CURS 14

Acizi nucleici Revers transcriere Mutaii

8.01.2014

Caracteristicile structurale ale ARN

Transcrierea (Biosinteza ARN) Modificari posttranscriere

Dogma central a biologiei moleculare

ADN conine informaia genetic sub forma unor secvene de nucleotide
Replicare
Transcriere Traducere

ADN

ARNm

Proteine

Revers transcriere

Toat informaia din celula parental este transferat celulelor fiice.

Catene parentale

Catene fiice

Reverstranscrierea Sinteza de ADN pe matri de ARN

Revers transcriptaza este prezent n virusurile oncogene care conin ca material genetic ARN Enzima este o ADN polimeraz ARN dependent, care se activeaz numai la ptrunderea n celula gazda. Primerul folosit de revers transcriptaz est un ARNt nglobat n particular viral Enzima prezint activitate de revers transcriptaz: activitate ribonucleazic (ribonucleaza H); activitate ADN polimerazic ADN dependent.

Virus cu 2 molecule ARN si revers transcriptaz

Ptrundere n calula gazd ARN legat de revers transcriptaz Sinteza ADN de ctre revers transcriptaz ARN-ADN hibrid ARN viral ADN dublu catenar Genom gazd ADN din celula gazd Sinteza ADN dublu catenar Integrarea ADN n genomul celulei gazd

 Revers transcriptaza nu prezint activitate

exonucleazic 3`

5`, putnd face greeli n

replicare, ceea ce explic numrul mare de

tulpini virale.

 HIV este un virus versatil rspunztor de SIDA (virusul conine genele: pol, env i gag) Revers transcriptaza poate utiliza ca matri orice ARN pe care construiete un ADNc (complementar), aceast posibilitate putnd fi utilizat n obinerea unor gene sintetice.

MUTAII. REPARAREA ADN

Notiunea de mutatie a fost elaborata in anul1901 de catre Hugo de Vries care este autorul binecunoscutei teorii mutationiste. Mutaiile sunt modificri permanente ale secvenei nucleotidice a ADN Mutaiile punctiforme= modificri ale unei singure perechi de baze

Mutaiile pot fi produse prin:

Substituia unei baze cu alt baz

tranziia A..T G.C

transversia

AT CG

Deleia Inseria

Cauzele care determin apariia mutaiilor

a.Erori n procesul de replicare care scap celor 2 sisteme:

-activitate de corector a ADN polimerazei III.
-sistemele specializate de reparare postreplicative

5` T ...... A T ...... A T ...... A

3` 5` C C C A A A

3`

Locul de hidroliz al exonucleazei 3` 5`

3` HO

T ...... A C A A A

Locul de hidroliz al exonucleazei 5` 3`

T ...... A T ...... A T ...... A T ...... A

a)

5`

3`

5`

b)

ADN polimeraza I ndeprteaz ARN primer ca urmare a activitii exonucleazice 5` 3` i l nlocuiete cu ADN ca urmare a activitii polimerazice.

 b.Factori chimici
Agenii nealchilani: formaldehida (H2C=O): reacioneaz cu gruprile amino; hidroxilamina (NH2-OH) reacioneaz specific cu citozina; acidul azotos (HNO2) determin dezaminarea oxidativ a citozinei, adeninei, guaninei modificnd mperecherea bazelor deoarece o amin se transform n ceton. Agenii alchilani. etilmetan sulfonatul, adaug o grupare metil la azotul din nucleul purinic labiliznd legtura N-glicozidic prin a crei hidroliz apare un loc depurinat;

 c.Analogi structurali ai bazelor azotate pot fi ncorporai n catena de ADN.

5-bromuracilul, se mperecheaz de obicei cu adenina. Forma enolic se leag cu guanina. Tranziia produs este AT cu G..C 2-amino purina se mperecheaz de obicei cu timina. Forma sa tautomer normal (amino), se poate lega cu citozina producnd mutaia prin tranziie GC la AT.

O HN O N
H

Br N H2N 2 N

N NH

5-bromo uracil

2-amino purina

 d.Factori fizici Radiaiile ultraviolete (200-400 nm) induc formarea dimerilor de timin TT

UV

Formarea dimerului de timin ntr-o caten ADN

Structura unui dimer de timin intracatenar

Radiaiile ionizante Razele X, radiaiile g, determin deschiderea nucleului purinic, depurinarea i ruperea legturilor fosfo-diesterice.

 e.Depurinri-Hidroliza legturilor glicozidice f.Dezaminri spontane CU G Xantin A Hipoxantin

 g.Inserie: h.Deleie:

Acridin pH i temperatur

Repararea ADN
Prin: a.excizie -excizia dimerilor de timin -excizia unei secvene ce conine o baz dezaminat b.direct -fotoreactivare -dealchilarea guaninei c.prin recombinare.

Repararea prin excizie a.Repararea ADN la procariote prin excizia dimerilor de timin 5` 3`
3` 5` Excizia unui fragment de 12 nucleotide

Sinteza de ADN de ctre ADN polimeraza I

Formarea unei legturi covalente de ctre ADN ligaz

 Repararea ADN n cazul dezaminarii uneia

dintre bazele azotate

prin dezaminarea citozinei uracil adeninei hipoxantina guaninei xantina se face analog reparrii prin excizie

DE ce timin n ADN i nu uracil ?

Prezenta timinei i nu a uracilului n ADN permite repararea ADN ce conine citozina dezaminat (uracil).

Folosirea timinei n structura ADN i nu a uracilului mrete fidelitatea mesajului genetic.

Repararea direct a ADN

prin fotoreactivare ADN fotoliaza,
o enzim care se afl n toate organismele i care este activat de radiaiile din domeniul vizibil (l = 400-600 nm).

cliveaz legtura covalent timin-timin din dimerii de timin

Absena genetic a fotoliazei duce la creterea riscului de apariie a cancerului de piele.

Caracteristicile structurale ale ARN

Sunt produi de policondensare a ribonucleozidtrisfosfailor

Structura primar:
H3PO4 -b-riboz

Baze azotate: A,G,U,C

N
O O
-

NH
G

P
O
-

5`

5` GCA 3`
NH2

N
O
3`

NH2

X
O O C O
-

N CH 2
3`

P
O

N
O

NH2
X O

N
A O

NH

P
O
-

CH 2

N
O

3` 3`

OH

 Structura secundar ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare

Bucl cu baze nemperechiate

Segment cu baze complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel de G diferit de cel n C

 Rolurile diferitelor tipuri de ARN

 ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare

-este heterogen ca form i mrime. -la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S

ARNr

-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic

-reprezint ~80% din ARN celular total.

Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor
Ribozomii = complexe ribonucleoproteice ARNr + proteine -proteinele: au roluri catalitice sau sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm i aminoacil~ARNt la ribozomi

Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i

ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

 Conin trei situsuri: -situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid; -situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan polipeptidic; -situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt liber.

Ribozom 70 S

ARNt

E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt

Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

 Structura ARNt (solubil sau adaptor)

conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;

raportul A+G/U+C este apropiat de 1;

prezint o conformaie n foaie de trifoi

Situs de legare aminoacid

a)

3`

CCA

Brat T C

b)

5` 3`

5` Perechi de baze complementare Bratul DHU Bratul DHU Brat T C

Bratul variabil Bucla anticodon Anticodon Bratul anticodon

 ARNt are cel mai mare coninut de baze minore

baze azotate modificate structural prin: -metilri - tiolri -hidrogenri dup sinteza ARNt (POST-TRANSCRIERE)

O NH HO H2 C N
O

O H3C NH N O O HN HO H2 C

O NH O O

HO H2 C

OH OH Dihidrouridin (DHU)

OH OH Ribotimidin (T) S NH N O N O

OH OH Pseudouridin O NH N

HO H2 C

N O

HO H2 C

HO OH 4-Tiouridin

OH OH Inozin

Funciile ARNt
Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i

i transport, la ribozomi, sub forma

complexelor aminoacil~ARNt

 Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de pe ARNm prin

recunoaterea codon-anticodon, pe baza complementaritii bazelor

3` A ~ aa1
C C

3` A ~ aa2
C C

5`

5`

Anticodon 3` C C G 5`

Anticodon 3` A G U 5`

GGC 5` Codon 1

UCA Codon 2 3`

ARNm

ARNm
Structur

-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea catenei matri sau template (necodificatoare).

-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic. ADN 5` - G C A T T A T G C - 3` 3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN

5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni este decodificat la nivelul ribozomilor.

ARNm procariot
este poligenic sau policistronic;

ntre gena transcris, ARNm i protein exist

o relaie de colinearitate

ARNm eucariot
este monogenic; nu este relaie de colinearitate: gen-ARNm-polipeptid gena pentru sinteza ARNm cuprinde:

exoni (expressed regions) i

introni (intervening sequences);

 ARNm matur care trec n citoplasm este

prelucrat prin excizia intronilor;

ARNm eucariot are o via de ordinul orelor ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3 minute)

ARN nuclear de mici dimensiuni (small nuclear RNA)

Este bogat n uridin (U1, U2, U4, U5, U6). se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

 prin asociere cu proteine, genereaz ribonucleoproteine (small nuclear ribonucleoproteins) sau snRNP ( denumite snurps) cu rol n: -excizia intronilor din ARNm transcript primar; -controlul traducerii.

TRANSCRIERE
Biosinteza ARN pe matri ADN

Transcrierea are loc de cte ori este nevoie n viaa unei celule nu angajaz tot cromozomul

 Transcrierea este asimetric

catena ARN se construiete numai pe una dintre catenele

ADN dublu catenar nuclear

desemnat drept caten template matri sau necodificatoare

 Catena netranscris (codificatoare) a ADN este identic cu ARN nou sintetizat, cu excepia nlocuirii timinei cu uracilul

 Catenele ADN vor fi catene template (necodificatoare) pentru unele gene i catene codificatoare pentru alte gene. Catenele template se citesc, invariabil, n direcia 3` 5`.

Elemente necesare transcrierii:

ADN dublu helicoidal. Substrate: ATP, GTP, CTP, UTP

Enzime
ARN polimeraze ADN dependente
-au activitate polimerazic -necesit caten matri -pot iniia sinteza catenelor poliribonucleotidice -conin Zn i necesit Mg2+ -nu au activitate de corector -sintetizeaz ARN n direcia 5` 3`, antiparalel catenei ADN folosit ca matri

Direcia de sintez

Direcia de cretere a lanurilor ribonucleotidice

rmne obligatoriu 5` 3`.

Reacia global catalizat de ARN polimeraz este:

N
O O
-

NH
G

P
O
-

5`

5` GCA 3`
NH2

N
O
3`

NH2

X
O O C O
-

N CH 2
3`

P
O

N
O

NH2
X O

N
A O

NH

P
O
-

CH 2

N
O

3` 3`

OH

Procariotele
Au o singur ARN polimeraz. Holoenzima, este un pentamer din:
bb s

constituit

enzima miez bb important n elongare;

subunitatea adiional s, proprie iniierii transcrierii. In absena subunitii s, ARN polimeraza, se leag nespecific la ADN.

Eucariotele
ARN polimeraza mitocondrial

ARN polimerazele nucleare, (cu sensibilitate diferit la -amanitin -octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile otrvitoare): ARN p I, aflat n nucleoli, sintetizeaz ARNr 45S,
insensibil la -amanitin;

ARN p II, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz ARNm, i ARN nuclear de dimensiuni mici
foarte sensibil la -amanitin;

ARN p III, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz, ARNt, ARNr 5S i ARN nuclear de dimensiuni mici
sensibil la concentraii mari de -amanitin

 Etape:
Initiere Elongare Terminare

 Unde ncepe transcrierea genei ?

Secvente nucleotidice Factori de transcriere

A.Secvenele promotor (P)

secvene specifice de nucleotide, din molecula ADN, responsabile de iniierea transcrierii

 punctul de start al transcrierii, este notat cu +1.

Secvenele nucleotidice situate n amonte (upstream), fa de punctul de start al transcrierii,

se noteaz cu (-)
Secvenele situate n aval (downstream) fa de +1 sunt notate cu (+)

Promotorii procariotelor sunt situai n amonte fa de

+1 i sunt notai cu minus Promotorii, pentru cele mai multe gene bacteriene, au dou secvene consens situate pe catena codificatoare: caseta 10 (Pribnow) i caseta 35

La eucariote
Acurateea iniierii transcrierii este realizat de:

-elementele de activare n cis a genelor

(secvene de ADN situate pe acelai cromozom cu gena de reglat) promotori enhanceri silenceri responsive elements care mediaz rspunsul la diferite semnale printre care hormonii hidrofobi

 La eucariote, fiecare ARN polimeraz, utilizeaz promotori diferii ARNp I utilizeaz promotori identici, ARNp II utilizeaz o diversitate de promotori, cu secvene consens: caseta TATA, asemntoare casetei Pribnow, este responsabil de acurateea iniierii transcrierii; casetele CAAT i GC sunt responsabile de frecvena transcrierii.

B.Factorii de iniiere
La procariote
subunitatea s a holoenzimei orienteaz legarea specific a ARNp la ADN Bacteriile prezint mai multe tipuri de factori s

Etapele iniierii transcrierii :

formarea complexului nchis de iniiere prin legarea ARNp la promotorul specific, n regiunea 35 recunoscut de factorul s;

Catena matrit

ARN polimeraza holoenzima

Promotor

formarea complexului deschis de iniiere

prin denaturarea ADN dublu catenar pe o poriune de ~10 perechi de baze pn la punctul de start al transcrierii
ARN polimeraza holoenzima

Formarea primei legturi fosfat diesterice

ARNp, aflat cu situsul catalitic n dreptul

semnalului de iniiere a transcrierii,
leag nucleotidul +1, aproape invariabil unul
purinic cu nucleotidul +2;

disocierea subunitii s din complexul ARN

polimerazADN-ARN dup legarea primelor 10 nucleotide i
asocierea ei cu alt molecul de ARN polimeraz-miez.

La eucariote
-elementele de activare n trans :
factorii de iniiere a transcrierii = proteine specifice
La procariote factorul s La eucariote fiecare polimeraz are setul su unic de factori de iniiere a transcrierii (cel puin 6 factori de transcriere acioneaz echivelent cu factorul s de la procariote)

Celulele eucariote au o capacitate de exprimare selectiv a genelor Viteza de sintez a unei proteine n dou celule din acelai organism poate diferi de 109 ori

Elongarea lanului polinucleotidic

bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de baze ADN-ARN
Catena ADN codificatoare Punctul de renaturare Punctul de denaturare

Directia de avansare a enzimei Catena matrit Hibrid ARN-ADN

 La procariote,
rifampin se leag de ARN polimeraz i i schimb

conformaia mpiedicnd iniierea sintezei ARN

La eucariote
rifampinul nu se leag de ARN polimeraz i nu este afectat sinteza ARN

Terminarea transcrierii
La procariote
a.Terminarea transcrierii independent de factorul
proteic rho Catena matri ADN conine semnale stop. Structurile n ac de pr a ARN format, favorizeaz terminarea transcrierii.

Terminarea transcrierii rho dependent

Factorul rho cu activitate ATP-azic se leag la o secven specific de ARN monocatenar. ARN este desprins de catena matri i de enzim

ppp 5` Proteina rho

ATP + HOH ADP + Pi

ARN polimeraza

Transcriptul primar ARNm procariot este mai lung dect gena de transcris.

Inhibitorii transcrierii
a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin intercalarea ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN mpiedicnd att transcrierea ct i replicarea. b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale. c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol inhibitor asupra procesului de elongare. Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la subunitatea b a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea tuberculozei i a altor infecii bacteriene.

 La procariote

ARN se nate matur

La eucariote
ARN-polimerazele transcriu ntreaga gen

Transcriptele primare ARN conin exoni i introni

 Intronii au dimensiuni cu mult mai mari dect exonii (de peste 100 de ori)
NUMAI 5-10% din genomul eucariot reprezint secvene codificatoare pentru proteine i ARN. Prezena intronilor i exonilor la eucariote este tipic: ARNm ARNt ARNr

Prelucrri post-transcriere la eucariote

eliminare fragmente polinucleotidice; adugare fragmente polinucleotidice la capetele 3` i 5`; modificri covalente ale unor resturi nucleotidice.

Dualitatea funcional a moleculei de ARN

ARN are rol catalitic i informaional Moleculele ARN cu rol catalitic = RIBOZIMI Substratele ribozimilor sunt molecule de ARN

Sunt 2 tipuri de Ribozimi:

cu activitate autocataliti
Ex. introni care i catalizeaz propria excludere (selfsplicing)

catalizeaz transformarea unor molecule din care acetia nu fac parte

Ex. ribonucleaza P care elimin extensia de la captul 5` din ARNt

Excizia intronilor
Excizia intronilor se realizeaz n nucleu, pentru toate
tipurile de ARN Enzime specifice:
s recunoasc jonciunile intron-exon s elimine intronii s lege exonii

5`

__________AGGU------------CAGG __________

exon

intron

exon

3`

 Mutaii la nivelul jonciunilor intron-exon pot genera un ARN inactiv

care conine un intron rezidual
Un defect de excludere a intronilor, ar putea duce la o sintez sczut a lanurilor de b-globin, fapt constatat n

unele b-thalasemii.

Excizia intronilor din ARNr

se realizeaz autocatalitic necesit GTP sau guanozina odat cu excluderea intronului, se leag cei doi exoni (splicing) Enzima numit ribozim cu activitate autocatalitic i modific structura n timpul actului catalitic.

Excizia intronilor din ARNm

este realizat de splicozom format din: particule ribonucleoproteice (snurps) (ARN de dimensiuni mici bogai n uracil (U1, U2, U4, U5, U6) asociate cu proteine)

ARNm transcript primar, subiect al prelucrrii.

 n splicozom aciunea catalitic este realizat de ARN de dimensiuni mici.

 Splicozomul dimensiune mare mpiedic

ARNm precursor s prsesc nucleul nainte de

prelucrarea sa complet la ARNm-matur

 desfacerea legturii fosfat diesterice de la unul dintre capetele intronului este realizat de un nucleotid din cadrul intronului

Excizia intronului din ARNt

ARNt eucariot conine introni, n regiunea

anticodon (succesiuni de nucleotide (20-40))

Excluderea acestor introni se face de un sistem

multienzimatic cu rol de endonucleaz i ligaz

3` OH
Extensie 5`

OH 3`

5`

Prelucrri posttranscriere

Intron
ARNt matur ARNt transcript primar

Modificri suplimentare exciziei intronilor n transcriptele primare ARN

ARNm procariot se nate matur

 Modificri ale ARNm eucariot

la eucariote
ARNm devine funcional numai dup

excizia intronilor i
modificarea capetelor 5` i 3`:
adugarea unui rest de 7-metil guanozin la captul 5`

formarea cozii poliadenilice 3`

 Formarea captului 5`prin adugarea unui rest de 7-metil guanozin la transcriptul primar.
O HN H2N N CH3 N N
+

O
2` 3`

O O
P

O O
P

CH2 O

Transcript primar

OH HO O 7-metil guanozin

OH

OH

OH

legtur 5` - 5` trifosfat ntre 7-metil-guanozin si transcriptul primar

 Funciile captului 5`:

protejaz moleculele de aciunea 5` 3` exonucleazelor; favorizeaz traducerea, fiind recunoscut de ctre ribozomi ca semnal de iniiere a sintezei proteinelor.

 Modificarea captului 3` al ARNm prin

formarea unor cozi poliadenilice

de 200-300 nucleotide

Poliadenilarea se produce
dup formarea captului 5` dar

nainte de excizia intronului.

 Poliadenilarea ajut la stabilizarea moleculei

ARNm de aciunea exonucleazelor.

ARNm pentru histone i interferon nu sunt poliadenilai.

Modificri ale capetelor ARNt

transformarea transcriptul primar multimeric n ARNt precursori monomerici care prezint extensii scurte 3` i 5`

Ribonucleaza P
o endonucleaz format din:
ARN cu rol catalitic (ribozim) i o protein cu caracter bazic) elimin extensiile din captul 5`

 Formarea captului 3` matur al ARNt La procariote secvena CCA este relevat de o exonucleaz La eucariote

secvena CCA este adugat ulterior de ctre o

nucleotidil-transferaz avnd ca substrate ATP i CTP Modificarea covalent a unor baze prin reacii catalizate enzimatic: alchilare, tiolare, hidrogenare

O NH HO H2 C N
O

O H3C NH N O O HN HO H2 C

O NH O O

HO H2 C

OH OH Dihidrouridin (DHU)

OH OH Ribotimidin (T) S NH N O N O

OH OH Pseudouridin O NH N

HO H2 C

N O

HO H2 C

HO OH 4-Tiouridin

OH OH Inozin

Situs de legare aminoacid

a)

3`

CCA

Brat T C

b)

5` 3`

5` Perechi de baze complementare Bratul DHU Bratul DHU Brat T C

Bratul variabil Bucla anticodon Anticodon Bratul anticodon

Modificri ARNr
La eucariote Din transcriptele primare 45 se formeaz ARNr matur: 28 S 18 S i 5,8 S. ARNr 5 S rezult dintr-o molecul precursoare diferit

Spatiatori

Transcrip primar

Clivare

ARNr maturi

Procesarea ARNr eucariot

 La procariote, dup ndeprtarea ARNt obinut prin transcrierea unor gene ARNt intruse, se formeaz ARNr maturi: 23 S, 16 S, i 5 S prin clivarea ARNr precursor 30 S.
Spatiatori Transcript primar Clivare Clivare ARNr maturi

Procesarea ARNr procariot