PRINCIPII GENERALE DE

IZOLARE A
ACIZILOR NUCLEICI

Voaides C. 2020
CINE?

voaidesc@gmail.com
NORME GENERALE ȘI SPECIFICE DE PROTECȚIA MUNCII

❑ în cadrul aplicațiilor practice de inginerie genetică și biologie moleculară se

folosesc unele substanțe chimice, ce pot fi periculoase în cazul în care nu sunt
utilizate/manipulate corespunzător
❑ dintre acestea sunt de menționat (fără a ne limita la acestea):
- FENOLUL - produs chimic puternic coroziv ce provoacă rapid arsuri
chimice grave;
- provoacă leziuni celulare prin precipitarea și denaturarea proteinelor
- este un iritant respirator și pătrunde ușor în pielea umană
- nu vă apropiați prea mult de acest produs în timpul utilizării
- trebuie purtate mănuși și protecție pentru ochi, halat de laborator și ar
trebui lucrat la hotă
- CLOROFORMUL - este un agent cancerigen puternic, ce poate
provoca leziuni ale țesuturilor și organelor
- poate fi inhalat sau absorbit prin piele
- efectele sale sunt cumulative
- dacă este amestecat cu fenol, crește capacitatea fenolului de a
pătrunde în piele
- trebuie purtate mănuși, protecție pentru ochi, halat de laborator și
ar trebui lucrat la hotă
- AGAROZA - fierberea agarozei poate provoca arsuri severe
- trebuie purtate mănuși de protecție atunci când este manipulată
soluția fierbinte de agaroză
- dacă se utilizează cuptorul cu microunde, capacul sticlelor de sticlă
ce conțin agaroză nu trebuie strânse, deoarece acesta va deschide capacul
 - BROMURA DE ETIDIU - este un mutagen puternic, ca urmare a inserției
sale între bazele ADN
- mănușile trebuie purtate întotdeauna la manipularea gelurilor sau
tampoanelor care conțin bromură de etidiu
- trebuie evitată contaminarea obiectelor aflate pe bancul de lucru din zona
în care se lucrează cu bromură de etidiu

❑ ACESTE SUBSTANȚE CHIMICE NU SUNT DĂUNĂTOARE DACĂ

SUNT UTILIZATE CORECT

❑ dacă stropiți accidental oricare dintre aceste substanțe chimice pe piele,

clătiți imediat zona cu apă din abundență și informați cadrul didactic sau
tehnicianul
❑ aruncați deșeurile în recipiente adecvate
❑ CURENTUL ELECTRIC dintr-un dispozitiv de electroforeză în gel este
extrem de periculos
❑ în timpul funcționării dispozitivului, capacul nu trebuie scos niciodată și, de
asemenea, nu trebuie atins tamponul din cuva de electroforeză
❑ asigurați-vă că blatul pe care se rulează gelul este complet uscat
❑ întotdeauna sursa de alimentare trebuie oprită și cablurile deconectate înainte
îndepărtarea unui gel

❑ LUMINA UV utilizată pentru evidențierea ADN, colorat cu bromură de etidiu,

este periculoasă
❑ ochii, fața și mâinile trebuie protejate atunci când este utilizată lumina UV
 REGULI GENERALE

➢ toate zonele comune trebuie păstrate libere și curate

➢ în laborator nu se consumă băuturi și alimente și nu se fumează
➢ echipamentele din laborator se manipulează numai în prezența sau sub stricta
îndrumare a cadrului didactic/tehnicianului
➢ conduita generală a celor prezenți în laborator trebuie să fie una civilizată,
responsabilă și de prevenție
 mănuși
tuburi Eppendorf PCR
tuburi Eppendorf

tuburi Falcon
anse sterile vârfuri pentru micropipete
 eprubete cu dop criotub
plăci Petri
cuvă electroporare

Electroporator
Real-time PCR
Termocycler
Aparat extracție acizi nucleici

Dispozitiv UV și preluare imagini

 Incubator
Hotă microbiologică

Vortex
Microcentrifugă

Centrifugă cu răcire

Aparat pentru gheață

Ansamblu electroforeză (sursă + cuvă + tanc)
Baie de apă

Nano-spectrofotometru

Balanță analitică
Balanță analitică de precizie
 Micropipete multicanal

Micropipete

Micropipete electronice
❑ tehnologia ADN recombinant se referă la
metodologia obţinerii moleculelor de ADN
recombinant, adică de realizare "in vitro" a unor
molecule de ADN noi prin îmbinarea de fragmente
provenite fie din genomul unor specii biologice
diferite, fie de la aceeași specie
❑ îmbinarea respectivelor fragmente se realizează într-o
ordine diferită de cea naturală, astfel încât elementele
genetice utilizate capătă o structură aparte, conferind
organismului în care sunt introduse proprietăți noi pe care nu
le-ar dobândi pe cale naturală
 Extracție
ARN Clonarea Introducerea
fragmentelor de molec. de
ADNp interes într-un
ADNrec într-o
vector de
ADNt clonare (enzime) gazdă specifică
ADN fagic

Identificarea
Purificarea fragmentelor de Identificarea
acizilor interes clonelor de
nucleici (hibridizări interes
moleculare

Separarea Analiza
Obținerea fragmentelor moleculelor
fragmentelor
de ADN de ADN de ADN de
(electroforeză) interes
 Izolarea şi purificarea acizilor nucleici

➢ experimentele de transfer de gene şi clonare "in vitro" necesită

elaborarea unor metodologii specifice de izolare a mai multor tipuri de
ADN:
- ADN genomic (provenit din celule bacteriene, celule vegetale,
celule animale, celule de levuri)
- ADN plasmidial (folosit ca vector de clonare) şi
- ADN fagic (utilizat ca vector de clonare sau pentru testarea unor
enzime de restricţie)
- pentru obţinerea genelor dorite se pot utiliza molecule de ARN ce
sunt mai întâi convertite la ADN prin reverstranscriere şi apoi se realizează
clonarea în vectori specifici
➢ pentru izolarea fiecărui tip de ADN au fost elaborate mai multe metode, ce

depind de scopul urmărit în experimente şi de materialul

biologic (sursa de ADN) utilizat
➢ acizii nucleici trebuie izolați într-o formă cât mai pură
➢ dimensiunea moleculelor de ADN și cantitatea sa variază în funcție de
gradul de complexitate al organismului

➢PK
- ADN cromosomal are o structură dublucatenară
circulară
închisă covalent
supraîncolăcită
dimensiunea sa fiind de ordinul a 1360 µm (aproximativ 109 Da)
➢ cromosomul procariot NU este complexat cu histone sau ARN, fiind
reprezentat exclusiv de ADN
➢ este inclavat direct în citoplasmă, ocupând o regiune limitată, de obicei
centrală și formând nucleoidul (lipsit de membrană)
➢EK
- materialul genetic este închis într-un spațiu
delimitat de o membrană nucleară tipică
dublu stratificată
fiind permanent complexat cu histone și
alte tipuri de molecule (ARN 12 – 13%, proteine
histonice și nonhistonice 68 – 72%, mici cantități de lipide, ioni de calciu și
magneziu, unele poliamide)
- lungimea ADN la eucariote este de circa 100 de ori mai mare decât la
procariote, iar masa moleculară de aprox. 1012 Da
➢ deși metodele utilizate pentru izolare diferă foarte mult în funcție de
gazdă, ETAPELE PRINCIPALE sunt:
❑ obţinerea/alegerea materialului biologic (tipului de celule) din
care se va izola ADN
❑ distrugerea învelișului celular*
....acolo unde e cazul... ?
❑ ruperea membranei plasmatice (liza celulelor) pentru eliberarea
acizilor nucleici
❑ îndepărtarea proteinelor (împreună cu componentele celulare
nedorite = resturi celulare etc.)
❑ precipitarea acizilor nucleici
❑ purificarea acizilor nucleici de interes (opțional)
❑ concentrarea acizilor nucleici obţinuţi anterior (opțional)
 1. OBŢINEREA / ALEGEREA MATERIALULUI BIOLOGIC
(TIPULUI DE CELULE) DIN CARE SE VA IZOLA ADN

*virusuri
- în cazul virusurilor, se pregătește mai întâi o suspensie ce
conține particule virale (un lizat celular)

*bacterii
- ADN bacterian se extrage din celule tinere, al căror înveliș poate
fi mai ușor distrus
- se folosesc suspensii bacteriene de cca. 18 – 24 h

* Eucariote
- la drojdii se preferă celule tinere, cultură de 24h
- pentru animale se alege țesut muscular, organe sau culturi de
cellule
- la plante se pot utiliza fragmente de țesut (mai ales țesut foliar)
sau calus vegetal
 2. DISTRUGEREA ÎNVELIȘULUI CELULAR

❖ la virusuri nu există înveliș celular: se elimină ADN și ARN de la gazdă,

existente în lizatul celular, prin tratament enzimatic și se îndepărtează
capsida virală proteică prin tratament cu fenol

❖ la bacterii există mai multe modalități de distrugere a peretelui celular:

- fizice – mojararea, ultrasonicarea, șocul termic
- astfel, se fragmentează peretele celular și se sparg celulele
- chimice – tratament enzimatic cu lizozim, mutanolizin
- efectul lizozimului* constă în degradarea legăturii β-1,4 dintre
acidul N-acetilmuramic și N-acetilglucozamină, urmată de permeabilizarea
peretelui celular pentru diverși agenți de liză celulară
- inhibarea sintezei peretelui celular cu ajutorul antibioticelor (β-
lactamice)
*IMPORTANT!
Lizozimul, cunoscut sub numele de muramidază sau N-acetilmuramid -
glicanhidrolază, este o enzimă antimicrobiană produsă de animale.
Lizozimul este o hidrolază glicozidică ce catalizează hidroliza legăturilor
1,4-beta între acidul N-acetilmuramic și resturile de N-acetil-D-
glucozamină în peptidoglican, componenta majoră a peretelui celular la
bacteriile gram pozitive. Această hidroliză afectează integritatea pereților
celulelor bacteriene și conduce la liza acestora.
❖ la drojdii se folosește - tratament enzimatic (cu suc de melc, liticază,
zymoliază)
- tratament fizic (ultrasonicarea, mojararea cu
nisip de quartz, biluțe de sticlă etc.)

❖ celulele animale nu sunt protejate de perete celular

❖ celulele vegetale pot fi tratate - fizic – ultrasonicare, șoc termic,

mojarare cu nisip de quartz, polivinilpirolidonă, azot lichid
- enzimatic – cu celulaze
 3. RUPEREA MEMBRANEI PLASMATICE

❖ ruperea membranei celulare și eliberarea conținutului celular se face cu

ajutorul unui tampon de liză ce conține un detergent (SDS*, CTAB**,
Brij, deoxicolat de sodiu)

❖ tamponul de liză trebuie să aibă un pH > 8

❖ la valori mari de pH (12 – 12,8) are loc denaturarea ADN, urmând ca
renaturarea să aibă loc odată cu neutralizarea soluției
*IMPORTANT!
• SDS (dodecil sulfat de sodiu) este un detergent anionic puternic, care
poate solubiliza proteinele și lipidele ce formează membranele
• îndepărtează ionii negativi din proteină și îi distruge conformația
• din cauza pierderii conformației, proteina își pierde structura
• proteinele din membrana celulară se deteriorează și celula se rupe
• acest lucru va ajuta membranele celulare și membranele nucleare să
se descompună și să expună cromozomii care conțin ADN
• pe lângă eliminarea barierelor membranare, SDS ajută la eliberarea
ADN din complexul cu histone și cu alte proteine de legare, prin
denaturarea lor
 **IMPORTANT!
o CTAB (bromură de cetil trimetilamoniu), un detergent cationic,
facilitează separarea polizaharidelor în timpul purificării ADN, în timp ce
aditivii, cum ar fi polivinilpirolidona, pot ajuta la îndepărtarea
polifenolilor
o tampoanele de extracție pe bază de CTAB sunt utilizate pe scară largă
la purificarea ADN din țesuturile plantelor
o principiul purificării ADN folosind CTAB se bazează pe faptul că
polizaharidele și ADN au solubilități diferite în CTAB, în funcție de
concentrația de clorură de sodiu (din compoziția tamponului de
extracție)
o la concentrații mai mari de sare, polizaharidele sunt insolubile, în timp
ce la concentrații mai mici ADN este insolubil
 4. ÎNDEPĂRTAREA PROTEINELOR

✓ prin spargerea celulelor se eliberează o cantitate mare de proteine,

între care pot fi DN-aze, RN-aze sau enzime ce degradează acizii
nucleici
✓ chiar dacă funcția nucleazică este blocată, prezența proteinelor în
soluție poate influența negativ experimentele ulterioare (clivare cu
enzime de restricție, hibridări, reacția PCR, secvențieri etc.)
✓ protejarea ADN de acțiunea DN-azelor se face cu ajutorul detergentului
și al EDTA (EDTA = acid etilen-diamino-tetraacetic = agent chelator)
 EDTA

Agent chelator = leaga ionii de

Mg

ionii de Mg = cofactori
enzimatici ai DN-azelor

DN-azele nu mai functioneaza,

sunt blocate, nu mai ataca ADN
A = structura EDTA
B = ”M” înseamnă cationi metalici bivalenți (Ca2+, Mg2+)
C = EDTA complexează cationii bivalenți, făcând astfel indisponibilă DN-aza
✓ atunci când se urmărește izolarea ARN, nu e suficientă prezența
EDTA, deoarece RN-azele nu necesită Mg2+ în calitate de cofactori
✓ în acest caz trebuie să se lucreze în condiții de sterilitate maximă și
să se adauge proteinază K*

✓ proteinele sunt denaturate prin utilizarea

fenolului
amestecului cloroform:alcool izoamilic 24:1 v/v
amestecului fenol:cloroform:alcool izoamilic 25:24:1 v/v
îndepărtarea lor făcându-se prin centrifugare (ADN rămâne în
faza apoasă)
IMPORTANT!

o Proteinaza K – o serin-protează cu spectru larg, este utilizată pentru digestia

contaminanților de natură proteică, în protocoalele de izolare a acizilor
nucleici
o adăugarea proteinazei K duce la inactivarea rapidă a nucleazelor – enzime ce
denaturează, de altfel, ADN sau ARN în timpul protocolului de izolare
o această enzimă este deosebit de utilă în aplicații de izolare a acizilor nucleici,
deoarece este activă în prezența substanțelor chimice care denaturează
proteinele (SDS sau uree), a agenților chelatori (EDTA, soluții cu sulfhidril)
sau a inhibitorilor tripsinei sau chemotripsinei
 5. PRECIPITAREA ADN

▪ se poate face cu:

- 2 – 2,5 volume de alcool etilic absolut și incubare la rece
- 0,7 – 1 volum alcool izopropilic și incubare 10 – 15 min. la
temperatura camerei
- PEG 60% și incubare la 43oC, peste noapte
▪ recuperarea ADN se face prin centrifugare la rece, la turație mare,
sedimentul fiind reluat în tampon de păstrare TE (Tris 10 mM, EDTA 1
mM, pH 8)
 IMPORTANT!

• ADN rămâne dizolvat într-o soluție apoasă, deoarece ADN are ”schelet”
fosfodiesteric (deci, de natură hidrofilă)
• molecula de apă formează învelișul de hidratare al ADN, formând
legături de hidrogen
• etanolul, precum și izopropanolul sunt utile în precipitarea ADN,
deoarece rup acest înveliș
• volumul necesar de izopropanol este mai mic (0,7 volume din
supernatant) decât cel de etanol (2,5 volume), deoarece izopropanolul
are o capacitate mai mare de a reduce constanta dielectrică a apei decât
etanolul
• în timp ce isopropanolul este unic în acțiunea sa, ARN (are 2 grupări -
OH în plus, și rămâne astfel legat prin legături de hidrogen cu apa, mai
puternic decât ADN) tinde să rămână solubil în acesta, astfel încât se
poate face precipitarea selectivă a ADN
• isopropanolul dizolvă, de asemenea, solvenții nepolari, cum ar fi
cloroformul, astfel încât impuritățile formate în etapa anterioară pot fi
astfel îndepărtate
1 g = 103 mg = 1.000 miligrame (mg)

1 g = 106 µg = 1.000.000 micrograme (µg)

1 g = 109 ng = 1.000.000.000 nanograme (ng)

1 kg = 103 g = 1.000 grame (g)

g.............mg..................... µg...................ng.......................pg
1………..103………………106..................109......................1012

1 mg = ? g 1 mg = 0,001 g = 10-3 g

1 mg = ? ng 1 mg = 1.000.000 ng = 106 ng

1 µg = ? ng 1 µg = 1.000 ng = 103 ng
1 g = ? µg 1 g = 1.000.000 µg = 106 µg

1 ng = ? µg 1 ng = 0,001 µg = 10-3 µg

1 µg = ? g 1 µg = 0,000001 g = 10-6 µg

1 g = ? kg 1 g = 0,001 kg = 10-3 kg

Nr. de moli
md (g)
Cm =
M x Vs(l)
 EXERCIȚII ȘI PROBLEME

Calculați câte g de substanță sunt necesare pentru a obține:

a) 213 ml soluție NH4Cl 0,6M
b) 359 ml soluție NaCl 2 M
c) 2,5 ml soluție EDTA 0,5 M
d) 37 ml soluție Tris bazic 1,5M
e) 789 µl soluție NaCl 10 mM
 Ci x Vi = Cf x Vf
C f x Vf
Vi =
Ci
Calculați volumul de apă necesar pentru a obține următoarele soluții
diluate:
a) 1 ml soluție 2 mM dintr-o soluție 13 mM
b) 3,5 ml soluție 12 mM dintr-o soluție 25 mM
c) 0,5 ml soluție 3 mM dintr-o soluție 10 mM
d) 0,5 ml soluție 2,3 M dintr-o soluție 12 M
e) 500 ml soluție 1X dintr-o soluție 10X
f) 438 ml soluție 0,5X dintr-o soluție 10X
 Calculați ce volume de soluții sunt necesare pentru a obține:
a) 10 ml amestec cloroform:alcool izoamilic 24:1 (v/v)
b) 5,4 ml amestec fenol:cloroform:alcool izoamilic 25:24:1 (v/v)
c) 15,8 µl amestec cloroform:alcool izoamilic 24:1 (v/v)
d) 3 ml amestec fenol:cloroform:alcool izoamilic 25:24:1 (v/v)

cloroform................................alcool izoamilic...................................amestec
24 p ............................ ..................1 p................................. ...................25 p = ml
y ml ............................ ..................x ml....................................................10 ml

10 x 1 10 x 24
X= y=
25 25
Dar daca lucram cu microlitri, cum facem?