PREPARAREA ESUTURILOR I CELULELOR PENTRU OBSERVARE LA MICROSCOPUL ELECTRONIC

1. Microscopia electronic de transmisie (TEM, "transmission electron microscopy") Exist cinci modaliti de pregtire a probelor pentru microscopia electronic de transmisie. 1.1 Studii pe seciuni ultrafine ("Ultrathin scctioning,,): Reprezint cea mai folosit modalitate, implicnd etapele redate n fig. 1. a) Prelevarea materialului : din esuturile analizate se taie cu o lam de ras ct mai repede posibil, piese dc circa 1mm3 care se introduc n fixatori. b) Fixarea materialului: are scopul pstrrii structurii materialului biologic i stabilizrii ei ct mai aproape de structura "in vivo"; se face introducndu-1 timp de 30 minute pn la 24 ore n soluii de fixatori: glutaraldehid 1-2% pentru prefixare, apoi n acid osmic 12% pentru fixare definitiv. Glutaraldehida produce stabilizarea proteinelor ("cross - link"), prezint avantajul pstrrii n oarecare msur a activitilor enzimatice i de aceea se folosete i n studiile de histochimie la microscopul electronic. Acidul osmic ( introdus n 1952 dc Georgc Emil Palade) stabilizeaz lipidele i fiind i metal greu adaug contrast la preparat. c) Deshidratarea: se face introducnd piesele n soluii de concentraii cresctoare de aceton sau etanol, solveni miscibili cu materialele utilizate pentru includere. d) Includerea: piesele deshidratate sunt introduse n soluii de rini sintetice (epon, vestopal, metacrilat etc.) spre a fi ptrunse de acestea; dup infiltrare piesele se incubeaz la 60C timp de 24 ore n care timp se produce polimerizarca i ntrirea rinii; piesele trebuie incluse pentru a se putea seciona, iar deshidratarea este necesar pentru ndeprtarea apei care nu este miscibil cu rinile. e) Secionarea i montarea pe grile: dup o prelucrare preliminar a blocului de plastic coninnd preparatul se fac seciuni la ultramicrotom, aparat prevzut cu cuit de sticl sau de diamant. Seciunile avnd suprafaa sub 1 mm2 i grosimea de aproximativ 60 nm, sc desprind de pe cuit plutind pe suprafaa apei din cuva ultramicrotomului, de unde sunt prinse pe grile (uneori acoperite cu carbon i o pelicul de plastic, de pild parlodion). f) Colorarea seciunilor se face cu sruri ale metalelor grele spre a mri contrastul imaginilor (cu acetat de uranil, citrat de plumb, acid fosfotungstic, permanganat de potasiu sau bariu). g) Examinarea preparatelor la microscop i fotografierea imaginilor de interes. Aplicaii: microscopia de transmisie cu coloraie pozitiv a seciunilor fixate se utilizeaz n studiul celulei n condiii normale i patologice. Astfel, microscopia electronic a

precizat ultrastructura celulei, dovedind existena membranei plasmatice la exterior (plasmalema), a demonstrat existena membranei duble a nucleului cu porii nucleari, a precizat ultrastructura mitocondriilor, descriindu-se sistemul de membrane externe i interne mitocondriale (crestele mitocondriale fiind evideniate prima dat de G. E. Palade), membranele rcticulului endoplasmic, aparatul Golgi, a fcut posibil descoperirea peroxizomilor, a precizat structura diferenierilor citoplasmatice (microfilamente, microtubuli).

Fig. 1 Pregtirea probelor pentru microscopia electronic de transmisie Datorit microscopici electronice a devenit posibil studiul modificrilor ultrastructuralc patologice, de pild n bolile mitocondriale, lisosomale (tezaurismoze) sau a modificrilor patologice n alte boli ce afecteaz structurile celulare, precum a efectelor unor tratamente asupra integritii structurale a celulei. Microscopia electronic pe seciuni colorate pozitiv a permis apoi studiul fraciunilor subcelulare izolate prin centrifugare difereniat i efectuarea unor studii de histochimie, cu localizarea subcelular a unor enzime. Dezavantaje: necesit etape multe de pregtire a seciunilor, n acestea existnd ansa de apariie a unor artefacte. Apoi este dificil examinarea structurii spaiale (tridimensionale) a

obiectului, realizabil numai prin seciuni seriate. n sfrit proba este fragil i se deterioreaz prin radiaii dac este lsat prea mult timp n fasciculul electronilor. 1.2 Colorarea negativ ("Negative staining') Se folosete n special pentru examinarea particulelor. Proba este nconjurat de un strat de material dens ( molibdat de amoniu, fosfotungstat de Na, acetat de uranil), foarte opac pentru electroni. Deoarece colorantul mprtie electronii fondul colorat apare negru, iar particulele prin care trec electronii apar albe. Deci particulele apar albe pe fond ntunecat. Proba se prepar rapid, amestecnd particulele cu o soluie de acid fosfotungstic 1%, apoi se plaseaz o pictur din amestec pe o gril carbonatat, lsnd s se usuce. n cteva minute preparatul poate fi examinat la microscop. Aceast metod se folosete la examinarea virusurilor, a componentelor celulei bacteriene (pili, flageli, perete celular izolat), a liposomilor sau a particulelor din membrane. De pild prin aceast metod se poate identifica membrana intern a mitocondriilor dup particulele ce proemin din membran, n care se afl localizat ATP-aza, enzima cheie n sinteza de ATP n mitocondrii. 1.3. Umbrirea cu metale Se utilizeaz pentru obinerea reliefului obiectelor examinate. ntr-un evaporator de vid un fir de platin este nclzit pn la vaporizare. Apoi metalul este depus pe preparatul ce urmeaz a fi examinat. Depunerea se poate face n dou feluri. n prima variant depunerea metalului se face dintr-o singur direcie, deci pe o fa a preparatului se depune metal iar pe cealalt nu se depune ; electronii trec uor prin partea ce nu conine metal, mai greu prin fond i foarte greu prin partea metalizat. Particula va apare ca vzut n lumin puternic, deci cu o umbr. Acest procedeu se folosete n special pentru virusuri. n a doua variant proba este metalizat prin rotirea ei ("rotary shadowing ), astfel ca particula s apar n relief fa de fond. Aceast tehnic se utilizeaz pentru ngroarca unor filamente foarte subiri, cum sunt cele de ADN (20 ) care dup metalizare apar de 10 ori mai groase ca n realitate. 1.4. Criofracturarea '("Freeze fracture") n aceast tehnic proba este ngheat instantaneu pentru a se pstra-structura, apoi este fracturat n vid foarte nalt i la temperatur foarte sczut, dup care se face o replic a suprafeei fracturate. Replica se examineaz apoi la microscopul de transmisie. Prima etap, nghearea, se face foarte rapid, cel mai adesea prin plasarea probei pe un suport dintr-un material bun conductor de cldur (cupru, argint, aur), care se arunc ntr-un lichid criogen (propan, etan, azot lichid). A doua etap, fracturarea, se face n aparate speciale de criofracturare deoarece trebuie s se fac n vid nalt (spre a evita condensarea apei pe suprafaa fracturat) i la o temperatur ct mai joas (pentru a evita deformarea plastic). Fracturarea probei se poate face prin lovire cu un cuit sau alte procedee.Planul de fractur trece prin liniile de minim rezisten, de pild prin centrul stratului dublu lipidic al membranelor biologice (fig. 2).

Fig.2 Schema criofracturrii Spre a se pune n eviden proeminenele de pe suprafaa de fractur, proba se nclzete la -100 C i se las 30 - 90 secunde pentru evaporarea gheii, proces numit gravare ("etching"). A treia etap, replicarea, se face prin vaporizarea unui amestec de platin i carbon proiectat sub un unghi de 45 pe suprafaa fracturat, apoi se proiecteaz la 90 vapori de carbon spre a obine un film de suport al replicii de 15 - 20 nm grosime. Dup aceea replica se scoate din aparat, se cur i se examineaz la microscopul electronic de transmisie. Aplicaii: Studiul membranelor biologice naturale (evidenierea proteinelor integrale de membran) al jonciunilor celulare, studiul liposomilor (structur i dimensiuni). 1.5. Examinarea direct a preparatelor pe gril Se utilizeaz la examinarea cromozomilor sau a altor preparate relativ groase, care mprtie suficient de puternic electronii pentru a da o imagine far secionare, colorare sau metalizare. Se poate realiza i cntrirea cromozomilor deoarece mprtierca electronilor este proporional cu masa lor. 2. Microscopia electronic de baleiaj ("scanning electron microscopy") n aceast variant un fascicul subire de electroni este micat pe suprafaa obiectului (baleiat) la fel cum un fascicul de electroni baleiaz suprafaa ecranului unui televizor. De fapt, electronii mprtiai de prob vor fi colectai de un fotomultiplicator, apoi detectai pe ecranul unui televizor. Fasciculul de electroni pe ecran se mic sincron cu fasciculul de electroni ce baleiaz suprafaa obiectului (fig. 3). Din depresiunile obiectului sunt reflectai mai puini electroni, deci acestea apar mai ntunecate; dimpotriv, proeminenele sunt mai luminate fiindc mprtie puternic electronii. Consecina este obinerea n relief a imaginii, care poate fi i fotografiat.

Fig. 3 Schema microscopului electronic cu baleiaj Specimenele care se examineaz la microscopul cu baleiaj trebuie s fie uscate (deshidratate). Uscarea se poate face n aer numai n cazul probelor foarte rigide precum sporii de ciuperci. n cazul altor specimene, pentru a le pstra structura nemodificat (fiindc suprafaa s-ar zbrci prin deshidratare) se pot folosi dou tehnici: - una este criouscarea ("freeze drying") care se face nghend proba foarte rapid n vid foarte nalt (cum s-a descris la criofracturarc), apoi lsnd gheaa sa sublime; procedeul este similar cu cel de "etching", doar c se las proba pn sublimeaz toat gheaa; - a doua tehnic se numete uscarea la punct critic ("critical point drying") i se bazeaz pe fenomenul fizic al dispariiei suprafeei de separare ntre lichid i gaz la o anumit temperatur i presiune (punctul critic). La punctul critic lichidul devine gaz far ca s existe fore de tensiune superficiale. Deci dac un specimen umed este imersat complet ntr-un lichid sub punctul critic ntr-un vas de presiune i apoi se nclzete pn presiunea i temperatura devin superioare punctului critic, specimenul va ajunge n gaz fr s existe for de tensiune superficial (deci se evit deformarea suprafeei specimenului). Apa are punctul critic la valori care ar distruge probele (374 C i 3212 psi); de aceea se folosete ca fluid C02 (ce are punctul critic la 31 C i 1072 psi). Fiindc apa i dioxidul de carbon nu sunt miscibile sunt necesare nti etapele de fixare (cu glutaraldehid i tetraoxid de osmiu) i deshidratare (prin treceri succesive n serii dc aceton sau etanol). Apoi se plaseaz proba n aparatul de uscare la punct critic se imerseaz n CO: lichid, se nclzete cu cteva grade peste 31 C, dup care se ndeprteaz C02 i se scoate proba din aparat. Apoi se aplic pe suprafaa specimenului un strat subire de metal (aur, aur/paladiu, platin), cu grosimea sub 15nm, dup care preparatul poate fi examinat la microscopul cu baleiaj. Microscopia cu baleiaj permite examinarea formei celulei i a suprafeelor ceea ce nu se poate face cu microscopul de transmisie. De pild se pot vedea formele hematiilor umane modificate n unele forme genetice de anemii hemoitice (sferocitoz, ovalocitoz, anemia falciform cu celule n form de secer) fa de forma normal de disc biconcav.