Curs 13

Caracteristicile structurale ale ARN

Transcrierea (Biosinteza ARN)

Caracteristicile structurale ale ARN

Sunt produi de policondensare a

ribonucleozidtrisfosfailor

Structura primar:
H3PO4
-riboz
Baze azotate: A,G,U,C

N
O
O

5` GCA 3`

P
O

NH

5`

N
O

NH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

CH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

CH2

N
O

3`
3`

OH

NH

 Structura secundar
ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare
Bucl cu baze
nemperechiate

Segment cu baze
complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel

de G diferit de cel n C

 Rolurile diferitelor tipuri de ARN

 ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare

-este heterogen ca form i mrime.

-la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S
la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S

ARNr
-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic
-reprezint ~80% din ARN celular total.

Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor
Ribozomii = complexe ribonucleoproteice
ARNr + proteine
-proteinele:
au roluri catalitice sau
sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm
i aminoacil~ARNt la ribozomi

Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei
proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i

ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

 Conin trei situsuri:

-situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid;
-situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan
polipeptidic;
-situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt
liber.

Ribozom 70 S

ARNt

E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt

Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

 Structura ARNt (solubil sau adaptor)

conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;

raportul A+G/U+C este apropiat de 1;

prezint o conformaie n foaie de trifoi

a)

Situs de
legare aminoacid

3`

CCA

Brat T C

b)

5`
3`

5`
Perechi de baze
complementare
Bratul DHU

Brat T C

Bratul
DHU

Bratul variabil
Bucla
anticodon

Bratul anticodon

Anticodon

 ARNt are cel mai mare coninut de baze minore

baze azotate modificate structural prin:
-metilri
- tiolri
-hidrogenri
dup sinteza ARNt (POST-TRANSCRIERE)

O
H3C

NH
HO H2 C

HO H2 C

O
NH

HN
O

OH OH
Ribotimidin
(T)

OH OH
Dihidrouridin
(DHU)

N
O

HO OH
4-Tiouridin

O
O

OH OH
Pseudouridin
O
N

NH
HO H2 C

HO H2 C

NH

HO H2 C

N
O

OH OH
Inozin

NH
N

Funciile ARNt
Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni
n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i
i transport, la ribozomi, sub forma
complexelor aminoacil~ARNt

 Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de

pe ARNm prin
recunoaterea codon-anticodon,
pe baza complementaritii bazelor

3` A ~ aa1
C
C

5`

Anticodon 3` C C G 5`

5`

3` A ~ aa2
C
C

5`

Anticodon 3` A G U 5`

GGC

UCA

Codon 1

Codon 2

ARNm
3`

ARNm
Structur

-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea catenei matri
sau template (necodificatoare).

-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic .

ADN
5` - G C A T T A T G C - 3`
3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN

5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm

sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni
este decodificat la nivelul ribozomilor.

ARNm procariot
este poligenic sau policistronic;

ntre gena transcris,

ARNm i
protein exist
o relaie de colinearitate

ARNm eucariot
este monogenic;
nu este relaie de colinearitate:
gen-ARNm-polipeptid
gena pentru sinteza ARNm cuprinde:
exoni (expressed regions) i
introni (intervening sequences);

 ARNm matur care trec n citoplasm este

prelucrat prin excizia intronilor;

ARNm eucariot are o via de ordinul orelor

ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3
minute)

ARN nuclear de mici dimensiuni

(small nuclear RNA)

Este bogat n uridin

(U1, U2, U4, U5, U6).
se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

 prin asociere cu proteine,

genereaz ribonucleoproteine
(small nuclear ribonucleoproteins)
sau snRNP ( denumite snurps)
cu rol n:
-excizia intronilor din ARNm transcript primar;
-controlul traducerii.

TRANSCRIERE
Biosinteza ARN pe matri ADN

Transcrierea
are loc de cte ori este nevoie
n viaa unei celule
nu angajaz tot cromozomul

 Transcrierea este asimetric

catena ARN se construiete numai pe una dintre catenele
ADN dublu catenar nuclear
desemnat drept caten template
matri sau
necodificatoare

 Catena netranscris (codificatoare) a ADN

este identic cu ARN nou sintetizat, cu
excepia nlocuirii timinei cu uracilul

 Catenele ADN vor fi catene template

(necodificatoare) pentru unele gene i catene
codificatoare pentru alte gene.
Catenele template se citesc, invariabil, n
direcia 3` 5`.

Elemente necesare transcrierii:

ADN dublu helicoidal.

Substrate: ATP, GTP, CTP, UTP

Enzime
ARN polimeraze ADN dependente
-au activitate polimerazic
-necesit caten matri
-pot iniia sinteza catenelor poliribonucleotidice
-conin Zn i necesit Mg2+
-nu au activitate de corector
-sintetizeaz ARN n direcia 5` 3`, antiparalel
catenei ADN folosit ca matri

Direcia de sintez

Direcia de cretere a lanurilor ribonucleotidice

rmne obligatoriu 5` 3`.

Reacia global catalizat de ARN polimeraz

este:

N
O
O

5` GCA 3`

P
O

NH

5`

N
O

NH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

CH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

CH2

N
O

3`
3`

OH

NH

Procariotele
Au o singur ARN polimeraz.
Holoenzima, este un pentamer

constituit

din:

important n elongare;
enzima miez

subunitatea adiional , proprie iniierii transcrierii.

In absena subunitii , ARN polimeraza, se leag
nespecific la ADN.

Eucariotele
ARN polimeraza mitocondrial
ARN polimerazele nucleare,
(cu sensibilitate diferit la -amanitin -octapeptid biciclic,
toxic, existent n ciupercile otrvitoare):
ARN p I, aflat n nucleoli, sintetizeaz ARNr 45S,
insensibil la -amanitin;

ARN p II, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz ARNm, i

ARN nuclear de dimensiuni mici
foarte sensibil la -amanitin;

ARN p III, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz, ARNt, ARNr

5S i ARN nuclear de dimensiuni mici
sensibil la concentraii mari de -amanitin

 Unde ncepe transcrierea genei ?

Secvenele promotor (P)

secvene specifice de nucleotide, din molecula
ADN, responsabile de iniierea transcrierii

 punctul de start al transcrierii, este notat cu +1.

Secvenele nucleotidice situate n amonte

(upstream), fa de punctul de start al transcrierii,
se noteaz cu (-)
Secvenele situate n aval (downstream) fa de +1
sunt notate cu (+)

Promotorii procariotelor sunt situai n amonte fa de

+1 i sunt notai cu minus
Promotorii, pentru cele mai multe gene bacteriene,
au dou secvene consens situate pe catena
codificatoare: caseta 10 (Pribnow) i caseta 35

 La eucariote, fiecare ARN polimeraz,

utilizeaz promotori diferii
ARNp I utilizeaz promotori identici,
ARNp II utilizeaz o diversitate de
promotori, cu secvene consens:
caseta TATA, asemntoare casetei
Pribnow, este responsabil de acurateea
iniierii transcrierii;
casetele CAAT i GC sunt responsabile de
frecvena transcrierii.

Iniierea transcrierii
Factorii de iniiere
A.La procariote
subunitatea a holoenzimei orienteaz legarea
specific a ARNp la ADN
Bacteriile prezint mai multe tipuri de factori

Etapele iniierii transcrierii :

formarea complexului nchis de iniiere
prin legarea ARNp la promotorul specific,
n regiunea 35 recunoscut de factorul ;

Catena matrit

Promotor

ARN polimeraza holoenzima

formarea complexului deschis de

iniiere
prin denaturarea ADN dublu catenar pe o poriune de
~10 perechi de baze pn la punctul de start al
transcrierii
ARN polimeraza holoenzima

Formarea primei legturi fosfat diesterice

ARNp, aflat cu situsul catalitic n dreptul

semnalului de iniiere a transcrierii,
leag nucleotidul +1, aproape invariabil unul
purinic cu nucleotidul +2;

disocierea subunitii din complexul ARN

polimerazADN-ARN dup legarea primelor
10 nucleotide i
asocierea ei cu alt molecul de ARN polimeraz-miez.

La eucariote
B.Acurateea iniierii transcrierii este realizat de:
-elementele de activare n cis a genelor
(secvene de ADN situate pe acelai cromozom cu gena de reglat)
promotori
enhanceri
silenceri
responsive elements care mediaz rspunsul la diferite semnale
printre care hormonii hidrofobi

-elementele de activare n trans :

factorii de iniiere a transcrierii = proteine specifice
La procariote factorul
La eucariote fiecare polimeraz are setul su unic de factori de iniiere a
transcrierii (cel puin 6 factori de transcriere acioneaz echivelent
cu factorul de la procariote)

Celulele eucariote au o capacitate de exprimare selectiv a genelor

Viteza de sintez a unei proteine n dou celule din acelai organism
poate diferi de 109 ori

Elongarea lanului polinucleotidic

bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de
baze ADN-ARN
Catena ADN codificatoare
Punctul de renaturare

Punctul de denaturare

Directia de avansare a enzimei

Catena matrit
Hibrid ARN-ADN

 La procariote,
rifampin se leag de ARN polimeraz i i schimb
conformaia mpiedicnd iniierea sintezei ARN

La eucariote
rifampinul nu se leag de ARN polimeraz i nu este
afectat sinteza ARN

Terminarea transcrierii
La procariote
a.Terminarea transcrierii independent de factorul
proteic rho
Catena matri ADN conine semnale stop.
Structurile n ac de pr a ARN format, favorizeaz
terminarea transcrierii.

Terminarea transcrierii rho dependent

Factorul rho cu activitate ATP-azic se leag la o
secven specific de ARN monocatenar. ARN este
desprins de catena matri i de enzim

ppp 5`
Proteina rho
ATP + HOH

ADP + Pi

ARN polimeraza

Inhibitorii transcrierii

a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea

ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att
transcrierea ct i replicarea.

b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile

otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.

c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea

transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.

Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la

subunitatea a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.

Transcriptul primar ARNm procariot este mai

lung dect gena de transcris.

Inhibitorii transcrierii

a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea

ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att
transcrierea ct i replicarea.

b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile

otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.

c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea

transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.

Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la

subunitatea a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.

Modificarea transcriptelor
primare ARN
eliminarea exo- i endonucleazic a unor
fragmente polinucleotidice;
adugarea unor fragmente
polinucleotidice la capetele 3` i 5`;
modificri covalente la nivelul unor resturi
nucleotidice.

 La eucariote:

eliminarea unor fragmente polinucleotidice din

transcriptele primare ARN.

Transcriptele primare ARN conin exoni i

introni
ARN-polimerazele transcriu ntreaga gen

 Intronii au dimensiuni cu mult mai mari

dect exonii
(de peste 100 de ori)
NUMAI 5-10% din genomul eucariot
reprezint secvene codificatoare
pentru proteine i ARN.
Prezena intronilor i exonilor la eucariote este
tipic:
ARNm
ARNt
ARNr

Dualitatea funcional a moleculei de ARN

Ribozimii = ARN cu rol catalitic i

informaional
Substratele ribozimilor sunt molecule de
ARN

Exist dou tipuri de ribozimi:

Ribozimi care realizeaz activiti autocatalitice
Ex. introni care i catalizeaz propria excludere (selfsplicing)

Ribozimi care catalizeaz transformarea unor

molecule din care acetia nu fac parte
Ex. ribonucleaza P care are ca substrat ARNt.

Excizia intronilor
Excizia intronilor se realizeaz n nucleu, pentru toate
tipurile de ARN

Enzime specifice:
trebuie s

recunoasc jonciunile intron-exon i

s catalizeze excizia intronilor i legarea exonilor.

In general, intronii au la capete secvenele:

5` GU ------------ AG

3`

 Mutaii la nivelul jonciunilor intron-exon pot

genera un ARN inactiv
care conine un intron rezidual
Un defect de excludere a intronilor, ar putea duce la o
sintez sczut a lanurilor de -globin, fapt constatat n
unele -thalasemii.

Excizia intronilor din ARNr se realizeaz

autocatalitic
GTP sau guanozina desface legtura fosfat diesteric de
la unul din capetele intronului.
Captul 3` eliberat, al exonului I, efectueaz o
transesterificare la captul 5` al exonului II, realiznduse odat cu excluderea intronului, legarea celor doi
exoni (splicing)
Enzima numit ribozim cu activitate autocatalitic i
modific structura n timpul actului catalitic.

Excizia intronilor din ARNm

este realizat de splicozom format din:
particule ribonucleoproteice (snurps)
(ARN de dimensiuni mici bogai n uracil
(U1, U2, U4, U5, U6) asociate cu proteine)
ARNm transcript primar, subiect al
prelucrrii.

 n splicozom aciunea catalitic este realizat

de ARN de dimensiuni mici.

 Splicozomul dimensiune mare mpiedic

ARNm precursor s prsesc nucleul nainte de

prelucrarea sa complet la ARNm-matur

 desfacerea legturii fosfat diesterice de la

unul dintre capetele intronului este realizat
de un nucleotid din cadrul intronului

Excizia intronului din ARNt

ARNt eucariot conine introni, n regiunea

anticodon (succesiuni de nucleotide (20-40))

Excluderea acestor introni se face de un sistem

multienzimatic cu rol de endonucleaz i ligaz

3` OH

OH 3`

Extensie 5`

5`

Prelucrri posttranscriere

Intron
ARNt matur
ARNt transcript primar

Modificri suplimentare exciziei intronilor

n transcriptele primare ARN

ARNm procariot se nate matur

 Modificri ale ARNm eucariot

la eucariote
ARNm devine funcional numai dup
excizia intronilor i
modificarea capetelor 5` i 3`:
adugarea unui rest de 7-metil guanozin la captul 5`

formarea cozii poliadenilice 3`

 Formarea captului 5`prin adugarea unui

rest de 7-metil guanozin la transcriptul
primar.
O

CH3
+

HN
H2N

O
2`

3`

OH HO
O
7-metil guanozin

CH2 O

OH

O
O

OH

O
O

Transcript primar

OH

legtur 5` - 5` trifosfat
ntre 7-metil-guanozin si transcriptul primar

 Funciile captului 5`:

protejaz moleculele de aciunea 5` 3`
exonucleazelor;
favorizeaz traducerea, fiind recunoscut de
ctre ribozomi ca semnal de iniiere a sintezei
proteinelor.

 Modificarea captului 3` al ARNm prin

formarea unor cozi poliadenilice

de 200-300 nucleotide

Poliadenilarea se produce

dup formarea captului 5` dar

nainte de excizia intronului.

 Poliadenilarea ajut la stabilizarea moleculei

ARNm de aciunea exonucleazelor.

ARNm pentru histone i interferon nu sunt

poliadenilai.

Modificri ale capetelor ARNt

transformarea transcriptul primar multimeric n
ARNt precursori monomerici
care prezint extensii scurte 3` i 5`

Ribonucleaza P
o endonucleaz format din:
ARN cu rol catalitic (ribozim) i
o protein cu caracter bazic)
elimin extensiile din captul 5`

 Formarea captului 3` matur al ARNt

La procariote
secvena CCA este relevat de o exonucleaz
La eucariote
secvena CCA este adugat ulterior de ctre o
nucleotidil-transferaz avnd ca
substrate ATP i CTP

Modificarea covalent a unor baze prin reacii catalizate

enzimatic: alchilare, tiolare, hidrogenare

O
H3C

NH
HO H2 C

HO H2 C

O
NH

HN
O

OH OH
Ribotimidin
(T)

OH OH
Dihidrouridin
(DHU)

N
O

HO OH
4-Tiouridin

O
O

OH OH
Pseudouridin
O
N

NH
HO H2 C

HO H2 C

NH

HO H2 C

N
O

OH OH
Inozin

NH
N

a)

Situs de
legare aminoacid

3`

CCA

Brat T C

b)

5`
3`

5`
Perechi de baze
complementare
Bratul DHU

Brat T C

Bratul
DHU

Bratul variabil
Bucla
anticodon

Bratul anticodon

Anticodon

Modificri ARNr
La eucariote
Din transcriptele primare 45 se formeaz
ARNr matur:
28 S
18 S i
5,8 S.
ARNr 5 S rezult dintr-o molecul precursoare
diferit

Spatiatori

Transcrip
primar

Clivare

ARNr maturi

Procesarea ARNr eucariot

 La procariote, dup ndeprtarea ARNt obinut

prin transcrierea unor gene ARNt intruse, se
formeaz ARNr maturi: 23 S, 16 S, i 5 S prin
clivarea ARNr precursor 30 S.

Spatiatori
Transcript
primar
Clivare
Clivare
ARNr
maturi

Procesarea ARNr procariot