STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

Dup provenienta lor, respectiv dup materialele din care au fost extrasi, acizii nucleici erau considerati de dou tipuri: acizi timonucleici (acizi nucleici animali) acizi zimonucleici (acizi nucleici vegetali). Ulterior denumirile lor au fost nlocuite cu denumirile de: acizi dezoxiribonucleici (ADN) acizi ribonucleici (ARN).

Secvente: - oligonucleotidice - polinucleotidice ( acizii nucleici) Unitatea de structura a acizilor nucleici este NUCLEOTIDUL alcatuit din : - baza azotata - pentoza ( zahar, glucid) - radical fosfat.

Bazele azotate - purinice : adenina(A),6-amino purina si guanina(G),2-amino-6-oxipurina - pirimidinice : citozina(C), timina(T) si uracilul(U)

Bazele azotate prezint fenomenul de tautomerie

NH2

NH2 C N N

NH C NH

NH

forma amino

forma imino

Citozina

Tautomeria=proprietatea unor substane organice izomere de a trece cu uurin una n alta, n anumite condiii , prin rearanjarea unor atomi sau grupe de atomi din molecula lor. Formele mai stabile: Forma lactam este mai stabil dect forma lactim Forma amino este mai stabil dect forma imino n acizii nucleici exist formele lactam i amino

C HN O N

C OH

forma lactam

forma lactim

Zaharul este o pentoza cu 5 atomi de C. Radicalul fosfat(P) formeaza legaturi esterice cu pentozele. ribonucleotid (ADENOZIN-5-FOSFAT)

5
dezoxiribonucleotid (DEOXIADENOZIN-5-FOSFAT)

Riboza
HO CH2
4 3 2

Dezoxiriboza
HO CH2 OH O

OH O
1

OH OH

OH

lipsete 2-OH

 Combinaia dintre o baz i o pentoz se numete nucleosid Combinaia celor trei componente nucleotid.

ribonucleotid (ADENOZIN-5-FOSFAT)

baz azotat (ADENIN)

nucleozid (ADENOZIN) dezoxiribonucleotid (DEOXIADENOZIN-5-FOSFAT)

Legtur -N-glicozidic

Att conectarea bazelor cu pentoza, ct i a nucleosidului cu acidul fosforic se realizeaz prin pierderea unei molecule de H2O.

Baza

Nucleozidul

Nucleotid

Adenina Adenozina (A) (A)

Adenozin monofosfat (AMP) sau adenilat Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP)

Terminologie Ribonucleozide/Ribonucleotide (cnd pentoza = riboz)

Baza Adenina (A) Nucleozidul Adenozina (A) Nucleotidul Adenozin monofosfat (AMP) Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP) Guanozin monofosfat (GMP) Guanozin difosfat (GDP) Guanozin trifosfat (GTP) Citidin monofosfat (CMP) Citidin difosfat (CDP) Citidin trifosfat (CTP)

Guanina (G) Guanozina (G)

Citozina (C)

Citidina (C)

Uracil (U)

Uridina (U)

Uridin monofosfat (UMP) Uridin difosfat (UDP) Uridin trifosfat (UTP)

Dezoxiribonucleotide
Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP) sau dezoxiadenilat

Dezoxiadenozin difosfat (dADP)

Dezoxiadenozin trifosfat (dATP)

Terminologie Dezoxiribo-nucleozide/nucleotide (cnd pentoza = dezoxiriboz)

Baza Adenina (A) Nucleozidul Dezoxiadenozina (A) Nucleotidul Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP) Dezoxiadenozin difosfat (dADP) Dezoxiadenozin trifosfat (dATP) Dezoxiguanozin monofosfat (dGMP) Dezoxiguanozin difosfat (dGDP) Dezoxiguanozin trifosfat (dGTP) Dezoxicitidin monofosfat (dCMP) Dezoxicitidin difosfat (dCDP) Dezoxicitidin trifosfat (dCTP) Dezoxitimidin monofosfat (dTMP) Dezoxitimidin difosfat (dTDP) Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

Guanina (G) Dezoxiguanozina (G)

Citozina (C)

Dezoxicitidina (C)

Timina (T)

Dezoxitimidina (T)

Structura primara ADN

Lantul unei catene de ADN este format prin insiruirea celor 4 tipuri de nucleotide care se unesc intre ele cu ajutorul acidului fosforic.

O HN H2N
5' end HO

Guanine
N N

Lanul polinucleotidic al ADN

ADN este un polidezoxiribonucleotid n care gruparea 3OH a unui dezoxiriobonucleotid este legat la gruparea 5OH a dezoxiriobonucleotidului vecin printr-o legtur fosfat diesteric. Lanul polinucleotidic este polar:prezint dou capete distincte. Captul 3este cel cu gruparea 3-OH liber. Captul 5este cel cu gruparea 5-OH liber sau fosforilat. Lanul polinucleotidic al ADN este ncrcat negativ la pH-ul fiziologic.

N
CH 2

NH2 N

Cytosine
O

3linkage

O O P O O
CH 2

N
O

5linkage

O P O O
H3C O

Thymine
NH

NH

O P O O

CH 2

OH 3' end

Reprezentarea simplificat a catenei de ADN

O HN H2N
5' end HO

Guanine
N N

N
CH 2

NH2 N

Cytosine
O

Prin convenie o caten de ADN se scrie n direcia 5- 3. ex. GCT nseamn 5GCT 3

O O P O O
O CH 2

N
O

O P O O
H3C O

Thymine
NH

NH

O P O O

CH 2

OH 3' end

U.M.F IAI

STRUCTURA PRIMAR ADN este un macro-polimer de dezoxiribonucleotide;

[P 5dR - N]n

Grup fosfat
(ac.ortofosforic)

Baz azotat:
Pentoz Pur A, G Pir T, C

D-2-dezoxiriboza

U.M.F IAI

Polimerizarea nucleotidelor: legturi covalente (puternice) fosfodiesterice Se formeaz o caten (lan): - continu, - linear (neramificat!) o parte "constant" (ax) fosfoglucidic (n care gruparea fosfat
alterneaz regulat cu deoxiriboza), ce formeaz axul catenei i

lateral pe "coloana vertebral" fosfoglucidic (bazele azotate de pe aceeai caten nu se leag ntre ele) Aceast caten = structura PRIMAR a ADN - ce deine informaia ereditar codificat

o parte variabil bazele azotate care se fixeaz perpendicular i

 Periodiocitate celor 4 nucleotide, adica o ordonare regulata:

A-T-G-C-A-T-G-C-A-T-G-C-A.
Chargaff a demonstra prin metode fizico-chimice ordinea aperiodica a nucleotidelor din monocatena de AND : .. A-T-T-A-G-C-G-A-T-C-C-A-C-A-T.

Informaia genetic codificat = secvena (ordinea) nucleotidelor determin ordinea aminoacizilor n proteine. 5'- ATGCCTAGATCA - 3' aa1- aa2-aa3- aa4

alfabet nucleic = patru "litere": A, T, G, C

"cuvinte" de trei litere = triplet sau codon aminoacid

ATG Met asamblate ntr-o "fraz" = o gen = unitatea de informaie genetic; secvena nucleotide secvena AA n protein.
ATG TGT AAA CCA Met cis lys pro

Structura secundara ADN

Bazele azotate se leaga complementar : A-T si G-C (formand un cuplu sau o pereche de baze pb).

Analizele chimice ale ADN au dus la stabilirea regulii lui Chargaff (1951) conform careia : A+G=T+C A/T si G/C =1 si A+T/G+C este diferit de 1 si caracteristic fiecarei specii (la om e de 1,7)

Intotdeauna adenina se leaga de timina prin 2 legaturi de hidrogen si guanina se leaga de citozina prin 3 legaturi de hidrogen.

Forma clasica de ADN descrisa de Watson si Crick reprezinta tipul B. In alte conditii, duplexul de ADN se poate gasi sub alte forme structurale.

AND de tip B Diametrul este de 20 A, pasul elicei (distanta pentru o rotatie completa de 360) este de 34 A si cuprinde o spira cu 10 perechi de nucleotide. Deci distanta dintre 2 nucleotide este de 3,4 A.

In configuratia ei spatiala, molecula de ADN prezinta doua santuri laterale (incizuri) : unul mai mic si altul mai mare, cu rol in recunoasterea si fixarea histonelor pe ADN la nivelul santului mic sau a moleculelor proteice reglatoare la nivelul santului mare.

STRUCTURA TERTIARA ADN

AND-ul celulelor eucariote se asociaza cu proteine histonice formand nucleoproteina. Proteinele au o dispozitie discontinua la exteriorul helixului complementar.

Analiza nucleoproteinelor prin metode fizico-chimice a aratat ca :

- AND-ul constituit din doua catene complementare dispuse helicoidal, este molecula neramificata, putin rigida, prezentandu-se ca un polimer flexibil si fragil

- molecula de nucleohistona are o lungime de aproximativ 4000 nanomicroni; daca este separata histona AND-ul rezidual poate ajunge la 7000, ceea ce confirma rolul histonelor in arhitectura spatiala a moleculei de AND
- la om celula somatica cu cei 46 cromozomi contine aproximativ 7X10 la -9 mg AND=5,6X10 la 9 perechi de nucleotide. Dispozitia rectilinie a acestor nucleotide ar da un fir de AND cu lungimea de cca 2m.

ACIDUL RIBONUCLEIC (ARN)

Complex macromolecular, structural i funcional, similar n anumite privine, ADN-ului. ARN-ul rezult din polimerizarea unor ribonucleotizi, care determin formarea unor lanuri lungi, monocatenare (structur primar). Pe anumite poriuni scurte monocatena de ARN se poate rsuci n jurul ei, determinnd apariia unei structuri duble ntre secvenele complementare de baze (structur secundar).

Exista diferente nete la nivelul structurii acizilor nucleici:

Compozitia chimica a acizilor nucleici

Compus chimic

ADN

ARN

Baze azotate
a) Purinice Adeninia, Guanina Adeninia, Guanina

b) Pirimidinice

Citozina, Timina

Citozina, Uracil

Pentoza

2-Dezoxiriboza

Riboza

Acid fosforic

Radical

Radical

TIPURI DE ADN
Tipul A caracterizat printr-un helix larg, prezinta bazele azotate orientate puternic spre interior. Duplexurile hibride ADN-ARN apartin structural formei A. Tipul B reprezinta structura generala a macromoleculei de ADN in celulele active metabolic. Diferentele dintre baze sunt de obicei usor de evidentiat in scobitura principala, care reprezinta locul ADN A principal de contact pentru proteine care leaga specific secventele de ADN. Tipul Z, singurul cu rasucire la stanga, este in contrast cu forma clasica, respectiv tipul B. Este o forma compacta avand cele mai multe perechi de baze pe rotatie. Numele este dat de forma in zig-zag a catenei fosfo-glucidice.

ADN B

ADN Z

Caracteristicile moleculare ale diferitelor tipuri de ADN

Tipul de ADN

Perechi de baze/ pas elice

Rotatia pe perechi baze

Cresterea verticala pe perechi baze ()

Diametrul moleculei ()

Conformaia B: descris de Watson i Crick are orientare dreapt, pasul dublu helixului este 34 (3,4nm), diametrul de 2nm, iar nr. perechi baze per tur este 10; cea mai rspndit.
Conformaia A: dublu helix de dreapta dar mai compact, pasul elicei este de 2,8nm, nr. perechi baze per tur este 11. Conformaia Z: dublu helix de stinga, pasul elicei 4,56nm i nr. perechi baze per tur este 12.

A 11 + 34,7 2,56 23

10

+ 34,0

3,38

20

Z 12 - 30,0 5,71 18

+ = rotatie stanga; - = rotatie dreapta

TIPURI DE ADN
In genomul uman exist mai multe tipuri de ADN, diferite prin repetiia secvenelor nucleotidice: ADN nerepetitiv, (60%) este alctuit din secvene unice per genom la nivelul cromozomilor se gaseste in benzile eucromatice, la nivel genic se gaseste in exoni ADN moderat repetitiv (30 %) este alctuit din secvene scurte repetate de zeci i sute de mii de ori i dispersate n genom. Se gaseste in: elemente retrotranspozabile din clasa LINE-elemente lungi de spaiere elementele SINE- elemente mici de spatiere gene care codifica ARNr si ARNt ADN nalt repetitiv (10 % din genom) este alctuit din secvene foarte scurte repetate n tandem (), de milioane de ori; ele nu sunt transcrise. Se clasifica in: ADN satelit din regiuni heterocromatice, pericentromerice si la nivelul telomerelor ADN minisatelit cuprinde secvente polimorfe si sunt localizate la nivelul telomerelor ADN microsatelit este reprezentat de numarul repetarilor intr-un anumit locus si cel mai bine caracterizat este cromozomul Y.

TIPURI DE ARN
Exista 3 tipuri importante de ARN: ARN mesager (ARNm) ARN de transfer (ARNt)

ARN ribozomal (ARNr).

ARN MESAGER-ARNm
-reprezinta 2-4% din ARN celular, este monocatenar, spiralat este heterogen, cu masa moleculara mica -are 150-12000 nucleotide - transcris in prezenta ARN polimerazei sub forma de ARN m precursor care prin maturare trece in ARNm matur. -poarta informatia genetica ce va specifica sinteza unui lant polipeptidic -preia informatia de la ADN fiind complementar cu acesta (T U) si o duce, ca pe un mesaj, la locul sintezei proteice

ARN RIBOZOMAL-ARNr
80-85% din ARN celular are zone monocatenare alternand cu zone dublu catenare este constituentul major al ribozomilor masa moleculara mare: 106 - 104 daltoni, are la eucariote 3 forme moleculare in functie de constanta de sedimentare: 5 S ARNr 18 S ARNr 28 S ARN (in functie de specie variaza de la 25 S la 30 S) 28 S ARNr si 5 S ARNr sunt in subunitatea ribozomala 60S, pe cand 18 S ARNr in cea 80S (eucariote) intervine in construirea ribozomilor

ARNt de transfer
- 8-10% din totalul ARN, este scurt: 73 - 93 nucleotide

- fixeaza un aminoacid specific si apoi amplaseaza acest aminoacid in polipeptid folosind informatia din ARNm - modelul structurii spatiale de frunza de trifoi -transfera aminoacidul specific pe lantul polipeptidic la situsul ribozomal al sintezei proteice - are 2 situsuri : 1. o extremitate se termina cu secventa CCA- unde se va fixa aminoacidul specific; 2. a doua polaritate este bucla centrala cu o secventa de 3 nucleotide (ANTICODON), complementara codonului de pe ARNm .

In toate ARNt se imperecheaza bazele complementare dand aspectul caracteristic (structura secundara) In bucle insa bazele nu sunt complementare si deci nu pot realiza punti de hidrogen.
Structura tridimensionala tertiara face ca domeniile functionale sa fie cat de departe posibil una de alta: bucla cu anticodonul (corespunzator unui triplet de baze azotate) si trunchiul acceptor de a.a.

ARN t : - bucla 1 prezinta o secventa specifica cu rol de situs pt fixarea temporara a ARNt la ribozom in timpul sintezei proteice - bucla 4 (bucla dihidrouracilului) - bucla 3 ( bucla anticodonului) prezinta o tripleta de nucleotide (3-5) care recunoaste codonul din ARNm (5-3) cu care formeaza leg de H in timpul fixarii ARNt pe complexul ARNm-ribozom.

Metode de analiza a acizilor nucleici

Metode de analiz a acizilor nucleici: extracia i amplificarea ADN; reacia polimerizrii n lan hibridizarea polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie. secvenierea ADN

U.M.F IAI

Denaturarea i hibridizarea ADN

n condiii experimentale (tratare termic sau chimic) ruperea (desfacerea) legturilor de hidrogen = denaturare monocatene *.
monocatenele de ADN rcite lent se pot reasocia pe baza complementaritii = renaturare sau hibridizare. rcire brusc monocatene separate

U.M.F IAI

DENATURAREA I HIBRIDIZAREA ADN

Monocatenele ADN separate se pot uni, pe baz de complementaritate, cu alte monocatene de ADN sau ARN formnd hibrizi moleculari; HM folosii n diagnostic i tratament:

hibridizare ntre o monocaten de ADN

nativ i o "sond de ADN (secven de ADN obinut artificial) ce corespunde unei gene, marcat fluorescent: - hibridizarea sondei prezena semnalului prezena genei; - absena semnal = deleia genei
del

Izolarea i purificarea acizilor nucleici

In funcie de tipul de molecule de acizi nucleici i de organismul de origine au fost elaborate numeroase metode de izolare i purificare. Indiferent de metoda utilizat este necesar parcurgerea mai multor etape: obinerea (cultivarea) materialului biologic; liza celulelor pentru eliberarea acizilor nucleici; ndeprtarea componentelor celulare nedorite (resturi celulare, proteine etc); purificarea acizilor nucleici de interes; concentrarea acizilor nucleici obinui

Reacia polimerizrii n lan

PCR este reactia de copiere si amplificare a informatiei ADN. PCR const n repetarea ciclic a unui sistem de trei etape : amplificarea-denaturarea ADN dublu catenar matri care trece n form monocatenar. renaturarea (alinierea perechilor de primeri la matriele de ADN monocatenar) prin hibridizare n zona 3, la monocatene elongarea noilor catene de ADN sub aciunea ADN polimerazei. PCR prezint numeroase aplicaii clinice: diagnosticul molecular al bolilor genetice i al predispoziiilor ereditare la boli, detectarea rapid i precis a mutaiilor implicate n determinismul bolilor monogenice, diagnosticul precoce i evaluarea prognosticului bolii canceroase, depistarea infeciilor virale i bacteriene, diagnosticul prenatal efectuat pe celulele fetale prezente n sngele gravidei.

Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (RFLP)

Aceast tehnic evideniaz polimorfismele existente la nivelul situsurilor enzimelor de restricie. Tehnica RFLP, bazat pe PCR, utilizeaz o enzim de restricie pentru digerarea unui produs de amplificare, obinut cu primeri specifici, iar n gelul de agaroz se vor obine benzi de dimensiuni diferite, corespunztoare celor trei genotipuri (homozigoi pe una din cele dou alele i heterozigoi). RFLP poate fi folosit ca un marker genetic. Identificarea markerului poate ajuta la diagnosticarea unei boli genetice sau poate determina izolarea genei. Polimorfismul de restricie are importan deosebit i n criminalistic, determinarea paternitii, precum i n alctuirea harilor de restricie.

Secventierea AND
Secventializarea AND reprezinta identificarea tipului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN. Metoda Maxam-Gilbert bazata pe inducerea unor modificari chimice ale AND-ului si apoi clivarea lantului la nivelul acestor modificari. Metoda enzimatica Sanger (dideoxi) se bazeaz pe ntreruperea controlat a sintezei enzimatice a ADN, amplificat prin PCR; fragmentele sintetizate sunt separate elecroforetic O metod mult mai precis este marcarea fluorescent a fragmentelor i secvenierea automat. Fragmentele de ADN sunt migrate ntrun gel de poliacrilamid iar secveniatorul, prevzut cu un fascicul laser, excit fiecare molecul marcat i transform valorile fluorescente n secvena nucleotidica a fragmentului analizat.