PREGTIREA PREPARATELOR

PENTRU TEHNICILE DE
MICROSCOPIE

Dr. Mihnea I. Nicolescu

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Obiectivul lucrrii practice

Cunoaterea etapelor de pregtire a preparatelor pentru

1. Microscopie
Optic (MO)

2. Microscopie
Electronic
(ME)

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b1/Optical_microscope_nikon_alphaphot_%2B.jpg/220px-Optical_microscope_nikon_alphaphot_%2B.jpg

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Puterea de rezoluie
ochiul uman
microscop optic
microscop electronic

http://research.stowers-institute.org/microscopy/external/Technology/Microscopy/index.html

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Pregtirea preparatului
pentru microscopie
optic
Cerine necesare pentru o examinare precis:
- Celulele i celelalte elemente prezente n
esut s fie pstrate n condiii ct mai
apropiate de condiiile lor naturale (FIXARE)
- Preparatul s fie transparent, subire, plat
- Diferitele componente s fie colorate diferit
(COLORARE)
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Pregtirea preparatului
pentru microscopie
optic
Posibiliti de preparare
- seciuni
- in toto (structuri/organisme mici,
suficient de subiri pt. a fi ntinse pe o
lam)
- zdrobire (pt. studiul coninutului celulei)
- frotiuri (celule suspendate n fluid)
- culturi celulare
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Preparatul microscopic permanent

Modalitatea de examinare a unor celule,
fragmente de esut sau organ, crora li sau suprimat procesele vitale prin fixare

Permite examinarea la microscopul optic a

principalelor caracteristici ale celulelor i a
modului lor de organizare

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Preparatul microscopic permanent

Un preparat microscopic este alctuit din:
1. obiect de examinat (subire i transparent)
2. mediu de montare (transparent)
3. suport de montare (lam i lamel/gril)

http://www.agtcbioproducts.com/images/slide.jpg

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Preparatul microscopic
permanent
Scopul realizrii de a conserva
- structurile celulare i
- raporturile dintre ele pe un timp
nelimitat.
Este folosit n:
-clinic
-laboratorul de anatomie patologic
-medicin legal
-cercetare
-scop didactic

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Etapele obinerii
preparatului
microscopic permanent

Recoltare
Fixare
Includere
Secionare
Colorare sau impregnare/contrastare
Montare (ntre lam i lamel/pe gril)
Etichetare

MO

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

ME

1. RECOLTAREA
= Operaia prin care fragmentul de esut/organ
este prelevat de la om, animal viu sau de la
cadavru
1. dimensiunea pieselor s nu
depeasc 5 mm
2. instrumentele bine ascuite
pentru a evita zdrenuirea i
pierderea paralelismului
dintre planuri
3. adecvat n funcie de tipul
organului; se vor evita
modificrile de volum, form
i relief

RECOLTAREA BIOPSIC

Se recolteaz de la om sau
animal viu i se practic n scop
diagnostic.
Se realizeaz prin :
1. raclare
2. puncie-biopsie
3. aspiraie cu ac fin
4. intervenie chirurgical

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

1. RECOLTAREA

(ct mai aproape de momentul decesului)

pentru a evita procesele de autoliz

RECOLTAREA NECROPSIC
recoltarea de la cadavrele umane se
practic n laboratoarele de anatomie
patologic i medicin legal cu
scopul de a confrunta datele de
anatomie clinic i tanatogenetice
dup sacrificarea animalului, n scop
de cercetare sau didactic
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Recoltarea biopsic
A. raclare

A
B

B. puncie biopsie
C

C. aspiraie cu ac
fin

D. intervenie
chirurgical
- biopsie incizional
- biopsie
excizional

http://img.webmd.com/dtmcms/live/webmd/consumer_assets/site_images/articles/health_tools/eczema_overview_slideshow/photolibrary_rm_photo_of_hand_with_eczem
a.jpg
http://www.beliefnet.com/healthandhealing/images/si55551723.jpg
http://www.glowm.com/resources/glowm/graphics/figures/v1/0270/016f.jpg

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

2. FIXAREA
etap critic pentru un bun preparat
proces fizic sau chimic prin care:
- sunt oprite rapid procesele vitale (celulare),
- pstrndu-se cu alterri minime
-

volumul,
http://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Sci_Lab_Histo_Lead0004_d0f91f3944.jpg
forma,
relieful i
raporturile moleculare (n structuri/ultrastructuri) i spaiale (ntre
structuri/ultrastructuri)

Prin fixare urmrim:

1.Conservarea esuturilor
2.Prevenirea pierderii de constitueni celulari
3.Creterea diferenierii optice a structurilor
celulare
4.Mrirea consistenei esuturilor n scopul de a
facilita trecerea lor prin celelalte etape i mai
ales pentru secionare
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

2. FIXAREA

MO
Fizic: criofixare
Chimic: alcool
metilic,
aceton,
formol

ME
Fixare dubl
Fixare cu
glutaraldehid
Stabilizeaz proteinele
Postfixare cu tetroxid
de osmiu
Stabilizeaz lipidele i
proteinele

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

3. INCLUDEREA

- etapa care asigur condiii optime pentru

secionarea pieselor
- precedat de deshidratare n soluii de
alcool de concentraii crescnde

ME

MO
Cea mai folosit mas
de incluziune: parafina

Rini epoxidice
(epon)

http://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Embedding_028_sized_31fe12192c.jpg
http://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Sci_Lab_Histo_Lead0008_03_a9cda89157.jpg

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

4. SECIONAREA
MO
cu microtomul
(aprox. 5m)

ME
cu ultramicrotomul
(40-100nm)

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Eantion de esut
n bloc de epon, fixat
n menghina
ultramicrotomului

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Bac cu ap
(Pentru
Cuit
de sticl

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

recoltarea
seciunilo
r)

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

5. COLORAREA

- creterea contrastului ntre

elementele tisulare sau celulare
cu ajutorul coloranilor
MO
Prin metode
compatibile cu
metoda de fixare
Pot fi metode
universale (HE) sau
specifice esutului
studiat (Nissl)

ME
Contrastare n soluii
de metale grele
(acetat de uranil i
citrat de plumb)

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

6.
MONTAREA
- permite conservarea
specimenelor pentru ct mai
mult
timp
MO
MO

ME

ntre lam i lamel, n

pe grile de cupru
diferite medii de
montare, iniial fluide
Protejarea seciunilor
fragile de eventualele
deteriorri
Conservarea
coloraiei i asigurarea
unui mediu optic
omogen i transparent
necesar examinrii
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti
microscopice

Seciuni pe gril
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

7. ETICHETAREA
Pe fiecare lam se noteaz:

tipul celular/tisular
sursa de recoltare
fixatorul
metoda de colorare
data realizrii preparatului
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Pregtirea preparatului pentru

microscopie electronic de
baleiaj/scanning (SEM)

- Pentru o imagine convenional de SEM,

suprafaa probelor de analizat trebuie s fie
conductiv electric i s fie asigurat
mpmntarea
pentru
a
mpiedica
acumularea ncrcrii electrostatice a
acestei suprafee
- Probele
biologice
sunt
acoperite cu un strat foarte
subire
de
materiale
conductive (Au, Au/Pd, Pt,
Os, Ir, Tu, Cr). Exist tehnici
de
SEM
care
permit
examinarea probelor fr
acoperire

ESEM

mtse.unt.edu/FACULTY/bgorman/sample%20prep.pdf

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Pregtirea preparatului pentru

microscopie electronic de
baleiaj/scanning (SEM)
- Fixare (fizic prin cldur sau ngheare /
chimic)
- Deshidratare (soluii de alcool de %
diferite)
- Montare
- Acoperire
(nvelire)
cu
metale
nalt
conductive
- Examinare

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

CONCLUZIE
Microscopia optic prezint structura
celulei i a esuturilor.
Pentru completarea informaiilor
obinute, se utilizeaz microscopia
electronic, pentru descifrarea
ultrastructurii acestora.
2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti