BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

1. Scopul lucrrii
Const n nsuirea utilizrii microscopului optic, cu finalitate n vizualizarea i msurarea
diametrelor unor celule sanguine.
2. Principiul lucrrii
Microscopul este un instrument optic care mrete diametrul aparent al obiectelor,
formnd imagini virtuale. Dimensiunea minim ce poate fi distins printr-un microscop este dat de
lungimea de und a radiaiei folosite, datorit fenomenului de difracie.

n Fig. 2.1 este

reprezentat o scal relativ a organismelor biologice i intervalele de msur ale ctorva dintre
instrumentele de investigaie.

Fig. 2.1. Scala relativ a organismelor biologice i intervalele de msur ale ctorva dintre
instrumentele de investigaie

Microscopul formeaz imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu ajutorul unui
sistem de lentile (la microscopul electronic, lentilele sunt nite cmpuri electrice i magnetice care
deviaz fasciculele de electroni) grupate n obiectiv i ocular, prin care mersul razelor este cel
reprezentat n Fig. 2.2.

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

Fig. 2. 2 Mersul razelor de lumin prin microscop

Pentru a distinge ntre performanele unor microscoape se compar caracteristicile acestora:

1. Puterea - raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede un obiect prin instumentul optic
( ) i dimensiunea liniar a obiectului pe direcia perpendicular pe axa optic.
2

tg 2
AB

(2.1)

2. Grosismentul sau mrirea unghiular - raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede un
obiect prin instumentul optic ( ) i tangenta unghiului sub care se vede un obiect cnd este privit
2

cu ochiul liber aezat la distana optim de citire = 25 cm ( ). Grosismentul microscopului

1

(G

) este egal cu produsul dintre grosismentul ocularului (G ) i cel al obiectivului (G ).

microscop

oc

Gmicroscop

tg 2
tg1

ob

(2.2)

Gmicroscop Gob Goc

Relaia dintre puterea i grosismentul microscopului este: G

P
e

4 4 f1 f 2

(2.3)

unde e este dinstana dintre focarul imagine al lentilei obiectiv i focarul obiect al lentilei ocular, iar
f1 i f2 reprezint distanele focale ale obiectivului i ocularului, respectiv (Fig. 2. 2).
3. Puterea separatoare () - inversul distanei separatoare (d ) care reprezint cea mai mic
distan la care se pot gsi imaginile a dou puncte care nu apar confundate:

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

1
d

(2.4)

Distana minim dintre dou puncte ale unui obiect care mai pot fi vzute separat unul de cellalt
prin microscop este

1.22
2n sin u

(2.5)

unde reprezint lungimea de und a radiaiei folosite, n este indicele de refracie al mediului
strbtut de radiaie dintre obiect i obiectiv, u este unghiul dintre axa optic i razele cele mai
ndeprtate de ax care mai ptrund n obiectiv. Pentru a micora aceast distan, adic pentru a
mbunti performanele microsopului exist mai multe metode:
-

folosirea unei radiaii cu lungime de unda ct mai mic (de exemplu, pentru radiaie
ultraviolet s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 0.15 m)

folosirea unor medii ntre obiect i obiectiv cu indicele de refracie n ct mai mare (microscop
cu imersie)

folosirea obiectivelor cu deschidere ct mai mare, astfel nct sin u s fie ct mai mare, dar
aceste obiective ridic probleme de construcie datorit aberaiilor de sfericitate.
n funcie de ceea ce se studiaz, se pot folosi diferite microscoape (Tabelul 2.1).
Microscopul optic folosete unde electromagnetice din domeniul vizibil. Lumina este

transmis de-a lungul axului optic al instrumentului, prin preparat, n aceste condiii obinndu-se
un cmp vizual puternic luminat, n care obiectele, pentru a putea fi vzute, se disting pe fondul
luminos fie prin opacitate, fie prin culoarea lor. Pentru a se face msurtori se folosesc nite
lamele de sticl pe care sunt gradate foarte fin nite scale, numite micrometre care sunt piese
auxiliare microscopului. Acestea au dimensiuni cunoscute sau uor de determinat i imaginea lor se
poate suprapune peste imaginea obiectului de cercetat. Micrometrele sunt de dou feluri: oculare
(sunt aezate n ocularul microscopului i imaginea lor este permanent n cmpul vizual al
experimentatorului) i obiective (acestea se aeaz pe platina microsopului n locul preparatului i
sunt folosite pentru calibrarea microscopului).

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

Tipul microscopului

Principiul de funcionare

Sursa de
radiaie

Mediul dintre prob

i obiectiv

Natura
lentilelor

Focalizare

Ajustarea mririi

Microscopul
optic

Folosete radiaie n vizibil.

Imaginile sunt
bidimensionale. Se pot
observa i celule vii.

Radiaie
e.m. n
vizibil

Aer sau lichid

sticl

mecanic

Interschimbarea
obiectivelor

Ultramicroscopul

mprtierea luminii de ctre

obiectele microscopice,
acestea apar ca nite puncte
luminoase pe un cmp
ntunecat

Radiaie
e.m. n
vizibil

Aer sau lichid

Sticl

Mecanic

Interschimbarea
obiectivelor

Microscopul cu
contrast de faz

Transformarea diferenelor
de faz aprute ca urmare a
detaliilor preparatului n
diferene de amplitudine; se
pot vizualiza obiecte
transparente fr a fi colorate
n prealabil

Radiaie
e.m. n
vizibil

Aer sau lichid

Sticl

Mecanic

Interschimbarea
obiectivelor

Microscopul cu
fluorescen

Folosete fluorescena
proprie a probei; se poate
pune n eviden starea
fiziologic a unor
microorganisme

Radiaie n
vizibil, UV

Aer sau lichid

sticl

Mecanic

Interschimbarea
obiectivelor

Microscopul
polarizant

Pune n eviden activitatea

optic a unor preparate

Radiaie
e.m. n
vizibil

Aer sau lichid fr

proprieti optic
active

Sticl

Mecanic

Interschimbarea
obiectivelor

Fascicul de
electroni

Vid

Electric;
de ex.
schimbarea
valorii
curentului
electric prin
solenoidul
lentilelor
obiectiv

Electric

Nu
folosete
radiaie
e.m., nici
fascicule de
electroni,
limitarea
fiind dat
nu de
difracie ci
de
dimensiune
a probei

Aer sau lichid

Microscopul
electronic

Microscopul de
for atomic

Folosete fascicule de
electroni. Imaginile sunt
tridimensionale.
Are mrire mare i rezoluie
bun. Se zrete conturul
specimenului, imaginea este
alb-negru. Nu se pot observa
specimene vii.

Msoar forele exercitate

ntre un ac plasat pe o
consol uoar i elastic
(cantilever) i prob.
Instrumentul scaneaz cu
acul proba, iar un aparat de
detecie msoar deflexia
vertical a cantileverului,
indicnd nlimea local a
probei. Rezoluia este de 10
pm, i se pot vizualiza probe
n aer sau imersate n lichid.

Cmpuri
magnetice
sau lentile
electrostatice

Tabelul 2.1 Tipuri de microscoape

Descrierea microscopului optic

Prile componente ale microscopului optic ( Fig. 2. 3) sunt urmtoarele:

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

1) Piciorul microscopului, constituit dintr-o plac metalic grea care are rolul de a susine fix
microscopul, pe care se afl platina microscopului. Pe aceasta se aeaz frotiul (lamel de sticl
pe care se afl preparatul) ce urmeaz a fi studiat. Platina prezint un orificiu central care
permite trecerea razelor luminoase i niste orificii laterale n care sunt prini cavalerii cu
ajutorul crora frotiul este fixat pe platin. Proba poate fi deplasat pe dou direcii
perpendiculare cu ajutorul unor uruburi, deplasarea fiind msurat pe dou scale ataate
msuei.

Fig. 2.3 Microscopul optic

2) Tubul microscopului pe care sunt prini ocularul i obiectivul; lui i se poate imprima o
micare ampl, vizibil cu ochiul liber cu ajutorul macrovizei i o micare fin cu ajutorul
microvizei. Ocularele de diverse puteri se monteaz la captul superior al tubului.
Microscopul poate fi mono sau binocular. n general, ocularele sunt construite din dou lentile
i anume aa numita lentil de cmp i lentila ocular propriu-zis. Ele sunt aezate ntr-un tub care
se introduce n partea superioar a tubului microscopului. Ocularele sunt de dou tipuri :
Huyghens (Fig. 2.4 a)) i Ramsden (Fig. 2.4 b)). Ambele sunt formate din lentile plan-convexe, dar
difer prin aezarea acestora, precum i prin mrimea lor.

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

a)

b)

Fig. 2.4 a) Ocularul Huyghens; b) Ocularul Ramsden

Astfel, la ocularul Huyghens lentilele sunt aezate cu convexitatea n jos, ctre obiectiv i
lentila ocular este mic n timp ce lentila de cmp este mare. Lentila inferioar face parte din
sistemul obiectiv, avnd rolul de a de a clarifica imaginea i de a o forma n planul diafragmei, care
limiteaz cmpul optic. Lentila superioar a acestui tip de ocular este, de fapt, o lup care mrete
imaginea format n lentila de cmp i d imaginea final (care este virtual i mrit) la 25 cm de
ochi.
La ocularul Ramsden, numit i ocular ortoscopic, cele dou lentile plan-convexe sunt egale ca
mrime i sunt aezate cu convexitatea fa n fa. Imaginea dat de obiectiv se formeaz chiar n
planul diafragmei. Acest tip de ocular se folosete pentru determinarea puterii de mrire a
microscopului sau pentru cazul n care se fac desene microscopice, deoarece d un cmp de
dimensiuni mari.
La microscoapele moderne ocularele moderne au mai multe lentile.
Obiectivul, care conine un set de lentile centrate, se monteaz n revolverul de la captul
inferior al tubului. Revolverul are locauri pentru mai multe obiective i permite schimbarea lor
prin rotire. Lentilele obiectivului au asemenea convergene nct s poat fi corectate aberaiile de
sfericitate. Lentila inferioar a obiectivului este plan convex avnd faa plan spre obiectiv. Cu ct
distana focal a obiectivului este mai mic cu att puterea de mrire este mai mare. Un obiectiv cu
putere separatoare mare determin o putere separatoare mare a microscopului. Obiectivele cu
putere mare au o vedere de ansamblu foarte bun, n timp ce obiectivele cu putere mai mic sunt
mai luminoase. Exist dou tipuri de obiective: uscate i cu imersie. Obiectivele uscate primesc
fasciculul de lumin ce trece prin preparat direct prin aer, astfel c o parte din razele trimise de
obiect ctre lentila obiectivului se pierd prin fenomenul de reflexie total. Pierderea razelor de

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

lumin datorit acestui fenomen se poate nltura dac ntre preparat i obiectiv se pune o pictur
dintr-un lichid (de exemplu ulei de cedru) cu indice de refracie apropiat de cel al sticlei din care
este fcut lentila frontal a obiectivului. Se obine astfel un obiectiv cu imersie.
3) Dispozitivul de iluminare este format din:
-

oglind care are rolul de a dirija razele de la sursa de lumin spre axul optic al microscopului;
prezint o suprafa plan i una concav i este fixat pe un suport, n aa fel nct se poate
roti n jurul a dou axe perpendiculare

Fig. 2. 5 Mersul razelor de lumin prin microscop

condensorul format din 2 sau 3 lentile care concentreaz lumina reflectat de oglind asupra
obiectului; fasciculul paralel de lumin care cade pe condensor este transformat ntr-unul
convergent; pentru a obine o imagine clar condensorul se poate deplasa pe vertical pn
cnd obiectul se gasete n focarul fasciculului convergent care iese din condensor; razele de
lumin, nainte de intrarea n condensor, trec printr-un suport de filtre i o diafragm (apertura
cu rol de a controla diametrul bazei "conului" luminos); exist filtre de diferite culori care pot
modifica spectrul luminii transmise. n practic, diametrul aperturii poate fi redus uor pentru
obinerea unui compromis ntre rezoluie i contrast. Reglarea diametrului aperturii nu trebuie
fcut pentru a controla intensitatea luminoas deoarece acest procedeu nu face dect s
produc imagini cu contrast mare, dar cu rezoluie sczut.

4) Piesele auxiliare ale microscopului sunt:

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

micrometrul ocular care este un disc de sticl cu diametrul egal cu diametrul interior al
tubului ocularului pe care sunt trasate niste diviziuni; acest micrometru se aeaz n ocular
chiar n planul imaginii date de obiectiv, motiv pentru care el se vede ntotdeauna clar n
microscop; n dreptul diviziunilor lui se pot aduce cu ajutorul msuei mobile obiectele ce
urmeaz a fi msurate. Micrometrele oculare sunt de mai multe tipuri, n funcie de ceea ce se
urmrete a fi msurat (Fig. 2. 6)

Fig. 2.6 Tipuri de micrometre oculare

micrometrul obiectiv care este o lam de sticl pe care sunt trasate pe o lungime de 1mm, cu
un vrf foarte fin de diamant, 100 de diviziuni. Acest micrometru este folosit pentru calibrarea
microscopului. El se aeaz n locul preparatului, urmnd s se fac suprapunerea scalei
micrometrului ocular cu scala micrometrului obiectiv, pentru determinarea dimensiunii unei
gradaii a micrometrului ocular (Fig. 2.7).

Fig. 2.7 Micrometrul ocular i micrometrul obiectiv

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

camera clar care este un dispozitiv ce se poate adapta ocularului microscopului i permite
suprapunerea n ochiul observatorului a imaginii unui obiect vzut direct n mrime natural
peste imaginea obiectului vzut prin microscop.

camera de numrare sau hematocitometrul (Fig. 2.8) care este un dispozitiv auxiliar
microscopului cu ajutorul cruia se poate determina numrul de celule dintr-un volum
oarecare.

Fig. 2. 8 Camera de numrare

3. Mod de lucru
Materiale necesare:
-

microscop optic

oculare, obiective de diferite puteri

micrometre oculare i obiective

obiecte de msurat

Lucrarea experimental presupune urmtoarele etape:

1) Calibrarea microscopului care se face n cazul n care valoarea diviziunilor micrometrului
ocular nu este cunoscut.
2) Msurarea dimensiunilor obiectelor de studiu.
Pentru calibrarea microscopului se procedeaz n felul urmtor:
-

n locul preparatului se pune un micrometru obiectiv cu dimensiuni cunoscute;

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

cu ajutorul msuei mobile i rotirii ocularului se aduc alturi cele dou scale ce apar n cmpul
aparatului;

se observ cte diviziuni ale micrometrului obiectiv sunt necesare s acopere ntreaga scal a
micrometrului ocular i se determina valoarea dimensiunilor micrometrului ocular.

Fig. 2. 9 a) i b) Calibrarea microscopului; c) Msurarea diametrului unei celule

Odat microscopul calibrat, se poate trece la msurarea diametrelor celulelor sanguine, urmnd
paii:
-

se aeaz obiectul pe platina microscopului i se fixeaz cu cavalerii;

privind din lateral microscopul, se coboar tubul acestuia folosind macroviza pn cnd
obiectivul de mare putere aproape atinge preparatul;

se rotete revolverul astfel nct s ajung deasupra probei obiectivul de mic putere;

apoi, privind prin microscop se clarific imaginea cu ajutorul microvizei;

se rotete din nou revolverul pentru alegerea obiectivului de mare putere i se clarific din nou
imaginea, folosind microviza;

privind n aparat se deplaseaz condensorul cu diafragma complet deschis pn cnd

marginile luminoase coincid cu marginile imaginii obiectivului;

se manevreaz diafragma condensorului pn cnd marginile cmpului apar nete;

n acest moment apertura condensorului este egal cu cea a obiectivului;

se introduce n ocularul folosit micrometrul ocular;

prin micarea msuei mobile i prin rotirea ocularului, lungimile ce trebuie msurate sunt
aduse n dreptul diviziunilor micrometrului ocular, a cror valoare este deja cunoscut;

se vor msura diametrele eritrocitelor, fcndu-se apoi calculul erorilor;

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

valoarea diametrului mediu obinut va fi comparat cu valoarea teoretic acceptat a acestuia

i se va stabili dac diferena dintre cele dou valori este semnificativ; pornind de la aceast
diferen se poate atribui hematiilor calificativul de normocitoz, microcitoz sau macrocitoz;

comparnd variana calculat pe eantioanele studiate cu valoarea teoretic a acesteia din

literatura de specialitate, se va atribui populaiei de hematii studiate calificativul de izocitoz
sau anizocitoz;

pentru dou eantioane de cte 15 hematii fiecare se vor compara mediile calculate stabilinduse dac diferena este semnificativ.