LP-1

MICROSCOPIA DE FLUORESCEN
Evidenierea nucleilor i a acizilor nucleici

Fluorescena este un fenomen de luminescen ce const n emisie

luminii pentru o scurt perioad de timp dup absorbia acesteia.
Cnd ntrziere dintre absorbie i emisie este de ordinul a 10-8
secunde sau mai puin, fenomenul poart numele de FLUORESCEN;
n cazul n care ntrzierea este mai mare de 10-6 secunde se produce
FOSFORESCENA (emisia dureaz un timp mai ndelungat).
n urma absorbiei de energie, moleculele aflate pe nivelul energetic
fundamental E0 (S0) pot trece pe nivelul de excitare E1 (S1) precum i
pe diferite nivele de excitare vibraional aparinnd strii electronice
excitate. Absorbia are loc doar la lungimi de und a cror energie este
echivalent cu diferena de energie dintre nivelul energetic
fundamental E0 i nivelul de excitare E1.

Fluorescena a fost descris ca un fenomen de relaxare, ce const n

emisia de lumin prin revenirea la starea fundamental (dezexcitare).
Legea lui Stockes
Lungimea de und a fluorescenei emise este de obicei mai mare dect
lungimea de und a luminii absorbite deoarece emisia prin fluorescen

2
corespunde unor energii de tranziie mai mici dect energie radiaiei
absorbite.

Autofuorescena este procesul de fluorescen al unor constitueni

celulari. Cea mai mare parte a autofluorescenei n cazul celulelor de
mamifere excitate n UV sau n domeniul albastru al spectrului vizibil este
datorat NADH, riboflavinei i flavin coenzimelor.
Fluorocromii sunt colorani fluoresceni ce se adaug preparatelor
biologice. Ei sunt alei pe baza urmtoarelor criterii: spectrul de absorbie
i emisie, coeficientul de excitaie, reactivitatea chimic. Cei mai utilizai
fluorocromi sunt: fluoresceina, rodamina, phycoeritrina, DAPI, acridin
orange, iodura de propidiu.
Stingerea fluorescenei (lb.engl. photobleaching) are loc atunci
cnd un fluorocrom i pierde definitiv capacitatea de a emite lumin
fluorescent din cauza leziunilor chimice induse de fotoni i a modificrilor
covalente induse de expunerea prelungit la lumina cu spectrul de
absorbie al fluorocromului.
Evidenierea
acizilor
nucleici
prin
microscopie
de
fluorescen
Detectarea prin MF a acizilor nucleici n celule vii i fixate se bazeaz pe
folosirea 3,6 diaminoacridinei (proflavinei) sau a derivatului su
tetrametilat: 3,6bis(dimetilamino)acridina, numit acridin orange.

Acridin orange-ul are capacitatea de a diferenia ADN-ul de ARN prin

fluorescen; 525nm - verde (ADN) i >630nm - rou (ARN).

Aplicaie clinic Detectarea anticorpilor antinucleari (ANA) pentru

diagnosticarea bolii Lupus eritematos sistemic (SLE) i a altor boli
autoimune
ANA (anti-nuclear antibodies)
Prezena lor a fost descris ntr-o multitudine de afeciuni autoimune
sistemice i organ-specifice (80-90% din cazurile de SLE)
Metod de imunofluorescen indirect
Performana metodei: aproape100% dintre pacienii bolnavi de lupus
au un rezultat pozitiv al acestui test.

Rezultat pozitiv al testului ANA

Distribuia ANA
Identificarea antigenelor implicate pentru un diagnostic difereniat:

4
1.
2.
3.
4.

Aspect nuclear omogen

Aspect ptat
Aspect nucleolar
Aspect nuclear omogen inelar

LP-2
TEHNICI DE IZOLARE A CELULELOR DIN ESUTURI I
SEPARAREA SUBPOPULAIILOR CELULARE
Disocierea celulelor din esuturi
Celulele separate din esuturi parenchimatoase sau snge sunt folosite
att n scop de diagnostic ct i pentru obinerea de culturi de celule.
Obinerea celulelor din esuri parenchimatoase sau din esuturi dure
presupune ca prim etap disocierea din esut i aducerea lor n
suspensie.
Exist dou metode de aducere a celulelor n suspensie:
- aplicarea unor fore fizice
- aplicarea unor metode enzimatice
Acest etap nu este necesar n cazul celulelor din snge.
Separarea (sortarea) celulelor
Separarea celulelor din amestecuri de suspensii celulare se bazeaz pe
diferenele fizice i biochimice ale celulelor.
Dintre metodele bazate pe diferenele fizice, folosite pentru separarea
subpopulaiilor celulare, cea mai utilizat este centrifugarea n medii
speciale (Sepcel, Ficoll, Histopaque).
Separarea pe baza diferenelor biochimice este mai complex i
presupune folosirea unor reactivi speciali. Frecvent se utilizeaz
anticorpii n vederea separrii anumitor subpopulaii celulare, pe baza
reaciei specifice dintre un anticorp i un marker de suprafa
caracteristic subpopulaiei respective. n aceast categorie pot fi
incluse tehnicile bazate pe cromatografia de afinitate, precum i
tehnici mai recente: FACS (fluorescence activating cell sorting) i
MACS (magnetic activated cell sorting).

5
Separarea cu bile magnetice (MACS)
Procedeul se bazeaz pe conjugarea ntre bile magnetice (nanoparticule) i
anticorpi specifici mpotriva unor epitopi de suprafa ai celulelor angajate
n diverse linii celulare.
Celulele care nu prezint epitopii respectivi nu se vor lega de bilele
magnetice.

SELECIA POZITIV. Separarea se realizeaz prin trecerea suspensiei

celulare, n care se introduc bilele magnetice conjugate cu Ac specifici,
printr-o coloan plasat ntr-un cmp magnetic puternic. Magnetul va
atrage celulele ataate de bile (ca urmare a interaciunii specifice Ag-Ac),
la pereii coloanei de separare. Celulele neataate de bile vor trece liber
prin zona supus cmpului magnetic. Celulele reinute de pereii coloanei
de separare (fracia celular de interes) vor fi ulterior eluate prin splare,
dup ndeprtarea cmpului magnetic.
SELECIA NEGATIV se folosesc anticorpi fa de antigene de suprafa
cunoscute ca fiind prezente doar pe suprafaa celulelor care nu sunt de
interes i pe care dorim s le ndeprtm.
I. Separarea celulelor mononucleare si a granulocitelor din
sngele periferic prin centrifugare n gradient de densitate
Principiul metodei
Separarea celulelor se poate realiza prin centrifugare, pe baza
diferenelor de densitate i mrime.
Mediile utilizate pentru separarea celulelor (Histopaque, FicollOdiston, Percoll, Sepcel) trebuie s aib o densitate care se
ajusteaz n funcie de celulele care urmeaz s fie separate.
Pentru separarea celulelor mononucleare din sngele periferic
densitatea optim a mediului este de 1,077.
Proba biologic
Snge periferic recoltat pe anticoagulant
Modul de lucru
Se recolteaz snge venos pe anticoagulant (100 U.I. de heparin
pentru 1 ml de snge);
La cel mult o or de la recoltare, un volum de 3 ml de snge este
pus peste un volum egal de Histopaque (Ficoll-Odiston, Sepcel) cu
densitatea 1,077;

Se centrifugheaz la 350xg, 20 minute, 25OC, rotor swing-out.

n urma separrii se obin 4 straturi distincte;
Cu pipeta Pasteur se ndeprteaz plasma;
Se extrage stratul de celule monocnucleare (limfocite, monocite).
Celulele se spal n mediu RPMI 1640.
Se efectueaz numrarea celulelor mononucleare i se determin
viabilitatea celular prin testul excluziei cu eozin sau albastru de
Trypan.
Suspensia de celule mononucleare se resuspend la densitatea
celular dorit.

Liza selectiv
n cazul celulelor din snge ndeprtarea eritrocitelor de celelalte
populaii celulare (ex. granulocite) se poate realiza prin liza selectiv
a eritrocitelor (tampon de liz: clorur de amoniu 0,84% n tampon
TRIS) .
Metoda lizei selective se poate folosi i n cazul suspensiilor celulare
impurificate cu eritrocite.
Prin liza selectiv a eritrocitelor aceast populaie este practic
eliminat, n suspensie
ramnnd numai celulele nucleate.

LP-3
CULTURI DE CELULE

Definiie
Terminologie
Condiii necesare pentru realizarea unei culturi de celule

Parametrii urmrii n studiul unei culturi de celule

Domenii de aplicabilitate

Definiie
Termenul de cultur de celule se refer la meninerea sau creterea
celulelor in vitro, n condiii controlate, mai mult de 24 ore. n culturile de
celule, celulele nu sunt organizate n esuturi.
Terminologie
Cultur primar - cultur iniiat din celule preluate direct din
organism.
Linie celular cultur ce ia natere din cultura primar la prima
subcultur stabil. Celulele liniei celulare cuprind celule descendente
ale celulelor originale, din cultura primar. n anumite situaii, pentru
imortalizarea culturii primare (proliferarea pe perioad indefinit), se
realizeaz hibridizarea celulelor normale cu linii celulare tumorale.
Tulpin celular - este o subpopulaie de celule derivat dintr-o
cultur primar sau dintr-o linie celular prin selecia sau clonarea
celulelor avnd proprieti specifice sau markeri. Proprietile sau
markerii trebuie s se menin n timpul unor cultivri ulterioare.
Pasaj (subcultur) - transferul sau transplantarea celulelor cu sau
fr diluie dintr-un vas de cultur n altul. Aceast manevr este
necesar deoarece majoritatea celulelor manifest fenomenul de
inhibiie a creterii dependent de densitate, adic blocareaa mitozei
corelat cu creterea densitii celulare. Transferul celulelor este
necesar i din cauza epuizrii substanelor nutritive din mediul de
cultur.
Explant - fragment de esut preluat din organism i transferat ntr-un
mediu artificial pentru cretere sau meninere.
Condiiile necesare pentru realizarea unei culturi de celule
I. Sursa de celule este reprezentat de esuturi prelevate de la om,
animale, insecte, plante.
Dup provenienta lor celulele pot fi:
Normale (celule diploide cu o durat de via limitat):
- adulte se cultiv mai greu in vitro, creterea este relativ nceat,
necesit medii de cultur complexe, i prezint timp de laten al
dezvoltrii ce poate dura 6-10 zile.
- embrionare se cultiv uor, prezint o cretere rapid care ncepe
la scurt timp dup punerea n cultur.
Tumorale (celule cu proliferare foarte activ i de obicei cu via
nelimitat).
Exemplu celulele HeLa (celule epiteliale umane din carcinom de
cervix, stabilizate i cultivate in vitro din 1950. Denumirea liniei
celulare HeLa provine de la Henrietta Lacks (numele persoanei de la
care au fost prelevate aceste celule).
Culturile celulare pot fi iniiate pornind de la celule individuale sau
esuturi. Celulele individuale se gsesc n mod natural liber (ex. limfocite,
granulocite). Disocierea celulelor din esuturi se poate realiza prin:

8
-

metode enzimatice (cu tripsin, colagenaz, pronaz, n funcie de

esut)
metode fizice (mecanic prin rzuire prin site, presare ntre lame de
sticl)

II. Mediul de cultur este specific fiecrui tip celular i trebuie s asigure
condiii asemntoare celor din organismul de origine. Mediul de
cultur trebuie s fie steril (sterilizarea nu se face prin fierbere sau
pasteurizare, ci numai prin sterilizare filtrant folosind pori de 0,22
m). Mediile de cultur cel mai frecvent folosite sunt: RPMI 1640,
ISCOVE, DULBECCO, MEM.
Mediul de cultur are o compoziie complex i cuprinde:
- Soluia salin care asigur izotonia, izoionia, pH-ul i aportul de
glucoz. Izotonia este asigurat de NaCl iar izoionia de o combinaie
de sruri (K+, Ca2+, Mg2+, PO4-, CO32-, SO42- , Fe2+, Cu2+, NO3-). pH-ul
optim al mediului de cultur este de 7,2-7,4 i este asigurat de sistemele
tampon fosfat disodic-fosfat monopotasic, bicarbonat de sodiu CO 2, HEPES (sistem
tampon cu activitate maxim la 7,5 ce se opune modificrilor rapide de pH). Pentru un
control uor i rapid al pH-ului mediului de cultur soluiile conin i un indicator de
pH, rou fenol, a crui virarea a culorii se face de la galben (pH 6,6-6,8) la rou aprins
(pH 7,8-8). Concentraia glucozei n mediul de cultur este de 1-4,5%, prezena ei
fiind absolut necesar pentru susinerea metabolismului energetic.
- Elemente proteice reprezentate de aminoacizi eseniali i
neeseniali precum i de globulinele i factorii de cretere existeni
n serul sanguin. n funcie de tipul de celule se utilizeaz ser fetal de
viel, ser bovin, ser de cal, iepure.
- Vitamine (A, B, C, D, E, K) cu rol n asigurarea viabilitii celulare.
- Antibiotice (penicilin, streptomicin, neomicin) i antimicotice
(amfotericina B). Ele mpiedic apariia infeciilor n mediul de
cultur ntruct serul sanguin coninut de acesta este un mediu
propice pentru dezvoltarea bacteriilor i fungilor.
Medii de cultur fr ser - sunt utilizate pentru producerea vaccinurilor
i a unor produse biofarmaceutice destinate uzului uman.
III. Alte condiii de cultivare: temperatura de 37OC n atmosfer de
CO2 5% umidificat (n cazul celulelor de provenien uman).
Concentraia CO2 variaz ntre 2-10%, n funcie de tipul celular.
Este absolut obligatoriu ca toate manevrele (prelevarea celulelor,
prepararea mediilor, pregtirea vaselor de cultur, investigarea culturilor
i pasajul celulelor, etc) s fie efectuate n condiii sterile, n hot cu flux
laminar sau n hot bacteriologic cu flacr deschis.
Culturi primare (preluate direct dintr-un esut sau organ; au un timp
de via limitat i intr n senescen dup un numr finit de diviziuni)
Realizarea unei culturi celulare primare cuprinde urmtoarele etape:
- recoltarea steril a organului (fragmentului de esut)
- disocierea celulelor din esut prin metode enzimatice sau fizice
- nsmnarea celulelor cu o densitate cunoscut n mediul de cultur

9
-

meninerea plcilor cu celule nsmnate n atmosfer umed cu

CO2 la 37oC
urmrirea zilnic a culturii (viabilitatea, perioada de lag, aderarea,
modificrile morfologice)
schimbarea mediului de cultur la 2-3 zile sau de cte ori este
nevoie

Linii celulare stabilizate

n cazul liniilor celulare se elimin etapa de recoltare. Surse
recomandate pentru procurarea de linii celulare: ECACC (European
Collection of Cell Cultures) i ATCC (American Type Culture
Collection); dein peste 3.400 de linii celulare provenite de la 80 de
specii.
Celulele din culturi pot fi stocate n medii de ngheare speciale n
containere cu azot lichid la 180OC i pot fi utilizate n studii ulterioare.
Senescena celular replicativ (fenomenul Hayflick)
Celulele normale nu se pot divide indefinit din cauza fenomenului de
senescen replicativ.
La nivel celular, senescena reprezint un program fiziologic de
blocare a creterii/proliferrii celulare ce poate fi determinat de
scurtarea telomerelor.
Senescena replicativ se mai numete i fenomen Hayflick, dup
Leonard Hayflick,
cercettor american specialist n biologie
celular care l-a descris pentru prima dat (1961), artnd c
numrul de diviziuni posibile pentru celulele normale n cultur este
limitat.
Domeniile de aplicabilitate a culturilor de celule
Utilizarea culturilor de celule ca model experimental prezint avantajul de
a permite studiul celulelor sustrase influenei sistemului nervos i fluxului
sanguin. Culturile celulare sunt ideale pentru studii de fiziologie i
patologie a celulei i organitelor celulare, morfologie a celulei i a
organitelor celulare, biochimie, biologie celular, biofizic, genetic,
imunologie, farmacologie.
Parametrii studiai n cazul culturilor de celule
1. Viabilitatea celular
2. Aspectul morfologic al culturii (forma i mrimea celulelor, aspectul
membranei, citoplasmei i nucleului, prezena sau absena vacuolelor,
aderarea de substrat)
3. Diviziunea celular (stadiul ciclului celular)
4. Cinetica de cretere (timpul necesar pentru dublarea populaiei,
numrul dublrilor de populaie)
5. Capacitatea de clonare (procentul de celule nsmnate care formeaz
clone)
6. Determinarea activitii unor enzime specifice

10

Exist linii tumorale pentru care nu s-au identificat toi factorii de

cretere necesari pentru cultivarea lor timp ndelugat in vitro i de aceea
este necesar cultivarea lor in vivo, respectiv inocularea lor la animalele
de laborator.
Exemplu EL-4, linie eritroleucemic murin.
Determinarea viabilitii celulare cu ajutorul coloranilor vitali
Stabilirea viabilitii celulelor se bazeaz pe utilizarea coloranilor vitali
(eozin, albastru de trypan, nigrosin).
Coloranii ptrund doar n celulele moarte (prezint leziuni membranare),
pe care le coloreaz, difereniindu-le de celulele vii, care rmn
necolorate.
Viabilitatea celular se exprim n procente.
Colorantul (albastru de trypan) ptrunde
numai n celulele moarte.

Evaluarea strii metabolice a celulelor n cultur

Metoda cea mai simpl i cel mai des utilizata pentru evaluarea strii
metabolice a celulelor n cultur este testul reducerii srii de
tetrazoliu (MTT sau MTS). Metoda se bazeaz pe capacitatea
dehidrogenazelor mitocondriale i citoplasmatice de a reduce sarea de
tetrazoliu la formazan. Determinarea spectrofotometric a absorbanei la
lungimea de und corespunztoare maximului de absorbie al
formazanului (490 nm n cazul utilizrii MTS, 500-600 nm pentru MTT)
permite evaluarea cantitativ a formazanului format i implicit a
capacitii reductoare a celulelor.
Testul
TUNEL
(Terminal-Uridine-Nucleotide-End-Labeling)
Metod
neradioactiv care detecteaz rapid i simplu celulele apoptotice,
permind decelarea fragmentelor de ADN de 180pb rezultate prin
fragmentarea intranucleosomal, caracteristic etapelor trzii ale
apoptozei. Metoda se poate utiliza att pentru celule cultivate in vitro ct
i pentru seciuni de esuturi.

11

TUNEL- Control pozitiv

cultur

TUNEL Proba: Celule K562 n

PROBLEME PRIVIND CULTURILE CELULARE:

CONTAMINAREA CULTURILOR CU BACTERII, FUNGI, SI VIRUSURI
Contaminarea bacterian i fungic. Contaminarea bacterian este
n general vizibil cu ochiul liber i poate fi detectat prin creterea
brusc a turbiditii mediului i prin schimbarea culorii acestuia ca
rezultat al schimbrii pH-ului.
Contaminarea cu mycoplasma. Efectele contaminrii cu mycoplasma
sunt mult mai insidioase dect acelea induse de bacterii i fungi,
acestea referindu-se la: reducerea ratei de cretere, modificri
morfologice,
aberaii
cromozomiale,
modificri
metabolice,
modificarea antigenicitii membranei celulare. Contaminarea nu
este decelabil la microscop din cauza dimensiunilor foarte reduse
ale micoplasmelor (0,2-0,3 m).
Contaminarea viral. Cteva linii celulare conin virusuri endogene
pe care le elimin. Aceste linii nu sunt considerate a fi contaminate.
Serul este considerat o surs potenial de contaminare cu virusul
diareei virale bovine. Folosirea unui ser contaminat cu virus va
determina implicit infectarea liniei celulare ce va cauza modificri
ale ratei de cretere.

LP-4

MEDICINA REGENERATIV
REGENERAREA

TISULAR CU AJUTORUL CELULELOR STEM

EMBRIONARE I ADULTE

Medicina regenerativ reprezint un domeniu al medicinii ce se

bazeaz pe noi tehnologii, avnd ca scop repararea sau nlocuirea esurilor
i organelor lezate, devenite nefuncionale din cauza mbtrnirii, bolilor

12
sau defectelor congenitale, n principal cu ajutorul celulelor cultivate in
vitro. Acest domeniu al medicinii vizeaz aadar regenerarea esuturilor i
organelor lezate prin stimularea unor procese de vindecare a acestora sau,
n condiiile n care nu este posibil regenerarea, lor prin nlocuirea, dup
creterea in vitro a celulelor, esuturilor i organelor i implantarea lor n
organism.
Medicina regenerativ rezolv problema transplantului de organe
prelevate de la donatori umani (persoane n moarte clinic sau persoane
adulte care accept s doneze propriile organe sau poriuni ale acestora,
de exemplu pentru transplantul renal, hepatic, de piele).
Principala strategie abordat n medicina regenarativ este terapia
cu celule stem.
Celulele

stem

sunt

celule

nespecializate

din

organismele

multicelulare care se divid prin mitoz i au capacitatea de a se diferenia

n diverse tipuri de celule specializate (n cele 220 de tipuri celulare ale
organismului uman).
La mamifere exist 3 tipuri de celule stem cu potenial terapeutic:
- celule stem embrionare (izolate din blastocist);
- celule stem fetale (recoltate de la foetus dup ntreruperea sarcinii, din
lichidul amniotic, sau, la natere din sngele cordonului ombilical);
- celule stem adulte (surse: mduva osoas, esutul adipos, sngele).
Clasificarea celulelor stem n funcie de capacitatea de a se diferenia n celule
specializate:

Totipotente pot da natere tuturor tipurilor de celule ale embrionului, foetusului i

organimului adult; deriv din stadiul embrionar de morul (n primele 4 zile dup
fertilizare);
Pluripotente au capacitatea de a se diferenia n celule din cele 3 foie embrionare;
endoderm, ectoderm, mezoderm. Nu se difereniaz n celule ale placentei i
trofoblastului; pot fi izolate din blastocist (embrion n stadiul de 4-5 zile, conine circa
100 de celule);

Multipotente pot genera un numr limitat de tipuri celulare (ex. celulele stem
hematopoietice);

Unipotente dau natere unui singur tip celular.

13

Ovul fertilizat

Morul

Blastocist

Totipotena
La mamifere, produsul de fecundaie (ovulul fertilizat, zigotul) este o
celul stem totipotent, capabil s se diferenieze n toate tipurile
tisulare, ca de altfel i toate celulele provenite din acesta, pn la stadiul
de blastocist. n primele ore dup fertilizare, zigotul se divide n celulele
totipotente identice. Aceasta nseamn c, oricare dintre celule, dac este
implantat n uterul unei femei, va fi capabil s duc la dezvoltarea unui
ft.
Pluripotena i multipotena
Celulele stem embrionare (CSE) se dezvolt din mugurele celular
intern al blastocistului, i dau natere celor 3 straturi germinale
fundamentale: endodermul, ectodermul i mezodermul. n acest stadiu,
CSE ale fiecrui strat i pierd progresiv pluripotenialitatea i devin
multipotente, fiind capabile s se diferenieze numai n cteva tipuri
celulare (tisulare) specifice. Celulele stem multipotente le regsim ulterior
i n organismul copilului, precum i n organismul adult. La sfritul
embriogenezei, fiecare esut include populaii heterogene cu mai multe
linii celulare diferite, aflate n diverse stadii de difereniere (maturare).
Celulele stem adulte (CSA) sau celulele stem specific tisulare (CSST) se
menin toat viaa n esutul de origine, producnd elemente difereniate
noi. CSST au fost identificate n mduva osoas, esutul gastrointestinal,
piele, muchi, ficat, esut adipos.
Celulele stem hematopoietice sunt celule care dau natere tipurilor
celulare din snge. Ele pot fi prelevate i din sngele cordonului ombilical

14
i pot fi stocate n bnci de celule stem prin crioprezervare (-196 oC) pentru
o perioad nelimitat de timp. Celulele stem fetale din sngele cordonului
ombilical sunt multipotente, adic pot genera un numr limitat de tipuri
celulare, i pot fi folosite pentru tratarea unor boli limfoproliferative i
neuromusculare.
Celule stem reprogramate (Celule stem pluripotente induse iPSC)
Celulele adulte difereniate (ex. fibroblaste din derm) pot fi
reprogramate pentru a deveni pluripotente.Tehnologia iPSC a fost iniiat
n 2006 de ctre Shinya Yamanaka (Universitatea din Kyoto, Japonia).
Premiul Nobel 2012 i-a fost decernat cu urmtoarea motivaie a juriului:
"for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become
pluripotent."

Tehnologia celulelor stem ofer direcii i sperane pentru gsirea

unor tratamente eficiente ale bolilor maligne i non-maligne, dar care
presupune un efort susinut, convergent al specialitilor n biologie
celular, genetic i al medicilor. Studiile privind celulele stem n esuturi
solide nu au progresat la fel de mult ca cele privind celulele stem
hematopoietice din cauza dificultii de a reproduce aranjamentul 3D
precis i interaciunile celul-celul i celul-matrice extracelular
existente n organele solide. Cu toate acestea, capacitatea celulelor stem
de a fi asimilate n citoarhitectura tisular sub controlul micromediului
organismului gazd le face ideale pentru a fi utilizate n terapii prin
nlocuire celular.
Celulele stem hematopoietice (HSC) sunt celule stem
multipotente, adulte ce dau natere tuturor tipurilor celulare ale sngelui
i sistemului imunitar; linia mieloid (monocite, macrofage, granulocite,
eritrocite, megacariocite i plachete) i linia limfoid (limfocite T,
limfocite B i Natural Killer).
Sursele HSC:
- mduva osoas hematogen
- sngele periferic
- cordonul ombilical.
-

Sngele de cordon ombilical

Cordonul ombilical realizeaz legatura dintre ft i mam cu ajutorul
placentei;
Prezint dou artere ombilicale care elimin sngele cu substane
reziduale i o ven ombilicala aflat n masa gelului lui Wharton, ce
aprovizioneaz ftul cu snge oxigenat i cu nutrieni.
Sngele de cordon ombilical prezint un potenial ridicat n
transplanturile autoloage sau alogene.

Avantajele utilizrii sngelui de cordon ombilical n transplant

- Este un produs care n mod curent nu e utilizat dup natere;

15
-

Recoltarea acestuia este o procedur uoar, neinvaziv;

Prezint o concentraie important de celule stem hematopoietice;
Este mai bogat n celule progenitoare hematopoietice faa de
mduva osoas hematogen sau sngele periferic;
Compatibilitatea HLA (Human Leukocyte Antigen) este mult mai
puin restrictiv n comparaie cu transplanturile de mduv;
Dup transplant riscul apariiei bolii gref contra gazd (Graft versus
host disease) este mai sczut fa de transplanturile de mduv.
Prezint risc sczut de apariie a infeciilor.
Poate fi utilizat n tratarea unei palete largi de boli limfoproliferative,
neuromusculare.

Bncile de celule stem

- Pentru o disponibilitate mai uoara a sngelui de cordon ombilical, la
nceputul anilor 90 au fost nfiinate primele bnci ce stocheaz
sngele de cordon ombilical.
- Bncile de CS sunt de dou tipuri: publice i private (familiale).
- Sngele de cordon ombilical este recoltat, procesat i crioprezervat
pentru o perioad nedefinit de timp.
Colectarea, procesarea si crioprezervarea SCO
Spre deosebire de colectarea sngelui din mduva osoas, colectarea
SCO este o procedur neinvaziv, nedureroas, nici pentru mam, i nici
pentru nou-nscut.
Procesarea const n principal din trei etape majore, indiferent de banc:
- ndeprtarea eritrocitelor i plasmei;
- reducerea volumului concentratului leucocitar, ceea ce
presupune izolarea celulelor CD34+ (celulele stem hematopoietice) din
sngele integral / concentratul leucocitar (buffy-coat);
- numrarea celulelor stem din prob;
- nghearea i stocarea probei;
Crioprezervarea (stocarea) celulelor stem se realizeaz n tancuri speciale
ce conin azot lichid la -196oC.
Numrarea celulelor stem din proba de snge de cordon ombilical
SCO este prelevat sub forma de uniti de snge individuale, fiecare prob
de snge avnd o concentraie proprie de celule stem;
Pricipalul marker de suprafaa al celulelor stem hematopoietice este
CD34.
Numrarea este realizata cu ajutorul unui flow-citometru, care are i
capacitatea de a le separa de restul celulelor (sortare).
La o numrare obinuit se dorete aflarea numrului de celule stem per
unitate, numrul total de celule nucleate (TNC), precum i viabilitatea
celulelor din prob (cte celule vii au rmas dup procesare /
crioprezervare).
Numrul de celule CD34+ per prob este direct proporional cu TNC-ul.
Viabilitatea este influenat de timpul trecut de la recoltare i pn la
procesare. Cu ct timpul procesrii sau stocrii este mai apropiat de cel al

16
recoltrii, cu att viabilitatea msurat nainte i post-dezgheare sunt mai
mari.
Doza de transplant trebuie s conin cel puin 30 milioane de celule
nucleate per kg corp (2,9 ml de SCO per kg corp; 8,6x106 TNC per ml de
SCO).