2.

APA ȘI BIOELECTROLIȚII

Organizmele vii sunt constituite din substanțe de natură

organică (e.g.: glucide, lipide, proteide) dar și substanțe de natură
anorganică, apa și bioelectroliții. Apa este biocomponentul principal al
organismelor vii, fiind indispensabilă organismului vegetal și animal.
Apa, reprezintă solventul și mediul în care se au loc reacțiile biochimice.

Apa are un rol esențial în organism [1], astfel:

- participă la diverse procese de morfogeneză,
- are capacitate mare de solubilizare a compușilor organici
și biominerali;
- asigură un mediu optim de desfășurare a proceselor
metabolice (cata- și anabolice);
- intervine și transportul diverselor substanțe în organizm;
- participă la procesul de termoreglare intevenind în
homeostazia termică, ș.a

Bioelectroliții au, de asemenea, o importanță deosebită în

materia vie, fiind esențiali în procesul de formare, dezvoltare,
regenerare a celulelor organismului vegetal, animal și uman.
Substanțele minerale îndeplinesc pentru organismele vii funcții
importante atât din punct de vedere biochimic cât și fiziologic. Cu toate
că reprezintă numai 4-5% din greutatea corpului, substanțele minerale
sunt indisponibile pentru organism. În lichidele biologice din organism
majoritatea substanțelor minerale dizolvate se găsesc sub formă

1
ionizantă ca anioni și cationi, care în condiții fiziologice se află intr-un
echilibru perfect. Principalele funcții ale acestor compuși anorganici în
organism sunt acelea că: participă la procese de morfogeneză; au rol de
efectori metabolici; asigură echilibrului acido-bazic și presiunea
osmotică; participă la formarea sistemelor tampon, etc [13]. Astfel, se
pot menționa câteva exemple: Mg2+, Ca2+, Fe2+, Zn2 – activatori
enzimatici +; rolul Ca2+ în procesul de coagulare și osificare, rolul Na+,
K+ în controlul osmotic al metabolismului apei și reglarea echilibrului
acido-bazic, rolul Fe2+ în biosinteza hemoproteinelor ș.a.
Elementele biominerale nu pot fi sintetizate sau degradate în
organism. În anumite condiții fiziologice, ele se găsesc în cantități
constante iar în cazul în care aportul alimentar variază apreciabil,
funcția de excreție are un rol important în hemeostazie.
Importanța electroliților pentru organism este dată, nu din
greutatea lor atomică, ci de numărul de particule pe unitatea de volum
(exprimată sub formă de moli), de care depinde activitatea lor.
Substanțele biominerale se pot clasifica în funcție de cuantumul
lor în organism sau în sistemele biologice în trei clase de compuși
biominerali (tabel 2.1.): macrobioelemente, ologobioelemente și
microbioelemente [1, 2, 19, 20]. Din punct de vedere al caracterului
chimic al bioelementelor acestea se clasifică în bioelemente cu caracter
cationic sau anionic.
Din categoria macoelemetelor fac parte bioelemetele cuaternare
(C, H, O, N), calciul și fosforul. Elementele oligobiogene
(oligobioelementele) sunt de natură cationică (Na, K, Mg) și anionice (S
și Cl). Microbioelementele, elementele microbiogene, pot fi de natură
anionică și cationică, variabile și invariabile.
În clasificarea elementelor minerale prezente în organismele vii
se are în vedere mai multe criterii precum rolul acestora în organism

2
(bioelemente cu rol benefic sau cu potențial toxicogen), sau chiar direct
având în vedere caracterul chimic anionic sau cationic [1, 19, 30].

Tabel 2.1. Clasificarea bioelementelor – prezentare schematică

Bioelemente
Macrobioelementele Oligobioelementele Microbioelementele
Bioelemente Bioelemente Bioelemente Bioelemen Micro- Micro-
cuaternare cu alte cationice te anionice bioelemente bioelemente
valențe invariabile variabile
Cationice: Cationice:
Fe, Cu, Zn, Co, Ni
C, H, O, N Ca, P K, Na, Mg S, Cl
Mo Anionice:
Anionice: F, I Se, Si, B

Sunt necesare studii aprofundate atât în determinările atât

analitice cu privire la conținutul și rolul apei în organismele vii, cât și
cele referitoare la elementele biominerale.

2.1. Determinarea umidității și a substanței uscate

În organismele vii, apa reprezintă un metabolit fundamental în

funcționarea organismelor, este întâlnită atât la nivel intracelular cât și
extracelular, fiind constituent principal al tuturor țesuturilor vegetale
şi animale. [19, 25, 36, 38].
Toate produsele alimentare conțin apă în cantități diferite.
Determinarea umidității reprezintă o metodă de investigare
analitică dintre cele mai importante pentru substraturile alimentare (de
origine vegetală cât si animală). Prin determinarea umidității se găsesc
informații privind [31, 38,]:
• aprecierea valorii alimentare;

3
 • aprecierea puterii de conservare;
• verificarea în ce măsură a fost respectată rețeta oficială
de fabricație, dar și decelarea de adaosuri nepermise.

Metodele de determinare a umidității sunt variate și depind de

felul substratul alimentar, viteza urmărită de efectuare a investigării,
precum și de acuratețea rezultatelor obținute.
Este dificil să se determine umiditatea cu precizie deoarece
pentru îndepărtarea tuturor formelor de apă prezente în produsele
alimentare sunt antrenate și alte substanțe volatile. Există metode
standard specifice fiecărui tip de substrat alimentar, care se folosesc, cu
precădere, în caz de litigiu.
Metodele pentru determinare a cantității de apă din produsele
alimentare pot fi [24]:
 metode fizice (prin rezonanță magnetică nucleară sau
prin uscare în aer cald, în vid sau cu ajutorul
radiațiilor infraroșii);
 metode fizico-chimice (cu ajutorul refractometrelor
sau a aerometrelor, antrenare cu solvenți organici);
 metode chimice (titrarea Karl Ficher).

După modul, metodele de determinare a conținutului de apă

pot fi [14]:
• metode indirecte (se măsoară conținutului de substanță
uscată rămasă după îndepărtarea apei din produsul
alimentar, iar apoi se calculează conținutul de apă care
s-a îndepărtat);
• metode directe prin care se determină direct apa care a
fost îndepărtată din proba de analizat.

4
 Pentru determinarea umidității, sunt folosite, în mod frecvent,
metodele indirecte [4, 38].

În orice analiză chimică, este imperios necesar să se determine

umiditatea probei pentru ca rezultatele analizei chimice să fie raportate
la cantitatea de substanța uscată sau la cantitatea de substanța
proaspătă.

5
 Parte experimentală

2.1.1. Determinarea umidității prin uscarea la etuvă

Principiul metodei
Această metodă are la bază determinarea umidității prin
pierderea de masă a produselor alimentare sau a produselor biologice
prin încălzire în etuvă la temperatura de 103±20C și respectiv
temperaturile de 130 ± 2 0C și 150 ± 20C, până la masă constantă [13-16,
18, 26, 28, 30, 38]. Temperatura la care se realizează uscarea depinde de
natura probei care este analizată.
Este indicat, pentru fiecare probă, să se realizeze în paralel
două determinări pentru aceeași probă luată pentru analiză.

Reactivi și aparatură:
• proba alimentară (material vegetal sau animal);
• proba alimentară (material vegetal sau animal);
• balanță analitică cu precizie de 0,0001g;
• etuvă electrică;
• exicator cu capac și substanțe higroscopice (higro-
absorbante), CaCl2 sau CaCO3 (este de preferat);
• fiole de cântărire prevăzute cu capac, care în prealabil au
fost uscate în etuvă până la greutate constantă;
• baghete de sticlă, spatule, tăvițe, lingurițe;
• nisip de mare. Acesta a fost pregătit în prealabil prin
fierbere în acid clorhidric 18,5% timp de o jumătate de
oră, sub agitare continuă. Operația se repetă până când,

6
 după fierbere, nisipul nu se mai îngălbenește. Nisipul
este apoi spălat cu apă distilată și se usucă la etuvă la
temperatura de 150 0C. Se va păstra într-un flacon închis;
• alcool etilic 97 %.

Mod de lucru
a. Determinarea umidității pentru făină
Într-o fiolă de cântărire cu capac se cântăresc 5 g făină cu o
precizie de 10–4 g. Fiola a fost adusă în prealabil la masă constantă prin
încălzire la 105 0C cu o precizie de 10–4. Proba se întinde în fiolă în strat
uniform. Se va introduce fiola cu probă, cu capacul alături, în etuvă,
încălzită în prealabil la 103 ± 2 0C. Etuva se reglează la 103 °C și, timp de
120 minute, se menține fiola la această temperatură. Se acoperă fiola cu
capacul și se introduce în exicator pentru a se răci până la temperatura
mediului ambiant [1, 2, 6, 42]. După răcire, fiola se cântărește cu precizie
de 10–4g. Pentru aceeași probă sunt efectuate două determinări.
Determinarea umidității din făină prin uscare la 130 °C
presupune respectarea etapelor de la metoda anterioară de uscare la
etuvă la temperatura de 103 ± 2 °C. Această metoda este una expeditivă
(timpul de încălzire în etuvă se va reduce la jumătate), însă există o
anumită eroare deoarece la această temperatură are loc o ușoară
carbonizare a produsului testat [38, 42].

Mod de calcul și exprimarea rezultatelor

Conținutul în apă, umiditatea (U,%) din proba de făină se
calculează cu formula:

𝑚 −𝑚
𝑈, % = ∙ 100 [%]
𝑚 −𝑚

7
în care: m0 = masa fiolei goale cu capac, exprimată în grame;
m1 = masa fiolei cu făină (cu capac) înainte de uscare,
exprimată în grame;
m2 = masa fiolei cu făină (cu capac) după uscare, exprimată în
grame;

Rezultate, observații și discuții

Rezultatul este redat în valori procentuale, exprimate cu o
zecimală. Ca rezultat se ia media aritmetică a celor două determinări
efectuate în paralel.

b. Determinarea umidității pentru preparate din carne

În cazul produselor din carne se va folosi și nisip marin. Pentru
probele care au un conținut ridicat de apă, în fiola cu probă se va adăuga
nisip marin (aproximativ 20 g), se va introduce o baghetă de sticlă.
Nisipul este folosit pentru a mări suprafața de evaporare, la produsele
sub formă de pastă sau la cele fluide.
În fiolă de cântărire cu capac se introduc 15-20 g nisip de mare,
se cântăresc cu o precizie de 10–4g şi se usucă în etuvă alaturi de bagehta
de ticlă, timp de 30 minute, la temperatura de 103 ± 20C. Fiola și capacul
acesteia au fost adusă în prealabil la masă constantă, cu o precizie de 10–
4 prin încălzire la 105 0C [2, 18, 28, 30, 31, 38, 43]. Se va cântări fiola cu
nisip, capacul și bagheta, după ce în prealabil au fost răcite în exicator
la temperatura camerei. Se notează masa totala a acestora. Se introduc
5 g de produs – bine mărunțit (tocat) şi omogenizat – în fiolă. Se
amestecă, cu ajutorul baghetei, cât mai uniform nisipul din fiolă cu toată
cantitate de produs. Fiola cu produs și nisip se cântărește. Cantitatea de
probă luată în lucru se află prin diferență. Din masa fiolei cu probă și

8
nisip și bagheta se scade masa fiolei cu nisip și bagetă înainte de
adăugarea probei). Se toarnă în fiolă, după cântărire, 5 ml alcool etilic şi
se omogenizează bine cu bagheta. Fiola fără capac se așază pe o baie de
apă cu temperatură reglată la 60-80 0C, pe care se menține, amestecând
cu bagheta, până se evaporă alcoolul. Apoi fiola se introduce în etuvă,
care, în prealabil, a fost reglată la temperatura de 103 ± 2°C și se menține
cu capacul și bagheta alături timp de 2 ore. Se introduce fiola acoperită
cu capac în exsicator. Fiola se cântărește, după ce s-a răcit la temperatura
ambiantă, masa acesteia se notează. Operațiile de încălzire la etuvă
(câte o oră), răcire și cântărire, se repetă până când rezultatele a două
cântăriri consecutive nu diferă cu mai mult de 0,1 din masa probei.
Metoda prin uscare la etuvă la temperatura de 150 °C
presupune același mod de lucru anterior. Metoda este mai rapidă (se
reduce la jumătate timpul de încălzire la etuvă), dar va exista o eroare
de 1-3, indusă de o carbonizare ușoară a produsului investigat la acesta
temperatură [30, 38].
Se vor face câte două determinări pentru aceeași probă

Mod de calcul și exprimarea rezultatelor

Conținutul în apă, umiditatea (U,%) din proba de făină se

calculează cu formula:
𝑚 _ −𝑚 _
𝑈, % = ∙ 100 [%]
𝑚 _ −𝑚 _

în care: m0 = masa fiolei goale cu capac, exprimată în grame;

m01 = masa fiolei goale cu capac și baghetă, exprimată în
grame;
m02 = masa baghetei (m01 – m0), exprimată în grame;
m1_0 = masa fiolei cu nisip (cu capac) înainte de uscarea probei,

9
 exprimată în grame;
m1_1 = masa fiolei cu nisip (cu capac și baghetă) înainte de
uscarea probei, exprimată în grame;
m1_2 = masa fiolei cu nisip și probă (cu capac și baghetă) înainte
de uscarea probei, exprimată în grame;
m2_1 = masa fiolei cu nisip și probă (cu capac) după de uscare,
exprimată în grame;
m2 = masa fiolei cu nisip și probă (cu capac și baghetă) după
uscare, exprimată în grame;

Rezultate, observații și discuții

Rezultatul este redat în valori procentuale, exprimate cu o
zecimală. Ca rezultat se ia media aritmetică a celor două determinări
efectuate în paralel.

10
2.1.2. Determinarea umidității și a substanței uscate prin
uscarea cu radiații infraroșii

Principiul metodei
Principul acestei metode de uscare este asemănător uscării la
etuvă. Spre deosebire de uscarea la etuvă sunt folosite termobalanțe,
dispozitive prevăzute cu bec de radiații infraroșii. Uscarea cu radiații
infraroșii se realizează in timp scurt. Este o metodă folosită frecvent în
laboratoarele industriale, cu toate că, datorită uscării forțate, prin
această metodă apar mici erori. Metoda Karl Fisher este folosită ca
metodă de referință de metodă de uscare cu radiații infraroșii [24, 38].

Reactivi și aparatură:
• probă alimentară;
• termobalanță;
• tăviță de aluminiu (accesoriu pentru termobalanță).

Mod de lucru:
Termobalanțele (umidometre, balanțe de umiditate) sunt
concepute pentru determinarea umidității, oferind precizie și rapiditate
în investigarea probei. Accesoriile cu care este prevăzută termobalanța
sunt următoarele: lampă infraroșu (IR), tăvițe de cântărire metalice,
software pentru prelucrarea datelor pe calculator.
Termobalanțele pot, simultan, să determine masei probei și să o usuce
pe aceasta prin încălzire cu scopul determinării umidității probei în mod
automat [24, 38 ].
Probele de investigat se usucă în tăvițe (de aluminiu), care, în
prealabil, au fost tarate în termobalanță.

11
 Cantitatea de probă care trebuie analizată este aleasă în funcție
de mărimea tăvițelor de aluminiu și de granulația probei [1, 2, 38].
Pentru o bună acuratețe a metodei trebuie ca proba să fie întinsă
uniform într-un strat cât mai subțire pe întreaga suprafață a tăviței
metalice (de aluminiu). Tăvița cu probă se introduce în termobalanță,
unde se încălzește sub acțiune a lămpii de halogen cu o emisie cuprinsă
între 1 - 2 µm [26, 27].

Fig. 2.1. Termobalanță pentru determinarea umidității (model Sartorius)

În funcție de compoziția chimică și proprietățile fizice ale probei

de investigat pot fi folosite diferite programe de uscare setând timpul
și temperatura de uscare [24, 28]. Determinare a umidității se poate
realiza, în funcție de modelul termobalanței, în următoarele moduri
[38]:
• umiditatea în procente din masa inițială (raportare la
masa inițială);
• umiditate a în procente din corpul uscat (raportare la
masa uscată);
• procentul de masă uscată din masa inițială.

12
 Mod de calcul și exprimarea rezultatelor
Datele măsurate de termobalanță sunt notate, dar pot fi tipărite
la o imprimantă, prin cuplarea la calculator a imprimantei și a
termobalanței [24, 38].

Rezultate, observații și discuții

Un avantaj deosebit al acestei metode de este acela că pierderea
masei probei se poate urmării în mod continuu (microbalanță
încorporată). Datele obținute sunt folosite la trasarea diagramei
pierderii de apă în timp a produsului investigat în funcție de
temperatură, care reprezintă o caracteristică dependentă de natura
probei. Prin conectarea la o imprimantă externă, pot fi printate datele
măsurate de termobalanță [38].

Observații și discuții

.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

13
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
...........................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

14
 Proba practică

 Determinarea umidității următoarelor probe de analiză

conform tabelelor 1 și 2.

Tabel 1. Determinare umiditate - experimental

Nr. Proba Caracterizarea metodei U, %

Uscare la etuvă, 150°C , 1h

Uscare la etuvă, 150°C , 1h

Uscare la etuvă, 103°C , 2h

Uscare la etuvă, 103°C , 2h

Uscare la etuvă, 130°C , 1,5h

Uscare la etuvă, 130°C , 1,5h

Uscarea la termobalanță

Uscarea la termobalanță

.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

15
 Tabel 2. Determinare umiditate - experimental
Nr. Proba m0 m1 m2 U, % Observații

 Arătați care sunt avantajele și dezavantajele între metoda

uscării la etuvă, uscarea cu radiații .

.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

16
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

17
 Rezultate, observații și discuții

.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

18
2.2. Determinarea conținutului total de substanțe mienerale

Conținutul total de substanțe minerale (cenușa)

reprezintă reziduul anorganic care rezultă prin oxidarea completă a
produsului analizat, prin incinerare (calcinare) la temperatura de 500 –
900 °C. Pentru a evita pierderea compușilor volatili este recomandat ca
temperatura de calcinare să fie 500 – 600 °C [1, 9, 18, 40, 41].
Mineralizarea (oxidarea completă) se poate realiza prin două căi:
- mineralizare pe cale uscată are loc prin incinerarea
probei, se folosește un calcinator (cuptor de calcinare);
- mineralizare pe cale umedă are loc prin combustia probei
cu amestecuri de acizi tari (acid sulfuric, azotic și
percloric), este folosită pentru dozarea elementelor
minerale.
Compoziția substanțelor minerale totale (compoziția cenușii)
variază în funcție de tipul probei luate în analiză. Cenușa este un
amestec de oxizi, sulfați, fosfați, silicați şi cloruri a diferitelor
bioelemente. Conținutul mediu al cenușii este variază de la probă la
probă. Conținutul în cenușă ne oferă informații cu privire la:
 aprecierea calității alimentului (e.g.: la faină);
 identificarea contrafacerilor (lapte, ceai, condimente,
etc.).

19
 Parte experimentală

Determinarea conținutului total de prin calcinare din făina de

grâu

Principiul metodei
Substanțele minerale totale reprezintă reziduul anorganic
obținut după calcinarea probei la temperatura de 550 °C până la
greutate constantă.

Reactivi și aparatură:
 balanță analitică;
 creuzete de porțelan;
 etuvă termoreglabilă;
 cuptor de calcinare;
 proba de analizat: făină de grâu.

Mod de lucru
Într-un creuzet de porțelan se cântăresc la balanța analitică 5 g
din produsul de analizat, cu precizie de 10–3 g. Creuzetul a fost adusă
în prealabil la masă constantă prin calcinare la 550 °C . Proba se întinde
în creuzet în strat uniform. Se va introduce fiola cu probă în cuptorul de
calcinare model Naberthem (figura 2.2.). Calcinarea probei se face la 550
°C. Dacă după incinerare mai rămân puncte negre de cărbune, se
umectează reziduu cu 2-3 picături de apă distilată.

20
 Fig. 2.2. Cuptor de calcinare (model Nabertherm)

Apoi, se ține creuzetul la gura cuptorului, până când reziduu devine alb
sau alb-cenușiu. Timpul de calcinarea este de circa șase ore.
Creuzetul se scoate din cuptor, după calcinare. Se va răci într-
un exicator (prevăzut cu clorură de calciu anhidră). După răcire,
creuzetul se cântărește cu precizie de 10–4g. Durata de răcire nu trebuie
să fie mai mare de 2 ore. Pentru aceeași probă sunt efectuate două
determinări [2, 16, 17, 28 ].

Mod de calcul și exprimarea rezultatelor

Conținutul de substanțe minerale totale, exprimat în procente, se
calculează folosind următoarea formulă:
𝑚 −𝑚
𝐶𝑒𝑛𝑢șă, % = ∙ 100
𝑚 −𝑚
unde: m0 = masa creuzetului gol, exprimată în grame;
m1 = masa creuzetului cu probă înainte de calcinarea probei,
exprimată în grame;
m2 = masa, creuzetului cu cenușă, exprimată în grame;

21
 Rezultate, observații și discuții
Rezultatul reprezintă media a două determinări paralele și
este exprimat în procente, cu precizie de 10–2 g cenușă la 100 g probă.
Între aceste determinări parale trebuie să nu existe diferențe (cu o
precizie de 0,1 g cenușa Ia 100 g probă). Cenușa obținută prin această
metodă (de mineralizare uscata) este folosită pentru:
 a determina elementele minerale (e.g.: dozarea Zn, Cu,
Sn, Pb din conservele de carne),
 a determina cenușa insolubile în HCl 10% (din făină,
pâine, condimente),
 a determina alcalinitatea cenușii, etc.

22
 Proba practică

 Determinarea umidității următoarelor probe de analiză

conform tabelelor 1 și 2.

Tabel 1. Determinare umiditate - experimnetal

Nr. Proba Caracterizarea metodei U, %

Calcinare, 550°C, 2h

Calcinare, 550°C, 2h

Calcinare, 550°C, 4h

Calcinare, 550°C, 4h

Calcinare, 550°C, 6h

Calcinare, 550°C, 6h

23
Tabel 2. Determinare cenușă - experimnetal
Nr. Proba m0 m1 m2 U, % Observații

24
 Rezolvare, observații și discuții

.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................
.............................................................................................................................

25