Prof.dr.

Ileana Stoica
Conf.dr. Diana Pelinescu
Lect.dr. Ana-Maria Tănase
 Conjugarea bacteriană = procesul de transfer de material genetic de la o bacterie “donor” la o bacterie “receptor”,
prin intermediul unei legături intercelulare directe,
şi condiţionat de prezenţa în bacteria donor a unui element genetic specializat, denumit CONJUGON
Aceste gene sunt organizate într-un operon complex – OPERONUL TRA
de regulă, localizat pe un plasmid şi nu pe cromozomul bacterian

- descoperită de Lederberg şi Tatum în 1946; inițial descrisă ca un fenomen de para- (proto) sexualitate bacteriană
Cele 2 “sexe” bacteriene erau diferențiate pe criteriul prezenţei/absenţei factorului F :
Celulele bacteriene cu factor F = bacterii mascule, notate F+,
Celulele bacteriene fără factor F = bacterii femele, notate F−
Cercetările ulterioare → “factorul F” este un plasmid bacterian
Plasmid F Cromozom
Cromozom

“celule mascul” - Celule F + “Celule femela” - Celule F -

Procesul de conjugare bacteriană nu este un fenomen de sexualitate,
ci fenomen de transfer de material genetic pe orizontală în lumea bacteriană
Operonul tra este situat de obicei pe un plasmid, mai rar pe cromozom
Plasmidele cu operon tra = plasmide conjugative → pot genera proces de conjugare bacteriană

Celulele cu plasmid conjugativ = celule donor (D), prezintă pili de conjugare

Celulele fără plasmid conjugativ = celule receptor (R), nu au pil de conjugare

cromozom
bacterian

cromozom pil de
bacterian conjugare

plasmid cromozom
conjugativ bacterian

plasmid
non-conjugativ
Celulă bacteriană donor (D)
Celule bacteriene receptor (R)
 Plasmidul F -primul plasmid conjugativ descris - (inițial denumit factor F)
ADN d.c. circular (CCC), 94.5 kpb (49%GC), la Escherichia coli, 1-2 copii per celulă bacteriană
o treime (33.3 kpb) din plasmidul F = regiunea tra (operon tra)

Pozițiile unde secvențele de inserție (IS) de pe plasmidul F

se recombină cu IS de pe cromozomul bacterian,
conducând la integrarea plasmidului în cromozom;

Regiunea tra de pe plasmidul F cuprinde mai mult de 40 de gene

și se întinde între ori T și gena fin O

Un plasmid conjugativ are 2 regiuni ori :

- o regiune ori V, de unde este inițiată replicarea plasmidului
- o regiune ori T, unde este inițiat transferul conjugativ
(se taie o catenă ce este apoi transferată în celula receptor)

ori T ori V
(regiunea de (regiunea de
origine a transferului origine a replicării
conjugativ) plasmidului)
Regiunea leader (L)
- se transferă o monocatenă ADN, în urma exciziei unei legături fosfodiesterice (“nick”)
- Ruperea se realizează în regiunea ori T
- regiune ce pătrunde în celula R cuprinsă între ori T şi secvenţa rep-inc - regiune leader (L)

Dimensiune de 13 kpb, - gene care codifică 8 polipeptide, dintre care cele mai importante sunt :
• gena ssb – omoloagă cu gena ssb din cromozom, codifică o proteină de tip Ssb
• genele psi A - psi B – codifică proteine ce inhibă activitatea enzimei Rec A
• genele flm A, flm B, flm C – codifică proteine implicate în menţinerea stabilităţii plasmidei în populaţia bacteriană
L

catena ADN
ce se transferă
F
op. tra

în celula R

op. tra
op. tra

F
L rep-inc
ori T

L rep-inc catena ADN

incizia unei catene ADN ce rămâne
(nick) în celula D
 Regiunea ori T
- originea transferului conjugativ (între un situs Bgl II şi începutul genei tra M )
- conţine situsul unde se produce nickarea (incizia unei catene ADN) → iniţierea transferului unei monocatene în celula R

R e g i u n e a ori T

reg. LEADER o p e r o n u l tra

curbură
intrinsecă

Zonă importantă ptr nickare Zonă importantă ptr transfer

catena tăiată pătrunde în celula R
cu regiunea L înainte;
operonul tra este ultima regiune care
intră în R
curbură intrinsecă
Din punct de vedere funcţional, regiunea ori T prezintă două zone :
- o zonă esenţială pentru nickare, ce cuprinde:
situsul A ← ataşarea proteinei IHF (Integration Host Factor) => curbarea ADN la 140o;
o parte din situsul sby A ← ataşarea proteinei Tra Y => curbarea ADN la 50o.
- o zonă esenţială pentru transfer, ce cuprinde:
o parte din situsul sby A
cele 3 situsuri sbm A, B, C, ← ataşarea proteinei Tra M.
oriT include şi zone de curbură intrinsecă a moleculei ADN (bogate în A-T)
Principalele gene din operonul tra
• Gene implicate în sinteza pilului de conjugare
• Gene implicate în formarea și stabilizarea perechilor celulare de conjugare (între un D și un R)
• Gene implicate în fenomenul de excludere de suprafață => să nu se formeze perechi celulare între 2 D
• Gene implicate în transferul conjugativ al unei catene ADN
• Gene reglatoare
Operonul tra este un operon complex, ce include:
- gene cu promotor propriu → sunt transcrise monocistronic
- gene ce sunt transcrise policistronic pornind de la un același promotor
Cei mai importanti promotori:
PM – promotorul genei tra M. TraM – important semnal chimic de imperechere in procesul de conjugare
PD – promotor gena traD. TraD – transport activ al plasmidului F in celula receptor
Ps si Pt – promotori traS si traT. TraS si TraT –implicate in procesele de excludere de suprafata si intrerupere a conjugarii.
Pj – P tra J – TraJ proteina reglatoare care activeaza transcrierea de la PY
PfinP – FinP – molecula de ARN cu rol de inhibitor al transcrierii de la nivelul Pj
PY – promotor major al operonului tra de la care sunt transcrise mai multe gene inclusiv gena traY, proteina TraY se
leaga ca dimer la situsul sbyA si determina curbarea moleculei de ADN. TraY este si reglator al propriei transcrieri.
Cu exceptia genei fin P si a genei art A toate genele sunt transcrise in aceeasi directie
 Rolul unor gene de la nivelul operonului tra

traA, traB, traE, traC,

Formarea și asamblarea pililor de conjugare traF, traG, traH, traK,
traL, traQ, traU, traV, traW,

traB, traE, traG,

Inner Membrane Proteins
traL, traP

traC, traF, traH

Proteine periplasmatice
traK, traU, traW

traC, traD, traI,

Transferul molecuelor de ADN
traM, traY

Proteine implicate în procesul de excludere de

traS, traT
suprafață
Stabilizarea împerecherii celulare traN, traG
 Fin P
Regiunea reglatorie a operonului tra Fin O
-
transcriere

3 componente majore: fin P

PM tra M PJ tra J PY tra Y
➢ tra J
➢ fin P transcriere
+
transcriere transcriere
+ +
➢ promotorul PY traducere traducere - traducere
+
Tra M Tra J Tra Y

▪ Tra J care este o proteină reglatoare, activând transcrierea de la promotorul central PY.
▪ Fin P - o moleculă ARN de 75b (transcriptul genei fin P), a cărui structură este stabilizată de proteina Fin O
▪ fin P se suprapune parţial peste gena tra J şi, ca urmare, molecula Fin P poate fi considerată un ARN antisens-inhibă
transcrierea de la promotorul PJ
▪ gena fin O este întreruptă de IS3, astfel încât are loc exprimarea constitutivă a lui tra J.
▪ în prezenţa proteinei Fin O active în celula gazdă, sistemul de represie fin O-P transcrierea genei tra J scade operonul
tra este represat

Promotorul PY – major (complex) al operonului tra

Procesul de transcriere de la promotorul central PY este controlat de :
- proteine codificate cromosomal: Sfr A (efect inhibitor), IHF (efect activator)
- proteine tra : Tra J (efect activator), Tra Y (efect inhibitor)
 Plasmidul F se poate găsi liber în citoplasmă, sau integrat în cromozomul bacterian.

Tulpinile bacteriene cu F liber = tulpini F+ Tulpinile bacteriene cu F integrat = tulpini Hfr

(High frequency of recombination),
(permit o rată înaltă a recombinării între gene cromozomale)

Integrarea plasmidului F în cromozom se realizează

prin recombinare genetică omoloagă
între secvențe de inserție (IS) de pe F și IS de pe cromozom.

cromozom F pil de
bacterian conjugare

plasmid F
liber
F
cromozom pil de
Tulpină bacteriană F+ bacterian conjugare
plasmid F integrat
în cromozom
Ambele tipuri de tulpini sunt tulpini DONOR
Tulpină bacteriană Hfr
Tipuri de celule bacteriene funcţie de prezenţa/absenţa, localizarea şi structura plasmidului F
Denumire Caracteristici D/R Aspect
celule de tip F+ prezintă un plasmid F (în 1-2 copii per celulă) ?
în formă extracromozomală

celule de tip F− nu prezintă plasmid F, nici extracromozomal, ?

nici integrat în cromozomul bacterian sau

celule de tip Hfr prezintă un plasmid F integrat în cromozomul ?

bacterian → recombinare între gene
cromozomale din celule diferite F

celule de tip F′ prezintă în citoplasmă un plasmid F′ (= F + ?

gene cromozomale, rezultat prin excizia
incorectă din cromozomul bacterian; aceste
gene cromozomale se găsesc într-un singur F’
a1
(gene crz)
exemplar – cel de pe plasmidul F′
celule de tip F′′ prezintă în citoplasmă un plasmid F′; sunt ?
diploide pentru genele cromozomale prezente a2
pe F; rezultă prin conjugare inițiată de celule F’ a1
Procesul de conjugare

legătură
plasmid intercelulară
conjugativ
directă D R
Celulă donor (D) Celulă receptor (R)

Replicare ADN

D legătura
2 celule donor D intercelulară
se întrerupe
În conjugare, se transferă o singură catenă ADN, de la donor la receptor
- În cazul transferului unui plasmid conjugativ, după transferul monocatenei, se reface structura dublucatenară,
atât în celula donor, cât și în celula receptor
Ca urmare, plasmidul conjugativ nu se “mută” dintr-o celulă într-alta, ci se răspândește într-o populație bacteriană

Deci, prin conjugarea dintre o celulă donor și una receptor, rezultă 2 celule donor
conjugare
1 celulă D + 1 celulă R 2 celule D

Conjugarea poate fi întâlnită:

- Între tulpini din aceleași specie
- Între tulpini din specii diferite
- Între tulpini din genuri diferite
- între bacterii Gram negative și Gram pozitive
- între bacterii Gram negative și drojdii
- între bacterii Gram negative și plante
Etapele procesului de conjugare
A. Formarea agregatelor celulare de conjugare intre un DONOR și un RECEPTOR
Formarea pilului de conjugare rol esențial în formarea corectă a perechilor de conjugare

Pilul F – format din molecule de pilină (L 1-20mm):

- recunoaște suprafața celulelor de tip receptor;
- se atașează la suprafața acestora;
- recunoaște proteinele de excludere de suprafață;
- prezintă situsuri de atașare pentru fagii pilus-specifici
Sinteza pilinei controlată de 3 gene
➢ tra A codifică subunitățile de pilină
➢ tra Q – Tra Q proteină de tip chaperone - protejează moleculele de pilină și translocă pro-pilina prin
membrana internă a celulei donor
➢ tra X codifică o proteină ce acetilează moleculele de pilină
Asamblarea - 11 gene tra: tra L, E, K, B, V, C, W, U, F, H, G
Tra G – rol în asamblare și stabilizare
B. Stabilizarea agregatelor de conjugare

Pilul F interacționează cu proteina OmpA

➢ proteine esențiale Tra G și Tra N în stabilizare
Depolimerizarea pilinei duce la apropierea celulelor = comunicare directă între D și R
➢ Tra D – formează un canal proteic
➢ Tra T – în membrana externă a celulelor donor – blochează fazele inițiale ale conjugării – exprimare consitutivă la un nivel
ridicat
➢ Tra S – în membrana plasmatică a celulelor donor – blochează transferul ADN -exprimare consitutivă la un nivel scăzut –
activată transcrierea după prima etapă de formare a agregatelor de conjugare
C. Transferul ADN conjugativ
Formarea comunicării semnal sesizat de Tra M
R e g i u n e a ori T

traM
reg. LEADER o p e r o n u l tra
traY Curbarea ADN
curbură
IHF intrinsecă

Zonă importantă ptr nickare Zonă importantă ptr transfer

catena tăiată pătrunde în celula R
cu regiunea L înainte;
operonul tra este ultima regiune
care intră în R curbură intrinsecă

Activarea regiunii oriT

Tra I activitate nickază/helicază

➢ taie la nivel ori T funcționând ca o fosfodiestertransferază
➢ se leagă covalent la capătul 5’
➢ desface dublu helix rupând legaturile de H
 Cromozom
Cromozom
Plasmid F
ori T
Tra I
3’
5’
pil de conjugare

Celulă donor Celulă receptor

 transferul
monocatenei
Cromozom
Cromozom

ori T
Replicare ADN

Celulă donor Celulă receptor

 Cromozom
Cromozom
3’

Plasmid F
Plasmid F 5’ 3’
3’
5’ 5’

ambele copii F se replică

Celulă donor Celulă receptor

TRANSFER CONJUGATIV CELULE HFR HFR – High Frequency of Recombination
frecvență ridicată de recombinare între gene cromozomale
(ale unei celule D și una R)

Celulă F + Celulă Hfr

Recombinare
omoloagă

F F
ori T

Plasmidul F se poate integra în cromozomul bacterian prin recombinare între IS (Insertion sequence) de pe F cu cele din crz B
 Celulă F +

Celulă Hfr

excizie corectă F
excizia F

F
ori T
excizie incorectă
F’ a1

Celulă F ‘
TRANSFER CONJUGATIV CELULE HFR

Excizie incorectă

a2
a1
F’

Celulă F ‘ Celulă R
 F’ a1 a2

Celulă F ‘ Celulă R
 Celulă F’’

F’ a1 a2

a1

Celulă F ‘ Celulă F ‘‘
Celulele Hfr pot iniția conjugare cu o celulă R, fără excizia plasmidului F
- se transferă o catenă a cromozomului celulei Hfr, începând cu regiunea leader a lui F
- lungimea (dimensiunea) catenei transferate depinde de timpul în care cele 2 celule rămân în contact direct
- ca și în cazul transformării genetice a bacteriilor,
monocatena intrată în celula R invadează dublul helix al cromozomului gazdă în regiunile cu omologie de secvență,
și participă la recombinare genetică omoloagă, astfel înlocuind gena gazdă

F
ori T

F
ori T
Hărți genetice – 1961 – F. Jacob și E.L. Wollman
 Structura plasmidului conjugativ RP4

Apr , Tcr , Kmr - gene de rezistență la antibiotice (ampicilina, tetraciclina, kanamicina);

tra1 , tra2 - regiuni implicate în controlul transferului;
oriT - originea transferului (transfer replicativ);
oriV - originea replicării plasmidului; IS8 - secvența de inserție.
Copy protected with Online-PDF-No-Copy.com