Specierea

Termenul de speciere este utilizat pentru o mare varietate de analize, de la determinarea unor specii bine definite, ca: elemente cu diferite stri de oxidare sau compui organo-metalici pn la forme ale elementelor care sunt operaional definite ca biodisponibile sau mobile.Specierea unui element const n identificarea i determinarea formelor fizico-chimice individuale ale elementului respectiv n mediul, care, mpreun, formeaz concentraia total a elementului n prob.Cunoaterea formelor n care se gsete un element este de mare importan, deoarece toxicitatea, mobilitatea, biodisponibilitatea i bioacumularea depind de specia chimic.Studiile de speciere sunt de altfel utile chimitilor ce studiaz toxicitatea i tratamentul chimic al apelor, solurilor i al sediementelor, biologilor care cerceteaz infulena speciilor chimice asupra plantelor i animalelor, geochimitilor care investigheaz transportul elementelor n mediu. Motivul cel mai important pentru determinarea speciilor chimice este identificarea acelor specii metalice cate au efecte negative asupra organismeolor vii (bacterii, alge, pe ti, mamifere).Determinarea concetraiei toatele a elementului n probe de mediu nu aduce informaii despre biodisponibilitatea elementului.Toxicitatea unor elemente este dependent n primul rnd de forma chimic, apoi de concetraia total. Specierea elementar este o metod de analiz a elementelor n urme i aduce informaii, n special, despre forma chimic a unui element, mai degrab dect despre cantiatea lui total n prob . Conform International Union of Pure Applied Chemistry (IUPAC), termennul speciere este definit ca forma unui element cu privire la compoziia sa izotopic, starea de oxidare i/sau structura molecular.Din acest punct de vedere, se disting dou abordri: specierea organometalic-inculude metalele ale cror forme organice sau anorganice sunt caracterizare pe baza toxicitaii diferite, a mobilitaii diferite, etc (Pb,Sn,Hg); specierea anorganic include metalele ale cror diferite stri de oxidare sunt caracterizare pe baza toxicitii diferite, a mobilitii idiferite, etc. (Cr,As,Se,Sb) Specierea este o unealt indisponibil,aceast tehnic este folosit la: n studiul biochimiei elementelor prezente n urme; pentru nelegerea ciclului bio-geo-chimic al contaminanilor n ecosistemele acvatice i terestre; pentru detectarea substanelor toxice pentru mediu; pentru testarea calitaii produselor, de exemplu cantitatea de elemente eseniale din alimente; pentru determinarea impuritilor i a substaelor chimice nprodusele farmaceutice; folosit n industrie.
1

ANALIZA DE SPECIERE ELEMENTAR

Interesul crescnd pentru specierea elementar din ultimele dou decenii este dovedit prin numrul mare de tehnici analitice cuplate care sunt capabile s deternime diferite forme chimice ale unui element. Metoda pentru analiza de speciere trebuie s fie: foarte selectiv pentru a putea determina diferitele forme chimice ale elementului prezent n proba cu matricea complex; foarte sensibil deoarece elementul de interes se gsete, de obicei, n urme ntr-o matrice complex, iar speciile individuale sunt doar fracii din aceste cantiti n urme; Este obligatoriu ca, de-a lungul fiecrei etape de analiz, s fie conservat integritatea speciilor elementului de interes.Labilitatea speciilor, concentraiile sczute i matricele foarte complexe fac analiza de speciere una dintre cele mai provocatoare i dificile sarcini ale chimiei analitice moderne. Provocrile analizei de speciere sunt: recoltarea i prepararea probei; metodele de separare ce trebuie s fie nalt-selective; detectorii sensibili, care s furnizeze infurmaii despre speciile elementare. Una din principalele probleme n analiza de speciere const n faptul c speciile diferite ale metalului sunt prezente n matrice complexe i n concentraii foarte sczute ceea ce impune necesitatea separrii analitului de matrice i concentaraia pn la limita detectabil.
1. Tehnici de preparea a probei pentru studii de speciere elementar 2. Recoltatea i depozitarea probei

n vederea analizei de speciere, este necesar recoltarea unei probe alimentare reprezentative.Alimentele sunt extrem de variate i pentru fiecare tip de prob trebuie considerat modul de recoltare, preparare i pretratare. n etapele premergtoare procedurii analitice pot fi intreoduse erori ce nu mai pot fi corectate n fazele ulterioare ale analizei.n timpul recoltrii trebuie luate precau ii pentru evitarea contaminrii.Pentru coletarea probelor se utilizeaz containere curate.O metod eficient de curire a vaselor de recoltare const n meninerea vaselor de sticl n acid azotic concentrat, fierbinte pentru descompunerea compuilor organometalici adsorbii anterior.Acidifierea ( n cazul probelor de ap) este recomandat pentru prevenirea pierderilor prin adsorbie pe pere ii containerului. n general, procedurile recomandate pentru determinarea urmelor de elemente n materialul biologice se aplic i pentru analiza de speciere.Dup recoltare, este necesar analiza rapid a probei sau conservarea acestuia prin ngheare, deoarece continu activitatea enzimatic, iar procesele de proteoliz i autoliz continu i dup recoltare,putna astfel altera analiza de speciere.
2

3. Prepararea probei pentru analiza de speciere elementar

Cheia pentru o analiz de speciere reuit este prepararea probei.n analiza de speciere, metodele de preparare prin digestie umed joac un rol unic deoarece: concetraia analitului este foarte sczut (adesea sub 0.1 g/g sau g/l); fragilitatea analitului i necesitatea consevrii speciei organometrice de-a lungul procesului; necesitatea conservrii structurii organometrice de-a lungul procesului; cerinele strict impure de sistemul analitic cuplat: volumul probei, polaritatea, matricea acceptat de instrumentul analitic. Dezvoltarea n perspectiv a metodelor de preparare a probei necesit autoamtizarea procesului care implic proceduri de prepare eficiente, de preferin ntr-o singur etap i automate. Procedurile de preparare a probei depind de: tehnica analitic aleas; ceea ce impune necesitatea separrii analitului de interes de matrice i concentrarea pn la concentraia detectabil. De asemenea este obligatorie o atenie deosebit n timpul extractie: pentru evitarea contaminri probelor; pentru evitarea pierderilor speciilor; transformarea speciilor analitului de interese. Concentraia metalului prezent n prob poate fi apropiat de limita de detecie.Aceast concentraie este divizat corespunztor fiecrei specii, aceasta necesitnd o sensibilitate analitic deosebit. Mai mult, diferite specii sunt n mod uzual n echilibru, unele cu altele n prob.Aceasta necesit proceduri de extracie mai puin agresive, pentru ca ntreg echilibrul s fie afectat mai puin posibil. 4. Filtrarea Filtrarea este folosit pentru separarea particulelor din probe gazoase i apoase.Se folosesc n mod normal filtru de 0,45 m, iar anterior HPLC este necesar filtru de 0,2 m. 5. Solubilizarea Solubilizarea se utilizeaz pentru aducerea materialului biologic n soluie i se poate realiza prin diferite proceduri de hidroliz.Este necerar aplicarea unei proceduri de digestie potrivit (hidroliz), ce permite distrugerea complet a matricei n timp ce compuii organoleptici rmn nemodificai. Se pot aplica trei proceduri de hidroliz: Hidroliza acid cu HCl; Hidroliza alcalin cu NaOH metalonic sau cu hidroxind de tetrametilamoniu (TMAH); Hidroliza enzimatic. 6. Extracia Extracia speciilor chimice din prob este o sarcin dificil i complet datorit faptului ca e necesar.
3

 obinerea unei recuperri adecvate; prevenirea pierderilor; prevenirea distrugeri analitului.

Extracia trebuie efectuat astfel ncat analitul s fie separat de matricea interferent, fr pierderi sau contaminare, fr schimbarea speciei.Extracia solid-lichid: se utilizeaz pentru extracia speciilor analitice din probe (sol, sedimente, esuturi bilogice); este o metoda preferata pentru analiza probelor de sol i sedimente care nu pot fi solubilizate fr distrugerea analiilor. Extracia probelor cu ajutorl microundelor.Microundele sunt unde electromagnetice de mare frecven (2.45 GHz) care sunt puternic absorbite de molecule polare (ap, acizi minerali) i care interacioneaz slab cu solvenii nepolari.Avantajele nclzirii cu microunde sunt: absena ineriei, viteza mare de nclzire, eficiena i uurina n automatizarea procesului, care au fcut ca aceast metod s fie larg utilizat pentru accelerarea extraciei compuilor polari ntr-un solvent nepolar sau slab polar.Microundele accelereaz extracia din biomateriale. Dac se utilizeaz un reactiv potrivit (hidroxi de tetrametilamoniu), esuturile biomateriale pot fi solubilizate n 2-3 minute, n loc de 1-4 ore. O alternativ i mai atractiv o reprezint integrarea solubilizri, derivatizri i a extraciei ntr-o procedur cu o sigur etap. Hidroliza cu acid acetic efectuat cu ajutorul unui cmp electrounde de joas putere, n prezena NaBEt 4 i nonan, a scurtat timpul preparrii probelor pentru determinarea compuilor organo-staniu din material bilogic la 3 minute. 7. Preconcentrarea Preconcentrarea este necesar pentru creterea concentraiei speciilor analitice n soluia indus ntr-o coloan cromatografic; tehnicile utilizate includ: extracia gaz-solid (trapping) (pentru analiii aflai deja n faza gazoas), microextracia n faza solid (SPME) pentru anali ii n faza gazoas, extracia lichid-solid (asorbaie) pentru analiii din ap.Preconcentrarea se poate realiza prin extracia solventului i evaporarea extractului. Unele tehnici de extracie, cum sunt sorbaia (extracia n faza solid sau purge-and-trap) ofer un grad mare de concentrare intrinsec.Metodele de extracie cu solveni au dezavantajul comun de a se obine un mare volum de extract ( n mod obinuit, aproximativ 5 ml), ceea ce crete considerabil cantitate ce poate fi introdus n coloana capilar. Discrepana ntre concentraia unei specii analitice dintr-o prob i sensibilitatea detectorului e adesea crescut prin factorul de diluie n timpul analizei probei solide. De aceea, este necesar o etap de preconcentrare adiional ( de exemplu, prin evapoare) a extractului ce conine analiii.n timpul concentrrii prin evapoare pot aprea pierderi ale unor specii derivatizate volatile, de exemplu Me3Pb+. Recuperri mai bune se obin cnd soluia chelailor organometalici (care sunt mai pu in volatilii dect speciile tetraalchil) este evaporat anterior derivatizrii. Preconcentrarea prin evapozare i injectarea unui mare volum de proba duce, de asemenea, la preconcentrarea i a celorlalte substane prezente n proba i pot fi n detrimintul coloanei cromatografice n timpul analizei de rutin.De aceea, este necesar o etap de degazare (clean-up). 8. Clean-up (degazare)
4

Etapa de clean-up are ca scop ndeprtarea componenilor matricei (grsimi, proteine, hidrocarburi cu punct de fierbere ridicat), care, dac ar fi introdui n coloana cromatografic ar duce la degradarea proprietilor de separare a coloanei. Aceast etap se realizeaz, de obicei, prin separarea cromatrografic de joas rezoluie, cu un mecanism diferit de cel folosit n separarea analitic. Diferite tehnici bioanalitice, cum sunt: ultracentrifugarea, dializa i prepararea cu sulfat de amoniu, adesea trebuie precead separarea cromatografic a complexilor metalprotein.Ultrafiltrarile succesive prin membrane cu pori de 30000, 50000 i 500 unita i se folosesc pentru studierea distribuiei speciilor metalice, ca funcie de masele moleculare i pentru simplificarea matricei de ncarcare a coloanei HPLC. Alt metod de clean-up utilizat pentru extractele metanol-ap ale compuilor de As din probele alimentare, prevede folosirea unei coloane Dowex 50W-X8 (rin cu schimbtori de cationi). 9. Derivatizarea Procedurile de deratizare sunt utilizate pentru a se para elementele de matice i interfereni i pentru a concentra speciile analitului. Exist n natur civa compui organometalici care sunt suficient de volatili pentru a fi separai prin GC: specii de tetralchil-plumb (MenEt4-nPb), compui metil-seleniu (Me2Se, Me2Se2), compui organo-mercurici (MeHg+,Me2Hg), precum i metaloporfirine.Aceti compui pot fi purjai direct cu un gaz inert sau extrai ntr-un solvent nepolar, apoi cromatografia i prin desorbie termic, pe o coloan cu umplutur sau capilar. Majoritatea speciilor organometalice exist n forme polare cvasi-ionice care au puncte de fierbere relativ ridicate i, adesea, stabilitate termic sczut.Pentru a fi potrivite pentru separare prin GC,aceste specii trebuie transformate n specii nepolare, volatile i termic stabile. Metodele de derivatizare obinuite sunt: transformarea ionilor organometalici anorganici n compui covaleni volatili (hidrid, specii etilate) n mediul apos; transformarea cationilor mari alchilmetal (RnPb(4-n)+) cu reactivi Grignard n specii nepolare; transformarea speciilor ionice n chelai volatili (ditiocarbamt, trifluoroaceton) sau ali compui. Alegerea uneia dintre aceste metode de derivatizare depinde de concentraia de inters i de matricea probei.n mod frecvent, speciile obinute prin derivatizarea sunt concentrate prin extracie ntr-un solvent organic anterior injectrii ntr-o coloan GC. a) Derivatizare prin generare de hidruri Unele elemente (Hg, Ge, Sn, Pb, Se, Te, Sb, As, Bi, Cd) pot fi transformate n hidruri volatile. Se, As, Sb formeaz uor hidruri doar n starea de oxidare sczut.Formele nalte de oxidare trebuie reduse anterior generrii de hidruri. Acestfel, toate speciile anorganice ale acestor elemente formeaz, n final, aceeai hidrur (SeH 2, AsH3,SbH3). Acizii metilarsonic i dimetilarsinic (sau stibonic) pot fi separai printr-o singur cromatografiere dup generarea hidrurilor volatile: MeAsH2 i Me2AsH (sau MeSbH2 i Me2SbH, respectiv). Speciile trialchil5

prlumb formeaz hidruri stabile, n timp ce speciile dialchil-plumb nu sunt reactive.Speciile Hg (II) i metil-mercur, precum i Ge i metil-germaniu pot fi convertite la hidruri prin GC.Tehnica generrii de hidruri se aplic i pentru analiza de speciere a compuilor organo-Sn, datorit posibilitaii de determinare simultan a speciilor ionice metil i butil, ntr-o singur cromatogram. Generarea de hidruri are loc n mediul acid, utiliznd n mod uzual, borohidrura de sodiu ca agent reductor.Avantajul major al reaciei este c se pstreaz integritatea legturii metalcarbon i astfel se conserv speiile de interes. O mare varietate de specii ale elementelor pot fi determinate utiliznd aceast procedur:As, Ge, Sb, Sn. Prin selectarea pH-ului n vasul de reacie, gama de compui care genereaz hidruri este restricional. De expemplu, n cazul As, reducerea pH-ului la 1 favorizeaz generarea de hidrur de ctre arsenit i arsenat, n timp ce la pH de 5 doar arsnitul est redu. Generealizarea de hidruri prezint dificulti: n recuperarea hidrurii de tributil-staniu n prezena coninutului ridicat de compui organici, se observ variabiliti mari n recuperare ntre diferite matrice, borohidrura nu convertete toi compuii n derivaii volatili: de exemplu arsenobetaina sau arsenocolina n arsin, trifenil-staniu, deoarece legturile n aceste molecule sunt prea puternice. b) Derivatizare cu tetraalchil(aril)borato Procedeul comun de derivatizare se bazeaz pe etilarea cu tetraetilborat de sodiu (NaBEt4), care este solubil n ap i relativ stabil n mediul apos. Compuii metil-, butil- i felnil-staniu reacioneaz rapid cu NaBEt 4 i formeaz specii stabile termic, ce pot fi separate prin GC. Toate speciile alchil-plumb reac ioneaz, de asemenea, rapid, dar doar speciile metil-plumb pot fi separate neambiguu, deoarece prin derivatizare compuii etil-plumb i Pb organic formeaz acelai produs: PbEt 4. Metil-mercur i Hg anorganic pot fi determinare ntr-o singur cromatogram, dup concetrare purge-and-trap.Derivatizarea diferitelor specii de seleniu a dovedit posibiliti sczute pentru analiza simultan. Totui, Se (IV) poate fi detrminat n mod selectiv i liber de interfente, prin reacia cu NaBEt4. c) Derivatizarea cu reactiv Grignard Generarea de hidruri sau etilarea cu alchilborai uureaz pentru specii sau n cazul unor matrice foarte complexe.O alternativ este derivatizarea cu reactivul Grinard, care este versatil, dar necesit un mediu de reacie neapos. n practic, derivatizarea cu reactivi Grinard se aplic extractelor ce conin complecii unui compus organometalic cu ditizona, diticarbonatul sau tropolona. Reactivii Grinard propui pentru derivatizare n analiza de speciere prin GC cu detecie specrometric cu surs de plasm sunt: clorura sau bromura de metil-, etil-, propil-, butil- i pentil-magneziu.Srile de alchil-magneziu cu mas mai mic sunt preferate datorit volailitii ridicate a speciilor rezultate care fac separarea prin GC mai rapid. Reactivul Gringard nereacionat trebuie s fie distrus anterior injectrii extractului derivatizat pe coloan, ceea ce se realizeaz prin agitarea fazei organice cu acid sulfuric diluat. n
6

finalul procedurii, faza organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidr, apoi injectat pe coloana GC. 10. Separarea Separarea se realizeaz cnd determinarea diferitelor specii nu se poate efectua cu selectivitate suficient de mare. Separarea speciilor chimice ale elementelor se efectueaz numai prin tehnici care nu distrug formele chimce i se realizeaz dup extracia i clean-up potrivit a extractului. n analiza de speciere se folosesc, n mod uzual, trei metode de baz pentru speciere: cromatografia de gaze:- gaz-cromatografia capilar; cu schimbtori de ioni pereche; cromatografia de excluziune esteric (pentru separarea moleculelor mari); electromatografia: electoforeza capilar (CZE: capillary zone electrophoresis). 11. Detecia final Deoarece toxicitatea elementelor se poate manifesta la nivele de urme sau ultraurme, este necesar o surs de ionizare eficient cu un detectro extrem de sensibil.Detectorii folosii n analiza de speciere sunt fie specifici elementului ( de ex. AAS), fie nespecifici ( de ex. FID, EPD, ECD). n general, analitul trebuie s soseasc singur la detector pentru evitarea interferenelor. Alt metod pentru detecia speciilor este spectrometria de florecen atomic, utilizat, de exemplu la determinarea cantitativ a speciilor de arsen (arsenit i arsenat) din produse medicale tradiionale chinezeti, dup generarea de hidruri.