Curs 13
Caracteristicile structurale ale ARN
Transcrierea (Biosinteza ARN)
Caracteristicile structurale ale ARN
Sunt produi de policondensare a
ribonucleozidtrisfosfailor
Structura primar:
H3PO4
-riboz
Baze azotate: A,G,U,C
N
O
O
5` GCA 3`
P
O
NH
5`
N
O
NH2
3`
NH2
X
O
O
P
O
CH2
3`
NH2
X
O
O
P
O
CH2
N
O
3`
3`
OH
NH
Structura secundar
ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare
Bucl cu baze
nemperechiate
Segment cu baze
complementare
Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel
de G diferit de cel n C
Rolurile diferitelor tipuri de ARN
ARNr -caracteristici structurale
conine zone dublu catenare i monocatenare
-este heterogen ca form i mrime.
-la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S
la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S
ARNr
-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic
-reprezint ~80% din ARN celular total.
Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor
Ribozomii = complexe ribonucleoproteice
ARNr + proteine
-proteinele:
au roluri catalitice sau
sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm
i aminoacil~ARNt la ribozomi
Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei
proteinelor
Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i
ARNr, n vederea sintezei proteinelor.
Conin trei situsuri:
-situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid;
-situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan
polipeptidic;
-situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt
liber.
Ribozom 70 S
ARNt
E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt
Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total
Structura ARNt (solubil sau adaptor)
conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;
raportul A+G/U+C este apropiat de 1;
prezint o conformaie n foaie de trifoi
a)
Situs de
legare aminoacid
3`
CCA
Brat T C
b)
5`
3`
5`
Perechi de baze
complementare
Bratul DHU
Brat T C
Bratul
DHU
Bratul variabil
Bucla
anticodon
Bratul anticodon
Anticodon
ARNt are cel mai mare coninut de baze minore
baze azotate modificate structural prin:
-metilri
- tiolri
-hidrogenri
dup sinteza ARNt (POST-TRANSCRIERE)
O
H3C
NH
HO H2 C
HO H2 C
O
NH
HN
O
OH OH
Ribotimidin
(T)
OH OH
Dihidrouridin
(DHU)
N
O
HO OH
4-Tiouridin
O
O
OH OH
Pseudouridin
O
N
NH
HO H2 C
HO H2 C
NH
HO H2 C
N
O
OH OH
Inozin
NH
N
Funciile ARNt
Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni
n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i
i transport, la ribozomi, sub forma
complexelor aminoacil~ARNt
Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de
pe ARNm prin
recunoaterea codon-anticodon,
pe baza complementaritii bazelor
3` A ~ aa1
C
C
5`
Anticodon 3` C C G 5`
5`
3` A ~ aa2
C
C
5`
Anticodon 3` A G U 5`
GGC
UCA
Codon 1
Codon 2
ARNm
3`
ARNm
Structur
-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;
-este sintetizat prin transcrierea catenei matri
sau template (necodificatoare).
-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic .
ADN
5` - G C A T T A T G C - 3`
3` - C G T A A T A C G - 5`
ARN
5` G C A U U A U G C 3`
-informaia depozitat n ARNm
sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni
este decodificat la nivelul ribozomilor.
ARNm procariot
este poligenic sau policistronic;
ntre gena transcris,
ARNm i
protein exist
o relaie de colinearitate
ARNm eucariot
este monogenic;
nu este relaie de colinearitate:
gen-ARNm-polipeptid
gena pentru sinteza ARNm cuprinde:
exoni (expressed regions) i
introni (intervening sequences);
ARNm matur care trec n citoplasm este
prelucrat prin excizia intronilor;
ARNm eucariot are o via de ordinul orelor
ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3
minute)
ARN nuclear de mici dimensiuni
(small nuclear RNA)
Este bogat n uridin
(U1, U2, U4, U5, U6).
se afl n nucleu, citosol i mitocondrie
prin asociere cu proteine,
genereaz ribonucleoproteine
(small nuclear ribonucleoproteins)
sau snRNP ( denumite snurps)
cu rol n:
-excizia intronilor din ARNm transcript primar;
-controlul traducerii.
TRANSCRIERE
Biosinteza ARN pe matri ADN
Transcrierea
are loc de cte ori este nevoie
n viaa unei celule
nu angajaz tot cromozomul
Transcrierea este asimetric
catena ARN se construiete numai pe una dintre catenele
ADN dublu catenar nuclear
desemnat drept caten template
matri sau
necodificatoare
Catena netranscris (codificatoare) a ADN
este identic cu ARN nou sintetizat, cu
excepia nlocuirii timinei cu uracilul
Catenele ADN vor fi catene template
(necodificatoare) pentru unele gene i catene
codificatoare pentru alte gene.
Catenele template se citesc, invariabil, n
direcia 3` 5`.
Elemente necesare transcrierii:
ADN dublu helicoidal.
Substrate: ATP, GTP, CTP, UTP
Enzime
ARN polimeraze ADN dependente
-au activitate polimerazic
-necesit caten matri
-pot iniia sinteza catenelor poliribonucleotidice
-conin Zn i necesit Mg2+
-nu au activitate de corector
-sintetizeaz ARN n direcia 5` 3`, antiparalel
catenei ADN folosit ca matri
Direcia de sintez
Direcia de cretere a lanurilor ribonucleotidice
rmne obligatoriu 5` 3`.
Reacia global catalizat de ARN polimeraz
este:
N
O
O
5` GCA 3`
P
O
NH
5`
N
O
NH2
3`
NH2
X
O
O
P
O
CH2
3`
NH2
X
O
O
P
O
CH2
N
O
3`
3`
OH
NH
Procariotele
Au o singur ARN polimeraz.
Holoenzima, este un pentamer
constituit
din:
important n elongare;
enzima miez
subunitatea adiional , proprie iniierii transcrierii.
In absena subunitii , ARN polimeraza, se leag
nespecific la ADN.
Eucariotele
ARN polimeraza mitocondrial
ARN polimerazele nucleare,
(cu sensibilitate diferit la -amanitin -octapeptid biciclic,
toxic, existent n ciupercile otrvitoare):
ARN p I, aflat n nucleoli, sintetizeaz ARNr 45S,
insensibil la -amanitin;
ARN p II, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz ARNm, i
ARN nuclear de dimensiuni mici
foarte sensibil la -amanitin;
ARN p III, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz, ARNt, ARNr
5S i ARN nuclear de dimensiuni mici
sensibil la concentraii mari de -amanitin
Unde ncepe transcrierea genei ?
Secvenele promotor (P)
secvene specifice de nucleotide, din molecula
ADN, responsabile de iniierea transcrierii
punctul de start al transcrierii, este notat cu +1.
Secvenele nucleotidice situate n amonte
(upstream), fa de punctul de start al transcrierii,
se noteaz cu (-)
Secvenele situate n aval (downstream) fa de +1
sunt notate cu (+)
Promotorii procariotelor sunt situai n amonte fa de
+1 i sunt notai cu minus
Promotorii, pentru cele mai multe gene bacteriene,
au dou secvene consens situate pe catena
codificatoare: caseta 10 (Pribnow) i caseta 35
La eucariote, fiecare ARN polimeraz,
utilizeaz promotori diferii
ARNp I utilizeaz promotori identici,
ARNp II utilizeaz o diversitate de
promotori, cu secvene consens:
caseta TATA, asemntoare casetei
Pribnow, este responsabil de acurateea
iniierii transcrierii;
casetele CAAT i GC sunt responsabile de
frecvena transcrierii.
Iniierea transcrierii
Factorii de iniiere
[Link] procariote
subunitatea a holoenzimei orienteaz legarea
specific a ARNp la ADN
Bacteriile prezint mai multe tipuri de factori
Etapele iniierii transcrierii :
formarea complexului nchis de iniiere
prin legarea ARNp la promotorul specific,
n regiunea 35 recunoscut de factorul ;
Catena matrit
Promotor
ARN polimeraza holoenzima
formarea complexului deschis de
iniiere
prin denaturarea ADN dublu catenar pe o poriune de
~10 perechi de baze pn la punctul de start al
transcrierii
ARN polimeraza holoenzima
Formarea primei legturi fosfat diesterice
ARNp, aflat cu situsul catalitic n dreptul
semnalului de iniiere a transcrierii,
leag nucleotidul +1, aproape invariabil unul
purinic cu nucleotidul +2;
disocierea subunitii din complexul ARN
polimerazADN-ARN dup legarea primelor
10 nucleotide i
asocierea ei cu alt molecul de ARN polimeraz-miez.
La eucariote
[Link] iniierii transcrierii este realizat de:
-elementele de activare n cis a genelor
(secvene de ADN situate pe acelai cromozom cu gena de reglat)
promotori
enhanceri
silenceri
responsive elements care mediaz rspunsul la diferite semnale
printre care hormonii hidrofobi
-elementele de activare n trans :
factorii de iniiere a transcrierii = proteine specifice
La procariote factorul
La eucariote fiecare polimeraz are setul su unic de factori de iniiere a
transcrierii (cel puin 6 factori de transcriere acioneaz echivelent
cu factorul de la procariote)
Celulele eucariote au o capacitate de exprimare selectiv a genelor
Viteza de sintez a unei proteine n dou celule din acelai organism
poate diferi de 109 ori
Elongarea lanului polinucleotidic
bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de
baze ADN-ARN
Catena ADN codificatoare
Punctul de renaturare
Punctul de denaturare
Directia de avansare a enzimei
Catena matrit
Hibrid ARN-ADN
La procariote,
rifampin se leag de ARN polimeraz i i schimb
conformaia mpiedicnd iniierea sintezei ARN
La eucariote
rifampinul nu se leag de ARN polimeraz i nu este
afectat sinteza ARN
Terminarea transcrierii
La procariote
[Link] transcrierii independent de factorul
proteic rho
Catena matri ADN conine semnale stop.
Structurile n ac de pr a ARN format, favorizeaz
terminarea transcrierii.
Terminarea transcrierii rho dependent
Factorul rho cu activitate ATP-azic se leag la o
secven specific de ARN monocatenar. ARN este
desprins de catena matri i de enzim
ppp 5`
Proteina rho
ATP + HOH
ADP + Pi
ARN polimeraza
Inhibitorii transcrierii
[Link] actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea
ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att
transcrierea ct i replicarea.
b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile
otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.
[Link] din familia rifamicin, inhib specific iniierea
transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.
Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la
subunitatea a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.
Transcriptul primar ARNm procariot este mai
lung dect gena de transcris.
Inhibitorii transcrierii
[Link] actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea
ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att
transcrierea ct i replicarea.
b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile
otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.
[Link] din familia rifamicin, inhib specific iniierea
transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.
Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la
subunitatea a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.
Modificarea transcriptelor
primare ARN
eliminarea exo- i endonucleazic a unor
fragmente polinucleotidice;
adugarea unor fragmente
polinucleotidice la capetele 3` i 5`;
modificri covalente la nivelul unor resturi
nucleotidice.
La eucariote:
eliminarea unor fragmente polinucleotidice din
transcriptele primare ARN.
Transcriptele primare ARN conin exoni i
introni
ARN-polimerazele transcriu ntreaga gen
Intronii au dimensiuni cu mult mai mari
dect exonii
(de peste 100 de ori)
NUMAI 5-10% din genomul eucariot
reprezint secvene codificatoare
pentru proteine i ARN.
Prezena intronilor i exonilor la eucariote este
tipic:
ARNm
ARNt
ARNr
Dualitatea funcional a moleculei de ARN
Ribozimii = ARN cu rol catalitic i
informaional
Substratele ribozimilor sunt molecule de
ARN
Exist dou tipuri de ribozimi:
Ribozimi care realizeaz activiti autocatalitice
Ex. introni care i catalizeaz propria excludere (selfsplicing)
Ribozimi care catalizeaz transformarea unor
molecule din care acetia nu fac parte
Ex. ribonucleaza P care are ca substrat ARNt.
Excizia intronilor
Excizia intronilor se realizeaz n nucleu, pentru toate
tipurile de ARN
Enzime specifice:
trebuie s
recunoasc jonciunile intron-exon i
s catalizeze excizia intronilor i legarea exonilor.
In general, intronii au la capete secvenele:
5` GU ------------ AG
3`
Mutaii la nivelul jonciunilor intron-exon pot
genera un ARN inactiv
care conine un intron rezidual
Un defect de excludere a intronilor, ar putea duce la o
sintez sczut a lanurilor de -globin, fapt constatat n
unele -thalasemii.
Excizia intronilor din ARNr se realizeaz
autocatalitic
GTP sau guanozina desface legtura fosfat diesteric de
la unul din capetele intronului.
Captul 3` eliberat, al exonului I, efectueaz o
transesterificare la captul 5` al exonului II, realiznduse odat cu excluderea intronului, legarea celor doi
exoni (splicing)
Enzima numit ribozim cu activitate autocatalitic i
modific structura n timpul actului catalitic.
Excizia intronilor din ARNm
este realizat de splicozom format din:
particule ribonucleoproteice (snurps)
(ARN de dimensiuni mici bogai n uracil
(U1, U2, U4, U5, U6) asociate cu proteine)
ARNm transcript primar, subiect al
prelucrrii.
n splicozom aciunea catalitic este realizat
de ARN de dimensiuni mici.
Splicozomul dimensiune mare mpiedic
ARNm precursor s prsesc nucleul nainte de
prelucrarea sa complet la ARNm-matur
desfacerea legturii fosfat diesterice de la
unul dintre capetele intronului este realizat
de un nucleotid din cadrul intronului
Excizia intronului din ARNt
ARNt eucariot conine introni, n regiunea
anticodon (succesiuni de nucleotide (20-40))
Excluderea acestor introni se face de un sistem
multienzimatic cu rol de endonucleaz i ligaz
3` OH
OH 3`
Extensie 5`
5`
Prelucrri posttranscriere
Intron
ARNt matur
ARNt transcript primar
Modificri suplimentare exciziei intronilor
n transcriptele primare ARN
ARNm procariot se nate matur
Modificri ale ARNm eucariot
la eucariote
ARNm devine funcional numai dup
excizia intronilor i
modificarea capetelor 5` i 3`:
adugarea unui rest de 7-metil guanozin la captul 5`
formarea cozii poliadenilice 3`
Formarea captului 5`prin adugarea unui
rest de 7-metil guanozin la transcriptul
primar.
O
CH3
+
HN
H2N
O
2`
3`
OH HO
O
7-metil guanozin
CH2 O
OH
O
O
OH
O
O
Transcript primar
OH
legtur 5` - 5` trifosfat
ntre 7-metil-guanozin si transcriptul primar
Funciile captului 5`:
protejaz moleculele de aciunea 5` 3`
exonucleazelor;
favorizeaz traducerea, fiind recunoscut de
ctre ribozomi ca semnal de iniiere a sintezei
proteinelor.
Modificarea captului 3` al ARNm prin
formarea unor cozi poliadenilice
de 200-300 nucleotide
Poliadenilarea se produce
dup formarea captului 5` dar
nainte de excizia intronului.
Poliadenilarea ajut la stabilizarea moleculei
ARNm de aciunea exonucleazelor.
ARNm pentru histone i interferon nu sunt
poliadenilai.
Modificri ale capetelor ARNt
transformarea transcriptul primar multimeric n
ARNt precursori monomerici
care prezint extensii scurte 3` i 5`
Ribonucleaza P
o endonucleaz format din:
ARN cu rol catalitic (ribozim) i
o protein cu caracter bazic)
elimin extensiile din captul 5`
Formarea captului 3` matur al ARNt
La procariote
secvena CCA este relevat de o exonucleaz
La eucariote
secvena CCA este adugat ulterior de ctre o
nucleotidil-transferaz avnd ca
substrate ATP i CTP
Modificarea covalent a unor baze prin reacii catalizate
enzimatic: alchilare, tiolare, hidrogenare
O
H3C
NH
HO H2 C
HO H2 C
O
NH
HN
O
OH OH
Ribotimidin
(T)
OH OH
Dihidrouridin
(DHU)
N
O
HO OH
4-Tiouridin
O
O
OH OH
Pseudouridin
O
N
NH
HO H2 C
HO H2 C
NH
HO H2 C
N
O
OH OH
Inozin
NH
N
a)
Situs de
legare aminoacid
3`
CCA
Brat T C
b)
5`
3`
5`
Perechi de baze
complementare
Bratul DHU
Brat T C
Bratul
DHU
Bratul variabil
Bucla
anticodon
Bratul anticodon
Anticodon
Modificri ARNr
La eucariote
Din transcriptele primare 45 se formeaz
ARNr matur:
28 S
18 S i
5,8 S.
ARNr 5 S rezult dintr-o molecul precursoare
diferit
Spatiatori
Transcrip
primar
Clivare
ARNr maturi
Procesarea ARNr eucariot
La procariote, dup ndeprtarea ARNt obinut
prin transcrierea unor gene ARNt intruse, se
formeaz ARNr maturi: 23 S, 16 S, i 5 S prin
clivarea ARNr precursor 30 S.
Spatiatori
Transcript
primar
Clivare
Clivare
ARNr
maturi
Procesarea ARNr procariot
