Capitolul II: Analiza apelor prin intermediul comunitilor de microorganisme

2.1. Definire i obiect de studiu

Termenul de microorganism (gr. mikros mic, organismos - organism) se refer la un
grup eterogen de vieuitoare microscopice, uni- sau pluricelulare, care cuprind bacteriile,
arheele, protozoare, microfungi, alge microscopice i formele microscopice de rotifere i
planarii.
Virusurile, viroizii, virusoizii i prionii, ultimele trei fiind fragmente de ARN sau
proteine cu caracter infecios, sunt de obicei integrate n rndul microorganismelor, dar
aspectul este contestat de o parte e lumii tiinifice, care argumenteaz tratarea lor separat
pe baza faptului c acestea nu sunt considerate organisme vii.
Indiferent de clasificare, toate organismele prezentate anterior fac obiectul de studiu
al microbiologiei, definit ca tiin care studiaz microorganismele.

2.2. Metodologie specific
Analiza apelor din punct de vedere microbiologic este una dintre cele mai vechi
metode de analiz a calitii corpurilor de ap cu ajutorul comunitilor de organisme
acvatice. Cu toate acestea, ea prezint o serie de particulariti metodologice care o
difereniaz de restul tipurilor de analiz biologic.
n primul rnd, obiectivele analizei microbiologice sunt, n mare parte, diferite de cele
ale celorlalte tipuri de analiz bazate pe studiul organismelor care populeaz corpurile de
ap. Patru obiective principale se pot identifica n cazul analizei microbiologice a apelor:
- stabilirea calitii apei pentru potabilitate
- identificarea eventualelor contaminri ale apelor folosite n industrie i
agricultur
- evitarea contaminrii populaiei umane
- evitarea eutrofizrii bazinelor acvatice
De menionat faptul c, exceptnd ultimul punct, obiectivele acestui tip de analiz
sunt centrate pe nevoile de alimentare cu ap i securitate alimentar sau medical a
populaiilor umane, i doar n secundar pe identificarea funcionrii necorespunztoare a
ecosistemelor acvatice i pe remedierea cauzelor care au dus la aceast funcionare
deficitar. Din acest motiv, analiza microbiologic a apelor se difereniaz semnificativ de
celelalte tipuri de analiz biologic pe care le vom prezenta ulterior.
Colectarea probelor de analizat se realizeaz n mod omogen din diversele corpuri de
ap considerate de interes:
- fntni
- reea public de alimentare a populaiei
- staii de tratare a apei pentru potabilizare
- ruri
- lacuri cu ap dulce, bli, mlatini
- piscine publice i private
Se remarc lipsa interesului pentru bazinele acvatice cu ap srat (zone maritime
costiere, lacuri srate), datorit incapacitii speciilor sau taxonilor de interes n analiz de a
supravieui i dezvolta populaii n astfel de ape.
Colectarea se realizeaz prin prelevarea unui volum cunoscut (i, de obicei,
standardizat la nivel naional) de ap din sursa de interes, cu ajutorul unor recipiente
speciale din material inert (sticl, materiale plastice speciale), opacizate pentru a preveni
dezvoltarea difereniat a microorganismelor autotrofe sub influena luminii. n mod
obinuit, un volum de 0,5 l sau 1 l este consemnat n standardele de colectare, dar, n funcie
de specificul analizei, volumul colectat poate ajunge i la 100 l (cum este cazul
enterobacteriilor patogene, inegal rspndite n masa de ap i sunt rapid supuse factorului
de diluie).
Prelevrile se realizeaz direct din sursele de alimentare (robinete de la instalaiile
centrale sau casnice de alimentare cu ap, izvoare) sau prin imersarea recipientului n masa
de ap care se dorete a fi analizat (n cazul rurilor, lacurilor, piscinelor etc.). Recipientul
trebuie cltit de 2-3 ori n apa de analizat, pentru a evita diluarea probei de analizat cu apa
folosit pentru curarea recipientului naintea colectrii.
Datorit capacitii ridicate de nmulire a microorganismelor, se recomand ca
analiza probelor s se realizeze ntr-un interval de timp ct mai scurt de la momentul
prelevrii, de obicei la maxim 6 ore de la acest moment. n acest scop au fost dezvoltate
chiar metode de analiz in situ a unor grupe de microorganisme. n mod excepional, un
interval de 24 de ore este acceptat ca tolerabil, n situaia n care probele sunt colectate din
locuri greu accesibile sau situate la distane mari de laboratoarele de analiz. n acest caz,
probele vor fi refrigerate, pentru a putea fi transportate necontaminat la laborator.

Metodele de analiz a probelor sunt cele specifice microbiologiei, implicnd:
- diluii ale probelor, acolo unde concentraiile de microorganisme sunt foarte
mari sau unde metodologia specific grupului analizat o cere
- incubarea probelor (pe plci Petri sau n eprubete, folosind medii de cultur
generale sau specifice pentru anumite specii sau taxoni superiori)
- citirea rezultatelor cu ajutorul:
- coloraiilor
- analizei coloniilor specifice
- evidenierea fermentaiilor sau precipitrii
- evidenierea degajrii de gaze
Metodologia de lucru se bazeaz pe concentraii maxime admise la indicatorii luai n
calcul. Sub aspect legislativ, n ceea ce privete apa destinat potabilizrii, acestea au fost
reglementate de STAS 1342-91 la nivelul rii noastre, act nlocuit cu prevederile Legii nr.
458/2002 privind calitatea apei potabile, care a fost ulterior completat i modificat de
Legea nr. 311/2004, care a integrat prevederile legislaiei europene n jurisprudena
romneasc, n spe cele ale Directivei 98/83/CE privind calitatea apei destinate consumului
uman. Acest ultim act normativ stabilete, n ceea ce privete ncrcarea microbian,
parametrii microbiologici (Tab. 1) i parametrii indicatori (Tab. 2) pentru a stabilii calitatea
apei potabile.
n lipsa unei legislaii specifice de reglementare a criteriilor de calitate a apelor de
suprafa, valorile referitoare la concentraiile admise ale ncrcrii microbiene a apei
lacurilor, rurilor sau piscinelor sunt preluate din legislaia referitoare la apele destinate
potabilizrii, considerndu-se c acestea asigur condiii de protecie mpotriva eventualelor
contaminri.

Tab. 1. Parametrii microbiologici conform Legii nr. 311/2004
Parametru Valoare admis (numr/100 ml)
Escherichia coli 0
Enterococi 0



Tab. 1. Parametrii indicatori conform Legii nr. 311/2004 (cu evidenierea parametrilor
microbiologici)
Parametru Valoare CMA
Unitate
de msur
Aluminiu 200 g/l
Amoniu 0,50 mg/l
Bacterii coliforme 0
numr/100
ml
Carbon organic total (COT)

Nici o modificare anormal

Cloruri 250 mg/l
Clostridium perfringens
(specia, inclusiv sporii)
0
numr/100
ml
Clor rezidual liber 0,50 mg/l
Conductivitate 2.500 S cm
-1
la 20C
Culoare Acceptabil consumatorilor i nici o modificare anormal

Duritate total, minim 5
grade
germane
Fier 200 g/l
Gust Acceptabil consumatorilor i nici o modificare anormal

Mangan 50 g/l
Miros Acceptabil consumatorilor i nici o modificare anormal

Numr de colonii la 22C Nici o modificare anormal

Numr de colonii la 37C Nici o modificare anormal

Oxidabilitate 5,0 mg O
2
/l
pH 6,5; 9,5 uniti de pH
Sodiu 200 mg/l
Sulfat 250 mg/l
Sulfuri i hidrogen sulfurat 100 g/l
Turbiditate 5 UNT
Zinc 5.000 g/l
Tritiu 100 Bq/l
Doza efectiv total de
referin
0,10 mSv/an
Activitatea alfa global 0,1 Bq/l
Activitatea beta global 1 Bq/l


2.3. Specii i taxoni care fac obiectul analizei microbiologice a apelor
Alturi de indicatorii microbiologici cuprini n prevederile legislative, o serie de alte
specii, genuri sau grupuri taxonomice aparinnd microorganismelor fac obiectul unor
analize specifice referitoare la calitatea apelor. Vom prezenta n cele ce urmeaz cele mai
importante analize microbiologice efectuate n mod curent n laboratoarele de specialitate.

Numrul total de bacterii aerobe la 22 i 37C
Este un indicator cantitativ care relev ncrcarea microbiologic general a apei
analizate. Cel mai frecvent, analiza se realizeaz prin metoda ncorporrii n plci Petri a
diluiilor succesive realizate din apa prelevat, inserndu-se 1 cm
3
de diluie n mediul de
cultur (de obicei se folosesc medii generale, cum este geloza nutritiv). Numrul de colonii
obinute dup incubarea vreme de 48 de ore la cele dou temperaturi menionate este
folosit mpreun cu diluia folosit pentru a se estima numrul de germeni mezofili, respectiv
termofili, pe cm
3
de ap prelevat.

Coliformii totali i fecali
Sunt poate cel mai studiat grup de microorganisme din punctul de vedere al calitii
apelor, datorit potenialului patogen al unui numr mare de specii aparintoare. Exist
metodologii dezvoltate pentru evidenierea prezenei coliformilor totali n probele de ap,
cu particulariti de colectare n funcie de sursa de ap analizat. n toate cazurile, prezena
este semnalat de degajarea n eprubete a gazelor rezultate din fermentarea glucozei de
ctre bacterii, dar testul trebuie confirmat prin nsmnarea pe medii solide i identificare
coloniilor specifice acestui grup, pentru a evita confuziile generate de prezena n apa
analizat a altor microorganisme cu proprieti fermentative.
Testri suplimentare, bazate pe metodologii specifice, sunt utilizate pentru a se
estima numrul de coliformi din proba de ap i pentru a identifica prezena coliformilor
fecali, cu nalt grad de patogenitate, n cadrul coliformilor totali.

Escherichia coli
Este o bacterie gram-negativ, parte a microbiotei intestinale a organismelor
endoterme. Dei majoritatea tulpinilor sunt inofensive i bacteria este benefic prin
producerea de vitamin K2 i mpiedicare fixrii unor patogeni n tractul digestiv, anumite
serotipuri sunt responsabile de generarea unor boli de tipul enterocolitelor i infeciilor
urinare severe, iar potenialul de transmisie este ridicat, prin intermediul apelor impurificate
cu materii de origine fecal.
Streptococii fecali
Denumii i enterococi, datorit potenialului de producere a enterocolitelor,
streptococii fecali sunt un grup de bacterii prezente n mod normal n tractul digestiv cu
patogenitate condiionat. Alturi de enterocolite, sunt responsabili de infecii ale tractului
urinar i de endocardite.

Clostridiile anaerobe i Clostridium perfringens
Sunt bacterii care fac parte din flora normal a tractului digestiv, n mod similar
multor ali patogeni, fiind grupul determinant implicat n descompunerea cadavrelor.
Patogenitatea lor este condiionat, dar sunt considerate printre cele mai frecvente cauze
ale enterocolitelor. Specia Clostridium perfringens este considerat a avea cea mai agresiv
patogenitate, necesitnd teste suplimentare pentru identificare.

Salmonella
Este un gen bacterian Gram-negativ, care cuprinde doar dou specii, S. enterica i S.
bongori, comune n tractul digestiv la mamifere, inclusiv la om, dar i la alte vieuitoare
endoterme sau poikiloterme. Serotipurile celor dou specii prezint specificitate de gazd
relativ mare, ele fiind inofensive pentru gazda principal dar patogene la alte mamifere. La
om, bacteria este responsabil de afeciuni grave, cum sunt febra tifoid, febra paratifoid i
enterocolite severe, iar numite serotipuri infecioase nu au putut fi legate de o gazd anume,
n scopul de a evita contaminarea.

Shigella
Este un gen bacterian Gram-negativ strns nrudit cu Salmonella i Escherichia,
prezent n mod natural n tractul digestiv al primatelor, inclusiv al omului. Forma sa
infecioas provoac shigelloza, una dintre cele mai severe forme de enterocolit, cauzat de
ingerarea bacteriei din materiile fecale pe cale oral, n condiii de igien
necorespunztoare. Analizele filogenetice recente au artat c Shigella este mai degrab un
subgen al Escherichia, i c anumite serotipuri patogene de E. coli ar aparine, mai degrab,
grupului Shigella.



Pseudomonas aeruginosa
Este o specie bacterian comun n sol, ap, pe tegumentul plantelor i n majoritatea
habitatelor umane, care poate supravieui i n condiii aerobe i anaerobe, de unde
capacitatea mare de rspndire. A fost chiar obiect de studiu al cercetrilor desfurate n
spaiul cosmic, unde s-a observat capacitatea ei de a se adapta la microgravitaie i a
dezvolta culturi bacteriene de o form specific, nentlnite la populaiile terestre.
Fiind extrem de bine adaptat i coloniznd cu precdere zonele umede, P.
aeruginosa dezvolt colonii i pe esuturi umane i animale afectate sau cu imunitate redus,
provoacnd infecii caracterizate prin inflamaii i oc septic iar cnd infecia se localizeaz n
organe importante ale corpului (plmni, tract urinar sau rinichi), aceasta poate fi fatal.

Vibrio cholerae
Una din ameninrile la adresa sntii populaiilor umane pn la nceputul
secolului al XX-lea, V. cholerae este o bacterie Gram-negativ frecvent n ape stttoare
eutrofizate. Dezvoltarea ei n tractul digestiv uman provoac holera, cea mai cunoscut
form de enterocolit, cu o rat extrem de rapid de dispersie, dei nu exist dovezi clare ale
transmisiei de la un individ infectat la altul. La ora actual, epidemiile de holer sunt extrem
de rare.

Yersinia enterocolitica
Ruda mai puin agresiv Y. pestis, agentul infecios al ciumei bubonice, Y.
enterocolitica este comun n tractul digestiv al roztoarelor i poate ajunge, prin
intermediul acestora, n rezervoarele de alimentare cu ap a populaiei. Intrat n sistemul
digestiv al omului, dar i al mai multor specii animale, inclusiv de interes agricol, provoac
yersinioza, o form sever de enterocolit cu simptomatologie diferit n funcie de vrsta
pacientului, care poate fi confundat cu apendicita sau cu o afeciune pulmonar (de unde i
denumirea de pseudotuberculoz).

Campylobacter
Este un gen bacterian Gram-negativ, cuprinznd cel puin 12 specii care provoac
enterocolite la om, cele mai frecvente fiind C. jejuni i C. coli, considerate chiar printre
principalele cauzei ale enterocolitelor alimentare n rile dezvoltate. Specia C. fetus este, de
asemenea, bine cunoscut, fiind cauz a avortului spontan la vite i oi, dar i patogen
ocazional la om.
Legionella pneumophila
Este o bacterie aerob, Gram-negativ, care triete n simbioz cu amoebe din apele
stagnante. Prin consumul acestor ape netratate, L. pneumophila ajunge n interiorul
organismelor umane, unde provoac legionelloza sau boala legionarului, o form potenial
fatal de pneumonie, rezultat al dezvoltrii bacteriei n celulele epiteliale pulmonare.

Virusuri
Sunt cunoscute i s-au dezvoltat metodologii de analiz pentru peste 100 de virusuri
patogene care pot fi transmise prin intermediul corpurilor de ap. Dintre acestea, cele mai
periculoase i generatoare de afeciuni severe sunt: rotavirusul, cauz frecven a acceselor
de diaree la copii, enterovirui, cauze pentru o serie larg de afeciuni severe, inclusiv
poliomielita, norovirusul, frecvent cauz a enterocolitelor fatale n rile slab dezvoltate
economic, hepatita A, etc.

Candida albicans
Este o specie de drojdii cu potenial patogen, parte a florei intestinale normale a
oamenilor. n situaii de compromitere a sistemului imunitar al gazdei, C. albicans se poate
dezvolta n exces, provocnd infeciile denumite candidoze sau moniliaze, localizate bucal
sau genital, dar i onicomicoza, o afeciune a prii dure a unghiilor. n cazul pacienilor
imunocompromii (bolnavi de SIDA, pacieni care efectueaz chemoterapie, pacieni cu
organe sau mduv transplantat), infeciile fungale sistemice, inclusiv cele cu C. albicans,
sunt considerate de mare risc i pot fi cauz important a morbiditii i mortalitii.

2.4. Concluzii
Pentru a concluziona, se poate spune c grupul microorganismelor cuprinde un
numr ridicat de forme patogene sau potenial patogene pentru populaiile umane i
animale, care sunt cauze mai mult sau mai puin frecvente pentru infecii individuale sau
epidemii.
Aceste organisme patogene sunt fie specii comune tractului digestiv uman sau animal
devenite patogene prin schimbarea gazdei sau prin reingerarea materiilor fecale, fie
organisme patogene care fac parte din comunitatea normal a rezervorului de ap sau care
au ajuns prin intermediul gazdelor intermediare n ap.
Identificare microorganismelor patogene se realizeaz cu ajutorul metodelor
specifice microbiologiei, fiecare specie sau grup considerat avnd propria metodologie de
evaluare (etape specifice de lucru, medii de cultur, metode de evideniere i cuantificare
etc.).
Pentru o parte a microorganismelor patogene i potenial patogene exist
reglementri legale referitoare la prezena acestora n apele considerate pentru potabilizare.
Analiza calitii apelor cu ajutorul microorganismelor menionate se realizeaz pe baza
comparrii cu standardele i concentraiile maxime admise reglementate legal, pe cnd, n
cazul celorlali poteniali patogeni, simpla determinare a prezenei lor n apa de analizat este
suficient pentru considerarea ei ca i contaminat.
n final, se poate spune c analiza calitii apelor pe baza comunitilor de
microorganisme prezint un caracter aparte n cadrul conceptului de analiz biologic a
apelor, att din cauza specificitii i caracterului microorganismelor, dar i datorit
concentrrii ei pe necesitile societii umane i nu pe evaluarea funcionrii naturale a
ecosistemelor acvatice investigate.