Strategii de clonare, bibliotecile

de gene

Proiect realizat de:

Elena-Alexandra Cabat
Introducere
• Conceptul de biblioteca-colectie de clone ADN
dintr-o celula, tesut sau organism
• Exista 3 categorii de biblioteci:
1. Genomice → alcatuite din ADN-ul genomic
total al unui organism
2. ADNc→colectia de clone obtinute pe baza de
ADN complementar
3. Cromozomiale→specifice fiecarui cromosom in
parte
1.Biblioteci genomice
• O biblioteca genomica contine toate secventele
prezente in genomul unui organism.

Procedura cuprinde 5 etape:

 Pregatirea ADN-ului
 Fagmentarea ADN-ului
 Pregatirea vectorului
 Ligaturarea si introducerea in gazda
 Amplificarea
• Biblioteca genomica-utila pentu a gasi o gena de
interes prin screening cu sonde specifice

Bibliotecile genomice se obtin prin 2 tehnici

1. ADN genomic este digerat complet cu o enzima de

restrictie, iar fagmentele rezultate sunt clonate fie pintr-
un vector derivat din bacteriofagul λ, fie printr-un vector
cosmidic.

Cosmidele - vectori hibrizi ce conţin ADN

plasmidial şi situsul cos din genomul fagului λ.
• Prezentând secvenţa din plasmidul EcoRI şi gena de
rezistenţă la ampicilină (Ampr),cosmidele se pot
replica şi mentine în celula bacteriană în forma
plasmidială şi permit selecţia transformanţilor pe
mediu cu ampicilină.

2. O altă cale este digestia parţială cu ER, care

recunosc secvenţe de 4 pb. Prin digestie parţială doar o
parte din SR este tăiată de ER.
2.Biblioteci de ADNc
Colecţia de clone obţinute pe baza ADN complementar se
numeşte bibliotecă ADNc.

Din bibliotecile de ADNc se produc copii ADN din secvenţe

ARN (ARNm) care apoi se clonează.

Extrem de utile: nu reprezintă doar colectarea de secvenţe

exprimate, ci şi pe acele secvenţe de după orice modificare
post-transcripţională

Secvenţierea parţială a unei colecţii mari de ADNc si

depunerea într-o bază de date- etape de caracterizare
agenomului unui organism
 Fiind sintetizat pe matriţa moleculelor de ARNm,
ADNc va corespunde numai genelor aflate în
stare de activitate transcripţională, reproducând doar
genele funcţionale specifice celulei respective. ADNc
este clonat în vectori plasmidici sau în vectori derivaţi
din bacteriofagul λ.
Spre deosebire de fragmentele obţinute prin digestie cu
enzime de restrictie (ER), moleculele de ADNc nu
posedă capete adezive, de aceea pentru introducerea în
vector, la moleculele de ADNc se adaugăadaptori care
conţin capete adezive.
Alegerea vectorului λ(lambda)

• Niciunul din vectorii derivaţi din fagul λ nu este adecvat

pentru toate experimentele de clonare moleculară.

• Este necesară alegerea vectorului cel mai adecvat scopului

urmărit.

• Trebuie luaţi în considerare 3 factori:

→ enzima (enzimele) de restricţie folosite

→dimensiunea fragmentului de ADN ce va fi clonat

→dacă vectorul va fi folosit şi pentru exprimarea ADN în

E.col
 3.Biblioteci cromozomiale
• Dimensiunea genomului uman este atât de mare, încât
sunt necesare mii de clonepentru a reprezenta întregul
genom.
→ pentru om sunt necesare 24 de biblioteci diferite
→dacă o genă este localizată pe un cromosom cunoscut
cu metode genetice,cercetarea va fi limitată la biblioteca
acelui cromosom.
 →izolarea cromozomilor este posibilă datorită
dimensiunii şi morfologiei diferiteale cromozomilor,
care pot fi separaţi cu ajutorul citometriei în flux.

→în prezent sunt disponibile biblioteci preparate din

toţi cromozomii umani
Sortarea cromosomilor
→ gena de interes poate fi cartografiată la un cromosom
particular
→ separarea cromosomilor –PFGE dar pentru clonare se
utilizează aparatul cu fluorescenţa
→cromozomii trebuie să fie în metafaza
→sunt izolaţi, apoi coloraţi cu EtBr şi conduşi printr-un
câmp electric la un fascicul laser care duce apoi la
fluorescenţă
 → cantitatea de fluorescenţă se măsoară cu un detector
iar filtrul utilizat identifică cromosomii particulari
→ aplicarea unui câmp electric între plăcile de deflecţie
prin care cromozomii vor trece, permite devierea şi
colectarea lor
→ după colectarea unei cantităţi suficiente, pot fi
deproteinizaţi şi utilizaţi pentru prepararea bibliotecilor
cromozomiale
Microdisectia
• Daca o gena a fost cartografiata la un cromosom
particular, se utilizeaza microdisectia, pentru a
obtine materialul corespunzator.

• Cromosomii colorati sunt examinati la

microscop si sunt mutati cu ajutorul unui
micromanipulator.

• Materialul este mai apoi colectat in pipete si

utilizat pentru clonari ulterioare