Universitatea Politehnica Bucuresti

Facultatea de Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor

Sectia de Chimie Alimentara si Tehnologii Biochimice

Referat

ENZIMOLOGIE

ENZIME CELULOZOLITICE

Student:
Anul: IV

-2011-
 Cuprins

1. Introducere
2. Microorganisme producatoare de celulaze
3. Hidroliza enzimatica a celulozei utilizand preparate
celulozolitice de origine microbiologice
4. Productia de enzime celulozolitice
5. Aplicatii ale celulazelor si hemicelulazelor
6. Studii referitoare la celulaze

2
 1.Introducere

Enzimele sunt utilizate in practica de mii de ani, inainte ca natura si rolul lor in reactii sa fie
intelese. Un exemplu in acest sens este obtinerea branzeturilor cu ajutorul stomacului de vitel.
Utilizarea acestui procedeu este atat de vechi incat data descoperirii lui a fost uitata. In orient
preparatele enzimatice brute,obtinute din fungi ce se formau pe suprafata orezului alimentar,erau
folosite de multe sute de ani in conservarea,condimentarea si modificarea de consistenta a diferitelor
produse alimentare.
Enzimele au fost denumite prima data cu termenul de “fermenti”,in 1897,cand Buchner,prin
distrugerea peretilor celulelor de drojdie obtine un mojarat care catalizeaza fermentatia alcoolica si a
demonstrat pentru prima oara ca enzimele pot functiona independent de celule.In prezent se cunosc
aproximativ 3200 de enzime diferite care s-au obtinut in stare pura,sau sub forma de preparate cu
diferite grade de puritate aproximativ 1000-1500.
Enzimele sunt prezente in toate organismele vii si se gasesc in toate tipurile de celule
animale,in fluidele corporale(sange,limfa,lichid cefalorahidian,lichid intestinal),in unele secretii
specifice pentru diferite organe(stomac,pancreas,rinichi),la plante si in toate virusurile si
microorganismele care populeaza diferite zone ale Pamantului.La plantele si la animalele
superioare,enzimele se gasesc in toate celulele vii ale acestora,insa distributia lor variaza dupa
natura tesutului din care fac parte celulele.
Exista mai multe tipuri de enzime cum ar fi:enzime de fermentatie,enzime
amilolitice,enzime celulozolitice,enzime proteolitice,enzime pectinolitice si enzime lipolitice.

3
 Enzime celulozolitice

Biomasa lignocelulozica (BLC) constituita din reziduuri agricole (paie, coceni de porumb),
unele subproduse ale industriei alimentare (pulpe epuizate de fructe, taitei de sfecla de zahar
epuizati), furajele si lemnele neutilizabile reprezinta o rezerva considerabila si insuficient
valorificata de glucide fermentescibile.
In ultimul deceniu s-au facut eforturi considerabile in privinta valorificarii superioare a
BLC. Orientarea principala a cercetarilor a fost transformarea prin fermentatie a poluzaharidelor
consecutive, celuloza si hemicelulozaa, si au aparut directii de cercetare majore, ca hidroliza
enzimatica a BLC, urmata de fermentatia dirijata a produsilor rezultati (glucoza, pentoza). In prim
planul obiectivelor vizate s-a aflat obtinerea de carburant lichid, datorita debuseurilor resurselor
disponibile.
Pentru hidroliza deseurilor celulozice se utilizeaza, in general, procedee enzimatice sau
procedee chimice, dar acestea din urma au fost mai putin agreate datorita efectului coroziv al
agentilor de hidroliza. Hidroliza enzimatica este preferata datorita conditiilor blande in care poate
avea loc si datorita specificitatii enzimelor fata de anumite substraturi. Se folosesc in general enzime
microbiene celulozolitice produse de diferite tulpini de microorganisme, ce produc in cantitati
apreciabile enzime care caracteizeaza hidroliza partiala sau totala a celulozei.

2. Microorganisme producatoare de celulaze

Exista multe tipuri de microorganisme care au capacitatea de a digera materiale celulozice

fie partial, fie total. Dintre acestea cele mai importante sunt bacteriile (tabelul 1) si fungii.

Bacterii termofile Clostridium thermocellum

Cellvilerio fulgus
Bacterii mezofile Pseudomonas fluorescens

4
 Ruminococcus sp.
Cellulomonas sp.

Tabelul 1. Bacterii producatoare de celulaze

Bacteriile. Desi multe specii de bacterii sunt capabile sa sintetizeze enzime celulozolitice,
putine sunt cele care prezinta interes industrial.
Bacteriile celulozolitice, atat Gram-pozitive cat si Gram-negative, includ specii aerobe (din
genul Pseudomonas), facultative anaerobe (din genul Cellulomonas) si strict anaerobe (din genul
Clostridium).
Fungii. In timpul celui de-al doilea razboi mondial, Armata Statelor Unite ale Americii a
suferit pierderi severe ale echipamentului si uniformei datorita atacului fungic in climatul cald si
umed din Pacificul de Sud. Fungii care au contribuit la acest dezastru au fost recoltati si s-a alcatuit
o colectie, din care s-a izolat si s-a caracterizat Trichoderma reesei (Reese si Mandels, 1984).
Tulpinile cunoscute sub aceaste denumire ( de fapt provenite din Trichoderma viride) constituie
mucegaiul cel mai studiat si probabil cel mai bun pentru biosinteza intregului sistem enzimatic
celulozolitic. Cu toate acestea, se va exemplifica si cu alte cateva specii de fungi care au fost
selectionate de diferiti cercetatori cu scopul declarat de a obtine buni producatori de celulaze:
Trichoderma koningii, Penicillium funiculosum, Penicillium iriensis, Penicillium verruculosum,
Fusarium solani, Aspergillus terreus, Aspergillus niger etc.

3. Hidroliza enzimatica a celulozei utilizand preparate

celulozolitice de origine microbiologica

Substratul natural al celulazelor este celuloza. Ea costituie componenta principala a peretilor

celulei vegetale. Se gaseste adesea in plante sub forma de fibre. Fibra de celuloza este constituita din
diferite straturi successive ale caror proprietati fizico-chimice si mecanice confera fibrei
functionalitatea sa specifica.
Din punct de vedere chimic, fibra vegetala cuprinde trei constituienti principali:
5
 Celuloza;
Hemicelulozele;
Ligninele.
Celuloza. Este un polimer insolubil, liniar, format din unitati de glucoza legate intre ele prin
legaturi de tip β-1,4. Gradul de polimerizare este de ordinul a 10 000 unitati molecula. In stare
naturala aceste molecule sunt asociate intr-o structura fibrilara sau cristalina.
Hemicelulozele. Sunt heteropolizaharide cu un grad de polimerizare mai mic si sunt mai
usor hidrolizabile decat celuloza. Constituientii principali sunt xiloza si arabinoza (majoritare),
glucoza (intotdeauna prezenta in cantitati mici). Hidroliza hemicelulazelor furnizeaza pentoze
nefermentescibile cu formare de etanol de catre Sacharomyces cerevisiae, dar sunt in curs de
cercetare alte cai de valorificare ale acestor heteroglucide.
Ligninele. Sunt polimeri tridimensionali de origine fenolica. Legaturile intre monomeri sunt
de diferite tipuri, multe dintre ele nehidrolizabile enzimatic. Produsii de degradare ai ligninelor sunt
practic nefermentescibili.
Celuloza, hemicelulozele si ligninele in stare naturala sunt insolubile in apa, iar pe de alta
parte nu sunt direct accesibile enzimelor celulozolitice datorita structurii cristaline si a diferitelor
tipuri de legaturi care leaga cei 3 polimeri (forte Van der Waals, punti de hidrogen, legaturi
covalente). Datorita faptului ca celuloza este practic “cimentata” de ceilalti doi polimeri, pentru o
hidroliza cat mai completa se fac pretratari fizico-chimice ale biomasei lingo-celulozice cu vapori
sub presiune, fie acide, fie alcaline.
Un substratat de complex ca BLC nu poate fi hidrolizat total de o singura enzima. Sistemul
enzimatic produs de Tricoderma reesei este, deci, un amestec de diferite enzime care coopereaza
intre ele. Rezultatele cercetarilor efectuate au aratat ca exista doua sisteme enzimatice principale,
unul specific hemicelulozelor si altul specific celulozei. Mecanismul de actiune al enzimelor care
hidrolizeaza hemicelulozele este asemanator cu cel al celulozelor, dar specificitatea lor de substrat
este net superioara ultimelor.
Sistemul enzimatic celulozolitic care hidrolizeaza celuloza este compus in principal din trei
clase de enzime:

 Exoglucanazele, care ataca molecula de celuloza la capatul nereducator al lantului

eliberand resturi de celobioza; ele mai sunt numite celobiohidrolaze;

6
  Endogluzanazele, care opereaza aleatoriu in interiorul lantului de celuloza, creand
astfel situsuri de atac suplimentare pentru exoglucanaze;
 Celobiazele (β-glucozidazele), care hidrolizeaza celobioza, dar in acelasi timp si
celotrioza si celotetroza cu formare de glucoza.

In interiorul fiecarei clase pot exista mai multe enzime, sub diferite forme de izoenzime. In
general aceste enzime sunt glicoproteine, cu variatii mari ale componentei glucidice. Atat
endoglucanazele cat si exoglucanazele si β-glocuzidaza au fost purificate din Trichoderma reesei.
Studiile de purificare si fractionare ale enzimelor din aceasta subclasa au relevat faptul ca
toate cele trei tipuri majore de enzime celulozolitice sunt biosintetizate de microorganisme in forme
multiple, din care se pot izola un numar variabil de fractiuni, atat in functie de natura mediului de
cultura folosit cat si de tehnicile utilizate.
Multe cercetari au demonstrat ca diferite enzime actioneaza in mod sinergic in hidroliza
celulozei cu grad mare de polimerizare. Rolul β-glucozidazei in sinergismul reactiei este usor de
explicat. In timp ce celobioza este un produs finit inhibitor al celobiohidrolazei, β-glucozidaza
actioneaza indepartand celobioza din amestecul de reactie. S-a aratat ca sinergismul dintre
celobiohidrolaza si endoglucanaza este foarte avansat in cazul substraturilor cu grad mare de
polimerizare, mai slab in cazul substraturilor amorfe, cum este celuloza gonflata in prezenta de acizi
si absent in cazul celulozelor solubile substituite (carboxi-metilceluloza).
Endoglucanaza actioneaza asupra regiunilor amorfe din fibrele de celuloza deschizand noi
capete de lant pentru atacul exoglucanazelor care, apoi, indeparteaza unitatile de celobioza de la
capetele nereducatoare ale lantului. Sinergismul dintre cele doua enzime rezulta asadar din faptul ca
noul substrat pentru exoglucanaze este format in urma actiunii endoglucanazelor.
Pentru biosinteza de β-glucozidaza, cele mai potrivite sunt tulpinile de Aspergillus niger, A.
phoenicis, A. wentii, β-glucozidaza produsa de aceste microorganisme fiind mai putin sensibila la
inhibitia prin produs finit decat cea biosintetizata de T. reesei, motiv pentru care s-au initiat
fermentatii mixte.
In fermentatiile mixte se obtin preparate cu activitati enzimatice mari ale celor trei enzime
mentionate anterior, ba chiar si pentru xilanaze, atunci cand tulpina de Aspergillus este introdusa in
fermentatie la 15 ore de la inceperea fermentatiei cu tulpina de Trichoderma. Dezvoltarea tulpinii de
Trichoderma este restrictionata cu aciditatea puternica a mediului produsa de tulpina de Aspergillus.

7
 4. Productia de enzime celulozolitice

Productia si caracterizarea enzimelor celulozolitice au facut obiectul unui volum foarte

important de cercetari fundamentale si aplicative. Aceste cercetari mai intai focalizate pe celulaze
“sensu stricto” (hidroliza celulozei cristaline) au fost apoi directionate pe hemicelulaze, datorita
interesului pentru potentializarea actiunii celulazelor pe material vegetal. Au fost identificate,
clasificate si secventializate genele principalelor enzime implicate, care au fost purificate si multe
dintre cristalizate. Structurile tridimensionale din ce in ce mai detaliate permit acum studierea si
modificarea principalelor regiuni functionale ale acestor molecule: situsul catalitic si regiunile de
absorbtie. De asemenea, s-au dezvoltat sistemele de transformare omoloage si heteroloage. Calitatea
acestor rezultate experimentale duce la deschiderea unor perspective foarte generoase, atat in
vederea ameliorarii performantelor catalitice ale enzimelor cat si a eficientei productiei lor. Pe de
alta parte, in prezent, costul de productie a acestor sisteme enzimatice s-a redus semnificativ gratie
cresterii spectaculoase a cantitatii de enzime celulozolitice produse pe unitatea de volum de
fermentatie.
Microorganisme utilizate. Majoritatea procedeelor studiate la scara preindustriala, sau
aplicate la scara industriala, utilizeaza enzimele produse in fermentatie submersa de catre ciuperca
Trichoderma reesei. Aceasta ascomiceta are avantajul ca secreta, in cantitati mult mai mari decat
alti fungi si alte bacterii, amestecul de enzime care permite hidroliza atat a celulozelor amorfe cat si
a celulozelor cristaline. Mutantele hiperproductive utilizate in prezent pot produce peste 40 g/l
proteine solubile.
Medii de cultura. Sinteza de celulaze este supusa unei reglari complexe, data de represia de
catre glucoza si represorii catabolici uzuali si inducerea biosintezei de catre produsii de hidroliza ai
celulozei. Din cauza acestor mecanisme de reglare, productia de celulaze in fermentatie submersa s-
a efectuat mult timp in laboratoare, utilizand celuloza ca sursa unica de carbon si energie. Calitatea
celulozei era aleasa astfel incat hidroliza ei in cursul dezvoltarii mucegaiului sa fie suficient de lenta
pentru a preintampina acumularea de glucoza in timpul culturii. Era nevoie de celuloza purificata si,
deci, costisitoare. Pe de alta parte, concentratia utilizata (50-70 g/l) producea o vascozitate crescuta
a mediului de cultura. Datorita acestor motive de cost si vascozitate, utilizarea acestui mediu de

8
cultura nu a putut fi extrapolata la scara industriala. A fost, deci, necesara punerea la punct a unui
mediu de cultura industrial bazat pe o sursa de carbon mai putin scumpa si cu o solubilitate redusa.
Acest scop a fost atins prin utilizarea de tulpini mutante rezistente la represie catabolica.
S-a pus la punct un mediu de cultura in care lactoza este principala sursa de carbon si
energie. Alti constituenti ai mediului de cultura sunt sarurile minerale uzuale, necesarul de vitamine
fiind acoperit prin aditia a 1 kg/m3 extract de drojdie sau extract de porumb. Eliminarea de celulaze
in mediul de cultura este facilitata de prezenta agentilor tensio-activi in mediul de fermentatie.

Figura 1. Cinetica fermentatiei discontinue (“batch) de producere a celulazelor cu tulpini de

Trichoderma reesei cultivata pe mediu cu lactoza, in reactor de 3 m3
●-● lactoza reziduala ■-■ consumul de NH4OH; ▲-▲substanta uscata

9
 ○-○ productia de proteine solubile; Δ-Δproductia de celulaze; □-□productia de
celobiaza
Cinetica fermentatiei. In figura 1 este redata cinetica cresterii si biosintezei de celulaze de
catre o tulpina ameliorata genetic de Trichoderma reesei pe un mediu de cultura bazat pe 6% lactoza
si 0,5% pasta de hartie. Aceasta fermentatie a fost efectuata intr-un reactor de 3 m3, cu agitare
mecanica; turatia agitatorului a fost de 120 rot/min, aeratia de 0,5L aer/L mediu/minut, la o
temperatura de 270C in primele 40 ore, apoi la 250C; pH-ul lasat liber in primele 20 ore a fost apoi
reglat la pH=5. Cresterea mucegaiului induce o acidifiere a mediului care este neutralizat prin aditie
de amoniac, care serveste si ca aport de azot mineral. Fermentatia pentru biosinteza de celulaze este
relativ lenta, durata intregii operatii depasind 140 de ore.
S-a utilizat tehnica alimentarii continue cu lactoza. Aceasta tehinca, mentinand un nivel
minim al continutului in lactoza reziduala pe tot timpul fermentatiei, permite o potentializare
maxima a sintezei enzimelor. (Tabelul 2).

Materii prime Celuloza Lactoza Lactoza

folosite

Tehnologia batch batch Fed batch

Activitate 13,7 8,7 19,6

(uPF/ml)2

Proteine secretate 17,9 14,7 13,1

(g/l)

Productivitate 98 62 140
(uPF/l/h)

Pret de 100 36 19
productie3

Tabelul 2. Ameliorarea succesiva a procedeului de productie a celulazelor

In figura 2 este exemplificata cinetica cresterii microorganismului si biosintezei de celulaze
utilizand aceasta tehnica numita “fed-batch”. Se constata ca la un timp de cultura echivalent
cantitatile de proteine si activitatile enzimatice sunt practic duble celor obtinute prin metoda
“batch”. Acest procedeu este in momentul de fata operat la scara industriala (fermentator de 30m3).

10
Figura 2. Cinetica fermentatiei discontinue (cu adaosuri) cu tulpini de Tricoderma reesei cultivata
pe mediu cu lactoza:
●-● lactoza reziduala; ■-■ lactoza alimentata;
□-□ consumul de NH4OH ; Δ-Δ substanta uscata;
; -⃰ -⃰ productia de proteine solubile; ○-○ productia de ccelulaze.
▲-▲ productia de celobiaza,

11
 5. Aplicatii ale celulazelor si hemicelulazelor

Datorita pretului de productie scazut, acestor enzime li se deschid perspective interesante

pentru diferite aplicatii industriale. Pe langa utilizarea cvasiconfidentiala a unor celulaze in formule
medicamentoase utilizate pentru unele deficiente ale tractului gastro-intestinal, exista patru piete
principale pe care se comercializeaza productii semnificative de celulaze si hemicelulaze.
In industria alimentara, celulazele sunt utilizate pentru a facilita filtrarea diverselor suspensii
bogate in fibre celulozice manipulate in aceasta industrie. In industria textila, ele sunt utilizate
pentru tratarea tesaturilor de bumbac, in special pentru inmuierea fibrelor. In fabricarea pastelor de
hartie, mai ales in suspensiile de pasta de hartie reciclata, celulazele amelioreaza semnificativ
filtrabilitatea acestora si conduc la economii importante de apa consumata.
In alimentatia animalelor, aditia de celulaze in jurajele administrate pasarilor si suinelor
amelioreaza digestibilitatea fractiunilor celulozice, permitand, deci, reducerea consumului de
amidon si a excretiei de celuloza nedigerata (si deci a incarcaturii poluante a fecalelor).
Hemicelulazele se utilizeaza, in principal, in industria alimentara ca adjuvant de filtrare si in
panificatie datorita efectului lor de expandare a produselor de panificatie.
Xilanazele sunt utilizate in industria hartiei in scopul inalbirii pastei de hartie. Utilizarea
acestor enzime reduce cu 30% consumul de clor considerat un poluant al mediului inconjurator.
Enzimele celulozolitice pot fi utilizate asa cum s-a aratat la tratarea BLC, iar glucidele
rezultate in urma tratarii pot fi convertite prin fermentatie cu microorganisme adecvate (Clostridium
acetobutylicum, Saccharomyces sp. Clostridium thermocellum, Zymomonas mobilis, Bacillus
stearothermophilus) in acetona, butanol, etanol (ABE).

12
 6.Studii referitoare la celulaze

Biomasa vegetală reprezintă sursa majoră de carbon în ecosistemele terestre astfel că este
firească presupunerea că multe dintre microorganismele care populează aceste ecosisteme să fie
capabile să degradeze aceste substrate, deci să sintetizeze enzime de timpul celulazelor şi
hemicelulazelor. Actinomicetele şi în mod special bacteriile din genul Streptomyces constituie un
grup important care intră în alcătuirea populaţiilor microbiene respective (Mc Carthy şi Williams,
1992).
Celuloza este un polimer neramificat de glucoză compus din unităţi de anhidro D-
glucoză unite prin legături 1,4-β-D-glucozidice. Aceste legături pot fi hidrolizate de către enzimele
celulozolitice. De obicei celuloza este foarte rezistentă la hidroliză datorită gradului ridicat de
cristalinitate, rezultatul unei conformaţi lineare (paralele) care permite realizarea unor puternice
legături de hidrogen între grupările OH ale lanţurilor paralele vecine. In fibrele de celuloză regiunile
cu structură înalt cristalină coexistă cu regiunile cu structură amorfă iar cele cu un raport favorabil
zonelor cristaline prezintă o rezistenţă crescută la acţiunea enzimatică. Celuloza, aşa cum se găseşte
în natură este un homopolimer cu greutate moleculară mare, insolubil şi adesea în asociere intimă cu
lignina, hemiceluloza la nivelul peretelui celular vegetal fapt ce o face puţin accesibilă degradării
enzimatice (Robson şi Chambliss, 1989).
Toate organismele care degradează celuloza cristalină secretă sisteme enzimatice
mai mult sau mai puţin complexe care sunt alcătuite din enzime cu diferite modalităţi de acţiune,
specificitate de substrat şi care acţionează de obicei sinergic pentru a hidroliza celuloza. Cel mai
bine studiat sistem celulazic este cel de la fungi (de la Trichoderma reesei), enzimele care îl
alcătuiesc fiind grupate în trei categorii:
- exo--1,4-glucanaze sau celobiohidrolaze (EC 3.2.1.91.)
- endo--1,4-glucanaze sau endocelulaze (endoglucanaze)(EC 3.2.1.4.)
- -glucozidaza sau celobiaza (EC 3.2.1.21.)
Aceste trei grupe de enzime acţionează sinergic ducând la hidroliza celulozei
cristaline. Endoglucanazele determină ruperea legăturilor interne ale lanţului de celuloză, atacul
13
făcându-se la întâmplare şi ducând la formarea de oligozaharide. Efectul direct al acestui tip de
enzime este fragmentarea lanţului de celuloză cuplat cu o creştere slabă a cantităţii de zaharuri
reducătoare eliberate. De obicei, în complexele celulozolitice sunt cuprinse mai multe
endoglucanaze care pot prezenta afinităţi diferite pentru celo-oligozaharide cu lungimi variate. Spre
deosebire de aceste, exoglucanazele (celobiohidrolazele) acţionează la nivelul extremităţilor
nereducătoare ale lanţului de celuloză, eliberând glucoză sau celobioză (zaharuri reducătoare) în
cantitate crescută, lungimea lanţului celulozic nefiind modificată semnificativ.
Acţionând individual, atât endoglucanazele cât şi celobiohidrolazele pot degrada
regiuni restrânse ale lanţului celulozic (cele cu structură amorfă). Pentru a determina hidroliza
regiunilor cu structură cristalină este necesar ca în amestecul enzimatic să fie prezente ambele tipuri
de enzime.
Studiile referitoare la celulazele de la Bacillus se referă atât la caracterizarea biochimică a
enzimelor cât şi la identificarea şi secvenţierea genelor implicate în producerea acestor enzime ca şi
în clonarea şi exprimarea lor în diferite gazde. In prezent se cunoaşte secvenţa de nucleotide a mai
multor endoglucanaze de la Bacillus (tabelul 3) şi deci secvenţa de aminoacizi a proteinelor
corespunzătoare, realizându-se astfel comparaţii între enzimele secretate de diferite specii de bacili.
Tabelul 3. Genele pentru celulazele de la Bacillus

Tulpina Gena Mărimea

proteinei produse
(aminoacizi)

B.circulans 378

B.subtilis 499
DLG

B.subtilis N- 463
24

B.subtilis 499
PAP 115

B.lautus celB 536

Bacillus N-4 celA 384

14
 celB 465
celC >800

B.polymyxa 365

Bacillus celF 770

1139

Bacillus 912
sp.KSM 635

S-a stabilit astfel că enzimele produse de diferite tulpini de Bacillus prezintă un grad
înalt de omologie, porţiunile cu omologie ridicată fiind localizate, în general, în regiunea
aminoterminală, ceea ce sugerează că situsul catalitic activ al enzimelor se află plasat în această
zonă. Această supoziţie este sprijinită de observaţiile că porţiunea de la capătul carboxiterminal al
endoglucanazei respective nu este necesară pentru activitatea celulozolitică, regiunea respectivă
putând fi deletată experimental fără pierderea actibvităţii (Nakamura şi colab. 1991). Recent,
Henrissat şi colab.(1989) analizând grupările ("clusterii") hidrofobe ale diferitelor enzime au
clasificat celulazele, inclusiv pe cele de la Bacillus, în şase familii. Din acest punct de vedere,
endoglucanazele de la B.subtilis şi B.ciculans sunt incluse în familia A, subfamiliile A2 şi A4
(Beguin, 1990; Gilkes şi colab.,1991).
De asemenea, rezultatele de până acum referitoare la genele pentru enduglucanazele
de la Bacillus sugerează ideea că ele ar deriva dintr-o genă ancestrală comună.
In ceea ce priveşte particularităţile biochimice ale endoglucanazelor de la bacteriile
din genul Bacillus acestea au o greutate moleculară ce variază, de obicei, între 35 şi 46 kDa, dar
poate atinge, la unele tulpini alcalofile, până la 92 kDa (Fukumori şi colab., 1986), sunt în general
termostabile, activitatea optimă realizându-se la 50-60oC.
Reglarea producerii de endoglucanaze de către bacteriile din genul Bacillus variază
nu numai de la specie la specie ci chiar şi de la tulpină la tulpină. Spre exemplu, tulpini de B.cereus,
Bacillus sp.N-4, B.subtilis AU1, B.licheniformis sintetizează enzima în mod constitutiv în timp ce la
alte tulpini, B.polymyxa, B.subtilis DLG, Bacillus sp.1139, aceasta pare a fi inductibilă. De
asemenea, nivelul glucozei şi al celobiozei influenţează diferit producerea englucanazei de către
tulpinile bacteriene studiate. Dacă în cazul tulpinii B.subtilis AU1 atât glucoza cât şi celobioza

15
inhibă sinteza enzimatică la concentraţii mai mari de 2%, în cazul tulpinii alcalofile Bacillus
sp.1139 glucoza inhibă, iar celobioza stimulează producerea de enzimă. La alte tulpini de Bacillus,
B.subtilis DGL, B.cereus, B.licheniformis, ambele zaharuri reducătoare stimulează sinteza
endoglucanazei.
In urma experimentelor de clonare a genelor pentru endoglucanază în diferite gazde
(fie tulpini auxotrofe de E.coli fie alte tulpini de B.subtilis) au fost obţinute informaţii interesante
referitoare la exprimarea genelor respective în gazde heterologe ca şi la reglarea exprimării acestora.
De obicei, celulazele ale căror gene au fost clonate în E.coli sunt sintetizate iniţial sub forma unor
compuşi de dimensiuni mari, activi din punct de vedere enzimatic, cu localizare intracelulară. Aceşti
compuşi suferă o "prelucrare" în urma căreia dimensiunea enzimei se micşorează, sub această formă
ea fiind exportată în spaţiul periplasmic (Cantwell şi Mc Connel, 1983; Robson şi Chambliss,
1989). In cazul utilizării drept gazda pentru clonare a unor tulpini mutante de Bacillus s-a observat
un fenomen similar de "procesare intracelulară" a precursorului enzimatic în urma căruia
dimensiunia enzimei se apropie de cea a enzimei produsă de tulpina de origine (Robson şi
Chambliss, 1989). De asemenea, Nakamura şi colab.(1991) au observat că utilizarea drept gazdă a
unei tulpini mutante de B.subtillis care nu produce proteaze a condus la obţinerea unei cantităţi
superioare de enzimă de la tulpina recombinată. Această creştere poate fi de cel puţin 9 ori dacă în
noua gazdă este clonată suplimentar şi gena sacQ.
Deşi cele mai multe informaţii referitoare la degradarea substratelor celulozice de
către actinomicete sunt legate de bacteriile din genul Thermomonospora (T.fusca, T.curvata)
(Wilson, 1992), în ultimii ani au fost realizate şi studii referitoare la sistemul celulazic al bacteriilor
din genul Streptomyces.
Tulpinile de streptomicete capabile de a degrada celuloza aparţin la mai multe specii
cum ar fi: S.antibioticus (Enger şi Mc Coy, 1965), S.thermodiastaticus (Crawford şi Mc Coy, 1972),
S.flavogriseus (Ishaque şi Kluepfel, 1980), S.olivochromogenes (Mac Kenzie şi colab.,1987),
S.reticuli (Wachinger şi colab., 1989), S.lividans (Theberge şi colab., 1992), S.flavovirens SfG3
(Cornea şi colab., 1993), dar lista poate continua dacă ţinem cont de tulpinile de Streptomyces care
nu au fost încadrate până acum într-o specie anume.
Primele lucrări referitoare la sistemul celulazic de la streptomicete au evidenţiat
faptul că acesta este complex, enzimele componente fiind capabile de a degrada substrate foarte
variate: CMC, hârtie de filtru, bumbac, celuloză microcristalină, celobioză dar şi paie, tărâţe sau alte

16
deşeuri celulozice. Studiind complexul celulazic de la S.flavogriseus, Ishaque şi Kluepfel (1980) au
stabilit că aceste bacterii produc enzime extracelulare capabile de a degrada, cu o rată diferită,
carboximetilceluloza, hârtia de filtru şi fibrele de bumbac. De asemenea, tulpina respectivă produce
şi -glucozidază dar această enzimă rămâne în cea mai mare parte localizată intracelular. Cercetările
ulterioare realizate asupra unor tulpini aparţinând aceleiaşi specii (S.flavogriseus) au condus la
precizarea că aceste bacterii produc atât endoglucanaze cât şi exoglucanaze (celobio-hibrolaze)(Mac
Kenzie şi colab.,1984). Rezultate asemănătoare au fost comunicate şi de alţi autori în cazul unor
specii diferite de Streptomyces: S.reticuli (Wachinger şi colab., 1989) sau Streptomyces sp.SD16
(Cornea şi colab.,1992) (Figura 3).
In ceea ce priveşte stabilirea condiţiilor optime de acţiune a acestor enzime, există o
oarecare variaţie în funcţie de tulpina bacteriană studiată şi de autor. Astfel, în cazul tulpinilor de
S.flavogriseus analizate, testarea acţiunii enzimelor pe CMC se realizează la 500C, în tampon fosfat
50mM pH 6 (Mac Kenzie şi colab.,1984) sau în tampon citrat-fosfat 50mM pH 7 (Ishaque şi
Kluepfel, 1980), în timp ce activitatea enzimatică pe hîrtie de filtru sau pe celuloză microcristalină
(Avicel) se realizează la 400C fie în tampon fosfat 50mM pH 6 (Mac Kenzie şi colab.,1984) fie în
tampon citrat 50mM pH 5,6 (Ishaque şi Kluepfel, 1980). La o altă specie, S.reticuli, testarea
activităţii celulazelor s-a realizat la 450C în tampon Tris HCl pH 7,5 (Wachinger şi colab., 1989).
Alţi autori (Godden şi colab., 1989) testează activitatea endoglucanazică a filtratului de cultură de la
o tulpină de Streptomyces în tampon fosfat de potasiu 100mM, pH 8 la 500C. Recent, Theberge şi
colab.(1992) au caracterizat o endoglucanază de la S.lividans 66 care prezenta o activitate optimă la
p 5,5 la 500C. O situaţie particulară a fost evidenţiată la o tulpină alcalofilă de Streptomyces tulpină
capabilă de a sintetiza trei endoglucanaze diferite, cu pH optim de acţiune ce variază între 6 şi 8,5
(Nakai şi colab.,1988).

17
 Figura 3. Selecţia unor noi tulpini de Streptomyces sp. producătoare de celulaze.

In cadrul unor exprimente realizate cu o tulpină de Streptomyces sp.SD16

izolată în Institutul de Biologie Bucureşti, Cornea şi colab. (1992) au înregistrat o activitate
endoglucanazică maximă la pH 6,4 la 500C în tampon fosfat de potasiu 50mM. In cazul utilizării
drept substrat a hârtiei de filtru au fost obţinute valori maxime de degradare (eliberare de zaharuri
reducătoare) la 400C în tampon fosfat de potasiu 50mM la pH 5,8 şi pH 8 (Figura 4).

Figura 4. Activitatea enzimatică a unor tulpini de streptomicete izolate din sol (după Cornea
şi colab., 1992).

18
 Streptomicetele, ca multe alte bacterii, sitetizează celobiază (β-glucozidază) dar în
mod normal nu o excretă în mediul de cultură ci ea rămâne localizată intracelular. Studii mai
amănunţite asupra acestui tip de enzime au fost realizate la tulpini de S.granaticolor (Jiresova şi
colab.,1987) la care s-a încercat izolarea şi caracterizarea enzimei, ca şi la S.thermodiastaticus
(Ozaki şi Yamada, 1991). La această ultimă specie a fost obţinută o tulpină care produce o β-
glucozidază a cărei sinteză nu este afectată de glucoză, enzima fiind purificată şi caracterizată.
Alături de această enzimă rezistentă la acţiunea glucozei, de la aceeaşi tulpină bacteriană au mai fost
izolate încă două enzime de acelaşi tip (β-glucozidaze) dar a căror sinteză este supusă inhibării de
către glucoză.
Un aspect interesant al cercetărilor referitoare la celulazele produse de bacteriile din
genul Streptomyces este izolarea şi purificarea componentelor acestui sistem. Spre deosebire de
bacteriile din genul Thermomonospora la care au fost bine caracterizate cinci endoglucanaze diferite
(E1-E5) dintre care E3 prezintă sinergism atât cu alte endoglucanaze cât şi cu o celobiohidrolază
izolată de la Trichoderma reesei (Wilson, 1992), la streptomicete asemenea rezultate sunt mai
puţine.
Nakai şi colab.(1987) au purificat şi caracterizat de la o tulpină alcalofilă de
Streptomyces (Streptomyces sp.KSM9) trei celulaze diferite care degradează preferenţial CMC şi
care au fost notate CMC-aza I, CMC-aza II şi CMC-aza III. Greutăţile moleculare ale acestor
enzime variază între 32 kDa (CMC-aza I), 32,5 kDa (CMC-aza II) şi 92 kDa (CMC-aza III).
Purificarea şi separarea celor trei enzime s-a realizat prin cromatografie pe schimbători de ioni, prin
trecerea pe o coloană de DEAE-Toyopearl 650M a unui preparat celulazic brut, rezultat prin
precipitarea cu sulfat de amoniu (70%) a proteinelor din filtratul de cultură şi eluarea lor cu un
gradient linear de NaCl (0,05-0,4M). Alţi autori (Wachinger şi colab.,1989) au fracţionat celulazele
de la S.reticuli prin gel filtrare pe Superose 12 şi au obţinut cel puţin două CMC-aze precum şi mai
multe proteine cu activitate pe celuloza microcristalină. CMC-azele, notate CMC-aza 1 de 40 kDa şi
CMC-aza 2 de 48 kDa prezintă un pH optim de acţiune ce variază între 5,5 şi 7,5 la o temperatură
de 45-500C. De asemenea ele nu sunt inhibate de tamponul fosfat şi nu sunt stimulate de adăugarea
de ioni de calciu în amestecul de reacţie. Spre deosebire de acestea, preparatul enzimatic ce prezintă
activitate specifică pe Avicel, supus electroforezei în gel de poliacrilamidă în condiţii de denaturare
a evidenţiat prezenţa a mai multor benzi cu greutăţi moleculare ce au variat între 42 şi 120 kDa (42,

19
56, 70, 120). Preparatul enzimatic obţinut prin gel filtrare a avut o temperatură optimă de acţiune la
45-500C la un pH optim 7. Activitatea celulazică pe substrat de Avicel este redusă semnificativ în
tampon fosfat, dar este stimulată de adăugarea de CaCl 2 40mM şi de asemenea ea este pierdută
rapid, în decursul a câtorva zile prin păstrare la 4 0C, în timp ce CMC-azele sunt mult mai stabile.
Proprietăţile avicelazei de la S.reticuli sunt foarte asemănătoare celor descrise pentru exoglucanaza
de la Ruminococcus albus care a fost izolată sub forma unui complex de 230 kDa, alcătuitdin
monomeri de 118 kDa (Gardner şi colab., 1987).
Recent, Theberge şi colab.(1992) au purificat şi caracterizat o endoglucanază de la
S.lividans 66 după cultivarea bacteriilor pe mediu cu xiloză ca sursă de carbon. Aceasta este o
glicoproteină cu greutatea moleculară de 46 kDa, cu pI la 3,3 şi cu o activitate maximă asupra
CMC la 500C la pH 5,5. Interesant este că prin cultivarea bacteriilor în mediu cu Avicel sau
celobioză ca sursă principală de carbon s-a obţinut un preparat enzimatic alcătuit din mai multe
proteine de dimensiuni variate, dar active pe oligozaharide şi care au interacţionat pozitiv cu
anticorpii anti-endoglucanază. Fenomenul respectiv a fost observat la celulazele de la Trichoderma
reesei şi de la Clostridium thermocellum, el datorându-se în cazul fungilor fie unui grad diferit de
glicozilare a proteinelor fie unor modificări proteolitice. In cazul bacteriilor fenomenul s-ar putea
explica prin formarea unor complexe enzimatice specifice, celulosomi, doar în prezenţa substratelor
microscristaline. Autorii presupun însă că apariţia fragmentelor endoglucanazice la S.lividans 66 s-
ar datora mai degrabă unei serii de fenomene proteolitice decât unei glicozilări diferenţiate sau
formării celulosomilor. In orice caz, activitatea specifică a endoglucanazei de S.lividans comunicată
de autori a fost de 539 IU/mg proteină, ceea ce reprezintă una dintre cele mai mari valori raportate
în literatură (Theberge şi colab.,1992).
Rezultate interesante au fost obţinute şi de Mac Kenzie şi colab.(1984) care au
reuşit, printre puţinii cercetători de altfel, izolarea şi caracterizarea unei exoglucanaze de la o tulpină
de S.flavogriseus. Aceasta s-a realizat prin cromatografie pe DEAE Bio-Gel A a unui preparat brut
obşinut prin concentrarea de 100 ori a filtratului de cultură (prin ultrafiltrare). Eluarea enzimelor s-a
făcut cu un gradient linear de NaCl (0-0,2M) obţinâdu-se mai multe "peak-uri" cu activitate
celulazică. Cinci dintre acestea au prezentat activitate CMC-azică iar unul a evidenţiat o activitate
enzimatică complexă (avicelazică, CMC-azică, xilanazică şi proteazică). Fracţiile care au prezentat
cea mai mare activitate avicelazică au fost supuse gel filtrării pe Bio-Gel P60 reuşindu-se separarea
avicelazei de CMC-ază. Fracţiile active au fost apoi trecute pe o coloană de Concanavalină A-

20
Sefaroză 4B, fiind recuperată o proteină de 46 kDa care nu a prezentat afinitate pentru coloana
respectivă (pentru lectina imobilizată). Această proteină prezintă pI la 4,15, determină în special
hidroliza celulozei tratate cu acizi ("acid-swollen cellulose"), produşii de hidroliză fiind celobioza şi
celotrioza (în cea mai mare parte).
Datele obţinute la streptomicete, în special de la tulpinile de S.flavogriseus
evidenţiază faptul că mecanismul de acţiune al celulazelor de la aceste bacterii este mai degrabă
asemănător celui descris la fungi la care degradarea substratelor celulozice se datorează acţiunii
sinergice a endoglucanazelor, exoglucanazelor şi β-glucozidazei. De asemenea, glicozilarea unora
dintre componentele sistemului celulazic de la streptomicete (a endoglucanazelor, de exemplu),
fenomen care este destul de puţin răspândit la bacterii dar frecvent la fungi poate sugera un
comportament asemănător al celulazelor de la streptomicete cu cel al unor fungi. In ceea ce priveşte
semnificaţia glicozilării, deşi unii autori atribuie glucidului un rol în funcţionarea enzimei, ea
rămâne încă neclară (Knowles şi colab.,1987).
Cu toate acestea explicarea mecanismului de acţiune a celulazelor de la
streptomicete este complicat de faptul că la unele tulpini bacteriene, la S.reticuli de pildă, au fost
identificate celulaze legate de miceliu ("mycelium buond cellulase") care amintesc de formarea
celulosomilor de la Clostridium thermocellum (Lamed şi Bayer, 1988; Wachinger şi colab.,1989). O
organizare a celulazelor în celulosomi similară celei evidenţiate la clostridii a fost descrisă şi la
Thermomonospora curvata deşi studiile au fost în special de microscopie electronică (Figura 5).

Figura 5. Aspect electronomicroscopic al suprafeţei celulelor de T.curvata cultivate pe fibre

de celuloză (după Bond şi Stutzberger, 1989).
21
 Modificarea aspectului suprafeţei celulelor de streptomicete cultivate în mediu de cultură ce
conţine celuloză drept unică sursă de carbon a fost observată la tulpinile Streptomyces sp.SD16 şi
Streptomyces sp.P216 (Figura 6) (Cornea, 1996). Aceste rezultate sugerează că fenomenul
complexării sistemului celulazic este comun mai multor tipuri de bacterii iar mecanismul de
degradare a celulozei este mai complicat decât s-a presupus iniţial (Ljungdahl 1989).

Figura 6. Aspect electronomicroscopic al celulelor Streptomyces sp.SD16 cultivate în

mediu minimal ce conţine celuloză.

In ceea ce priveşte determinismul genetic al producerii enzimelor celulozolitice,

datele referitoare la streptomicete sunt destul de puţine şi incomplete. In general, clonarea şi
secvenţierea unei gene structurale pentru o enzimă este utilă nu numai pentru determinarea
secvenţei de aminoacizi pe care proteina îi conţine ci şi pentru a obţine proteina în cantitate mai
mare ca şi pentru studii de mutageneză care să determine rolul anumitor secvenţe de aminoacizi în
funcţionarea enzimei. Clonarea prezintă interes mai ales pentru celulaze deoarece prezenţa mai
multor gene care codifică aceste enzime la majoritatea microorganismelor celulozolitice face
dificilă atât obţinerea de mutante cât şi studiul rolului fiecărui component în parte.
Până în prezent s-a reuşit izolarea, secvenţierea şi clonarea în diferite tulpini mutante
de S.lividans (care nu produc celulaze) sau în E.coli a trei gene implicate în sinteza celulazelor la
streptomicete: gena casA ce codifică CMC-aza I de la o tulpină alcalofilă de Streptomyces sp.

22
(Nakai şi colab.,1988), gena celA ce codifică o endoglucanază de la S.lividans 66 (Theberge şi
colab.,1992) şi gena celA1 ce codifică o endoglucanază de la S.halstedii (Fernandezabalos şi
colab.,1992). De asemenea, Shareck şi colab.(1987) au realizat clonarea într-o tulpină mutantă de
S.lividans (care nu producea celulaze) a unei secvenţe de ADN care a determinat nu numai
restabilirea capacităţii de a degrada celuloza ci şi o sporire de peste 800 ori a activităţii enzimatice
comparativ cu tulpina sălbatică. Interpretarea rezultatelor în acest caz rămâne dificilă deoarece
genele clonate nu au fost analizate astfel că nu se poate preciza dacă secvenţele de ADN clonate
conţin gene ce codifică celulaze (endoglucanaze) sau proteine reglatoare.
Secvenţierea genelor casA şi celA a relevat prezenţa unei secvenţe de 14 pb repetate
inversat, plasată înaintea regiunii ce codifică proteinele respective, secvenţă identificată şi la nivelul
genelor celE2, celE4 şi celE5 de la Thermomonospora fusca (Wilson, 1992; Theberge şi colab.,
1992). De asemenea, din examinarea secvenţelor de aminoacizi deduse din examinarea secvenţelor
de nucleotide ale genelor casA şi celA şi compararea lor cu secvenţele de aminoacizi ale altor
celulaze au fost evidenţiate elementele structurale ale celulazelor respective, aşa cum au fost ele
propuse de Gilkes şi colab.(1991): domeniile catalitice, domeniile de legare la celuloză, linkerii ce
unesc asemenea domenii şi secvenţele repetate de aminoacizi. Spre exemplu, endoglucanaza
produsă de S.lividans 66 (codificată de gena celA) este alcătuită din două domenii (domeniul
catalitic şi domeniul de legare la celuloză) conectate de un linker scurt, extremitatea amino-
terminală evidenţiind un grad înalt de omologie cu domeniul de legare la celuloză ("cellulose-
binding domain") al endoglucanazei CenA de la Cellulomonas fimi, iar regiunea din mijlocul
proteinei prezintă omologie extinsă cu celulaza E5 de la T.fusca şi alte endoglucanaze de Bacillus
(Theberge şi colab., 1992).
Conform propunerilor lui Henrissat şi colab.(1989) şi Gilkes şi colab.(1991) de
grupare a celulazelor în familii pe baza secvenţelor de aminoacizi de la nivelul domeniilor catalitice
conservate la mai multe microorganisme şi a analizei regiunilor ("clusteri") hidrofobe,
endoglucanazele ale căror gene au fost clonate şi secvenţializate (casA şi celA) pot fi încadrate în
familia A (celA), alături de endoglucanaze de la Clostridium thermocellum, B.subtilis, Bacillus sp.,
Erwinia chrosanthemi, Ruminococcus albus, Clostridium cellulolyticum etc, şi în familia B (casA)
alături de endoglucanaze de la Cellulomonas fimi, Microbispora bispora şi o celobiohidrolază de la
Trichoderma reesei.

23
 Reglarea activităţii celulazelor reprezintă un alt aspect al cercetărilor cu aceste
enzime, în scopul stabilirii condiţiilor optime de producere şi acţiune a acestora. La fel ca şi în cazul
mecanismului de degradare a substratelor celulozice, mecanismul de reglare a sintezei şi activităţii
celulazelor este destul de neclar. O ipoteză generală susţine că microorganismele celulozolitice
produc celulazele la un nivel bazal care este însă suficient pentru a asigura hidroliza celulozei
insolubile, rezultând produşi de degradare care pot funcţiona ca inductori determinând sinteza unor
cantităţi crescute de celulaze (Robson şi Chambliss, 1989). Ca şi alte enzime hidrolitice
extracelulare şi celulazele se sintetizează ca răspuns la prezenţa inductorului, ele fiind represate de
obicei de produşii finali de degradare. In cazul actinomicetelor există mai multe date referitoare la
reglarea celulazelor la bacteriile din genul Thermomonospora. Astfel, sinteza celulazelor de către
T.fusca este reglată atât prin inducere cât şi prin represie (Liu şi Wilson, 1987). Wilson (1992) a
arătat că tulpina T.fusca YX cultivată pe celuloză a evidenţiat o activitate celulazică de 100 ori mai
mare decât cea obţinută prin cultivarea în mediu cu glucoză ca sursă unică de carbon. Alţi autori
(Fennington şi colab.,1984) au obţinut o tulpină mutantă de T.curvata capabilă de a rezista la
acţiunea inhibitoare a glucozei. Liu şi Wilson (1988) au reuşit izolarea unei tulpini mutante de
T.fusca YX care sintetiza în mod constitutiv celulaze, dar sinteza lor era supusă în continuare
represiei produse de glucoză. Spre deosebire de bacteriile din genul Thermomonospora, la
streptomicete există foarte puţine date referitoare la reglarea sintezei celulazelor iar cele care există
sunt oarecum contradictorii. Astfel, Mac Kenzie şi colab.(1984) au arătat că activitatea celulazelor
de la S.flavogriseus este inhibată de concentraţii mai mari de glucoză şi celobioză, în timp ce Ball şi
Mc Carthy (1988) susţin că în cazul unor tulpini de Streptomyces izolate de ei glucoza şi xiloza nu
exercită efect inhibitor asupra enzimelor implicate în degradarea deşeurilor celulozice de tipul
paielor. In orice caz, cultivarea bacteriilor pe mediu ce conţine celuloză pulbere sau CMC are drept
consecinţă inducerea sintezei doar a enzimelor celulazice în timp ce prin cultivarea bacteriilor pe
medii mai complexe (cu paie, xilan sau tărâţe de grâu) are loc inducerea unei game mai largi de
enzime hidrolitice: atât celulaze cât mai ales hemicelulaze (Mac Kenzie şi col., 1987, Godden şi
colab., 1989). Spre exemplu, Godden şi colab. (1989) utilizând pentru testări o tulpină de
Streptomyces sp. a evidenţiat faptul că endoglucanazele şi β-glucozidazele sunt induse specific prin
cultivarea pe mediu cu CMC ca sursă de carbon. Celobioza a evidenţiat o slabă acţiune de inducere
a sintezei endoglucanazelor, dar induce -glucozidaza în timp ce celotrioza şi celotetraoza induc
slab endoglucanazele. Obţinerea unei activităţi celulazice specifice ridicate în filtratele de cultură

24
rezultate prin cultivarea bacteriilor pe substratele celulozice naturale (de exemplu paie) se datorează
probabil unei cooperări dintre diferiţii inductori rezultaţi din acţiunea componentelor complexului
lignocelulozic. Mai mult, inducerea sintezei celulazelor este inhibată de adăugarea a 50 g/ml
cloramfenicol ceea ce ar sugera că , cel puţin în cazul tulpinii analizate, inducerea enzimelor este
mai degrabă o sinteză "de novo" (Godden şi colab. 1989).

25
 Bibliografie:

[1]. Jurcoane, S., “Tratat de Biotehnologie”, Ed. Tehnica, Bucuresti, 2004, pag
308-315

[2]. Vasilescu, I., “Enzimele”, Ed Academiei Rupublicii Populare Romane,

Bucuresti, 1986

[3]. ebooks.unibuc.ro/biologie/ProgreseVolumul1/capitolul5.doc

26