Referat biocel

Microscopia electronica Microscopul electronic constituie un exemplu de felul cum au fost aplicate in practica unele din marile descoperiri facute in fizica la sfarsitul secolului trecut. Fizicianul francez Louis de Broglie a emis in 1924 ipoteza ca electronii au proprietati ondulatorii, adica le este asociata o unda, din acest punct de vedere asemanandu-se cu fotonii. Aceasta lungime de unda a electronului se numeste lungime de unda Broglie si este data de formula : landa = h / m v unde landa este lungimea de unda a electronilor, h constanta lui Planck, v viteza electronului si m masa electronului. Prin aceasta de Broglie a demonstrat asemanarea dintre radiatiile electronice si cele lumnioase. Microscoapele electronice existente se impart dupa tipul de constructie si destinatia lor in cateva grupe : 1. Microscoapele electronice de transmisie (TEM), utilizate pentru cercetari ultrastructurale 2. Microscoape electronice de baleiaj, sau de tip SEM, folosite la studiul ultramorfologiei suprafetelor cu ajutorul electronilor secundari sau reflectati. 3. Microscoape electronice de transmisie si baleiaj (STEM) 4. Microscoape electronice analitice de transmisie 5. Microscoape electronice sistematice 6. Microscoape electronice cu fotoemisie PEM 7. Microsonde electronice EPI 8. Microscoape ionice cu emisie de camp FIM Microscopul electronic de transmisie TEM Microscopia electronica prin transmisie este determinata, pe de o parte de interactiunea campurilor electromagnetice produse de lentile cu electronii, influientand parametrii electronooptici si, pe de alta parte de interactiunea electronilor cu proba. Pentru ca electronii sa poata tranversa proba e necesara o

grosime suficient de mica a ei si totodata energii de accelerare suficient de mari ale electronilor. O sectiune transversala printr-un microscop electronic releva o serie de elemente constructive ca : sistemul de vidare, tunul electronic, camera probei, ecranul fluorescent, dispozitivul de fotografiere si blocurile speciale pentru alimentarea electronica. Datorita complexitatii sale tehnologice de a mentine un fascicul de electroni cu un diametru de 1-2um in conditiile de paraxialitate impuse de legile opticii pe o lungime de cel putin un metru, putem distinge in cadrul microscopului electronic mai multe etaje, la fel de importante in functionarea lui. Intr-o astfel de clasificare evidentiem sistemul electronooptic, sistemul electronic si consola de comanda, sistemul de vid. Sistemul electronooptic sau sistemul responsabil de realizarea imaginii, localizat in coloana microscopului, este alcatuit din : a. sistem de iluminare b. camera pentru preparat c. sistemul de formare a imaginii d. camera de observatie e. camera fotografica Principal, realizarea imaginii la microscopul electronic nu difera de microscoapele obisnuite, fotonice. In componenta sistemului de iluminare intra tunul eletronic si lentilele condensor, sistemul avand rolul asigurarii unei straluciri optime pentru diferite trepte de marire la anumite grosimi ale preparatului. Tunul electronic, adica ansamblul catod-filament, cilindrul Wehnelt si anod, este plasat in partea cea mai de sus a coloanei microscopului, in prelungirea cablului de inalta tensiune. Lentilele condensor servesc la focalizarea fasciculului electronic pe proba, si constau dintr-un ansamblu de doua lentile, prima cu distanta focala scurta care creeaza o imagine micsorata a sursei de electroni, deci a filamentului, a doua cu distanta focala marita, care transfera imaginea micsorata in planul obiect. Camera probei este spatiul din interiorul coloanei microscopului dintre lentilele condensor si lentilele de formare a imaginii, marginita de doua diafragme. Accesul se face printr-o camera ecluza pentru adaptarea presiunii la

cea ambientala sau la vidul din coloana, iar proba, introducandu-se intr-un orificiu in lungul axului pptic prevazut in masuta preparatului. Sistemul de formare a imaginii este realizat prin intermediul a trei sau patru lentile :obiectiv, intermediara si proiector, toate, ca si cele condensor, fiind de tip electromagnetic. Datorita faptului ca radiatiile X sunt sarcini electrice iar sticla nu le poate modifica traiectoria, problema constructiei unor lentile pentru un astfel de fascicul a fost rezolvata prin utilizarea unui camp electromagnetic cu simetrie axiala. Camera de observatie, situata la nivelul panoului de comanda este prevazuta cu trei fereste de vizualizarea a imaginii, fiind in partea superioara in legatura cu lentila proiector, iar in partea inferioara cu caseta fotografica. In interiorul ei se afla ecranul care este format dintr-o placa metalica circulara acoperita cu o substanta fluorescenta, cum ar fi monocristale de sulfura de zinc si cadmiu. Camera fotografica se gaseste sub camera de observatie si este prevazuta cu o caseta cu 12 sau 24 de placi fotografice a caror emulsie este specifica radiatiei X. Sistemul electronic si consola de comanda Sistemul electronic e alcatuit in principal la microscoapele moderne din doua blocuri : unul responsabil de realizarea unei tensiuni inalte, bine stabilizate, care sa permita obtinerea rezolutiei propuse, sub 10 A, al doilea fiind responsabil de realizarea unui curent bine stabilizat pentru alimentarea lentilelor, micsorand pe cat posibil aberatiile lor. Sistemul de vid contine una sau doua pompe rotative care asigura un vid prelimnar si una de difuzie care ridica vidul la cotele cerute de rezolutia microscopului. Microscopul electronic cu voltaj inalt Microscopul electronic cu inalt voltaj (HVEM) este un microscop de transmisie ce foloseste o tensiune mai mare de 300.000 V, ajungand, la unele tipuri pana la 3-5 MeV.

In ciuda complexitatii lor si a costului ridicat ele s-au dovedit extrem de utile, deoarece intr-un astfel de microscop electronii pot trece prin preparate care au grosimi de 13 um, fiind posibil ca sectiuni de grosimea celor realizate de un microtom obisnuit sa fie usor examinate, uneori fara a mai fi colorate. De asemenea se pot cerceta celule intregi fara a fi incluzionate, iar Porter si Fotino au demonstrat ca in aceste conditii se poate realiza mai usor reconstituirea tridimensionala a structurilor si evidentierea enzimelor. Microscopul electronic analitic de transmisie TEAM TEAM e format dintr-un microscop electronic de transmisie de inalta rezolutie, la care se ataseaza un microanalizator de raze X din clasa spectrometrelor. El functioneaza pe baza analizei lungimii de unda dispersate, sau mai nou pe baza analizei energiei dispersate. Pana in prezent s-au conturat cateva directii de cercetare, prin utilizarea TEAM, cum ar fi : 1. localizarea elementelor chimice existente in conditii normale in tesuturi, in special a ionilor de Na si K 2. detectarea unor elemente in anumite stari patologice cum ar fi de exemplu intoxicatiile sau carentele fiziologice 3. aprecierea distributiei unor elemente poluante in diferite verigi ale lantului bilogic 4. identificarea unor reactii chimice intre diferite elemente pe baza analizarii unor precipitate ce se formeaza in tesuturi Microscopul electronic de baleiaj SEM Sem spre deosebire de TEM furnizeaza imagini tridimensionale ale suprafetelor probelor cercetate, ale caror dimensiuni sunt de ordinul centimetrilor, dar nu pot furniza informatiile morfo-structurale ce se regasesc in grosimea materialului. Formarea imaginii se bazeaza pe principiul emisiei electronilor secundari, reflectati in urma bombardarii probei de catre fasciculul primar de radiatii X.

Pentru obtinerea unei depuneri uniforme a stratului in cazul probelor a caror suprafata este rugoasa, acestea sunt supuse rotirii sub anumite unghiuri in tot timpul depunerii. Stratul depus este o vopsea pe baza de argint coloidal, observarea fiind ameliorata prin depunerea de straturi succesive de Au si Pd, grosimea totala nedepasind 1000 de A. In cazul probelor biologice care contin apa si lichide volatile si care sunt supuse evaporarii in timpul baleierii datorita vidului existent in coloana, este necesara in prealabil ca si in microscopia de transmisie, deshidratarea si eventual inghetarea lor, inlaturand, astfel, efectele nedorite. METODE PENTRU EXAMENUL CITOLOGIC N MICROSCOPIA ELECTRONIC

Tipuri de informaii care se pot obine prin microscopie electronic -gradul de nrudire genetic ntre organisme -biosinteza de proteine i structurile implicate n acest proces -structura i configuraia macromoleculelor proteice -configuraia molecular a acizilor nucleici i stabilirea greutii moleculare -procese de filtrare prin membran -transportul ionic prin celule -localizarea reaciilor imunlogice i a activitii enzimatice -aciunea unor substane asupra structurilor celulalre -structura suprafeelor esuturilor, celulelor i biomoleculelor -alctuirea molecular a virusurilor i mecanismele infeciei virale -procese de transcripie i translaie a codului genetic -ultrastructura diferitelor tipuri de celule i a componentelor acestora in stare normal i patologic

PRELEVAREA PROBELOR -recoltarea trebuie s se fac rapid -a se lua n considerare particularitile tipului de organism -condiia esential obinerii unor rezultate corecte este ca probele de material biologic s fie prelevate numai din organisme vii care nu au suferit aciunea unor factori stresani 1. Fragmentele de material biologic obinute prin puncii sau biopsii sau fragmentele mici din esuturile i organele recoltate imediat dup sacrificarea animalului sunt puse pe faa fr emulsie de azotat de argint a unei hrtii fotografice 2. Peste aceste fragmente se pun 2-3 picturi din lichidul fixator pentru a opri pe ct posibil aciunea distructiv a enzimelor celulalre 3. Cu ajutorul a dou lame de ras noi, bine degresate, prin micri de translaie se confecioneaz cubulee cu latura de 1 mm 4. Cu o scobitoare se ridic fragmentele i se introduc ntr-un flacon cu fixator rcit la 4 0C. Sngele se recolteaz pe anticoagulant.

FIXAREA 1. Metode fizice -au la baz folosirea temp foarte sczute -deshidratarea inert i metoda de substituie prin ngheare 2. Metode chimice -soluia fixatoare este format din: a. soluii tampon(tampon cacodilat, tampon fosfat, tampon veronal) b. ageni fixatori anorganici( oxizi, sruri-permaganat de potasiu i bicromat de potasiu) i organici (aldehide- formaldehidele, acroleina, acizi). n practica curent se folosete o dubl fixare -prefixare cu glutaraledehid tamponat -postfixare cu tetraoxid de osmiu tamponat

Exist 3 procedee de fixare a. Fixarea prin imersie-fragmentele recoltate se introduc n flaconul cu fixator aflat ntr-un vas cu ghea b. Fixarea prin sedimentare-se realizeaz n tuburi de centrifug c. Fixarea prin perfuzie- se realizeaz prin introducerea lichidului fixator n torentul circulator, naintea sacrificrii animalului de experienta 3. Splarea pieselor oprirea procesului de fixare i indeprtarea excesului de fixator -splarea esuturilor timp de 5-20 de min sau peste noapte cu aceeai soluie tampon care a fost folosit la prepararea fixatorului 4. Deshidratarea preparatului eliminare apei din esuturile fixate pe cale chimic sau fizic solventul trebuie sa fie miscibil cu agentul de deshidratare 5. Includerea -includerea se face in capsule de gelatin sau polietin -piesele deshidratate corect de introduc intr-un mediu lichid prin polimerizare -cele mai utilizate medii de includere fac parte din grupa rinilor poliosterice a rinilor epozidice i mediile de includere hidrofile 6. Secionarea -cu ultramicrotoame pentru realizarea seciunilor ultrafine a cror grosime nu depete 1000 i care vor fi uor traversate de fasciculul de electroni

7. Aplicarea seciunilor ultragine pe grile Grile suport -preparatele biologice folosite n miceroscopia electronic fiind extrem de fine nu au rigiditate mecanic -se plaseaz pe un portobiect corespunztor -gril metalic -n prezent exist o gam variat de suporturi pentru preparate, confecionate pe cale electrolitic din cupru, nichel, oel inox, aur, argint, platin, etc. Grilele electrolitice sunt de mai multe feluri: A. grilele standard -criteriul internaionald e idetinficare- MESH-ul, adic numrul de ochiuri de pe inch -ca suport pentru seciunile ultrafine, cele mai bune grile sunt cele de 200 de meshuri acoperite cu o pelicul organic sau de 300 de mesh care pot fi utilizate fr pelicu B. Grilele de identificare -au marginea solid -prezint specificaii de referin n interiorul ochiurilor, pentru identificare rapid n microscop a unei zone de interes din preparat C. Grilele duble -destinate realizarii de preparate sub form de sandwich i au pe fiecare parte un tip de reea, fiind de fap dou grile suprapuse i legate ntre ele Pelicule suport -grilele se acoper cu pelicule organice sau anorganice gine, transparente la fasciculul de electroni a cror grosime nu trebuie s depeasc 200

a. b.

Peliculele organice Pelicule anorganice n vederea mririi rezistenei la fluxul de electroni a peliculei, pe suprafaa acesteia se depune un strat subire i uniform de carbon cu ajutorul unui aparat de carbnare sub vid nalt.

8. Contrastarea preparatelor biologice 1. Colorarea pozitiv are la baz interaciunea chimic dintre structurile biologice i un colorant format din sruri ale uinor metale grele -prin colorarea pozitiv se urmrete cuplarea colorantului cu moleculele preparatului biologic

1. 2. 3. 4.

Contrastarea cu acetat de uranil Contrastarea cu citrat de plumb Colorarea negativ utilizat pentru studiul virusurilor, microroganismelor i fraciunilor celulare 9. Metalizarea -pentru mrirea contrastului unui preparat biologic -evaporarea unui metal sub vid n aparate de metalizare i depunerea pulberii atomice sub un anumit unghi pe preparatul biologic A. Aparatul de metalizare B. Materiale pentru metalizare -densitate mare i cantitate mic C. Suportul pentru evaporare -se poate obine n diferite moduri, foarte des fiind ntlnit evaporarea cu ajutorul unui arc electric