tipic la sexul feminin cand unul din cei doi
cromozomi X este inactiv formand
corpusculul sexual X).
 NUCLEOZOMUL

 Primul nivel de organizare supramoleculara a ADN

(structura primara a cromozomului) este filamentul
cu nucleozomi cu diametrul de 11 nm.

 Nucleozomul (super helixul cromatinian) este

alcatuit dintr-o secventa de ADN (de 146 pb) care se
infasoara de aproximativ doua rotatii complete ( 1 tur
si ¾) in jurul unui miez histonic format din 8 histone
(cate 2 molecule din H2A, H2B, H3, H4).
 Nucleozomii sunt legati intre ei printr-un segment de
ADN liber ( 60 pb) formand un filament asemanator
unui “sirag de margele”. Aceasta structura
(mentinuta strans de histona H1 care leaga doi
nucleozomi vecini) realizeaza o impachetare a ADN-
ului de circa 10 ori.

 Dimensiunile nucleozomilor depind de organism,

tesut sau de starea de activitate a genomului celular
( exemplu : cand ADN-ul se replica, nucleozomii se
deschid pentru ca informatia genetica sa devina
accesibila ).
 Nucleozomul contine cantitati aproximativ egale de
ADN si histone. Masa moleculara a nucleosomului
este de cca 262 000 de daltoni, fiind alcatuita astfel :
H1 = 24000
H2A X 2 = 28000
H2B X 2 = 28000
H3 X 2 = 30000
H4 X 2 = 22000
Deci in total histonele reprezinta 132000 de daltoni si
ADN diferenta de 130000 de daltoni ( cca 200 pb).
 SOLENOIDUL
 Este al doilea nivel de organizare ( structura
secundara sau super-super-helixul) sau fibra de
cromatina de 30 nm.
 Acesta rezulta prin spiralizarea filamentului cu
nucleozomi. Aceasta structura ( cu pasul de 6
nucleozomi) este stabilizata de histona H1 si
realizeaza o compactare de 5 ori.
 In solenoid zonele spiralizate alterneaza cu zone
nespiralizate unde se pot fixa o serie de proteine
specifice. Totodata prin aceasta noua spiralizare,
diferite regiuni care pe ADN-ul liniar se aflau la
distanta, sunt apropiate favorizand interactiunile
genice.
 BUCLA CROMOZOMICA

 Este al treilea nivel de organizare ( structura tertiara a

cromozomului) care rezulta prin plierea fibrei de
cromatina de 30 nm in bucle laterale de lungimi
diferite ( 20-100 Kb), formandu-se fibra cu diametrul
de 300 nm.

 Buclele au o dispozitie helicoidala fiind dispuse in

rozete hexametrice.

 Dispunerea bucleiforma a fibrei polisolenoidice si

conservarea buclelor in cromozomii metafazici sunt
determinate de prezenta proteinelor non histonice
Sc1 si Sc2 ( scaffold”)

 Se considera ca fiecare bucla ar putea fi o unitate

functionala, de transcriptie si replicare.
 STRUCTURA CUATERNARA

 Este al patrulea nivel de organizare a cromozomilor

la eucariote

 Dupa dispozitia bucleiforma a fibrei nucleoproteice

urmeaza un proces de hipercondensare a ADN-ului.

 Prin spiralizarea fibrei de 300 nm, care are loc in

interfaza, ia nastere fibra de 700 nm care corespunde
diametrului unei cromatide.

 Fiecare cromatida contine o singura molecula de

ADN.
 Buclele anterior descrise se vor rasuci suplimentar
in metafaza. Intr-o rasucire de 360 apar aproximativ
30 de rozete hexametrice avand drept corespondent
banda G de pe cromozomii umani.

 Numarul de rasuciri complete depinde de cantitatea

de ADN/cromozom ( ex. la cr 1 ar fi intre 29-33 de
asemenea rotatii).

 In procesele de rasucire participa in jur de 30 de

proteine non histonice HMG, MARs ( matrix
associated regions) sau SARs ( scaffold associated
regions). Astfel molecula de ADN sufera o
compactare de 10000 ori.
NUCLEOZOMUL
 CROMOZOMII B
 Sunt numiti si cromozomi aditionali
complementului normal de cromozomi
(cromozomi supranumerari)
 Au fost identificati la peste 1000 specii de plante
si 260 specii de animale
 Indivizii care au cromozomi B nu se deosebesc
fenotipic de indivizii conspecifici lipsiti de
prezenta acestor cromozomi
 Se numesc B, deoarece prezenta lor nu este
indispensabila pentru cresterea, dezvoltarea si
reproducerea normala a organismelor
Caracteristicile cromozomilor B
 Morfologie diferita in comparatie cu cromozomii
A (cromozomi esentiali)
 Talie foarte mica
 Contin o cantitate mai mare de heterocromatina
constitutiva
 Nu sunt omologi cu cromozomii A normali si nu
se cupleaza cu acestia in timpul meiozei sau
mitozei
 Se mostenesc nemendelian la descendenti
 Nu contin gene indispensabile dezvoltarii si
activitatii celulare
 Efectul lor este cumulativ
 Ca origine, provin din cromozomii A care au
suferit o serie de deletii repetate, ce au dus la
vidarea de ADN a cromozomului initial si
reducerea considerabila a talie
 Datorita transmiterii nemendeliene, nr.
cromozomilor B variaza intre indivizii conspecifici
( uneori se constata ca un individ poate prezenta
mai multe populatii celulare care difera intre ele
prin numarul de cromozomi B).
Replicarea cromozomilor umani
 In 1957 Taylor a demostrat ca in stadiul S
interfazic , cromozomii se replica conservativ

 Replicarea cromozomilor este legata direct de

replicarea semiconservativa a ADN-ului si de
dublarea cantitatii de histone

 Exista mai multe metode: Taylor ( 1957, folosiind

timidina tritiata; substanta radioactiva ); Dutrilaux
si Latt ( 1973, folosiind 5-brom-dezoxiuridina,
BrdU)
 Experimentul Taylor
 Se cultiva plante de Vicia Faba in mediu “cald”
bogat in timidina tritiata, timp de 8 ore (timp
necesar pentru o replicare)
 Aceasta v-a fi incorporata in ADN-ul cromozomial
in cursul replicarii acestuia
 Se scot plantele din mediul radioactiv; se
recolteaza un esantion si se cultiva inca 8 ore pe
un mediu “rece” lipsit de precursori radioactivi
 Esantionul recoltat ( generatia nr. 1) se trateaza cu
colchicina si se face analiza autoradiografica a
cromozomilor
 Dupa introducerea in mediul rece, la fiecare 8 ore
se recolteaza si se examineaza cite 1 esantion
(generatiile nr.2 si 3)
 Concluzii
 Primul esantion:
- toate metafazele marcate
- toti cromozomiii din placa metafazica prezinta ambele
cromatide marcate cu timidina tritiata
 Al doilea esantion:
- toate metafazele marcate
- toti cromozomi marcati,prezentand o cromatida marcata si
una nemarcata
 Al treilea esantion:
- 1/2 din cromozomi marcati si 1/2 nemarcati
- cromozomii marcati au o cromatida marcata si una
nemarcata
Aceste rezultate sunt posibile doar daca replicarea
cromozomilor este semiconservativa ca si replicarea
ADN-ului
 Analiza cromozomilor
 Metode citogenetice de rutina: folosesc culturi de limfocite
din sangele periferic ( este produsul cel mai accesibil
pentru studiu)

 Metode speciale: folosesc culturi din alte tipuri celulare

(maduva osoasa, fibroblaste obtinute prin biopsii de piele,
celule fetale recoltate prin amniocenteza sau biopsie de
trofoblast). Dezavantaj: prelevare mai dificila si timp mai
lung de cultura

 Metode directe (fara cultura): se aplica in anumite situatii

tesuturilor care se divid activ (maduva osoasa in leucemii,
tumori solide, vilozitati coriale). Avantaj: rezultat rapid (3-
12 ore). Dezavantaj: nr. metafazelor e variabil si calitatea
cromozomilor este mediocra
 Tehnici de analiza cromozomiala

 Tehnici de generatia I (1956):

- cromozomii obtinuti sunt uniform colorati

- au putine repere pentru identificarea lor

- tehnica e limitata la diagnosticul aneuploidiilor si

mozaicurilor cromozomiale, a situsurilor fragile,
a rupturilor si polimorfismului cromozomial
 Tehnici de generatia II
 Sunt tehnici de bandare a cromozomilor
metafazici (bandare G,Q,R,T,C,N)
 Folosiind o serie de tratamente si coloratii
speciale a ADN-ului se vizualizeaza pe
cromozomi o serie de benzi alternative, intens si
slab colorate
 Se evidentiaza ~ 300-400 de benzi pentru un set
haploid de cromozomi metafazici
 Permit identificarea precisa a fiecarui cromozom
precum si caracterizarea majoritatii anomaliilor
cromozomiale
 Tehnici de generatia III
 Sunt tehnici de inalta rezolutie
 Studiaza cromozomii in primele faze ale
diviziunii cind sunt mai putin condensati
 Se obtin intre 650-850 de benzi corespunzatoare
prometafazei sau profazei
 Fiecare banda corespunde la 20-30 de gene,
aceasta fiind limita maxima de rezolutie in
analiza citogenetica conventionala
 Nu este o tehnica de rutina, se efectueaza cind
exista suspiciunea de modificari mici (ex.
Microdeletii)
 Tehnici de generatia IV (1991)
 Sunt tehnici de citogenetica moleculara

 Folosesc “sonde” de ADN monocatenar,

specifice unui anumit cromozom, regiuni
cromozomice sau a unor gene cu
localizare cunoscuta

 Sondele se fixeaza (hibridizeaza) prin

complementaritate in aceste situsuri tinta
 Pentru a fi evidentiate dupa hibridizare, sondele
sunt marcate cu fluorocrom (vizibil la
microscopul cu lumina UV)

 De aceea tehnica se numeste “hibridizare

fluorescenta in situ” sau FISH (Fluorescence In
Situ Hybridization)

 FISH e o metoda performanta avand rezolutia

de citeva megabaze, dar este dificila si
scumpa.Se foloseste pentru suspiciunea de
translocatii criptice, deletii telomerice si unele
microdeletii/microduplicatii