See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/336059019

INGINERIE GENETICĂ 3. INGINERIA GENOMICĂ

Chapter · September 2019

CITATION READS

1 3,026

1 author:

Aurel Popescu
University of Pitesti
39 PUBLICATIONS   161 CITATIONS   

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Euroberry Research: From Genomics to Sustainable Production, Quality & Health View project

Euroberry Research: From Genomics to Sustainable Production, Quality & and Health View project

All content following this page was uploaded by Aurel Popescu on 26 September 2019.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 INGINERIE GENETICĂ

3. INGINERIA GENOMICĂ

Progresele recente în ingineria genomică permit modificarea

secvențelor de ADN în celulele vii, făcând posibil controlul materialului
genetic într-un mod fără precedent. La plante, printre aplicațiile de maxim
interes realizabile prin inginerie genomică sunt rezistența la dăunători,
sporirea valorii nutritive și capacitatea de a crește pe solurile sărace.
In multe cazuri, plante cu astfel de caractere vor putea fi create prin
modificarea a doar câteva dintre miliardele de nucleotide pe care le
conține genomul lor. Valoarea lor de ansamblu și percepția publică vor
determina măsura în care plantele create prin inginerie genomică vor
contribui la securitatea alimentară a populației.
Pe parcursul ultimilor 100 de ani, productivitatea agricolă a
crescut remarcabil ca rezultat al producerii de plante hibride și al utilizării
genelor “Revoluției Verzi” – gene codificând caracteristici care conduc la
o productivitate crescută. Cu aproape trei decenii în urmă, eforturile
având ca scop ameliorarea plantelor au fost concentrate pe transgeneză,
adică pe introducerea de ADN străin în genomul plantelor. Exemple
relevante de rezultate ale transferului de gene străine la plantele cultivate
sunt soia și porumbul conținând una sau mai multe transgene responsabile
de caractere cum sunt rezistența la insecte și/sau rezistența (sau toleranța)
la erbicide. Transgeneza este, în mod fundamental, un proces de adăugare
de gene; deci, caracterele cu valoare agricolă sunt expresia repertoriului
genetic nativ al plantelor. Mai mult, extinderea cultivării plantelor create
prin introducerea de ADN străin, în special a celor generate prin transferul
de gene de la organisme înrudite îndepărtat sau neînrudite, a fost
împiedicată sau limitată de reținerea consumatorilor față de acestea.
Cadrul legislativ creat pentru a proteja mediul și pentru a răspunde
îngrijorării (temerilor) publice privind securitatea a crescut considerabil
costul producerii de plante transgenice. Aceste costuri au limitat utilizarea
tehnologiilor de transfer de gene pentru crearea de plante de cultură cu
caractere valoroase din punct de vedere agricol la doar câteva specii
profitabile, cum sunt bumbacul, soia și porumbul.
Instrumentele ingineriei genomice fac posibilă manipularea
precisă a ADN în celulele vii. Deși ingineria genomică poate fi utilizată
pentru a adăuga o transgenă într-o locație specifică dintr-un genom,
oferind astfel o cale mai precisă de modificare genetică decât cea a
transferului de gene (transgenezei), o aplicație mult mai puternică este cea
a modificării informației genetice pentru crearea de caractere noi. În mod
tradițional, caracterele noi sunt introduse în soiurile de plante cultivate

181
 AUREL POPESCU

prin încrucișare, exploatând variația genetică existentă natural. Alternativ,

se crează variație genetică nouă prin mutageneză.
Ingineria genomică permite ca mai întâi să se determine
modificările în secvența de ADN care sunt dorite în soiul cultivat și apoi
să se realizeze aceste modificări în mod precis și rapid. Capacitatea de a
controla tipul variației genetice introduse în plantele cultivate promite
schimbarea modului în care sunt create soiurile noi.
Ingineria genomică este posibilă prin exploatarea căilor de
reparare a ADN celular. Majoritatea tehnicilor de inginerie a genomului
direcționează repararea ruperilor dublu catenare ale ADN, care sunt
introduse în genom la nivelul, sau în apropierea situsului unde este dorită
o modificare a secvenței ADN.
Ruperile (tăierile) dublu catenare sunt realizate utilizând nucleaze
cu specificitate de secvență (SSN) – enzime care recunosc și taie locusul
țintă (vizat) cu înaltă specificitate. Repararea ruperii poate fi direcționată
pentru a crea o varietate de modificări ale secvenței de ADN, de la deleții
ADN până la inserția de șiruri mari de transgene.

3.1. MODIFICAREA GENOMULUI PRIN MUTAGENEZĂ

DIRECȚIONATĂ CU OLIGONUCLEOTIDE

Mutageneza situs-direcționată este o metodă utilizată pentru

modificarea secvenței de nucleotide a ADN clonat, într-o poziție
predefinită. Această metodă permite realizarea de modificări ale unei
singure perechi de nucleotide, ale câtorva perechi de nucleotide, sau
modificări ale unor secvențe mai extinse (mari) de ADN, cum ar fi deleții
sau inserții de secvențe de nucleotide.
Potențialul de a realiza mutații direcționate ale unor situsuri în
ADN clonat a crescut semnificativ odată cu progresul metodelor de
sinteză de oligonucleotide sau segmente scurte de ADN. De altfel, a
devenit evident faptul că mutageneza situs-direcționată este realizată cel
mai ușor și cel mai precis utilizând oligonucleotide.
În prezent, mutageneza direcționată cu oligonucleotide este o
tehnologie ce permite inducerea ţintită (situs-specifică) a unor mutaţii
punctiforme în genomul celulelor vegetale sau animale. Gena țintă este
modificată fără integrarea de ADN străin în genom. Modificările sunt
făcute la nivelul materialului genetic al organismului prin mecanismele
proprii de reparare (Fig. 75).

182
 INGINERIE GENETICĂ

Vector plasmidial

ADN este tăiat cu enzimele XbaI și BglII

Se îndepărtează fragmentul Două oligonucleotide sintetice

original (wild-type)

Vector plasmidial
Fragmentul de ADN original
(wild-type)

“Caseta” ADN

ADN ligază

Sunt transformate celule ADN mutant

bacteriene competente

Se prepară ADN plasmidial.

Toate plasmidele rezultate conțin
secvența mutantă

Fig. 71. Mutageneza casetei. O plasmidă conținând o clonă a genei de

interes (segmentul negru) este tăiată cu două enzime de restricție, de
exemplu, XbaI și BglII, fiecare din ele având un singur situs de restricție
în întreaga plasmidă. Amestecul de reacție este separat prin electroforeză
în gel de agaroză, și cel mai mare fragment este purificat din gel. Prin
sinteză de ADN sunt sintetizate două oligonucleotide monocatenare ale
căror secvențe sunt complementare una celeilalte și diferă de secvența
originală (wild-type) într-o singură poziție (banda neagră) și conțin
modificările dorite. Oligonucleotidele sunt amestecate într-o soluție care
favorizează hibridizarea celor două catene în virtutea complementarității
secvențelor lor. Capetele fragmentului dublu catenar (duplex) sunt
monocatenare, coezive, capete lipicioase care se unesc cu situsurile XbaI

183
 AUREL POPESCU

și BglII. Caseta ADN este amestecată cu fragmentul izolat, și cele două

molecule sunt unite covalent prin acțiunea ligazei ADN T4. ADN ligat
este transferat în E. coli, și sunt selectate coloniile rezistente la antibiotic.
Este preparat (extras) ADN plasmidial din coloniile bacteriene
individuale. Intrucât cele două fragmente lineare nu pot transforma ele
însele E. coli, toate coloniile conțin plasmide cu secvența mutantă
(http://what-when-how.com/molecular-biology/site-directed-mutagenesis-
part-1-molecular-biology/).

Procedeele actuale utilizate pentru mutageneza situs-direcționată

bazată pe oligonucleotide pot fi grupate în două categorii: (1) mutagenaza
casetei; (2) extensia enzimatică a unei oligonucleotide mutagenice legată
pe bază de complementaritate la o matriță ADN. Mutageneza casetei este,
în practică, cea mai simplă dintre cele două căi. Aceasta este o variantă a
sintezei de gene totale, în care o genă este construită prin legarea unei
serii de oligonucleotide sintetice.
Mutageneza casetei (Fig. 71) implică înlocuirea unui fragment din
ADN clonat (gena de interes) cu un alt fragment de ADN (un fragment de
restricție) conținând modificările nucleotidice dorite. Procesul începe prin
digestia ADN clonat cu una sau două enzime de restricție pentru
eliberarea (obținerea) fragmentului (de ADN) conținând secvența ce
trebuie modificată. Noua secvență (mutantă) este construită din două
oligonucleotide monocatenare complementare, sintetice, care sunt mai
întâi amestecate împreună într-o soluție tamponată pentru a hibridiza și a
forma molecule dublu catenare (duplex) de ADN, dar cu capete coezive,
pentru a hibridiza cu situsurile de restricție ale vectorului. Pentru a
poziționa fragmentul sintetic înapoi în vector, capetele fragmentului
sintetic de ADN trebuie să fie aceleași ca în fragmentul original (wild-
type). ADN-ul clonat din vector care rămâne este amestecat cu fragmentul
sintetic, și cele două sunt legate la loc prin acțiunea enzimei ligaza (de la
bacteriofagul T4). După unirea celor două molecule (de ADN), ADN din
reacția de ligare este introdus în celule competente de E. coli și apoi sunt
selectate moleculele recombinate conținând mutația dorită.
In general, mutageneza casetei are ca rezultat aproape 100% clone
având secvența nouă dorită (mutantă). Singura dificultate asociată cu
această metodă este aceea că situsurile de recunoaștere unice, distribuite
la distanțe convenabile, pentru endonucleaze de restricție, pentru a exciza
o casetă mică în locul dorit, adeseori lipsesc. In acest caz, se poate opta
pentru metoda extensiei enzimatice.

184
 INGINERIE GENETICĂ

Extensia enzimatică a unei oligonucleotide mutagenice

Principiul și rezultatul final al mutagenezei situs-direcționate prin

extensia oligonucleotidelor sunt similare celor ale mutagenezei casetei:
O oligonucleotidă codificând secvența de ADN nouă, dorită, este inserată
într-un fragment clonat de ADN. In metoda de bază, o oligonucleotidă
scurtă, de obicei cu o lungime de 20 până la 40 de nucleotide, este
hibridizată secvenței sale complementare într-o matriță ADN wild-type,
circulară, monocatenară. Secvența oligonucleotidei este proiectată în așa
fel ca noua secvență (mutantă) să se găsească în mijlocul oligonucleotidei
și flancată de secvențe wild-type la capete. Pe parcursul atașării
complementare (annealing) a oligonucleotidei la ADN matriță, secvențele
wild-type din cadrul oligonucleotidei sunt perfect complementare ADN-
ului matriță, însă secvențele mutante nu sunt perfect complementare
(Fig. 72). Secvențele wild-type trebuie să fie suficient de lungi astfel încât
oligonucleotida să formeze un duplex stabil cu ADN matriță. In
continuare, se adaugă o ADN polimerază și precursori ai nucleotidelor
(dNTP) pentru sintetizarea catenei complementare rămase, utilizând
oligonucleotida mutagenică ca primer pentru sinteza ADN. In trecut, în
mutageneza situs-direcționată erau utilizate variante ale ADN polimerazei
de la E. coli. Mai recent, ADN polimerazele de la E. coli au fost înlocuite
cu cele de la bacteriofagii T4 sau T7. Aceste ADN polimeraze sunt mai
lucrative decât cele de la E. coli și nu dislocă/deplasează sau corectează
oligonucleotida mutagenică, îmbunătățind astfel frecvența plasmidelor
mutante obținute.
Tehnica mutagenezei situs-direcționată se bazează pe reacția de
polimerizare în lanț (PCR). PCR implică producerea a numeroase copii
ale unui segment scurt de ADN (care conține/include secvența ce se
dorește a fi amplificată, denumită “ADN matriță”) printr-un procedeu ce
implică cicluri succesive de: (1) denaturare (prin încălzire la circa 95°C);
(2) atașare de primeri (secvențe scurte de nucleotide/ADN monocatenar,
complementare secvențelor de nucleotide din regiunile în amonte și
respectiv în aval ale segmentului de ADN ce trebuie amplificat) la
monocatenele ADN rezultate în urma denaturării (prin scăderea
temperaturii la 55-60°C); (3) extensie/alungire a secvențelor primer
atașate la monocatene (prin acțiunea unei ADN polimeraze, la
temperatura de 70-72°C, dependent de enzima utilizată). ADN polimeraza
reconstruiește fiecare catenă ADN, pornind de la secvența primer,
utilizând monocatenele ADN ca matrițe. Procesul de denaturare, atașare a

185
 AUREL POPESCU

secvențelor primer și extensie, este repetat de 25-35 de ori, cantitatea de

ADN dublându-se după fiecare ciclu.

Matrița ADN conținând secvența

wild-type
Denaturare

Primerul conținând mutația

se atașează la matriță

P M
Atașare
M P

Primerul conținând mutația

se atașează la matriță

Extensie

Denaturare

Atașare

Plasmidă completă Extensie Plasmidă completă

conținând mutația conținând mutația

Fig. 72. Odată ce procesul mutagenezei situs-direcționată este încheiat,

marea majoritate a ADN va conține mutația dorită. Totuși, mai există încă
unele matrițe nemutante rămase din amestecul de reacție original. Etapa
finală a procesului de mutageneză situs-direcționată este aceea a
îndepărtării acestui ADN matriță. Plasmida conținând secvența matriță
este adesea crescută în bacterii care metilează (atașează grupări -CH3 la)
ADN ca o cale de reglare a exprimării genelor pe care le conține.
Endonucleaza de restricție DpnI este o enzimă care țintește ADN metilat,
tăind catenele ADN în oligonucleotide scurte care nu pot fi exprimate.

186
 INGINERIE GENETICĂ

De aceea, pentru îndepărtarea oricărui rest de ADN matriță (cercurile

negre din diagramă), amestecul de reacție este tratat cu DpnI (http://www.
di.uq.edu.au/proj21proc). Legendă: M = ADN matriță; P = primer.

PCR pentru mutageneza situs-direcționată diferă de PCR de

rutină, în primul rând prin aceea că primerii utilizați (unul pentru regiunea
din amonte și celălalt pentru regiunea din aval) sunt complementari unul
celuilalt – ADN polimeraza realizează o buclă completă în jurul matriței
ADN și amplifică întreaga plasmidă conținând gena țintă, și nu doar un
scurt segment ADN dintre cei doi primeri; în al doilea rând (aceasta este
diferența cea mai importantă), spre deosebire de PCR de rutină, în care se
utilizează primeri ce sunt perfect complementari regiunilor (plasmidei) la
care se leagă, primerii utilizați în mutageneza situs-direcționată conțin
baze necomplementare (nepereche) (Fig. 72) care creează mutația în ADN
sintetizat. Acești primeri sunt sintetizați cu mutația dorită (ceea ce poate
însemna cu secvența normală a unei gene de interes).

3.2. TEHNOLOGII DE EDITARE A GENOMULUI

Editarea genomului include o serie de tehnici moleculare care

permit inducerea unor schimări direcţionate (ţintite) în genomurile
organismelor. Denumită şi “inginerie genomică” (genome engineering)
sau mutageneză situs-direcţionată, editarea genomului permite:
- modificarea informaţiei genetice pentru a genera noi însuşiri;
- îndepărtarea unor regiuni specifice din genomuri;
- adăugarea unor transgene (gene provenite de la alte
organisme) în locații specifice din genomuri.
Pentru introducerea caracterelor dorite la plante, este mai precisă
decât metodele convenţionale de ameliorare şi decât multe dintre
metodele standard de inginerie genetică (transgeneză) (www.science
mediacentre.org/genome-editing).
Editarea genomului modifică cu precizie nucleotidele (A, T, G, C)
din informaţia genetică codificată folosind: (1) “foarfeci moleculare”
(nucleaze) astfel modificate încât să taie ADN în locuri predictibile; (2)
mecanisme naturale celulare de reparare a ADN.
Nucleazele pot fi modificate astfel încât să recunoască locații
specifice în genom şi, tăind la nivelul respectivelor locații, să stimuleze

187
 AUREL POPESCU

căile de reparare a ADN, care mediază editarea genelor. Pentru editarea

genomului se folosesc 4 tipuri de nucleaze secvenţă-specifice:
1) Meganucleazele (Meganucleases);
2) Nucleazele “degete de zinc” (Zinc Finger Nucleases - NZF);
3) TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) -
nucleaze efectori care acţionează ca activatori transcripţionali;
4) CRISPR)/Cas9 (Clustered Regularly Interspersed Short
Palindromic Repeats) - repetiţii palindromice scurte intercalate
în mod regulat.

Meganucleazele

Meganucleazele sunt endodezoxiribonucleaze caracterizate printr-

un situs de recunoaștere foarte mare (secvențe dublu catenare de ADN de
12 până la 40 de perechi de baze); ca urmare, acest situs apare, în general,
o singură dată în genomul unui organism. De exemplu, secvența de 18
perechi de baze recunoscută de meganucleaza SceI ar avea nevoie, în
medie, de un genom de 20 de ori mai mare decât genomul uman pentru a
fi găsită odată (deși secvențe cu o singură împerechere greșită apar în
medie de trei ori per genom de mărimea celui uman). De aceea, se
consideră că meganucleazele sunt cele mai specifice enzime de restricție
ce apar în mod natural.
Dintre meganucleaze, familia LAGLIDADG de endonucleaze
voiajoare (homing endonucleases) a devenit în cursul ultimelor două
decenii un instrument valoros pentru ingineria genetică. Meganucleazele
sunt “foarfece ale moleculelor de ADN” care pot fi utilizate pentru
înlocuirea, eliminarea sau modificarea secvențelor într-un mod foarte
țintit. Prin modificarea secvenței lor de recunoaștere prin inginerie
proteică, poate fi schimbată secvența țintită.
Meganucleazele sunt utilizate pentru modificarea tuturor tipurilor
de genomuri (la bacterii, plante, sau animale). De mare interes sunt
aplicațiile (bazate pe utilizarea meganucleazelor) din domeniul medicinii
umane, de exemplu cele ce au ca scop eliminarea materialului genetic
viral, sau repararea genelor defecte, utilizând terapia genică.
Specificitatea ridicată a meganucleazelor le conferă un grad ridicat
de precizie și o toxicitate celulară mult mai scăzută decât a altor enzime
de restricție sintetizate în mod natural.
Meganucleazele au fost identificate în anii 1990 și în scurt timp
s-au dovedit a fi instrumente deosebit de promițătoare pentru ingineria

188
 INGINERIE GENETICĂ

genomică și editarea genelor, deoarece ele sunt capabile să inducă în mod

eficient recombinarea omoloagă (Epinat și colab., 2003), să genereze
mutații (Arnould și colab., 2007) și să modifice cadrele de citire/lecturare
(reading frames) (Chapdelaine și colab., 2010). Totuși, recombinările
genetice induse de meganucleaze care pot fi realizate sunt limitate de
gama de meganucleaze disponibile. Deși în natură există sute de
meganucleaze și fiecare dintre ele este capabilă să tolereze variații minore
în situsul lor de recunoaștere, probabilitatea de a găsi o meganuclează
capabilă să taie o genă dată într-o localizare dorită este extrem de mică.
Acesta a fost motivul pentru care numeroase echipe de cercetare și-au
concentrat atenția asupra creării de meganucleaze noi prin inginerie
moleculară, care pot ținti situsuri de recunoaștere dorite.
Crearea de meganucleaze “la comandă”, se face pe două căi:

1) Modificarea specificității meganucleazelor existente prin

introducerea unui număr mic de variații în secvența de
aminoacizi și apoi selecția proteinelor funcționale în funcție de
situsurile de recunoaștere ale acestora (Seligman și colab.,
2002; Sussman și colab., 2004; Rosen și colab., 2006).
2) Exploatarea unei proprietăți ce joacă un rol important în
gradul ridicat de diversificare a meganucleazelor sintetizate în
mod natural: posibilitatea asocierii sau fuzionării domeniilor
proteice ale diferitelor enzime (Arnould și colab., 2006; Smith
și colab., 2006). Această opțiune face posibilă crearea de
meganucleaze himerice cu un situs nou de recunoaștere.

Cele două căi pot fi combinate pentru a crește posibilitatea creării

de enzime (meganucleaze) noi, în condițiile menținerii gradului ridicat de
eficacitate și specificitate.
Compania de biotehnologie Precision Biosciences a elaborat un
proces de creare de meganucleaze modificate prin inginerie moleculară
denumit Directed Nuclease Editor (DNE). Aceste meganucleaze pot ținti
și modifica locații definite dintr-un genom (Gao și colab., 2010). In anul
2012, cercetătorii de la Bayer Crop Science au utilizat DNE pentru
incorporarea țintită, într-un situs prestabilit, a unei secvențe genice în
ADN-ul plantelor de bumbac.
O realizare recentă a utilizării meganucleazelor pentru ingineria
genomică este incorporarea domeniul de legare la ADN de la efectorii
similari activatorilor transcripției (transcription activator-like effectors,
TAL effectors) în nucleazele hibride. Aceste meganucleaze hibride

189
 AUREL POPESCU

combină ușurința modificării prin inginerie moleculară și specificitatea

ridicată a legării la ADN a unui efector TAL, cu eficiența ridicată de
clivare (tăiere) a meganucleazelor (Boissel și colab., 2014). In plus,
meganucleazele au fost fuzionate cu enzimele de procesare finală a ADN
pentru a stimula creșterea frecvenței de evenimente mutaționale într-o
locație dată (Delacoté și colab., 2013).

Nucleazele programabile

Nucleazele programabile (denumite și nucleaze designer) (Fig. 73)

- incluzând nucleazele degete de zinc (ZFN), nucleazele efector care
acţionează ca activatori transcripţionali (TALEN), repetiţiile palindromice
scurte intercalate în mod regulat (CRISPR)/Cas9) și nucleazele ghidate de
ARN, modificate prin inginerie moleculară (RGEN) (ultimele, derivate
din CRISPR), fac posibile modificări genetice țintite în celulele cultivate,
precum și în plante și animale întregi (Fig. 74).
Valoarea nucleazelor programabile în cercetarea din domeniul
biotehnologiei și ingineriei genetice, în medicină și agricultură, rezultă
din capacitatea de a induce tăieri situs-specifice în genom, a căror
reparare (prin mecanismele endogene) permite editarea cu mare precizie a
genomului.
Între nucleazele programabile există câteva diferențe, încluzând
compoziția lor, situsurile de țintire, specificitatea și modelul de mutație
(mutation signature). Cunoașterea caracteristicilor și particularităților
acestor nucleaze este esențială pentru cercetători (incluzând inginerii
geneticieni), în funcție de ele făcându-se alegerea celei mai adecvate
tehnici pentru o anumită aplicație (Kim și Kim, 2014).

Tehnologia nucleazelor deget de zinc

Tehnologia nucleazelor deget de zinc (NZFs) utilizează nucleaze

sintetizate artificial pentru introducerea unor mutaţii situs-specifice, adiţia
sau inactivarea situs-specifică a unor gene, înlocuirea unei gene, sau
cumularea mai multor gene (stacking) în genomurile plantelor.
Nucleazele deget de zinc se obţin prin fuziunea unei nucleaze,
care taie ADN dublu catenar, cu un domeniu deget de zinc al unui factor
de transcripţie astfel conceput încât să se ataşeze unei secvenţe specifice,
aflate într-un anumit locus (Fig. 73). Cu alte cuvinte, domeniul
funcţionează ca un instrument de direcţionare a nucleazei cu care este
fuzionat spre o anumită secvenţă, care trebuie clivată, din genomul

190
 INGINERIE GENETICĂ

complex. Existenţa mecanismului endogen de reparare a ADN permite

folosirea enzimelor deget de zinc pentru a face modificări situs-specifice
şi permanente în genom.
Într-o primă variantă, genele care codifică nucleazele degete de
zinc ZF-1 sunt introduse în celule fără o matriţă pentru repararea ADN.
Nucleazele ZF-1 recunosc în celule locul ţintă pentru care au fost
“concepute” şi taie ADN la nivelul respectiv, generând rupturi dublu
catenare situs-specifice. Prin generarea rupturilor dublu catenare este
indus procesul natural de reparare a ADN prin recombinare neomoloagă.
Recombinarea neomoloagă determină modificări, constând din scurte
deleţii sau inserţii, la nivelul uneia sau al câtorva perechi de baze.
Într-o a doua variantă, genele care codifică nucleazele deget de
zinc ZF-2 sunt introduse în celule cu o matriţă pentru repararea ADN,
omoloagă cu regiunea ţintită din genom, care acoperă mai multe kilobaze.
NZF-2 se ataşează de ADN şi generează rupturi dublu catenare situs-
specifice. Mecanismele naturale de reparare a ADN generează mutaţii la
nivelul uneia sau al câtorva perechi de baze prin recombinare omoloagă şi
copierea matriţei reparate.
Ultima variantă presupune introducerea în celule vegetale sau
animale a genelor care codifică nucleazele “deget de zinc” ZF-3 specifice
locului în care se urmăreşte integrarea unei anumite transgene, împreună
cu fragmente de ADN sau cu casete lungi de mai multe kilobaze. Concret,
se asamblează o moleculă de ADN recombinat care conţine insertul, mai
precis, informaţia care trebuie integrată. Insertul este delimitat de
secvenţe omoloage cu secvenţele de ADN care flanchează locul în care va
acţiona NZF. Construcţia - practic, un ADN donor - este inclusă la nivelul
clivării dublu catenare. Acest ADN poate avea origine endogenă, poate fi
omolog sau heterolog (provenit de la oricare altă specie).

Tehnologia CRISPR

Tehnologia CRISPR (clustered regularly interspaced short

palindromic repeats), al cărei potențial a fost demonstrat pentru prima
dată de Jennifer Doudna și Emmanuelle Charpentier în anul 2012, este o
tehnologie revoluționară pentru ingineria genetică, care permite
modificarea cu mare precizie a genomului oricărui organism viu (inclusiv
al oamenilor).

191
 AUREL POPESCU

Fig. 73. Nucleazele designer. (A) Nucleazele “degete de zinc” (zink finger
nucleases - ZFNs) combină un domeniu de legare ADN “deget de zinc”
cu enzima (nickase) FokI ce cauzează ruperi monocatenare. Fiecare
“deget de zinc” recunoaște o tripletă de baze și, în mod obișnuit, în fiecare
domeniu țintă sunt prezente trei până la șase degete de zinc. Clivarea se
produce înafara secvenței țintă și necesită o pereche de nucleaze “degete
de zinc” (ZFNs), fiecare legându-se la o catenă a ADN. (B) In mod
similar nucleazelor “deget de zinc”, nucleazele efector similare
activatorilor transcripției (transcription activator-like effector nucleases -
TALEN), au două domenii: un domeniu de legare ADN și un domeniu
pentru enzima FokI. Domeniul de țintire este compus din repetiții de 33-
35 de aminoacizi, fiecare legându-se la o singură nucleotidă. Mecanismul
de clivare a nucleazelor efector similare activatorilor transcripției
(TALENs) este identic celui al nucleazelor deget de zinc (ZFNs).
(C) Repetițiile palindromice scurte intercalate regulat (clustered regularly
interspaced short palindromic repeats - CRISPR) este un sistem de

192
 INGINERIE GENETICĂ

endonucleaze ale ADN dublu catenar, dirijat de ARN. Specificitatea de

clivare este asigurată de ARNcr (albastru) care hibridizează cu o secvență
țintă (verde). Clivarea este realizată de proteina Cas9 care, pe lângă
ARNcr, necesită ARNtracr pentru a fi activă. Situsul de clivare (stea
roșie) este localizat între secvența țintă și motivul protospațiator adiacent
NGG, complementar secvenței imediate din aval de țintă. ARNcr și
ARNtracr pot fi fuzionate pentru a forma ARN de ghidare cu activitate
similară (Ejsmont și Hassan, 2014; http://www.mdpi.com/2073-4425/5/2/
385/htm).

Prin analogie cu editarea textelor, CRISPR ar fi echivalentă cu

modificarea precisă a literelor de pe orice pagină a unei enciclopedii, fără
a face nicio greşeală de ortografie. La om, de exemplu, devine practic
posibilă modificarea precisă, în detaliu, a oricărei poziţii specifice din
ADN-ul/secvența de nucleotide a celor 23 de perechi de cromozomi
umani, fără a introduce mutaţii nedorite ori greşeli (terapia genică umană
s-a bazat până acum pe metode mult mai puţin precise de modificare a
genomului, adesea implicând virusuri modificate care inserează la
întâmplare porţiuni de ADN în genom).
La o întâlnire pe tema editării genomului uman, care a avut loc la
sfârșitul anului 2015 la Academia Națională de Științe a SUA,
geneticianul George Church de la Școala Medicală Harvard, co-fondator
al companiei de biotehnologie eGenesis, a anunțat că echipa din care face
parte a inactivat (prin deleții) 62 de retrovirusuri endogene porcine
(PERV) în embrioni de porci, utilizând tehnologia CRISPR/Cas9 de
editare a genomului. Aceste virusuri sunt integrate în genomurile tuturor
porcilor și, pentru că ele nu puteau fi neutralizate, exista teama că în cazul
transplantului de organe (xenotransplant) ar putea cauza boli virale grave
indivizilor umani primitori. Echipa respectivă de cercetători a mai
modificat, într-un set separat de embrioni de porc, peste 20 de gene,
incluzând gene codificând proteine care stau la suprafața celulelor și care
sunt cunoscute ca declanșatoare ale răspunsului imun uman sau cauzează
coagularea sângelui. Cel mai probabil, organele care vor fi folosite pentru
transplant vor fi prelevate de la animale la care sunt modificate atât genele
pentru proteinele responsabile de declanșarea răspunsului imun, cât și
genele de virulență ale PERV.
Se apreciază că această tehnologie inovativă va revoluţiona studiul
şi tratamentul unei întregi serii de boli, de la cancere şi infecţii incurabile
(cum este infecția cu HIV), la afecţiuni ereditare.

193
 AUREL POPESCU

Proteina deget de zinc Efector de tipul activatorului Cas9-ARNg

transcripțional

Gena țintă

Matrița ADN donor

Divizarea genei Deleție genomică Adiție sau înlocuire genică

Fig. 74. Aplicațiile tehnologiilor de editare a genomului. (a) Structurile unei

proteine deget de zinc (PDB: 1AAY), TALE (3UGM) și CRISPR (4OO8)
ce se leagă la ADN. Stânga și centru: gri, ADN; albastru, proteine; roșu,
lanțurile laterale ale aminoacizilor responsabile de țintirea ADN. Dreapta:
gri, ADN; albastru, enzima Cas9; roșu, ARNg. (b) O ruptură dublu
catenară indusă de nuclează poate conduce la scoaterea din funcțiune a
genei, deleția de regiuni genomice sau modificarea genică. (c) Aplicațiile
includ genetica inversă, modelarea bolilor, agricultura și terapia genică
(Genome engineering: the next genomic revolution; Gersbach, 2014).

194
 INGINERIE GENETICĂ

Modificarea precisă a genomului după producerea de ruperi dublu

catenare în situsul ADN dorit se realizează prin exploatarea mecanismelor
proprii ale celulelor de reparare a ruperilor (Fig. 75).

Knock-out sau knock-in mediat de unirea neomoloagă a capetelor

Deleție, inversie, inactivare de gene multiple, sau rearanjare

cromozomială mediată de unirea neomoloagă a capetelor

sau
sau

Înlocuirea genei sau knock-in mediat de recombinare omoloagă

Fig. 75. Ingineria țintită a genomului prin unirea capetelor neomoloage

sau recombinare omoloagă utilizând nucleaze cu specificitate de secvență.
(A) repararea mediată de unirea neomoloagă a capetelor (NHEJ, non-
homologous end joining) poate avea ca rezultat deleții sau inserții mici la
nivelul situsurilor țintă, care întrerup funcționarea genei (knock-out,
stânga). Fragmentele de ADN pot fi inserate pe calea ligării mediate de
unirea neomoloagă a capetelor (NHEJ) pentru a produce inserții țintite
(knock-in, dreapta); (B) Când sunt făcute două tăieturi de către nucleazele
cu specificitate de secvență, repararea mediată de unirea neomoloagă a
capetelor poate avea ca rezultat fie deleții sau inversii ale unor regiuni
genomice mari (stânga), fie deleții în gena țintită sau translocații
cromozomiale (dreapta); (C) Repararea mediată de recombinarea
omoloagă (HR, homologous recombination), implicând o matriță ADN
omoloagă, conduce la înlocuirea genei sau inserție genică.

195
 AUREL POPESCU

Un mecanism de reparare a ruperilor este unirea neomoloagă a

capetelor (NHEJ, non-homologous end-joining) (Fig. 75). Deși NHEJ este
adesea precisă, la joncțiunea capetelor nou reunite pot fi introduse mici
deleții sau, mai rar, inserții. Dacă modificarea secvenței cauzează o
mutație a cadrului de citire (frameshift mutation) sau alterează resturile de
aminoacizi cheie în produsul genei țintă, poate fi creată o mutație knock-
out (cu pierderea funcției). La capetele rupte ale molecule de ADN pot fi
unite, de asemenea, alte molecule de ADN care sunt introduse în celulă
simultan cu nucleazele cu specificitate de secvență (SSN). Capturarea de
secvențe de ADN heterolog poate fi utilizată pentru a realiza un knock-in
în gena țintită (inserție țintită). Dacă se produc simultan două rupturi, se
pot produce deleția genei țintite sau alte rearanjări (Fig. 75).
Repararea ADN prin unirea neomoloagă a capetelor este așadar o
cale foarte precisă și eficientă de realizare a unor modificări în secvențe
țintă ale ADN.
Recombinarea omoloagă (HR) este o cale alternativă de reparare a
ruperilor ADN (cromozomiale). In HR, o matriță de reparare este utilizată
ca sursă de informație pentru copierea secvenței de ADN ce trebuie
restaurată după rupere. HR poate fi exploatată pentru a realiza modificări
țintite ale unei secvențe de ADN prin introducerea în celulă atât a unei
nucleaze cu specificitate de secvență (SSN), cât și a unei matrițe de
reparare a ADN cu o secvență ce prezintă similaritate cu cea de la locul
ruperii (acest proces este denumit “țintirea genei”). Variația secvenței
purtate de matrița de reparare este copiată prin HR, realizând astfel
modificarea secvenței de ADN țintă. Deoarece utilizatorul specifică tipul
de variație a secvenței în matrițele de reparare, HR oferă numeroase
posibilități de manipulare a genomurilor plantelor și animalelor. De
exemplu, poate fi realizat un knock-in genic țintit utilizând o matriță de
reparare a ADN cu una sau mai multe transgene flancate de secvențe
omoloage situsului țintă. Pot fi realizate și modificări mai subtile ale
secvenței de ADN, incluzând alterarea resturilor de aminoacizi cheie în
cadrul secvenței codificatoare a unei gene, schimbarea elementelor
promotorului sau a altor elemente “motiv” (elemente ce crează un model
ce poate fi recunoscut) care acționează în cis pentru controlul exprimării
genei. Astfel, repararea ADN prin HR face posibilă manipularea
genotipului unui organism și implicit a fenotipului său, cu o precizie fără
precedent.

196
 INGINERIE GENETICĂ

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Arnould S., Chames P., Perez C., Lacroix E., Duclert A., Epinat J.C.,
Stricher F., Petit A.S., Patin A., Guillier S., Rolland S., Prieto J., Blanco
F.J., Bravo J., Montoya G., Serrano L., Duchateau P., Pâques F., 2006.
Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleases
that induce recombination on novel DNA targets. J. Mol. Biol. 355(3):
443-458.
Arnould S., Delenda C., Grizot S., Desseaux C., Pâques F., Silva G.H.,
Smith J., 2011. The I-CreI meganuclease and its engineered derivatives:
applications from cell modification to gene therapy. Protein Eng. Des.
Sel. 24(1-2): 27-31.
Arnould S., Perez C., Cabaniols J.P., Smith J., Gouble A., Grizot S.,
Epinat J.C., Duclert A., Duchateau P., Pâques F., 2007. Engineered I-CreI
derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce
highly efficient gene correction in mammalian cells. J. Mol. Biol. 371(1):
49-65.
Boissel S., Jarjour J., Astrakhan A., Adey A., Gouble A., Duchateau P.,
Shendure J., Stoddard B.L., Certo M.T., Baker D., Scharenberg A.M.,
2014. megaTALs: a rare-cleaving nuclease architecture for therapeutic
genome engineering. Nucleic Acids Res. 42(4): 2591-2601.
Chames P., Epinat J.C., Guillier S., Patin A., Lacroix E., Pâques F., 2005.
In vivo selection of engineered homing endonucleases using double-strand
break induced homologous recombination. Nucleic Acids Res. 33
(20):e178.
Chapdelaine P., Pichavant C., Rousseau J., Pâques F., Tremblay J.P.,
2010. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated
dystrophin. Gene Ther. 17(7): 846-858.
Damian M., Porteus M.H., 2013. A crisper look at genome editing: RNA-
guided genome modification. Mol. Ther. 21: 720-722.
Delacôte F., Perez C., Guyot V., Duhamel M., Rochon C., Ollivier N.,
Macmaster R., Silva G.H., Pâques F., Daboussi F., Duchateau P., 2013.
High Frequency Targeted Mutagenesis Using Engineered Endonucleases
and DNA-End Processing Enzymes. PLoS ONE 8(1): e53217.
Doudna J.A., Charpentier E., 2014. Genome editing. The new frontier of
genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346:1258096.
Ejsmont R.K., Hassan B.A., 2014. The Little Fly that Could: Wizardry
and Artistry of Drosophila Genomics. Genes 5(2): 385-414.
Epinat J.C., Arnould S., Chames P., Rochaix P., Desfontaines D., Puzin
C., Patin A., Zanghellini A., Pâques F., Lacroix E., 2003. A novel

197
 AUREL POPESCU

engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast

and mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31(11): 2952-2962.
Gao H., Smith J., Yang M., Jones S., Djukanovic V., Nicholson M.G.,
West A., Bidney D., Falco S.C., Jantz D., Lyznik L.A., 2010. Heritable
targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease. The Plant
Journal 61(1): 176-187.
Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F., 2013. ZFN, TALEN, and CRISPR/
Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31: 397-
405.
Gersbach C.A., Gaj T., Barbas C.F., 2014. Synthetic zinc finger proteins:
the advent of targeted gene regulation and genome modification
technologies. Acc. Chem. Res. 47(8): 2309-2318.
Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F., 2014. Development and applications of
CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157:1262-1278.
Kim H., Kim J.S., 2014. A guide to genome engineering with
programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15(5): 321-334.
Osakabe Y., Osakabe K., 2015. Genome editing with engineered
nucleases in plants. Plant Cell Physiol. 56(3): 389-400.
Pâques F., Duchateau P., 2007. Meganucleases and DNA double-strand
break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr. Gene
Ther. 7(1): 49-66.
Perez-Pinera P., Ousterout D.G., Gersbach C.A., 2012. Advances in
targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16: 268-277.
Rosen L.E., Morrison H.A., Masri S., Brown M.J., Springstubb B.,
Sussman D., Stoddard B.L., Seligman L.M., 2006. Homing endonuclease
I-CreI derivatives with novel DNA target specificities. Nucleic Acids Res.
34: 4791-4800.
Sander J.D., Joung J.K., 2014. CRISPR-Cas systems for editing,
regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32: 347-355.
Smith J., Grizot S., Arnould S., Duclert A., Epinat J.C., Chames P., Prieto
J., Redondo P., Blanco F.J., Bravo J., Montoya G., Pâques F., Duchateau
P., 2006. A combinatorial approach to create artificial homing endo-
nucleases cleaving chosen sequences. Nucleic Acids Res. 34(22): e149.
Sun N., Abil Z., Zhao H., 2012. Recent advances in targeted genome
engineering in mammalian systems. Biotechnol. J. 7(9): 1074-1087.
Sussman D., Chadsey M., Fauce S., Engel A., Bruett A., Monnat R. Jr.,
Stoddard B.L., Seligman L.M., 2004. Isolation and characterization of
new homing endonuclease specificities at individual target site positions.
J. Mol. Biol. 342(1): 31-41.

198
 INGINERIE GENETICĂ

Aurel POPESCU

INGINERIE GENETICĂ

Editura Universității din Pitești

2015

199

View publication stats