Universitatea Bucureti

Facultatea de Biologie

Studiul interrelaiilor dintre agenii infectioi,

celula eucariot i dispozitive protetice n patologia
infeciilor cardiovasculare

Coordonator tiinific: Prof. Dr. Tatiana esan

Drd. Biolog Otilia Banu

PARTEA TEORETIC
Lucrarea a urmrit abordarea bacteriilor dintr-un unghi diferit, fa de cel obinuit care
studiaz bacteriile n stare liber, n suspensie, i anume, creterea i dezvoltarea acestora n stare
aderat la diferite substraturi celulare i inerte, cu relevan n patologia i managementul infeciilor
asociate chirurgiei cardiovasculare.
Fenomenul formrii biofilmelor este mai puin cunoscut i abordat la noi n ar i este cu att
mai important de semnalat ateniei microbiologilor, mai ales datorit uneia dintre cele mai importante
consecine directe ale acestuia, rezistena fenotipic sau comportamental la substane antimicrobiene
care face biofilmul complet insensibil la dozele uzuale de antibiotice i bioacizi.
n chirurgia cardiovascular, eecurile frecvente n depistarea i tratamentul infeciilor se
datoreaz n cea mai mare parte mijloacelor i metodelor necorespunzatoare de laborator menite s
permit identificarea i testarea sensibilitii bacteriilor cu cretere sesil, implicate att n etiologia
endocarditelor, ct i a infeciilor asociate dispozitivelor protetice.
Infeciile cardiace implic formarea de biofilme att pe esuturi (endocadita valvular) ct i
dezvoltarea de biofilme pe dispozitive medicale (valve cardiace naturale i artificiale, catetere centrale
venoase, catetere urinare). Prin urmare, studiul relaiilor dintre agenii infectioi i celul eucariot, pe
de o parte, i agenii infectioi i dispozitivele protetice, pe de alta parte, reprezint un deziderat
important, cu rol att n patologia, ct i n managementul infeciilor cardiovasculare.
Capitolul 1 prezint principalele afeciuni n patologia infecioas cardiovascular i
manifestrile clinice ale acestora: endocardita infecioas (EI)

i complicaiile cardiace i

extracardiace ale endocarditei infecioase, precum i infeciile asociate dispozitivelor protetice nonvalvulare.
Capitolul 2 descrie agenii etiologici microbieni ai infeciilor cardiovasculare i factorii de
virulen implicai n procesul infecios. Microorganismele implicate n apariia EI la adult sunt
reprezentate de specii de streptococi, stafilococi, enterococi, bacili Gram negativi i bacterii din
grupul HACEK, n schimb etiologia microbian a infeciilor asociate dispozitivelor protetice nonvalvulare este dominat de Streptococcus aureus, S. epidermidis, bacili Gram negativi i Candida spp.
Factorii de virulen ai acestor ageni bacterieni sunt prezentai corelat cu etapele obligatorii ale unui
proces infecios, reprezentate de aderena la esuturi i dispozitive protetice, n care sunt implicate
molecule bacteriene denumite adezine i receptorii de adezine, urmate de agresivitaea sau
invazivitatea microorganismelor patogene, care rezid n capacitatea acestora de a se localiza,
multiplica i de a coloniza organismul gazd pe diferite ci. Sunt prezentate, mecanismele formrii
biofilmelor pe diferite suprafae esuturi i dispozitive protetice utilizate n chirurgia cardiovascular

i consecinele acestora: rezistena la mecanismele de aprare ale gazdei i la dozele convenionale de

antibiotice.
Inducerea apoptozei celulei gazd de ctre agenii infecioi bacterieni reprezint, de
asemenea, o condiie esenial a existenei patogenilor, pentru depirea mecanismelor de aprare i
instalarea infecei la nivelul organismului gazd. Pentru nelegerea n profunzime a procesului
infecios, este necesar att identificarea i cunoaterea factorilor de virulen care favorizeaz
supravieuirea patogenului, ct i investigarea mecanismelor de rspuns ale organismului gazd.
Bacteriile pot declana apoptoza printr-o varietate de mecanisme care includ secreia de
proteine inhibitorii ale sintezei, proteine formatoare de pori, molecule responsabile de activare a
mecanismelor endogene declanatoare de superantigene.
Utilizarea pe scar larg a antibioticelor n domeniul medical, dar i n alte domenii legate de
activitatea uman (agricultur, zootehnie, medicin veterinar) a dus la creterea fr precedent a
rezistenei la antibiotice a bacteriilor, ce se manifest la unul sau mai multe antibiotice, astfel nct,
constituie adevrai markeri de rezisten ai bacteriilor cu mare valoare clinic i epidemiologic.
Utilizarea din ce n ce mai frecvent a antibioticelor n tratamentul infeciilor a avut ca efect apariia
unui numr tot mai mare de tulpini bacteriene rezistente la un numr tot mai mare de antibiotice.
Odat aprut rezistena la antibiotice, gena codificatoare a acestui caracter se poate rspndi la alte
celule prin transferul plasmidelor sau a genelor cromosomale. O bacterie poate purta simultan mai
multe gene de rezisten la antibiotice, manifestnd fenomenul de multirezisten (Acinetobacter spp,
Ps, aeruginosa, K. pneumoniae, S. aureus) aa cum sunt bacteriile implicate n etiologia infectioas
cardiovasculat , care face dificil de realizat procesul terapeutic.
Urmrind prezena markerilor de rezisten la diferite tipuri de microorganisme s-au constatat
variaii semnificative care conduc spre identificri de tipuri epidemiologice ale tulpinilor bacteriene
mai ales n cazul celor nosocomiale.
Capitolul 3 evideniaz principiile actualizate aplicate n diagnosticul i tratamentul infeciilor
asociate cardiologiei i chirurgiei cardiovasculare. In scopul diagnosticrii corecte a diverselor
afeciuni cardiovasculare se utilizeaz diferite scheme grupnd criterii clinice, microbiologice i
ecocardiografice (criteriile von Reyn, crieriile Duke, criteriile Duke modificate) avnd drept scop
facilitarea diagnosticului i utilizarea acestuia n studii clinice i epidemiologice. Aceste indicaii sunt
cuprinse n diverse ghiduri cele mai utilizate fiind ESC - European Society of Cardiology, ACC American College of Cardiology i AHA - American Heart Association.
Diagnosticul presupune demonstrarea implicrii endocardului, respectiv a dispozitivelor
protetice n cursul unei infecii sistemice. Spectrul clinic al afeciunilor cardiovasculare este extrem de
variabil, de la forme fulminante, cu insuficien cardiac acut, manifestri embolice, distrugere
rapid a valvelor cardiace, la forme fruste, cu evoluie ndelungat, cu prezena sau nu a febrei, cu
3

apariia sau absena manifestrilor imunologice sau embolice. Avnd n vedere complexitatea acestei
patologii i morbi-mortalitatea ridicat, diagnosticul presupune un indice ridicat de suspiciune clinic

Scopul i obiectivele lucrrii:

Scopul lucrrii de doctorat este studiul relaiilor dintre unii ageni infectioi cu celula
eucariot, i cu dispozitive protetice n prezena unor componente serice, n vederea optimizrii
aciunii profilactice i terapeutice a infeciilor asociate patologiei cardiovasculare.

Obiective:
1. Izolarea, identificarea, studiul antibiorezistenei i caracterizarea gradului de virulen a
tulpinilor microbiene izolate din infecii asociate chirurgiei cardiovasculare.
2. Studiul antibiorezistenei tulpinilor bacteriene i influena unor parametri fizico - chimici
asupra acesteia: compoziia mediului de cultur, temperatura de incubare, tipul de cretere - n
suspensie sau aderat la substrat.
3. Studiul formrii i dinamicii biofilmelor pe substraturi inerte, sub influena concentraiilor
diferite de antibiotice
4. Sensibilitatea la antibiotice n prezena unor componente serice ale gazdei, a tulpinilor
aderate la substrat celular i inert, izolate din infecii specifice chirurgiei cardiovsculare.
5. Studiul interaciunilor celulelor bacteriene cu celulele HeLa.

MATERIALE I METODE
1 Metode de izolare, identificare biochimic i evideniere a spectrului de factori de
virulen la agenii etiologici ai infeciilor specifice afeciunilor cardiovasculare
- Recoltarea produselor patologice specifice chirurgiei cardiovasculare (tehnici cuprinse in
manualul laboratorului);
- Examinarea direct a probelor recoltate (frotiu colorat Gram);
- Determinarea ncrcturii microbiene a probelor recoltate;

- Izolarea tulpinilor microbiene din biofilmele dezvoltate pe dispozitivele protetice utilizate n

chirurgia cardiovascular (tehnici cuprinse n manualul laboratorului);
- Identificarea tulpinilor izolate (Sistem Api- Biomerieux; Vitek 2 C);
- Evidenierea factorilor de virulena la tulpinilor izolate din clinic (1) Demonstrarea
capacitii de aderena i invazie a bacteriilor la substratul celular prin Metoda Cravioto adaptat dup
Lazr i colab., 2003; 2) Teste enzimatice de evideniere a prezenei/absenei enzimelor .
2. Testarea sensibilitii la antibiotice i a influenei unor parametri fizico-chimici asupra
acesteia
- Evaluarea in vitro a eficienei unui antibiotic (Metode calitative (Disc- difuzimetric, discului
dublu i E-test) i cantitative (Diluii n mediu lichid sau agar, CMI- Vitek) de determinare a spectrului
de sensibilitate la antibiotice.
3. Testarea aciunii diferitelor concentraii de antibiotice asupra bacteriilor aderate la un
substrat
- Testarea capacitii de aderen la substratul inert - testul producerii de slime;
- Determinarea rezistenei la antibiotice a biofilmului aderat la o suprafa inert;
- Studiul rezistenei la antibiotice a biofilmului microbian n matricea de agar (Model
experimental - Lazar, 2003).
4. Evaluarea sensibilitii la antibiotice a unor tulpini de E.coli n prezena unor
componente serice cu rol protector
Substrat celular: linia celular HeLa;
Antibiotice (pulberi) Oxoid pentru testarea sensibilitii prin metoda microdiluiilor n mediu
lichid i testarea influenei antibioticelor n asociere cu diferite componente serice specifice sau
nespecifice, asupra capacitii tulpinilor de E. coli de a adera la substratul celular i inert;
Fracii serice: lizozim, complement C4, IgG, IgA, IgM, ser imun.
Capacitatea de aderen la substratul celular, reprezentat de celule HeLa, s-a realizat prin
metoda Cravioto, adaptat (Lazr i colab., 2003).
5. Studiul in vitro al interaciunii celulelor bacteriene cu celulele HeLa
- Investigarea calitativ a biofilmelor microbiene prin microscopie (TEM, CSLM, microscopia
cu fluorescen);
- Investigarea efectului diferitelor fracii bacteriene asupra viabilitii celulelor eucariote;
- Studiul influenei diferitelor fracii bacteriene asupra celulelor HeLa;
- Studiul expresiei citokinelor n celule tratate cu diferite fracii microbiene, n diferite condiii
experimentale prin Real Time PCR (RT-PCR).

REZULTATE I DISCUII
Rezultatele prezentate au derivat n urma unui studiu amplu asupra patologiei infecioase i
manifestrii rezistenei la antibiotice, la tulpini izolate din probe recoltate de la pacienii Institutului de
Urgen pentru Boli Cardiovasculare Prof. Dr. C C Iliescu (IUBCV), n perioada mai 2005decembrie 2008. Au fost utilizate date privind testarea sensibilitii la 374 tulpini izolate din infecii
invazive i localizate, din seciile de chirurgie cardiovascular i terapie intensiv (ATI) cu important
clinic i epidemiologic, dintr-un total de 2462 probe pozitive.
Prelevarea de probe biologice s-a realizat, respectndu-se principiile de igien, asepsie,
antisepsie existente n slile de operaie, dar i n seciile de terapie intensiv, inndu-se cont de
legislaia sanitar n vigoare.
Izolarea tulpinilor microbiene s-a realizat din produse patologice foarte diverse In
urmtoarea ordine a frecvenei izolrii: secreia traheal (28,88 %), secreiile de plag (14,44%), urina
(12,50%), snge (11,76%), dispozitive protetice (catetere, tuburi de dren, fragmente de valve,
fragmente din proteze cardiace i vasculare)(8,40%) , alte produse (lichide pericardic, pleural, sput,
exsudat faringian/nazal). Diversitatea probelor analizate, reflect gama larg de infecii localizate i
generalizate n care sunt implicate tulpini aparinnd unei mari diversiti de genuri i specii
bacteriene.
Identificarea tulpinilor bacteriene izolate, realizat cu ajutorul galeriilor microtest API 20E,
API 20NE, API STAPH, API NH i cu sistemul automat Vitek, a permis determinarea apartenenei la
gen i specie a acestora).
Patologia infecioas cardiovascular este variat n ceea ce privete etiologia
infecioas. Ponderea cea mai ridicat au avut-o bacilii Gram negativi aparinnd grupului
Enterobacteriaceae i bacililor Gram negativi non-fermentativi. Se observ ns incidena n cretere
a infeciilor cu stafilococi, S. aureus aflndu-se n topul etiologiei infeciilor de plag, hemoculturilor
i dispozitivelor protetice. Stafilococii coagulazo-negativi sunt frecvent izolai din hemoculturi i
dispozitive protetice avnd ca surs principal de contaminare i infecie consecutiv, tegumentul.
S-a constatat o inciden foarte crescut a infeciilor cu Ps. aeruginosa i Klebsiella
pneumoniae n departamentele de terapie intensiv. Atenia la detalii, anamneza atent, un examen
fizic minuios i cunoaterea microorganismelor responsabile de apariia celor mai frecvente infecii
nosocomiale, conduc la un diagnostic corect. Se remarc asocierea evident dintre microorganismele
oportuniste, statusul imunologic al pacientului i factorii de risc reprezenetai de portaj i prezena
dispozitivelor protetice, care n urma unei perioade de spitalizare prelungite, duc la iniierea i
propagarea infeciilor nosocomiale.

Evidenierea i caracterizarea factorilor de virulena implicai n aderena i progresia

infeciei la tulpinile izolate din clinic a relevat spectre diferite ale factorilor de virulen, n funcie de
apartenena taxonomic a acestor tulpini, i un grad nalt de patogenitate.
Prezena de enzime implicate n invazivitate prin distrugerea integritii tisulare precum
gelatinaze, toxine formatoare de pori (hemolizine, lecitinaze, lipaze) la toate tulpinile analizate poate
explica abilitatea acestora de a invada celulele eucariote, de a evada din fagosomi dup endocitare i
de a se externaliza din celulele infectate, producnd astfel infecii cu atingere sistemic.
Rezultatele testrilor pentru determinarea sensibilitii la antibiotice au relevat c nu exist
antibiotic utilizat n tratamentul clinic cu sensibilitate in vitro de 100%. Cefalosporinele de generaia a
IV-a (FEP, CPO), beta-lactaminele cu inhibitor de betalactamaze (TTC, TZP, CES), carbapenemii
(ERT, IMI, MEM), glicopeptidele (VA, TEC), lincosaminele (LZD) i colimicinele (CO, PB) au
pstrat cea mai bun eficacitate asupra tulpinilor testate, att in vitro, ct i in vivo.
n ceea ce privete prezena markerilor de rezisten pe tipuri de microorganisme s-au constatat
variaii semnificative care conduc spre identificri epidemiologice ale tulpinilor bacteriene, mai ales a
celor nosocomiale. Pentru fiecare patogen, mecanismele de rezisten i tendintele rezistenei
antimicrobiene sunt prezentate mai jos:
La Enterobacteriaceae s-a observat o cretere semnificativ a rezistenei la aminopeniciline,
cefalosporine de generaia I, II, III, fluoroquinolone i aminoglicozide (Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis). Creterea alarmant a numrului tulpinilor productoare de lactamaz (ESBL) se regsete n apariia rezistenei la cefalosporine de generaia a IV-a i la
inhibitori -lactaminici. Rmn nc eficieni n tratament carbapenemii, care sunt dificil de utilizat,
datorit costului ridicat. Utilizarea frecvent a penicilinelor i cefalosporinelor de generaia I i a II-a,
n tratamentele infeciilor cu E. coli a dus la rezistena covritoare la aceste antibiotice, recomandnd
excluderea lor ca opiune de tratament empiric de lung durat. n ultimii ani este evident tendina
creterii rezistenei combinate la cefalosporinele de generaia a III a, fluoroquinolone i
aminoglicozide, cu un procent de peste 20%.
La tulpinile de bacili non-fermentativi (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniicomplex) se constat o cretere intens a rezistenei la peniciline i cefalosporine, precum i la
quinolone (10-50%). Folosind ntregul arsenal antimicrobian, tot mai multe tulpini de Pseudomonas
aeruginosa i aproape 90 % din tulpinile de Acinetobacter baumannii-complex au reuit s anihileze
chiar i efectul carbapenemilor (producere de carbapenemaze, pompe de eflux), singurele antibiotice
rmase eficiente fiind colimicinele. Rezistena dobndit este realizat prin mai multe mecanisme,
care atunci cnd funcioneaz simultan, confer caracterul de multirezisten acestor tulpini.
Infeciile cu MRSA sunt frecvent asociate cu prelungirea duratei spitalizrii, S. aureus, fiind cel
mai comun agent infecios, att n clinicile IUBCV, ct i la nivel mondial. Tulpinile de stafilococi (n
7

special S. aureus), izolate n clinicile de cardiologie, prezint n proporie de peste 50% meticilinorezisten (producere de beta-lactamaz, mediat mec-A). Tot mai des se remarc prezena fenotipului
MLSb (rezisten inductibil la macrolide, lincosamine, streptogramine) i rezisten de nivel nalt la
mupirocin. Glicopeptidele (Vancomicin i Teicoplanin) sunt utilizate pe scar larg n ultimii ani n
tratamentul infeciilor nosocomiale ceea ce a dus, la selecia a dou tulpini de stafilococ -VISA i dou
tulpini de Enterococcus faecium -VRE (rezisten dobandit VanB). Controlul epidemiologic al
tulpinilor MRSA se poate obine prin identificarea prompt i testarea sensibilitii la antibiotice a
izolatului bacterian, asociat cu eliminarea strii de purttor att a pacienilor ct i a personalului
medical. Astfel se nltur substanial riscul apariiei complicaiilor infecioase i se previne
rspndirea agentului infecios, cunoscut fiind c profilaxia este mult mai ieftin i mai uor de aplicat
dect terapia.
Pentru S. pneumoniae ponderea tulpinilor rezistente la penicilin este de peste 50%, iar a celor
rezistente la MLS (macrolide, lincosamide, streptogramine) de 30%. S-a constatat c rezistena
combinat la cele dou clase de antibiotice atinge un nivel cuprins ntre 10 i 20 %.
Diversitatea originii i etiologiei infeciilor nosocomiale i asocierea acestora cu o gam
foarte larg de localizri, necesit realizarea unui diagnostic microbiologic amnunit care s includ
screening-ul mecanismelor de rezisten la antibiotice (natural i dobndit) i utilitatea folosirii
antibiotipului ca marker epidemiologic.
Influena compoziiei mediului de cultur asupr rezultatelor testrilor sensibilitii la
antibiotice a fost observat nu numai n cazul bacteriilor planctonice, ci i al celor aderate, aa cum
demonstreaz rezultatele obinute cu ajutorul modelului experimental de devoltare a biofilmelor n
matrice de agar (Lazr 2003). Mediul de cultivare lichid influeneaz semnificativ sensibilitatea la
cefalosporinele de generatia a III-a (CTX), valorile CMI obinute variind foarte mult n cadrul
aceleiai tulpini, fapt ce subliniaz necesitatea standardizrii i armonizrii la nivel naional a
tehnicilor de realizare a antibiogramei cantitative, pentru obinerea de rezultate reproductibile.
Temperatura de incubare a influenat variabil sensibilitatea la cefotaxim (CTX) a tulpinilor
testate. Este de remarcat faptul c la temperatura de +4o C valorile CMI au fost n general mai mici
dect cele obinute prin incubare la temperatura de 28 o C i, respectiv, 37oC, ceea ce demonstreaz
faptul c scderea temperaturii conduce la creterea sensibilitii tulpinilor microbiene la antibiotice,
probabil datorit modificrii expresiei anumitor gene n condiiile limitative de stres termic, mimate n
aceste condiii experimentale.
Datele experimentale, obinute prin intermediul model experimental de cretere n matricea de
agar, au artat faptul c dezvoltarea bacteriilor n biofilm conduce la o cretere a rezistenei la anumite
antibiotice, demonstrat prin reducerea diametrului zonelor de inhibiie a creterii, aa cum se poate
observa n cazul cefotaximului cefalosporine de generaia a III-a (CTX, CRO) i imipenem. Dei
8

creterea bacteriilor n biofilm determin scderea sensibilitii la unele antibiotice, arat creterea
sensibilitii fa de altele cum ar fi cefoxitinul (FOX -cefalosporina de generaia a II-a). Acidul
nalidixic (NA), nu difuzeaz n biofilm, ceea ce explic scderea sensibilitii bacteriilor sesile,
comparativ cu a celor planctonice.
Modalitatea colonizrii in vitro a diferitelor materiale protetice este determinat de structura
suprafeelor i de compoziia chimic a materialelor, dar i de speciile colonizatoare; grosimea
biofilmelor a relevat o colonizare neuniform, influenat de gradul de rugozitate al suprafetelor, ceea
ce semnaleaz importana selectarii compoziiei chimice a dispozitivelor protetice n vederea
prevenirii colonizrii bacteriene Modelul experimental utilizat a relevat c bacteriile incluse n
biofilme i pstreaz viabilitatea n prezena concentraiilor de antibiotic chiar superioare CMB i
ader mai eficient la cateterul venos fa de cel urinar. Cel mai eficient antibiotic, care a inhibat
dezvoltarea biofilmelor att la concetraii mari, ct i la concentraii subinhibitorii a fost
ciprofloxacinul, quinolona care probabil determin inhibarea biofilmelor datorit interferenei cu
sistemele de semnalizare intercelular, eseniale n iniierea i mai ales, maturarea biofilmului
microbian. n cazul biofilmelor de Ps. aeruginosa, pe lng ciprofloxacin, cel mai eficient antibiotic
fa de celulele crescute n biofilme a fost gentamicina. Efectul inhibitor al acestor antibiotice asupra
capacitaii de aderen a tulpinilor a fost demonstrat i de imaginile de microscopie electronic, ce au
artat reducerea numarului de celule bacteriene n prezena antibioticului.
Antibioticul exercit o presiune selectiv asupra celulelor incluse n biofilm, mpiedicnd
atingerea unor densiti celulare crescute care s grbeasc maturarea i respectiv dezintegrarea
parial a biofilmului, cu diseminare la distan a agentului patogen.
Aprecierea cantitativ i evaluarea dinamicii temporale a gradului de formare a biofilmelor
bacteriene pe suprafa de plastic sub influena concentraiei diferite a unor antibiotice, a relevat o
evoluie linear o biofilmelor de Ps. aeruginosa (numr conatant de celule, relativ stabile n timp).
Biofilmele dezvoltate n absena antibioticului prezint un numar maxim de celule la 48h, dup care
acesta scade brusc, fapt ce demonstreaz maturarea biofilmului cu desprinderea

(diseminarea)

celulelor.
Biofilmele de S. aureus au o dinamic temporal variabil, cu intervale diferite de maturare
n funcie de tulpina testat (48, 72 sau 96 de ore) cu excepia creterii n prezena gentamicinei, unde
apare o evoluie relativ constant n timp, indiferent de concentraia antibioticului.
Administrarea antibioticelor, indiferent de concentraie, nu este eficient fa de celulele
bacteriene aderate i incluse n biofilme. Infecia devine persistent i necesit prelungirea perioadei
de tratament, cu riscul dobndirii rezistenei, a toxicittii, a disconfortului clinic i creterea costurilor
spitalizrii.

Comportamentul bacteriilor sesile fiind diferit de cel al celulelor planctonice, antibiograma

clasic nu reprezint un model de predicie a spectrului de antibiorezisten a biofilmelor. De aceea se
impune necesitatea introducerii unei metode standardizate de testare a sensibilitii tulpinilor
bacteriene izolate din infecii produse de bacterii sesile. Creterea dozelor de antibiotice (mult
superioare CMB) ramne ineficient pentru tratamentul infeciilor datorate creterii bacteriilor n
biofilme, o posibil alternativ fiind utilizarea asocierii optime a dou sau mai multe antibiotice.
Studiile comparative, privind sensibilitatea la antibiotice a celulelor bacteriene incluse n
biofilme experimentale monospecifice, au evideniat c uneori, tulpinile microbiene i-au modificat
profilul de rezisten la antibiotice, modificrile variind foarte mult, n funcie de sursa de izolare a
tulpini.
Tulpinile de S. aureus izolate din secreii de plag crescute n biofilm sufer conversia de la S
la R la toate antibioticele -lactamice mai puin la rifampicin, i tetraciclin, in vitro, s-au dovedit
eficiente fa de tulpinile crescute n biofilme.
Rezultatele obinute sugereaz faptul c administrarea antibioticelor, indiferent de concentraie, nu
sunt eficiente pe celulele bacteriene aderate i incluse n biofilme, infecia este persistent i necesit
prelungirea tratamentului, cu riscul dobndirii rezistenei la antibiotice, a toxicittii, disconfortului
clinic, creterea costurilor spitalizrii.
S-a ncercat n acest sens gsirea unui model experimental in vitro de evideniere a unor
posibile corelaii ntre aspectele de antibiosensibilitate bacterian i componente serice ale
gazdei (nespecifice tip lizozim, C4 i specifice tip IgG, IgA, IgM), ser uman, la tulpini izolate din
infecii specifice chirurgiei cardiovsculare, aderate la substrat celular i inert. n acest context s-a
studiat influena antibioticelor, n concentraii subinihibitorii (CsI), pe de o parte, i a diferitelor
componente serice ale gazdei (tip lizozim, C4, IgG, IgA, IgM, ser imun obinut de la animale
imunizate cu tulpini de E. coli), pe de alt parte, asupra capacitii tulpinilor de E. coli de a adera la
substratul celular i inert. Utilizrarea modelului experimental a evideniat aspecte care ar putea
contribui la intelegerea mai buna a modului cum cresteriea bacterian n biofilm se opune
mecanismelor de aprare ale gazdei.
Concentraiile subinhibitorii (CsI) de antibiotic acioneaz asupra tulpinilor sensibile,
determinn trecerea fenotipului de la categoria S la R.
Serul imun, ca i asocierile dintre componentele serice nespecifice (lizozim, Complement) i
specifice (imunoglobuline) au inhibiat capacitatea de aderen a tulpinii de E. coli sensibil la
antibiotice (ATCC 25922).
Ceftazidimul n concentraie subinhibitorie (CsI) a stimulat sinteza adezinelor i consecutiv
aderena la substratul celular, a tulpinii de E. coli, productoare de -lactamaze de spectru larg.

10

Asocierea CTX n CsI cu unele componente serice, a inhibat capacitatea de aderen la

substratul celular, n timp ce Acidul nalidixic (NA) a avut efect de stimulare a aderenei n i fr
prezena opsoninelor.
Asocierea antibioticelor cu componente serice (lizozim, imunoglobuline, Complement, ser
total) a determinat o scdere sever a capacitii de aderen la substratul celular, datorat probabil
aciunii lizozimului asupra peretelui celular, care modific expresia moleculelor de suprafa, inclusiv
a epitopilor recunoscui de moleculele de Ig i de complement cu rol de opsonine.
Att antibioticele n CsI, ct i asocierile de componente serice nu au crescut capacitatea
celulelor bacteriene de a secreta polizaharide extraparietale (slime test), aspect care sugereaz c
secreia polizaharidului este unul dintre mecanismele de adaptare comportamental la diferii factori
de stres (antibiotice, molecule antibacteriene).
n prezena componentelor serice, a fost observat creterea capacitii de aderen, ceea ce
demonstreaz faptul c rezultatele testelor de sensibilitate la antibiotice obinute in vitro, pe celule n
suspensie, nu pot fi extrapolate in vivo, datorit apariiei fenomenului de aderen bacterian la
substratul celular, aderena fiind urmat de modificarea comportamentului celulelor bacteriene n ce
privete sensibilitatea la substanele antimicrobiene.
Celulele bacteriene, consecutiv aderenei, induc efecte multiple n celulele HeLa. Efectele
metabolice constau n sinteza citokinelor, modificarea citoscheletului i apoptoz. n acest context s-a
urmarit evidenierea localizrii intracelulare a unor tulpini de S. aureus i Ps. aeruginosa n celule
HeLa i investigarea efectului diferitelor fracii de cultur ale S. aureus asupra proliferrii celulare,
ciclului celular (analiza prin citometrie n flux) i inducerea apoptozei celulei gazd (kitul Anexin VFITC-PI) precum i inducerea expresiei citokinelor (real-time PCR).
A fost demonstrat faptul c bacterii considerate pn nu de mult prototipuri ale infeciilor
extracelulare, cum ar fi Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa sunt capabile s se
internalizeze i s se multiplice n celule nefagocitare, producnd reorganizarea scheletului
citoplasmatic care favorizeaza internalizarea asemntor fagocitelor (macrofage, celule dendritice).
Flosind metode cantitative i calitative de evideniere a capacitii de aderen i invazie s-a
observat valori foarte ridicate ale aderenei pentru tulpinile ambelor specii bacteriene.Valorile invaziei
sunt diferite n funcie de tulpin, ns, semnificative, demonstrnd capacitatea acestor bacterii de a
invada, consecutiv aderenei, celulele organismului gazd. Examinarea nivelului de fluorescen a
celulelor HeLa infectate cu S. aureus, evideniaz schimbri la nivelul membranei celulare cu
expunerea unor regiuni mascate sau criptice, aspect care demonstreaz posibila existena a unui proces
de endocitoz. Rezultatele obinute sunt, n concordan cu date din literatura de specialitate, care au
demonstrat supravieuirea intracelular a stafilococilor n celulele mamaliene nefagocitare,
demonstrnd necesitatea crerii unor noi modele pentru studiul stadiilor infeciei, inclusiv cel
11

intracelular. S. aureus, contribuie fr dubiu, la meninerea rezervorului de infecie n organismul

gazd, mai ales n prezena unei presiuni selective exercitate de componentele serice ale gazdei i
amplificate de administrarea excesiv de antibiotice, n special a celor active fa de bacteriile
extracelulare. n acest mod se urmrete gsiriea, de strategii eficiente de prevenire a infeciilor
persistente cu S. aureus.
Evaluarea cineticii celulare prin citometrie de flux a artat c n prezena corpilor bacterieni
are loc creterea fazei S n celulele HeLa i scderea pronunat a fazelor G2/M.
Cu referire la inducerea expresiei citokinelor (cuantificat prin real-time PCR), rezultatele au
artat c expresia TNF, IL-1b, IL-6 i IL-8) n celulele HeLa este crescut de fraciile bacteriene, n
principal n prezena fraciilor bacteriene solubile, care au manifestat i un efect pro-apoptotic. Aceste
date sugereaz c moleculele bacteriene solubile, induc schimbri n celula eucariot, care fac posibil
cronicizarea infeciei cu S. aureus i localizarea n compartimentul intracelular.
Aceste ultime rezultate deschid noi perspective de studiu pentru elucidarea mecanismelor de
semnalizare intracelular i a rspunsului celulei gazd implicat n aceste mecanisme, precum i al
rolului componentelor bacteriene specifice n activarea celulelor eucariote.

12