1

Curs de Biofizic
Prof.dr. Cipriana tefnescu
Disciplina de Biofizic
i Fizic medical
9
V rugm: gndii!
MICROSCOPIA
ELECTRONIC
Antarctic Mite -
Principiul fizic al microscopiei electronice
Interaciunea dintre un fascicul de electroni i
preparat
Partile principale ale unui microscop electronic
- Microscopul electronic de transmisie -TEM
- Microscopul electronic de baleiaj - SEM
Tehnici n relaie cu microscopia electronic
Subiecte principale:
2
Istoria microscopiei electronice
DATA NUME EVENIMENT
1897 J. J. Thompson Descoperirea electronului
1924 Louis de Broglie Identificarea lungimii de unda a electronilor in miscare
l=h/mv
unde:
l = lungimea de unda
h = constanta lui Planck
m = masa
v = viteza
(Pentru un electron la 60kV, l = 0.005 nm)
1926 H. Busch Efectul de lentila (asupra electronilor) al cmpurilor
magnetice sau electrice
1929 E. Ruska (Teza de doctorat) cu privire la lentilele magnetice
1931 Knoll & Ruska Construirea primului microscop electronic
1931 Davisson & Calbrick Proprietatile lentilelor electrostatice
1934 Driest & Muller Depirea rezoluiei MO
1938 von Borries & Ruska Primul EM (Siemens) - 10 nm rezolutie
1940 RCA EM comercial cu rezolutie 2.4 nm
1945 1.0 nm rezolutie
Microscopie electronica TEM
imagini ale membranei
Scala lucrurilor vizibile macro si
microscopic:
3
Rezoluia
Microscopia optica: detalii care nu sunt vizibile cu ochiul liber.
Microscopia electronica putem vedea detalii care nu sunt vizibile nici
cu ochiul liber si nici in microscopia optica.
a) Drosophila melanogaster, o musculi des folosita ca model animal
b) detalii din zona capului (microscopie optica)
c) detalii ale ochiului (SEM) (Tobin, Morell)
Principiul fizic al microscopiei
electronice
4
Ipoteza: Orice particul n micare asociaz o
und cu lungimea de und l
Ecuaia lui Louis de Broglie, 1923:
l = h/p = h/mv
unde:
h constanta lui Planck
p = impulsul particulei
m = masa particulei
v = viteza particulei
Dac viteza crete, l scade, puterea de
rezoluie crete:
l = h/p = h/mv
dar
d = l/2n sin u
p
r
= 1/d = 2n sinu / l
unde:
p
r
=puterea de rezoluie
d =distana minim dintre 2 puncte care pot fi vzute separat
n =indicele de refracie
u =unghiul de deschidere al microscopului.
Ex: pt 10 kV, - 130 nm,
pt 100 kV, - 30 nm .
Interactiunea
dintre
fasciculul de electroni
si
preparat
5
Tipuri de semnal dupa interactiunea fascicului de
elctroni cu preparatul
Fascicul incident de electroni
(5-40 kV)
Electroni transmii:
TEM
Raze X:
nuclear
microanal ysis
Electroni secundari:
SEM
Electroni retrodifuzai
Semnal n vizibil, U.V., I.R.
Fenomen de cato-
doluminescena
preparat
electroni Auger
Electroni
mprtiai
inelastic
Electroni
mprtiai elastic
Electroni transmii
nedeviai
Producerea diferitelor tipuri de particule la
interactiunea electronilor incidenti cu atomii:
6
Imagini TEM
Prtile principale ale unui
microscop electronic:
- Microscopia electronica de transmisie
- TEM
- Microscopia electronica de
baleiaj - SEM
Comparatie intre principiul microscopului optic si
cel al microscopului electronic:
7
Partile principale ale unui microscop electronic:
Tunul electronic :
Fascicol de
electroni
Anod
Filament Tungsten
Catod
Efect termionic
Sursa de
electroni
8
Lentilele electromagnetice
Un cmp magnetic intens
este generat printrecerea
unui curent electric printr-o
spiral metalic.
Acest cmp magnetic
acioneaz ca o lentil
convex asupra traiectoriei
electronilor.
Distana focal poate fi
modificat prin
modificareaintensitii
curentului electric.
Imaginea este rotit
dependentde puterea
lentilei.
Microscopul electronic
prin transmisie
Principiul TEM
Se folosesc electroni
transmii elastic prin
prob
e sunt focalizai de 2
lentile condensor,
n final e trebuie s
iradieze
toat suprafaa probei
Proba este aezat pe o
gril electrostatic
Lentil obiectiv
Lentil intermediar,
reglaj fin
Lentile de proiecie
Ecran fluorescent sau film
9
Microscopul electronic de transmisie
comparatie cu microscopul optic
Sursa
Lentile condensor
Lentile obiectiv
Lentile de proiecie
Gril electrostatic: 100 nm grosime
(cupru, molibden, aur platina)
Grosime preparat: sute de nanometri
Imagine MET
Cross section through rat ventricular myocytes. A.
Nucleus, B. Mitochondria, C. cross section of
myosin (thick filaments) and actin (thin filaments),
D. caveolae, scalebar 500nm
ParisaAsghari, Researcher in Dr. Ed Moore's lab,
Department of Cellular and Physiological
Sciences, UBC
Bacillus subtilus
10
Microscopul electronic prin
transmisie
11
Calitatea imaginii
Mrirea: raportul dintre mrimea imaginii i
mrimea obiectului
Rezoluia: 0,1 0,2 nm
Luminozitatea: depinde de numrul de
electroni transmii (intensitatea fascicolului
incident +caracteristicile probei)
Marcheri electrono-opaci: elemente cu numar
atomic mare (Osmiu, Plumb) care cresc
contrastul (absorb electroni)
Calitatea imaginii
mrirea, raportul dintre mrimea imaginii/mrimea
obiectului,
rezoluia, cu att mai bun cu ct l este mai mic i
apertura mare (care, ns, mrete aberaiile de
sfericitate) la diafragme de 20-70 m
rezoluia este 0,1-0,2 nm,
luminozitatea imaginii depinde de numrul de
electroni transmii
intensitatea fascicolului incident
caracteristicile probei,
raportul semnal/zgomot (semnal util/perturbator),
marcherii electrono-opaci utilizai.
Microscopul electronic
cu baleiaj
12
Principiu
Un spot de electroni baleiaz suprafaa probei (punct cu
punct)
Se folosesc electronii secundari emii din prob
Energie mic (0 50 eV)
Imaginea se formeaz pe un ecran fluorescent sau pe o
pelicul fotografic
Se obin imagini ale suprafeei unei celule, a unui
microorganism sau a unui esut, de unde impresia de
imagine tridimensional.
Mrire maximum 200 000 x, cu rezoluie de 3,5 nm.
Microscopul
electronic cu
baleiaj
Alctuire:
- tun electronic: fascicol de
e cu diametrul de 50nm
- 2-3 lentile condensoare:
spot e de 2 nm
- o lentil condensoare de
reglaj fin
- detector , cristal de
scintilaie, amplificare
- ecranul unui tub catodic
sau al unui monitor
13
Caracteristici
Mrire: maxim x 200 000 (dependent de
lungimea baleiajului orizontal)
Rezoluie 3,5 nm; cu att mai bun cu ct
diametrul spotului este mai mic
Luminozitatea fiecrui punct depinde de
numrul de e secundari emii i nregistrai din
punctul respectiv (unghiul sub care cade spotul de
e pe preparat, prezena metalelor grele emit mai
muli e).
Un fascicul de e cu energie prea mare smulge mai
muli e secundari; scade contrastul.
Proporii
Influenarea emisiei de electroni secundari:
- unghiul sub care cade spotul pe preparat,
- elementele grele apar mai luminoase, deoarece
emit mai muli electroni secundari,
- energia electronilor incideni: un fascicol de
electroni de energie mare smulge mai muli
electroni secundari, din toate zonele
preparatului, astfel nct micoreaz contrastul.
14
MEB - des rythrocytes humains vieilles
limphocyt B
Diffrents grains de pollen
Transformare in
sferocit
Leptocit si
microsferocit
Transformare in
echinocit
Hematii normale
TEM
versus
SEM
15
In TEM electronii traverseaz preparate foarte
subiri (50-1000 nm). Fascicol de e care
iradiaz toat suprafaa probei (bulk).
In SEM semnalul (electroni secundari) este
emis de pe suprafaa preparatului care are
grosime mai mare. Fascicolul de e este foarte
fin (subire).
SEM: imagini ale suprafeei
TECHNIQUE RESULTS
Scanning electron micro-
scopy (SEM). Micrographs taken
with a scanning electron micro-
scope showa 3D image of the
surface of a specimen. This SEM
shows the surface of a cell froma
rabbit trachea (windpipe) covered
with motile organelles called cilia.
Beating of the cilia helps move
inhaled debris upward toward
the throat.
(a)
Cilia
1 m
16
TEM: detalii ale structurii interne:
Transmission electron micro-
scopy (TEM). Atransmission electron
microscope profiles a thin section of a
specimen. Here we see a section through
a tracheal cell, revealing its ultrastructure.
In preparing the TEM, some cilia were cut
along their lengths, creating longitudinal
sections, while other cilia were cut straight
across, creating cross sections.
(b)
Longitudinal
section of
cilium
Cross section
of cilium
1 m
TEM/SEM
Glomerular membrane
The head of an ant
TEM / SEM: limfocit infectat
de un retrovirus
17
TEM SEM
Microscopul electronic de transmisie (TEM)
1: Tunul deelectroni.. 2 Lentileelectro-magnetice
pentru dirijareasi focalizareafascicolului de
electroni ininteriorul coloanei. 3: Sistemul
pompelor devid. 4: Deschidereaprincarese
introducobiectelepentru observatieincamerade
vidare. 5: Panouri deoperare(stangapentru
aliniere; dreaptapentru mariresi focalizare; sageti
pentru pozitionareaobiectului ininterior).
6: Ecranpentru afisareameniului si aimaginii.
7: Apapentru racireainstrumentului.
Microscopul electronic de baleiaj (SEM)
1: Tunul deelectroni. 2Lentileelectro-magnetice pentru
dirijareasi focalizarea fascicolului deelectroni ininteriorul
coloanei. 3: Sistemul pompelor devid. 4: Deschidereaprin
careseintroduc obiectelepentruobservatiein camerade
vidarein modul SEM normal. 5: Panoul deoperarecu
instrumentedefocalizare, aliniere si marireprecumsi un
joystick pentrupozitionareaobiectului. 6: Ecranpentru
afisareameniului si aimaginii. 7: Unitate-Cryopentru
preparareamaterialelor inghetateinaintedeintroducereain
cameradeobservareinmodul Cryo-SEM . 8: Parteade
electronicaamicroscopului aflatasubmasadelucru.
Tehnica de criofractur :
Criofractura a permis evidenierea aranjrii
proteinelor n biomembrane
18
SEM imagini ale hematiei:
Paianjen acoperit cu atomi de aur,
preparat pentru MEB
19
Imaginea MEB (SEM) a unui paianjen
Electron microscope
image of a fly foot
Avian flu virus is one of at least
a dozen potentially deadly
infectious diseases that may
become more widely distributed
because of global climate
change.
Microanaliza nuclear
1948-1950, Raymond Castaing
printele microanalizei nucleare
(teza de doctorat)
20
La interacia unui fascicul ngust (sub un
micrometru) de electroni cu un eantion, fiecare
element chimic produce radiaii X cu o lungime
de und caracteristic, conform legii Moseley.
Cu ajutorul unui spectrograf de radiaii X se obine
reprezentarea grafic a lungimilor de und a
radiaiilor X emise i se poate afla, deci, natura
chimic a elementelor prezente.
- MEC
- microsonda electronica
- spectrograf de radiatii X
1 tun electronic, 2 anod, 3
lentila condensor, 4
spectrometru cu raze X, 5
lentila objectiv, 6 preparat,
10 sistem vacuum (vid).
Principiu
Legea Moseley: se refer la
radiaia X caracteristic
emis de atomi.
Frecventa radiatiei X emise
de un atom depinde de:
-Numrul atomic Z al
ellementului
-Numerele cuantice
principale ale nivelelor
ntre care are loc tranziia
(n,k)
-2 constante (Riedberg- R,
o constant de ecran - s)
n
kn
=R(Z-s)
2
(n
-2
- k
-2
)
21
Microscopia ionica
Imaginea unor atomi
de tungsten prima
imagine in
microscopia ionica
Principiu asemanator cu al MEB, dar se
utilizeaza un fascicul de ioni (rezultat din
trecerea unui curent printr-un mediu intens
ionizat) care interactioneaza cu suprafata
probei, determinand producerea de alti ioni,
in relatie cu natura atomilor de suprafata.
Acestia sunt colectati de un spectrometru de
masasi determina formarea imaginii.
Imaginea
unui
fragment de
ADN vzut
pentru prima
oar graie
MET.
Imaginea obinut cu
ajutorul unui MET -
se poate distinge
poziia atomilor
Atom de aur - imagine obinut
cu MET
Schema de principiu
Microscopul prin efect tunel
(MET)
22
Microscopul electronic cu baleiaj
prin efect tunel (MET)
A fost proiectat (inventat) de Gerd BINNING(Germania)i Heinrich ROHRER
(Elveia)n anul 1982. n 1986 cei doi fizicieni au fost distini cu premiul Nobel pentru
Fizic, mpreun cu Ernst RUSKA(Germania, pentru proiectarea i construirea n
1933 a primului microscop electronic prin transmisie).
n cazul microscopului cu efect tunel (MET) nu este necesar o surs extern de
radiaii, energia fiind furnizat de nii electronii din stratul superficial al preparatului.
n conformitate cu fizica clasic, un electron poate prsi atomul numai dac
primete o energie mai mare dect energia sa de legtur. Adic, trebuie s treac
peste bariera de potenial. n mecanica cuantic, dat fiind caracterul dual al
electronilor, corpuscul i und, i datorit incertitudinii poziiei lor (principiul lui
Heisenberg) electronii pot trece prin bariera de potenial, cu o probabilitate cu att
mai mare cu ct bariera de potenial este mai ngust.
Acest efect poart numele de EFECT TUNEL.
Similar, n cadrul fizicii clasice, electronii nu pot prsi proba dect dac primesc
suficient energie. Conform mecanicii cuantice, ei formeaz, prin efect tunel, un nor de
electroni deasupra suprafeei. Densitatea norului de electroni variaz exponenial cu
distana: scade de 10 ori la o distan de 1 (10
-10
msau 0,1 nm). Acest fapt este folosit
n microscopul cu efect tunel.
n principiu, MET este alctuit dintr-un electrod (ac extremde fin, cu
vrful format dintr-unsingur atom), oparteelectronic i uncalculator. Electrodul
seapropiedesuprafaa probei deexaminat laodistan decirca10 ptaptrunde
n norul electronic al atomilor probei. Seaplic o diferen de potenial deciva
zeci de milivoli ntre electrod (+) i suprafa. ntre electrod i suprafaa
preparatului apare un curent electric datorit efectului tunel care, dup cumam
menionat, const ntrecereaunor electroni prinbarieradepotenial. Acest curent
are o intensitate foarte slab, de civa nA sau chiar pA. Ca urmare, este
indispensabil unsistemdeamplificare. Electrodul baleiaz opartedinsuprafaa de
civa micrometri ptrai. n timpul acestui baleiaj un sistemelectronic foreaz
electrodul s i modifice distana (fa de poziie medie) astfel nct intensitatea
curentului tunel s fie pstrat constant. Prin nregistrarea acestor variaii de
distan se obine un fel de hart nrelief i n perspectiv a suprafeei. Ceamai
mare dificultate const n eliminarea oricrei vibraii mecanice, care ar falsifica
rezultatele. De asemenea, este necesar prepararea suprafeei n ultravid, pentru
prevenirea contaminrii acesteia. Totodat, se impune controlul manevrelor de
apropiereaelectrodului i baleiereaunor distane foartemici alesuprafeei. Dac
se baleiaz o lungime de1 nm, careseafieaz peunecran de 10cm, rezult o
mrire de 100 000 000 (10
8
). Se poate obine o rezoluie lateral de 2. Cu
microscopul cu efect tunel pot fi identificateelementele chimice, deoarece norul
electronicareoconfiguraie specific fiecrui element.
MET- elemente esentiale
Densitatea norului de electroni variaz
exponenial cu distana.
EFECT TUNEL
rezoluie de 2
Cu microscopul cu efect tunel pot fi
identificate elementele chimice, deoarece norul
electronic are o configuraie specific fiecrui
element.
23
Microscopia de
forta atomica
BINNING a inventat n 1986
microscopul de for
atomic.
n acest caz se folosete
pentru explorarea
suprafeei, n locul
curentului tunel, deplasarea
acului datorit forei
exercitate ntre prob i ac.
Comparison of
resolutions of different
microscopes.
STM: shaded area.
HM: high-resolution
optical microscope.
PCM: phase-contrast
microscope
(S)TEM: (scanning)
transmission electron
microscope
SEM: scanning electron
microscope
REM: reflection
electron microscope
FIM: field ion
microscope.
Binnig and Rohrer, 1982