STRUCTUR ACIZI NUCLEICI

Curs general
Moleculele vieii
Viata depinde de stocarea stabila i compacta a informaiei
genetice ; Activitatile moleculelor celulare sunt guvernate de
principiile de baza ale chimiei; Apa celular, ionii anorganici, i
mici molecule organice reprezint aproximativ 75-80% din
greutatea celulei vii; Macromoleculele (proteine, polizaharide,
ADN) reprezinta restul.
Celule Procariote
Organisme unicelulare
Dou tipuri pricipale: bacterii i archaea
Relaii structurale simple
Celule eucariote
Organisme unicelulare i multicelulare
Plante i animale
Structural mult mai complexe: organite, citoschelet...
Structura celulei animale
Structura celulei vegetale
Complexitatea
structural a
organismului uman
Nucleul
Separ: ADN de citosol; transcriptia de translaie
Caracteristici: - membrana extern; membrana intern; porii
nucleari; nucleoli
La Eucariote ADN este mpachetat n cromozomi
Fiecare cromozom conine o
singur molecul linear de ADN
asociat cu proteinele.
Intregul ADN compactat n
cromozomii unui organism este
localizat n genom. Secvenierea i
alte tehnici au evideniat c peste
90% din genomul vertebratelor nu
codific pentru ARNm sau alte tipuri
de ARN. La organismele
multicelulare acest ADN conine
multe regiuni care sunt similare dar
nu identice.
Imagine de cromozomi n metafaz
evideniai prin tehnica fluorescent de
hibridizare in situ (FISH)
Acizii nucleici
Acizii nucleici sunt substane care au fost pentru prima dat
izolate
din nucleii celulelor. Exist acizi nucleici i n citoplasma celulelor.
Dou tipuri de acizi nucleici:
ADN (acid dezoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul
celulelor (cnd acesta este individualizat) ca n cazul eucariotelor);
ARN (acizi ribonucleici), prezeni n principal n citoplasma
celulelor dar i n nucleu.
Acizii nucleici ADNi ARN au rol esenial n sinteza proteinelor,
compui fundamentali ai celulei, suportul marii majoriti a activitilor
biologice.
ADN este suportul ereditii;
ARN reprezint acidul nucleic care permite sinteza proteic
Structuri generale macromolecule
Toi acizii nucleici au o structur general comun
Principalele cinci baze
din structura acizilor
nucleici
A, G, T, C sunt prezente n ADN
A, G, U, C sunt prezente n ARN
Structurile ceto-enol ale bazelor azotate
Forele de stivuire
Stivuirea inelelor de
adenin din cristalul 9-metil-
adenin.
Suprapunerea parial a
inelelor reprezint o asociere
tipic a bazelor n structuri
cristaline i n dubla elice a
acizilor nucleici
Terminologie nucleozide
Baze azotate Ribonucleozide Dezoxiribonucleozide
Nume S/3L Nume S/3L S/1L Nume S/3L S/1L
Baze Pyr
Pirimidinice
nuclozide Pyd Y
Pirimidinice
2dezoxiribonucleozide dPyd dY/Yd
pirimidinice
Citozin Cyt Citidin Cyd C 2.dezoxicitidina dCyd dC/Cd
Uracil Ura Uridin Urd U 2-dezoxiuridina dUrd dU/Ud
Timin Thy Ribozil-timin Thd T (2-dezoxi)timina dThd dT/Td
Baze Purinice Pur

nucleozide Puo R
Purinice
2dezoxiribonucleozide dPuo dR/Rd
purinice
Adenina Ade Adenozina Ado A 2-dezoxiadenozina dAdo dA/Ad
Guanina Gua Guanozina Guo G 2-dezoxiguanozina dGuo dG/Gd
Xantina Xan Xantozina Xao X 2-dezoxixantozina dXao dX/Xd
Hipoxantina Hyp Inozina Ino I
Conformaia nucleozidelor
Conformaie C3-endo
Conformaie C2-endo
conformaie
envelope
conformaie twist
Izomeri de rotaie n jurul legturii glicozidice
Orientrile sterice permise bazelor purinice i pirimidinice n raport cu
ataarea lor la unitatea ribozic
Terminologie general nucleotide
Nume Simboluri
Nucleozid x- fosfat Nuc-5P NMP
x- difosfat Nuc-5PP NDP
x- trifosfat Nuc-5PPP NTP
Citidin 5- fosfat Cyd 5.P CMP
5- difosfat Cyd - 5PP CDP
5- trifosfat Cyd - 5PPP CTP
Uridin 5- fosfat Urd - 5P UMP
5- difosfat Urd - 5PP UDP
5- trifosfat Urd - 5PPP UTP
dtimin 5- fosfat dThd - 5P dTMP
5- difosfat dThd - 5PP dTDP
5- trifosfat dThd - 5PPP dTTP
Adenozin 5- fosfat Ado 5 P AMP
5- difosfat Ado - 5PP ADP
5- trifosfat Ado - 5PPP ATP
Guanozin 5- fosfat Guo - 5P GMP
5- difosfat Guo - 5PP GDP
5- trifosfat Guo - 5PPP GTP
Structura
general
nucleotide
Conformaia unei uniti nucleotidice
este determinat de apte unghiuri de
torsiune
Structura ATP
Complexul ATP-magneziu
Complexul ATP-magneziu
cAMP
UDP-glucoza
S-adenozilmetionina (SAM)
Reactii de transfer de grupari metil
Acetil-CoA
Acetil CoA
NAD(P)
+
NAD
+

NADP
+
FAD
Constituenii ADN i ARN


Acid
nucleic


Pentoza

NMP majore


NMP
minore
Pyr

Pur


ARN


D-riboza

U

A

Foarte
diverse
ARNt
C

G


ADN


2-deoxi
D-riboza

dT

dA

Derivai
metilai ai
A i C
dC

dG
Structura general a acizilor nucleici
Formarea legturilor
fosfodiester
ADN-dublu helix format din catene complementare
Informaia genetic este
purtat de molecule de ADN foarte
lungi, i codificat n secvena linear
de nucleotide A, T, C i G ;
Molecula de ADN, n form
de dubl elice, compus dintr-o
pereche de catene complementare
formate din nucleotide care sunt
meninute mpreun prin legturi de
hidrogen care se realizeaz ntre
perechile de baze G-C i A-T ;
Tipuri de legturi de hidrogen (I)
mperecheri tip Watson-Crick
Alte tipuri de mperecheri
mprechere de adenine n
structura cristalului de 9-
metil-adenin
mperecheri Hoogsteen
ntre A i T
mperechere ipotetic
ntre C i T
Tipuri de legturi de hidrogen (II)
Tipuri de legturi de hidrogen (III)
Tipuri de legturi de hidrogen (IV)
ADN - dublu helix format din catene antiparalele
Fiecare caten de ADN posed o polaritate chimic datorat legturii
dintre glucide i gruprile fosfat, care alterneaz la nivelul scheletului.
Cele dou catene ale unei molecule
de ADN sunt antiparalele, adic posed
orientare invers;
Fiecare din cele dou catene pot
servi ca matri pentru sinteza celeilalte
catene.
Astfel, aceeai informaie genetic
este purtata de cele dou catene care
formeaz dubla elice.
Dublul Helix
caracteistici structurale
Structura ADN B
Imaginea se bazeaz pe
studiile cu raze X realizate
pe dodecamerul
d(CGCGAATTCGCG)
Structura ADN B
Vedere pertenticular pe axa helixului. n schem legturile fosforice sunt marcate n
albastru iar bazele n rou. Sint marcate n alb bazele, legturile fosfodiester i legturile de hidrogen
dintre dou baze.
Vedere de-a lungul axei helixului
Caracteristicile conformaiilor elicei ADN
Caracteristici Conformaie B Conformaie A Conformaie Z
Sens de rsucire drept drept stng
Numr pb/tur 10,4 (10,0-10,7) 11 12 (6 dinucleotide)
Pasul (nlinea pe
ax)/pe plan de baze
3,4nm
0,34 nm
2,8 nm
0,26 nm
4,5 nm
0,37 nm
nclinare baze fa de
ax/rotaia planului
bazelor
1
0
36
0
20
0
33
0
9
0
-60
0
/dinucleotid
Diametru 2 nm 2,3 nm 1,8 nm
conformaii
dPyd:pentoz
legtura glicozidic
2
E
anti
3
E
anti
2
E
anti
dPuo: pentoz
legtura glicozidic
2
E
anti
3
E
anti
2
E
syn
Fosa: mare
mic
Mare i profund
ngust i
profund
ngust i profund
Mare i profund
-
ngust i profund
Structura ADN A
Vedere de-a lungul axei helixului
Structura ADN A
Vedere perpenticular pe axa helixului
Structura ADN Z
Vedere de-a lungul axei helixului
Structura ADN Z
Vedere perpenticular pe axa helixului
Trecerea ADN B n ADN Z
Trecerea ADN-B n ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implic
rsucirea cu 1800 a fiecrei perechi de baze n raport cu lanul oz-fosfat
ADN sufer separri reversibile ale catenelor
Metode de determinare a mrimii acizilor nucleici
Metodele de determinare a dimensiunilor
acestor macromolecule se bazeaz pe
diferite caracteristici. Mrimea poate fi
determinat prin mai multe metode:
Microscopie electronic: datorit
dimensiunilor lor acizii nucleici pot
vizualizai prin aceast tehnic. Metoda se
potrivete foarte bine moleculelor de ADN
de mrime medie (cteva mii la 200 000
pb)
Electroforeza n gel:
Este o tehnic de separare a moleculelor n funcie de masa lor molecular.
Condiiile de densitate de sarcin asemntoare sunt realizate n mod natural, de ctre
scheletul oz-fosfat. De asemenea, dependena logaritmic, distan de migrare n
funcie de mrime, este bine respectat. Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici
de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroz cu poroziti variate (Figura 2.2).
Pentru facilitarea estimrilor cantitative exist colecii de polimeri marcheri de mas
molecular utilizai pentru etalonarea separrilor. De altfel, aceast metod de separare
este omniprezent n manipulrile de biologie molecular. Electroforeza se poate
realiza i n geluri de poliacrilamid pentru situaiile n care este necesar separarea
moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor. Prin electroforeza n gel de
poliacrilamid este posibil identificarea unor fragmente care difer numai printr-un
singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte util n secvenializarea acizilor
nucleici i n determinarea regiunilor de polimorfism normal sau patologic determinat
de existena unor mutaii.
Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat cu cea
a unei proteine fibroase, colagenul, i celulele procariote i eucariote.
ADN/particule/
organisme
n de baze
(kb)
Mas
(MDa)
Lungime
(nm)

(nm)
numr de
cromoz
omi
Virusuri ADN
SV40
fag X174
fag
5,2
5,4
48
3,2
3,6
32
1,7x10
-3
(1,7m)
1,8x10
-3
(1,8 m)
17x10
-3
(17 m)
2
2
2
Procariote
E. coli
4000 2600 1,36 2 1
Eucariote
Drosofila
Om
62 000
125 000
41000
80 000
21
41
2
2
2x4
2x23
Colagen 3x1000
amino
acizi
0,33 0,3x10
-3
(0,3 m) 1,5
Celule
Bacteria E. coli
Mamifere
2x10
-3
(0,5x2 m)
aprox 10x10
-3
(10 m)
Moleculele ADN de mrime mare sunt analizate i prin:

a) metoda clasic de ultracentrifugare cu toate c forele de
frecare existente ntre aceste molecule limiteaz cmpul aplicaiilor
(molecule de pn la 1,5 x 106 pb); Prin aceast tehnic pot fi
separate, n gradient de densitate de clorur de cesiu, urmtoarele: i)
fragmente de ADN care au un coninut diferit n guanin i citozin;
ii) ADN genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv) ARN total, etc.
Diferitele tipuri de ARN ribozomal de la eucariote i procariote
poate fi separat foarte simplu prin ultracentrifugare n gradient de
zaharoz
Separarea acizilor
nucleici prin
ultracentrifugare: a)
Separare ADN prin
ultracentrifugare n
gradient de CsCl; b)
separare ARN prin
ultracentrifugare n
gradient de zaharoz
Electroforez n cmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b)
electroforegram obinut n urma separrii unor fragmente
mari de ADN. Vizualizarea a fost realizat n urma colorrii cu
bromur de etidium.
Polimerizarea nucleotidic
Structura unei molecule ARN:
a) evidenierea nlnuirii
nucleotidelor i vectorizarea catenei;
b) reprezentrile prescurtat i
simbolic.
Hidroliza acizilor nucleici
Degradarea unui polinucleotid poate s se refere la: i) legtura
fosfodiester atunci cnd se produce o depolimerizare; ii) unitile nucleotidice
dac se rupe legtura glicozidic i se degradeaz componentele. n ambele cazuri
hidroliza poate fi de natur chimic sau enzimatic.
Hidroliza chimic a acizilor nucleici
Tratamentul acid afecteaz la fel ARN i ADN:
Comportamentul ARN i ADN la hidroliz bazic este foarte diferit:
Condiii Produi de hidroliz
ARN ADN
Acide
pH 1,0 + nclzire
pH 4,0
pentoze + fosfai + baze
baze purinice + AN apurinici
Alcaline NMP (2 sau 3) -
Produii de degradare chimic a acizilor nucleici
Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic: 1. Hidroxilul din
2 este deprotonat de ctre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atac
gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2: 3; 3. Un al doilea
hidroxid provoac hidroliza uneia sau alteia dintre legturile ester: se obin
izomeri 2 i 3 fosfat.
Scindarea enzimatic
Enzimele care catalizeaz hidroliza legturii fosfodiester din structura acizilor nucleici,
fosfodiesterazele, sunt numite i nucleaze. Acestea sunt prezente n toate celulele i sunt foarte
utile n metabolismul acizilor nucleici i proteinelor. O parte dintre a ceste nucleaze sunt
secretate de ctre pancreasul exocrin, n intestin, i particip direct la digestie hranei. Aceste
enzime prezint niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor i proteazelor.
Ele se pot clasifica n funcie de:
a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care acioneaz la
nivelul extremitii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atac n interiorul catenelor;
b) specificitatea lor fa de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze
pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN i nucleaze pentru ambele; ii) pentru tipul de
structur: mono- sau dublu catenar;
c) specificitatea lor de recunoatere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii)
specificitate pentru secvene;
d) tipul de rupere a legturii fosfodiester: i) exonucleazele i endonucleazele de tip d
scindeaz extremitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; ii) exonucleazele i endonucleazele
de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (Figura 2.8);
Scindarea
enzimatic
Nucleaze Substrate
1
Tietur
tip
2
; specificitate
Produi
Exonucleaze
fosfodiesteraza (venin de arpe) ARN, ADN
s
p
extremitatea 3
5-NMP
fosfodiesteraza (splin) ARN, ADN
s
d
extremitatea 5
3-NMP
exonucleaza I (E. coli) AND p
extremitatea 3
5-NMP
exonucleaza III (E. coli) AND p
extremitatea 3
5NMP+ADNs
Endonucleaze
endonucleaza S1 (Aspergillus
oryzae)
ARN,ADN
s,d
p
aleatoare
5-NMP +ON n 5
P
ribonucleaz T1 (Aspergillus
oryzae)
ARN s p
G/N
5-NMP +ON n 3
P
ribonucleaza A (pancreas) ARN s d-Pyr/N 3-NMP +ON n 3
P
Deoxiribonucleaza II (timus) ADN s d sPyr/dPur ON n 3 P
Exemple de enzime de
restricie i situsurile
recunoscute de acestea
Exemple de enzime de restricie i palindroamele recunoscute de
acestea cu marcarea situsurilor de clivare i a axei de simetrie: a)
obinerea de capete coezive; b) obinerea de capete drepte
Endonucleaza (sursa) Numr de situsuri de tiere
Virus SV40 fag X174 fag
EcoRI (E. coli RY13) 1 0 5
BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 1 0 5
HaeIII (Haemophilus aegypticus) 19 11 >50
Metode spectrofotometrice
Determinarea absorbiei n ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru
permite verificarea puritii unei soluii de ADN sau ARN. n urma determinrii
densitii optice se va obine un pic la 260 nm. Pentru estimarea puritii este necesar
calcularea raportului densitilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie
s fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o
contaminare cu ARN. Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270
nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dac ADN i ARN sunt puri, cantitatea
poate fi apreciat astfel:
unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenar
unitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN
Utilizarea de mini-gelulri
Determinarea secvenei primare a acizilor nucleici
Metoda chimic Maxam W. Gilbert
Metoda dideoxi a lui F. Sanger
Sinteza n faz solid a catenelor unui
polinucleotid prin metoda fosforamidiilor
Denaturarea
ADN
Msurarea absorbiei moleculelor denaturate
Determinarea Tm
Analiza denaturrii ADN
Renaturarea
ADN
Estimarea absorbanei n funcie de structur i
temperatur
Absorbana relativ a ADN monocatenar i bicatenar
Estimarea denaturarii termice
Electroforeza i autoradiografia ADN
Ultracentrifugarea
Ecuaiile Svedberg
Ultracentrifugarea ADN n gradient de CsCl
Ultracentrifugarea ARN n gradient de sucroz
Enzime de restricie
Super-helixurile ADN
Linking number
Writhing number
Forme suprarsucite
Structuri topoizomere
Topoizomeri i
topoizomeraze
Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA
evideniaz existena mai multor topoizomeri
cu un numr diferit de suprarsuciri
Rolul topoizomerazelor n replicarea ADN
Moleculele de ADN se pot ndoi i ncolci n
spaiu conducnd la modificri de topologie cum ar
fi formarea supra-rsucirilor
Topoizomerazele sunt enzime care controleaz
topologia ADN i realizeaz etape eseniale n
diferite etape ale replicrii avnd drept rezultat
nlturarea constrngerilor.
Topoizomeraze
Topoizomeraza de tip I relaxeaz ADN prin inducerea de
tieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN
Topoizomeraza de tip II modific topologia ADN prin
scindarea si resudarea ambelor catene
Mecanism topoizomeraze

Modelul activitii catalitice a topoizomerazei II (ADN
giraza) din E. coli
ADN giraza nltur super-rsuricirile pozitive care apar n
mod normal la nivelul furcii de replicare
Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este
realizat de topoizomeraza de tip II
Topoizomeraza de tip II separ
cromatidele lineare surori
Discuii
De ce T n ADN i U n ARN
De ce deoxiriboz n ADN i riboz n ARN
De ce 2 helixuri (catene ) n ADN i una n ARN
ADN de la diferite organisme:
Virusurile
Procariotele
Eucariotele
ADN din mitocondrii (ADNmt)
Tipuri de legturi de hidrogen care sunt
specifice structurii secundare a ARN
Tipuri de baze
modificate
prezente n
structura acizilor
nucleici
Structura ARN de transport: a) Motivele elementare
de structur 2-D; b) Structura teriar n form de L.
Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de
tip 16S: a) la archebacterii; b) eucariote, drojdii; c)
mitocondrie de mamifer (bovine)
Structura ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide
bazat pe compararea secvenelor de la diferite tulpini (se
presupune ca aceasta structura este conservata evolutiv)
Sinteza moleculelor de
ARNm: a) transcripia ARNm
policistronic la procariote; b)
transcripia i maturarea
ARNm la eucariote; ARN
transcris de la nivelul unei
uniti complexe (albastru)
poate fi procesat pe mai multe
ci pentru a conduce la unul sau
la mai multe uniti ARNm
monocistronice funcionale.
Liniile punctate marchez
nlturarea intronilor.
Moleculele de ADN ARN posed conformaii diferite
Inversiunile repetitive formeaz structuri foldback
Schema unei molecule de ARNt ncrcat: a) schema general
a structurii secundare a moleculei; b) modul de formare a
legturii ntre ARNt i aminoacil
Recunoasterea
codon
anticodon
Tipuri de molecule de
ARNt. Sunt marcate
elementele de identitate
majore n cele patru tipuri.
Fiecare baz din structura
ARNt este reprezentat de
cercuri pline. Cercurile
roii indic poziiile
identice pentru
recunoaterea ARNt de
ctre aminoacil-ARNt
sintetaz. Bazele din
structura anticodonului
care reprezint elemente de
identificare sunt subliniate.
Diferitele tipuri de ARN
Moleculele de ARN mesager
Moleculele de ARN de transfer: structura secundar sub
form de frunz de trefl; structura teriar 3-D n L a
moleculelor ARNt
Moleculele de ARN ribozomal; particulele ribozomale
Ribozimele
Moleculele snARN

Comparaie ARNm la procariote i eucariote
Procariote: operonii
bacterieni ARNm este
policistronic; Eucariote:
ARNm este monocistronic i
conine exoni i introni.
Exemple de structuri adoptate de ARNr
Structura ribozomilor la procariote & eucariote
Structura general a ARNt
Exemple de molecule ARNsn
Structura cap de ciocan a unei ribozime
ADN mitocondrial i din cloroplaste
Se consider c mitocondriile au evoluat din bacterii care prezint o relaie
simbiotic cu celulele ancestrale care conin un nucleu eucariot. Majoritatea genelor
originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear n timpul evoluiei,
pstrnd diferite gene n organitele diferitelor organisme;
ADNmt de la mamifere conine numai aprox 16 kb; acesta nu conine introni i
prezint numai o mic regiune necodant. ADNmt de la plante i drojdii este mult mai
mare. Toate tipurile de ADNmt codific pentru ARNr, ARNt i pentru cteva proteine
implicate n transportul mitocondrial al electronilor i n sinteza ATP;
Majoritatea ADNmt este motenit mai degrab din ou (ovul) dect din sperm,
mutaiile n ADNmt fiind motenite pe linie matern;
Ribozomii mitocondriali se aseamn cu ribozomii bacterieni ca structur,
sensibilitate la cloramfenicol i rezisten la cicloheximid;
Codul genetic pentru ADNmt de la animale i fungi difer de cel bacterian i
de cel al genomului nuclear prin aceea c numeroi codoni codific pentru aminoacizi
sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par s foloseasc codul standard
nuclear i bacterian;
Mutaiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil
datorit necesitii crescute de ATP a acestor esuturi. n general pacienii prezint un
amestec de mitocondrii care conin ADNmt normal i mutant n celule (heteroplasmie).
Severitatea fenotipic este mai mare cu ct proporia de ADNmt este mai mare;
ADN din cloroplaste este circular i conine aproximativ 120-160 kb, n
funcie de speciile de plante. Acestea codific pentru aproximativ 120 de proteine i
folosesc codul genetic standard.
ADN
mitocondrial
uman