27.

Diagnosticul în bolile infecţioase 

27. 1. Recomandări cu privire la diagnosticul integrat, în
bolile infecţioase
Cu toate că în primii ani de studiu este abordată în mod special partea microbiologică (bacteriologică,
virusologică, parazitologică, micologică) a diagnosticului, este strict necesar să menţionăm că examenul
clinic îşi păstrează valoarea în totalitate.

Orice investigaţie de laborator este precedată de studierea elementelor clinice, ulterior discuţiei cu
pacientul sau aparţinătorii acestuia (anamneză). Fără un examen clinic aprofundat şi fără evaluarea zilnică
a evoluţiei din punct de vedere clinic şi paraclinic a bolii, nici laboratorul de microbiologie modern nu
poate fi utilizat la nivelul posibilităţilor actuale. Dorim să subliniem faptul că în scopul diagnosticării bolilor
infecţioase au fost puse la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise şi obiective,
dar utilitatea lor este maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi epidemiologic.
Aşa cum am mai menţionat şi anterior, colaborarea şi stabilirea unei echipe interdisciplinare reprezintă
un deziderat esenţial, ţinta finală fiind reprezentată de vindecarea pacientului şi prevenirea apariţiei unor
cazuri secundare.
Investigarea şi documentarea bolilor infecţioase ilustrează prin excelenţă principiul „trepiedului
diagnostic”, datele de anamneză servind la orientarea examenului clinic obiectiv, care la rândul său
direcţionează investigaţiile paraclinice de laborator, imagistice ş.a. astfel încât  tabloul unitar necesar
demersului diagnostic poate fi realizat prin coroborarea datelor extrase prin toate cele trei metode.
În diagnosticul bolilor infecţioase trebuie respectate următoarele reguli:
1. Culegerea datelor reprezintă de multe ori o urgenţă; trebuie realizată cât mai curând posibil. Toate
datele necesare diagnosticării unei boli infecţioase (clinice, paraclinice şi de laborator) trebuie obţinute cât
mai rapid, chiar în prima oră după luarea în evidenţă a bolnavului. Anamneza şi „istoricul bolii” trebuie să
fie realizate riguros, de fiecare dată (chiar şi atunci, sau mai ales atunci când situaţia pare să fie
asemănătoare cu o situaţie „cunoscută” - interpretarea datelor sub formă de „şablon” reprezintă un
mare risc!).
Spre exemplu, succesul sau insuccesul terapeutic în meningitele sau în endocarditele bacteriene depinde
de fiecare oră, câştigată sau pierdută. În cazul apariţiei unui caz de holeră, lipsa obţinerii informaţiilor
necesare (anamnestice), lipsa orientării către ipoteza diagnostică, lipsa recoltării, examinării
coprocitogramei (element esenţial = lipsa leucocitelor) şi însămânţării produsului patologic pe apă
peptonată alcalină vor putea crea probleme atât pentru pacientul respectiv (evoluţia putând fi severă în
lipsa instituirii rapide a măsurilor de re-echilibrare hidro-electrolitică) cât şi din punct de vedere al
diseminării infecţiei (1) (de ex. în cazul în care această situaţie ar apărea în Delta Dunării, în condiţii
igienico-sanitare precare).
2. Datele obţinute în vederea diagnosticului trebuie privite ca un tot unitar; diagnosticul de boală
infecţioasă trebuie să rezulte din totalitatea datelor clinice şi a celor de laborator considerate şi
interpretate unitar. Nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului. Metodele
de laborator, luate separat, nu permit punerea diagnosticului, dar executarea corectă a manoperelor de
laborator reprezintă o condiţie sine qua non pentru un diagnostic corect şi util.
Este deosebit de important ca, în momentul în care luăm în calcul un diagnostic din sfera bolilor
infecţioase, să nu excludem şi alte etiologii posibile. De exemplu, o pacientă în vârstă de 51 de ani se
prezintă pentru apariţia recentă a unor leziuni eritematoase (Figura nr. 1).
Date din anameză (tratament cu etoricoxib) corelate cu lipsa decelării altor leziuni similare la examenul
clinic obiectiv, au condus către diagnosticul de eritem fix – reacţie adversă rară la administrarea de
etoricoxib (2). Acest caz ilustrează ponderea datelor anamnestice în formularea unei ipoteze diagnostice.
3. Este indispensabil să se stabilească diagnosticul etiologic în toate maladiile infecţioase, însoţit
de testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene pentru tulpina izolată, având în vedere
utilitatea şi importanţa tratamentului antimicrobian, precum şi actualitatea problematicii referitoare la
rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice (3). Anamneza trebuie realizată cu rigurozitate; aprecierea
statusului imunologic poate avea o contribuţie esenţială; efectuarea unui examen clinic minuţios
constituie o altă condiţie a unui diagnostic complet. Pentru medic (dar şi pentru pacient) contează toate
datele obţinute prin examenul obiectiv; nici un element nu trebuie neglijat:
- faciesul bolnavului (facies = aspect caracteristic, corelat cu boala de care suferă o anumită persoană),
postura şi unele aspecte particulare;
- febra/curba termică (cu toate caracteristicile ei); trebuie folosită termometrizarea şi nu „senzaţia de
febră” (vezi și subcapitolul 24.1.);
- modificările apărute la nivelul mucoaselor şi la nivel tegumentar;
- semnele de insuficienţă respiratorie acută;
- semnele care relevă un dezechilibru hidro-electrolitic şi acido-bazic;
- modificările neurologice şi psihice etc.
În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm urmatoarele aspecte:
 magnitudinea febrei,
 frecvenţa şi durata episoadelor febrile,
 recurenţa acestor episoade (cu/fără periodicitate),
 relaţia dintre puls şi temperatură şi patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.
Administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5), dar cu toate
acestea, în cazurile tipice, este important de decelat prezenţa unor pattern-uri febrile aşa-zise „clasice”. De
exemplu, febra terţiară se suprapune peste ciclul de reproducere asexuată al Plasmodium falciparum, P.
vivax, P. ovale pe când febra cuaternară este înalt sugestivă pentru P. malariae(6). Totodată, febra
continuă poate fi întâlnită în patologiile de etiologie rickettsiană iar un pattern bifazic poate semnala
febra Dengue (5).
4. Folosirea corectă a datelor care pot fi oferite de către laborator constituie un alt aspect foarte
important. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analize să solicite, ce produse se recoltează de
la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le expedieze / pregătească pentru expediere către laborator.
Sunt de menţionat şi reţinut următoarele reguli:
- produsele se recoltează înainte de administrarea tratamentului antimicrobian;
- se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru examinat;
- produsul trimis trebuie să fie reprezentativ pentru boala respectivă (de exemplu, spută şi nu salivă în
infecţiile respiratorii inferioare);
- produsul trebuie recoltat în perioada în care probabilitatea decelării agentului etiopatogen este maximă
(de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe cât posibil, în timpul unui episod febril);
- produsul examinat nu trebuie contaminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al transportului
(recoltare şi transport în condiţii aseptice) (7);
- expedierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare produs în parte
(trebuie să existe recomandări specifice, în detaliu, la îndemâna medicilor);
- se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator;
- se urmăreşte, în timp, apariţia rezultatelor şi „se ţine legătura” cu colegii din laborator.
Însă, pentru ca datele de laborator să fie corecte este strict necesară respectarea unei anumite conduite în
laborator, utilizarea judicioasă a diferitelor aparate şi echipamente de laborator şi implementarea
controlului de calitate (intern şi extern) (a se vedea anexa nr. 5).
5. Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între clinician şi specialistul de laborator. Este
necesară o informare (care să includă aspecte rezultate în urma anamnezei şi elemente clinice) a medicului
de laborator făcută de către clinician (direct sau cel puţin prin telefon) pentru orientarea cercetărilor în
laborator şi pentru alegerea celor mai bune metode de identificare a agentului etiologic. În acelaşi timp,
laboratorul informează clinicianul pe parcurs în legătură cu datele preliminare obţinute.
În cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul microbiologic
(bacteriologic şi / sau imunologic), care va fi prezentat în continuare. Pe scurt vor mai fi notate câteva alte
date referitoare (examene paraclinice, utile în diagnosticul bolilor infecţioase).
Diagnosticul citologic: constă în punerea în evidenţă a unor aspecte celulare caracteristice, utilizând un
material prelevat de la bolnav (ex. din leziuni tegumentare sau amprente de la nivelul mucoaselor). Spre
exemplu, citodiagnosticul revărsatelor pleurale şi al lichidului cefalorahidian poate aduce date preţioase
pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii şi respectiv a unei meningite.
Diagnosticul histologic: prin biopsii (recoltate prin tehnică chirurgicală) sau prin puncţii-biopsii ale
diferitelor organe (ficat, rinichi, plămân, ganglioni limfatici, fragmente vasculare, mucoasă digestivă sau
respiratorie) se pun în evidenţă modificări structurale caracteristice, determinate de acţiunea agentului
patogen.
Metodele de laborator nespecifice: în diagnosticul bolilor infecţioase sunt utile informaţiile obţinute prin
analiza valorii hemogramei, leucogramei (cu modificări destul de caracteristice în anumite situaţii), vitezei
de sedimentare a hematiilor, testelor de disproteinemie, testelor enzimatice, proteinei C reactive (beta-
globulină care nu se găseşte în serul normal, apărând numai în afecţiuni inflamatorii, neoplasme şi în
procese necrotice), altor teste de inflamaţie (reactanţi de fază acută) etc.
Alte metode paraclinice: examenul radiologic poate furniza date de valoare pentru bolile infecţioase cu
participare pulmonară (pneumonii virale, febră Q, pneumonie pneumococică etc). Se mai pot folosi
rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia, diferite determinări biochimice, examene
oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia computerizată, rezonanţa magnetică nucleară.

27. 2. Schema generală a diagnosticului microbiologic

Diagnosticul de laborator în microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic sau micologic (direct), un
diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante menţionate.
Aşa cum am menţionat, în continuare dorim să prezentăm etapele principale ale diagnosticului
microbiologic (bacteriologic, micologic, imunologic), structură pe care urmează să discutăm, concret,
diferite situaţii în cadrul capitolelor care urmează.
În celălalt volum, atunci când vom discuta recoltarea şi transportul produselor, vom sintetiza pentru unele
dintre aceste produse situaţiile posibile în momentul în care nu avem „în faţă” un anumit gen sau o
anumită specie ci produsul din care vom izola agentul etiologic, iniţial presupus.
27. 2. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic /
micologic
Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, şi anume:

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului
să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al
tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, prelevând un anumit produs
patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv, de exemplu urină în cazul unei infecţii
urinare, materii fecale în cazul dizenteriei, spută în cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame în cazul
unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6).
2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului patologic reprezintă de multe ori o etapă
esenţială, care poate orienta paşii următori.
Pentru examenul microscopic se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi
transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa şi respectiv Gram. Este
preferabil să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu (de rezervă), în special în cazul în care produsul
patologic este „preţios” (LCR, produs recoltat prin puncţie-biopsie etc). în cazul suspicionării unei infecţii
mycobacteriene este necesară realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se
examinează la microscopul optic, iniţial cu obiectivul 40× pentru o analiză mai generală, pentru stabilirea
câmpului microscopic sau a zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se notează prezenţa
diferitelor celule (eventual modificate faţă de normal, „burate” de microorganisme), prezenţa celulelor
inflamatorii (dovada reactivităţii organismului, ex. leucocite, surprinzând eventual fenomenul de
fagocitoză), precum şi eventuala prezenţă a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii),
care va fi interpretată cu precauţie, în contextul dat. Chiar dacă examenul microscopic este de cele mai
multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dată, cu rigurozitate, în anumite situaţii putând
fi foarte important şi foarte util.
Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă nu se
realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogramă,
un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă, căutându-se în special prezenţa leucocitelor (dar şi a
unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la funcţionalitatea tractului digestiv). În cazul
suspicionării unei infecţii urinare, se va realiza un sediment urinar (după centrifugarea urinei), care se va
examina între lamă şi lamelă în vederea aprecierii numărului de leucocite pe câmp microscopic, în cazul în
care acestea există, în vederea aprecierii prezenţei unor cilindri leucocitari precum şi a altor celule normale
sau patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile în vederea unui
diagnostic corect şi util pentru pacient.
În cazul suspicionării unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (ex. preparatul montat în
soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii „negative” (tuş de India, nigrozină), precum şi
frotiurile colorate May-Grünwald-Giemsa sau Gram.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie (mediile şi

condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe care trebuie să-l izolăm;
spre ex. în cazul în care infecţia este produsă de microorganisme strict anaerobe, în lipsa condiţiilor
anaerobe de cultivare este imposibilă izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile
potrivite şi o temperatură mai mică decât cea utilizată în cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza în aşa fel
încât să se poată obţine colonii izolate (tehnica „însămânţării în poligon”) şi respectiv o cultură pură, care
se va identifica.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolată, frotiu care se va fixa şi colora Gram sau
Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenţia numai
microorganisme cu formă şi tinctorialitate similară (în cazul germenilor cu polimorfism important,
ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite (8), de la aspecte cocobacilare până la
forme filamentoase). În cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai
mari.
b) Caractere de cultură: se vor examina coloniile izolate apărute pe mediile de cultură solide şi care pot fi
de tip S pentru majoritatea germenilor studiaţi inclusiv pentru levuri, de tip R în cazul Corynebacterium
diphteriae, Mycobacterium tuberculosis şi Bacillus anthracis, de tip M în cazul bacteriilor capsulate, de
exemplu Klebsiella pneumoniae şi respectiv un aspect pufos în cazul mucegaiurilor(detalii privind
aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate în capitolele dedicate fiecărui gen în parte).
c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbiană la alta şi pot fi foarte utile
spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în practică a „mediilor multi-test”
permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). În cazul fungilor
sunt utilizate auxanograma sau zimograma.
d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazându-ne pe structura şi antigenicitatea
microorganismelor şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscuţi pentru a
identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacţii de aglutinare directă, pe lamă, se
pot identifica antigenele şi respectiv speciile şi tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii
de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru
detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida
albicans, Aspergillus spp.) etc.
e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite
substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă de Staphylococcus aureus) sau infecţia
experimentală a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie
după inocularea sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută există pneumococi, animalul va muri în
24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o „cultură pură” de Streptococcus pneumoniae).
f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);
g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi
anexa nr. 7).

5. Antibiograma şi respectiv antifungigrama (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice

antibacteriene şi antifungice, în vederea stabilirii tratamentului) se realizează de obicei prin metode
difuzimetrice. În cazul unor infecţii grave, antibiograma difuzimetrică trebuie să fie completată de
determinarea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) şi respectiv bactericide (CMB). În infecţii grave, cu
potenţial fatal, poate fi necesară determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioticul utilizat, respectiv
stabilirea nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă (NEB) (vezi şi capitolul 7).
27. 2. 2. Diagnosticul de laborator imunologic poate fi
serologic şi / sau imunobiologic.
27. 2. 2. 1. În cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezenţa (sau se va dovedi
absenţa) anticorpilor, în serul pacientului investigat, utilizând antigene cunoscute. În diagnosticul serologic
ne bazăm pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp şi utilizând diferite tehnici trebuie să putem
răspunde la minim trei întrebări esenţiale, şi anume:
- există anticorpi în serul pacientului investigat?
- care este titrul anticorpilor?
- cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru; în acest sens se vor realiza minim două determinări
diferite la un interval de 7-10 zile; această analiză ne va permite să diferenţiem situaţia unei afecţiuni acute
(titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, în mod clasic de 4 ori), de situaţia în care
pacientul este deja în convalescenţă (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai scăzut) sau de
situaţia unui pacient cu o afecţiune cronică (titrul anticorpilor va fi asemănător sau foarte apropiat la cele
două determinări succesive). În vederea identificării unei infecţii acute, o variantă posibilă în majoritatea
situaţiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM.
27. 2. 2. 2. În cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea
pacientului faţă de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacţia la tuberculină (PPD, preparat proteic
purificat) (9) sau la candidină (10) reprezintă exemple clasice, în acest sens. Tehnica intradermoreacţiei
este folosită în mai multe scopuri şi trebuie să avem în vedere că în funcţie de scopul urmărit şi respectiv
în funcţie de antigenul inoculat (şi de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi
anexa nr. 3).
Considerăm că pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt
foarte utile, merită să fie înţelese şi aplicate corespunzător.
Pentru cei care se dedică microbiologiei sau bolilor infecţioase, aceste noţiuni reprezintă o bază
obligatorie, care poate fi completată utilizând pe de o parte diferitele tratate medicale în domeniu dar şi
experienţa personală dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi practic.

28. Prezentare generală a principalelor microorganisme

studiate; necesitatea studierii microbiologiei (MI Popa)
Lumea microbiană este alcătuită dintr-un mare număr de ordine, familii, genuri, specii, subspecii, tipuri,
subtipuri şi tulpini microbiene a căror prezentare face subiectul unor importante tratate în domeniu. În
lucrarea de faţă vor fi incluse informaţiile considerate esenţiale şi care sunt organizate utilizând un stil, pe
care îl considerăm folositor.
O prezentare exhaustivă, a tuturor amănuntelor, ar putea conduce la neglijarea aspectelor care chiar nu
trebuie să fie uitate, indiferent de specialitatea în care ne desfăşurăm activitatea. Considerăm că materialul
redactat este util nu numai în scopul pregătirii unui examen (care nu ar trebui în nici un caz să fie
considerat un scop în sine) ci este (ar trebui să fie) util reţinerii unor noţiuni şi principii microbiologice
care pot permite ulterior (indiferent de specialitatea aleasă) o abordare corectă, ştiinţifică a procesului
infecţios.
Microbiologia medicală reprezintă o specialitate care poate asigura (în condiţiile în care colaborarea între
clinică şi laborator funcţionează) date foarte precise, oferind suportul stabilirii unor atitudini, uneori
decisive pentru evoluţia ulterioară a pacientului.
În acest sens se pot da numeroase exemple, dar ne vom opri asupra a trei dintre acestea.
În cazul în care un pacient se prezintă la medic şi afirmă că are o infecţie urinară, medicul va putea, prin
efectuarea în mod corect a anamnezei (ex. discuţia cu pacientul respectiv) şi a examenului clinic, să
realizeze un prim pas către diagnostic şi stabilirea tratamenului. Însă certitudinea diagnosticului şi
stabilirea tratamentului corect vor rezulta numai prin examenul de laborator.
Într-o suspiciune de infecţie urinară, urocultura cantitativă trebuie precedată de examenul microscopic al
sedimentului urinar care necesită o dotare minimă (eprubete, centrifugă fără pretenţii, lame, lamele,
microscop optic nesofisticat şi mai ales, dorinţa medicului de a face cât mai mult şi cât mai bine pentru
pacienţii săi). Urina recoltată corect (adică aşa cum se cunoaşte încă din facultate) trebuie examinată
macroscopic, centrifugată iar sedimentul urinar trebuie examinat microscopic. În circa 20 de minute (sau
mai puţin) se va putea observa eventuala prezenţă a leucocitelor în sediment, amănunt care va permite (în
contextul clinic respectiv) aprecierea corespunzătoare a situaţiei şi adoptarea atitudinii celei mai potrivite.
Utilizarea corectă a datelor de laborator va permite nu numai o diminuare a risipei de medii de cultură şi
reactivi (nu în ultimul rând a timpului celui / celor care procesează probele) ci şi o posibilă direcţionare
spre un alt diagnostic decât cel al unei eventuale infecţii urinare, interpretată în mod mecanic sau la
indicaţia / solicitarea pacientului. Un studiu pe care nu l-am publicat a arătat că într-unul dintre spitalele
din Bucureşti, din peste 10.000 de uroculturi efectuate, s-au pozitivat mai puţin de 20%; examinarea
sedimentului urinar ar fi putut contribui la selectarea situaţiilor în care urocultura „merita” să fie făcută.

În cazul prezenţei unor dureri de cap intense (cefalee), a apariţiei fotofobiei, vărsăturilor fără efort, poziţiei
caracteristice (antalgice) se ridică ipoteza unei meningite a cărei etiologii nu se poate preciza fără
diagnosticul de laborator. Acest diagnostic va permite diferenţierea unor meningite în funcţie de cauză
[există meningite neinfecţioase şi meningite infecţioase (virale, bacteriene, parazitare sau fungice), iar
examenul biochimic la LCR împreună cu diagnosticul de laborator microbiologic vor putea arăta care este
etiologia]. Acest lucru este de maximă importanţă atât pentru evoluţia ulterioară, cât şi pentru
prognosticul pacientului implicat deoarece este bine cunoscut faptul că în cazul meningitei există şi
posibilitatea unei evoluţii nefavorabile, cu persistenţa unor sechele sau chiar apariţia decesului. În cazul
unei meningite (inclusiv a unei meningite meningococice), recoltarea şi transportul lichidului cefalo-
rahidian este esenţială. Este de preferat ca medicul să ştie care sunt manevrele necesare pentru a procesa
produsul patologic "la patul bolnavului". Realizarea şi examinarea corectă a frotiurilor va permite nu
numai ca în maxim 20 minute să se pună diagnosticul de meningită meningococică (prezenţa leucocitelor
şi a cocilor Gram-negativi intra şi extra-leucocitari) dar şi să se instituie tratamentul (de ex. cu penicilină).
În cazul în care pacientul prezintă febră, tuse şi expectoraţie nu este recomandată administrarea unor
antibiotice doar pe baza existenţei acestor semne. Administrarea unui antibiotic cu spectru larg (ex.
tetraciclină) ar putea crea probleme suplimentare. Dacă dorim să procedăm corect, după anamneză
trebuie să urmeze examenul clinic complet, revenind cu minuţiozitate asupra examinării semnelor şi
simptomelor în relaţie cu aparatul respirator. Dintre examenele paraclinice se realizează de obicei
radiografia cardio-toraco-pulmonară. Alte examene de laborator (aşa cum am menţionat în capitolul
precedent) sunt necesare şi trebuie efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corectă şi
transportul sputei reprezintă elementul esenţial. În laborator sputa va fi prelucrată, vom realiza cel puţin
trei frotiuri pe care le fixăm şi colorăm cu AM / Giemsa, Gram şi Ziehl-Neelsen. Din momentul recoltării
produsului patologic şi până la obţinerea primelor informaţii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai
mult de 20-30 minute. În cazul în care nu parcurgem aceste etape şi de ex. administrăm direct tetraciclină,
evoluţia pacientului ar putea fi nefavorabilă, chiar şi către deces, iar frotiurile realizate şi examinate post-
mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea demonstra prezenţa de hife şi levuri,
semnificând o infecţie fungică. Continuând cu etapa de identificare am putea stabili, de ex., că a fost vorba
de o pneumonie provocată de Candida albicans. Decesul a fost precipitat de utilizarea iraţională a
tetraciclinei, medicament care distrugând flora de asociaţie a permis multiplicarea „în voie” a fungului
respectiv. Dacă am fi examinat sputa recoltată de la bolnav am fi putut detecta prezenţa elementelor
fungice şi am fi ales medicaţia corespunzătoare.
Bacteriile studiate pot fi grupate după mai multe criterii, dar o variantă utilă este cea în care avem în
vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de diferiţi coloranţi.
Un prim grup important este cel care include cocii cu importanţă medicală, Gram-pozitivi (stafilococi,
streptococi, pneumococi etc) şi respectiv Gram-negativi (meningococi, gonococi etc).
Între bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate drept coci sau bacili
se află parvobacteriile, cocobacilii Gram-negativi (H. influenzae, B. pertussis, Brucella spp. etc).
Bacilii Gram-pozitivi care vor fi incluşi în prezentările din acest manual se pot grupa în bacili nesporulaţi
(Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) şi respectiv bacili Gram-pozitivi sporulaţi (Bacillus anthracis,
Clostridium spp.). Totuşi, nu trebuie să uităm că există şi alţi bacili Gram-pozitivi.
Bacilii Gram-negativi studiaţi fie aparţin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor (E. coli, Salmonella
spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. etc),  fie sunt incluşi în genuri separate
precum V. cholerae din genul Vibrio sau Ps. aeruginosa din genul Pseudomonas.
Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate; uneori nu se
colorează şi apar sub aspectul unor zone necolorate, „fantome” bacteriene) prin metoda Gram, dar în mod
caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. O adaptare a tehnicii Ziehl-Neelsen este medoda de
colorare Kinyoun. Specia principală studiată este M. tuberculosis.  Există şi alte specii de mycobacterii dar şi
bacterii aparţinând altor specii şi genuri, care se pot colora prin aceste tehnici.
O serie de bacterii spiralate (Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se colorează prin
metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie în preparate
proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând coloraţii particulare (ex. impregnarea
argentică).
Până în urmă cu o perioadă de timp microorganismele aparţinând
genurilor Rickettsia, Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi, proprietăţile lor
fundamentale fac să le studiem astăzi între bacterii.

În obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte. Noţiunile
legate de micologie sunt reluate în cadrul dermatologiei iar diagnosticul micologic este prezentat mai pe
larg în diferite tratate de specialitate.

Pentru fiecare microorganism studiat am abordat aspecte legate de încadrarea într-un anumit gen,
caracterele generale mai importante (habitat, caractere morfo-tinctoriale, caractere de cultură, caractere
biochimice, rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici, structura antigenică şi răspunsul imun realizat în
organismul gazdă, precum şi caracterele de patogenitate).
Legat de caracterele distinctive ale microorganismului studiat am prezentat, în general foarte succint, date
cu privire la patogenia principalei afecţiuni clinice produse (cu enumerarea mai multor entităţi clinice, de
la caz la caz).
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele avute în vedere este axat pe datele
microbiologice (diagnostic bacteriologic şi respectiv diagnostic imunologic) urmând schema care a fost
deja prezentată. Utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cunoştinţelor
precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea unor principii de către mai tinerii colegi, indiferent de
specialitatea care va fi aleasă ulterior, sau de către medici. Microbiologia este, după opinia noastră, o
ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate practică. Elementele de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile
pentru toţi partenerii implicaţi în sistemul sanitar. Cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni
o serie de anomalii şi erori care uneori pot avea consecinţe dezastruoase (aşa cum s-a întâmplat de ex.
într-o maternitate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii nosocomiale contractate
după naştere, în anul 2004).
În final vom oferi, pe scurt, unele noţiuni legate de tratament, modalităţile de transmitere şi respectiv de
prevenire a transmiterii germenului discutat. În privinţa datelor epidemiologice, pentru unele dintre
microorganisme / boli vor fi prezentate date concrete (în cazul acelor maladii pentru care există un sistem
de supraveghere şi datele sunt disponibile). Exemplele vor fi redactate comparativ, pentru sistemul de
sănătate american şi cel românesc. Motivaţia alegerii datelor din USA este reprezentată de faptul că
sistemul american de sănătate publică şi supraveghere epidemiologică pentru sănătatea publică poate fi
privit ca un model, iar aceste date sunt publicate în mod periodic, fiind puse la dispoziţia autorităţilor
sanitare, unităţilor sanitare, medicilor şi oricărei persoane care doreşte să obţină aceste informaţii
(http://www.cdc.gov). Recomandăm, de asemenea, consultarea site-ului http://ecdc.eu.int, site al Centrului
European de Prevenire şi Control al Bolilor Infecţioase („communicable diseases”), mai recent înfiinţat, dar
cu o evoluţie rapidă şi pozitivă.
În ceea ce priveşte tratamentul, este util să reţinem că pentru majoritatea situaţiilor este necesară izolarea
microorganismului implicat, identificarea acestuia şi testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice
(de ex. utilizând cel puţin antibiograma difuzimetrică).

29. Genul Staphylococcus

29. 1. Definiţie. Încadrare
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi, catalază-pozitivi.
Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre
aceste grupuri incluzând mai multe specii).
S. aureus este şi specia recunoscută cel mai de mult (Rosenbach, 1884), în timp ce una dintre speciile
recunoscute mai recent, S. succinus, se estimează că ar avea o „existenţă” de mai multe milioane de ani.
Numărul speciilor din acest gen a ajuns la 35, însă numărul este şi mai mare dacă luăm în consideraţie şi
subspeciile (de ex. S. aureus subspecia aureus şi S. aureus subspecia anaerobius).
 Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de:
- S. aureus;
- S. epidermidis  (produce un pigment alb);
- S. saprophyticus  (produce un pigment citrin).
S. aureus  reprezintă specia cel mai frecvent implicată în clinică, în timp ce celelalte două specii sunt de
obicei nepatogene. În funcţie de capacitatea de a elabora coagulază, toţi stafilococii coagulazo-pozitivi
sunt grupaţi ca S. aureus

29. 2. Caractere generale

 29. 2. 1. Habitat
 29. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
 29. 2. 3. Caractere de cultură
 29. 2. 4. Caractere biochimice
 29. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
 29. 2. 6. Structură antigenică
 29. 2. 7. Răspuns imun
 29. 2. 8. Caractere de patogenitate

29. 2. 1. Habitat
S. aureus  se poate multiplica la nivelul tegumentelor şi mucoaselor (în special în zonele piloase şi la nivelul
vestibulului nazal).
Există o serie de factori care determină şi/sau influenţează starea de purtător pentru S. aureus. O parte
dintre aceşti factori sunt legaţi de apărarea la nivel de gazdă, o parte sunt corelaţi cu anumite proprietăţi
ale bacteriei. Dintre acestea, menţionăm formarea de biofilm (caracteristică tulpinilor care se pretează
portajului nazal, dar nu şi celor care nu determină stare de portaj) (1), care pare să faciliteze nu numai
creşterea supravieţuirii bacteriilor în contextul tratamentului antibiotic, dar şi evitarea mecanismelor de
apărare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI
(secretory leukoprotease inhibitor), catelicidine, alfa şi beta defensine (2), inclusiv beta defensina umană 3
(HBD-3), cea mai eficientă dintre beta defensine în ceea priveşte rolul în infecţiile cu S. aureus  (3).
Deoarece unele studii arată că circa 20% dintre persoanele sănătoase sunt purtătoare în mod permanent
de S. aureus iar în circa alte 50-60% dintre cazuri este discutată situaţia portajului temporar, s-a intuit că
există un anumit grad de influenţă genetică privind starea de purtător de S. aureus. Într-un studiu
transversal recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate
(date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus, nazal şi/sau
faringian. Un studiu similar, transversal, efectuat în 2010 în Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari
(incluzând studenţi aflaţi în finalul anilor 1 şi 2 de facultate în domeniile: farmacie, medicină dentară şi
medicină generală), a decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un CMI (50) la meticilină de
0,5 µg/mL şi un CMI (90) de 1 µg/mL. Datele obţinute de noi în România sunt comparabile cu cele
obţinute în Brazilia, cu atât mai mult cu cât există similitudini şi la nivelul loturilor de voluntari incluse în
studiu.
Stafilococii coaguloază-negativi (SCN) formează microcolonii la nivelul foliculilor piloşi (4) şi la nivelul
glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S. epidermidis este reprezentat de vestibulul nazal.

Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicaţi în infecţii la nivelul tegumentelor
şi anexelor pielii (infecţii însoţite de puroi), dar pot fi implicaţi şi în infecţii localizate la nivelul oricărui alt
ţesut sau organ.

29. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm. Pe frotiul realizat din cultura pe medii
solide se poate remarca o dispoziţie în grămezi neregulate. În frotiurile realizate din culturi pe medii
lichide sau din produse patogene, se pot dispune în lanţuri scurte, perechi sau coci izolaţi. În culturile cu o
vechime mai mare de 2 zile, stafilococii pot apărea ca şi Gram-variabil sau chiar şi Gram-negativi „la
limită”.

29. 2. 3. Caractere de cultură

Se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S,
au diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată. Pigmentarea devine mai
pronunţată după menţinerea plăcii cu mediul de cultură încă 24-48 ore la temperatura camerei.
Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară (β-hemoliză), dar S.
aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine.
Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (exemplu
mediul Chapman).

29. 2. 4. Caractere biochimice

Stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ. Fermentează glucoza, manitolul,
xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid.
Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S.
aureus  (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). Stafilococii sunt catalază-pozitivi.

29. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Stafilococii sunt relativ rezistenţi faţă de agenţii din mediul extern. În culturi (bulion, geloză), rezistă la
temperatura frigiderului câteva luni; în puroi uscat pot supravieţui 2-3 luni.
Sunt relativ rezistenţi la anumite antiseptice şi dezinfectante (de exemplu, rezistă peste 30 minute la alcool
70°şi peste 10 minute în fenol 2%). Sunt distruşi în 60 minute la o temperatură de 60°C.

29. 2. 6. Structură antigenică

29. 2. 6. 1.Structuri antigenice legate de corpul celular
a). Capsula este prezentă la un număr mic de tulpini de S. aureus; este alcătuită din acid glucozaminuronic.
„In vivo“ pare a fi mai frecventă decât s-ar crede (examinând la microscop tulpinile cultivate). Tulpina
încapsulată prototip de S. aureus (tulpina Smith) dă naştere spontan la variante necapsulate.
b). Polizaharidul A a fost identificat la S. aureus, în timp ce la S. epidermidis s-a pus în evidenţă un
polizaharid B. Ambii sunt acizi teichoici. Astăzi se cunoaşte structura ambilor acizi teichoici, precum şi a
grupărilor răspunzătoare de specificitatea antigenică a fiecăruia.
c). Proteina A apare ca o componentă de suprafaţă la toate tulpinile de S. aureus  (proteina Cowan). Are o
greutate moleculară de 42 kDa şi poate induce apariţia de anticorpi specifici (este imunogenă). Este de
menţionat faptul că proteina A interacţionează nespecific cu porţiunea Fc a imunoglobulinelor de la
practic toate speciile de mamifere. Ca urmare a interacţiunii dintre proteina A şi fragmentul Fc, apar o
serie de efecte biologice precum: anafilaxie locală şi sistemică la animale, reacţii urticariene la om,
activarea complementului pe calea clasică şi alternativă urmată de generarea de factori chemotactici,
inhibarea activităţii opsonizante a anticorpilor (prin competiţie cu receptorii pentru Fc de pe fagocite),
proliferarea limfocitelor B umane etc. Proteina de suprafaţă A este unul dintre factorii determinanţi ai
virulenţei şi ai formării de biofilm (5), iar un studiu recent (2) a sugerat şi o asociere a statusului de
purtător nazal de S. aureus  cu un nivel crescut al expresiei acestei proteine.
d). Majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus  aglutinează atunci când sunt suspensionate în plasmă
sau în soluţii de fibrinogen. Factorul răspunzător de această reacție este o coagulază legată („clumping
factor”; factor de aglutinare/agregare) la nivelul suprafeţei celulei bacteriene. Acest factor poate fi prezent
şi la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte
plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv şi pentru S. lugdunensis şi S. schleiferi (subspecia schleiferi).
e). Adezinele sunt proteine de suprafaţă specifice, prin care stafilococii se fixează pe proteinele matriciale
de la suprafaţa celulelor gazdei (ex. laminină, fibronectină, elastină, colagen, proteina A etc). Par a fi
implicate în colonizarea matricei intercelulare, în invazia ţesuturilor şi în rezistenţa la fagocitoză.
29. 2. 6. 2.Structuri antigenice extracelulare produse de stafilococi
a). Stafilococii, mai ales S. aureus, produc o mare varietate de exoproteine imunogene. Majoritatea sunt
proteine accesorii care, în condiţii de creştere optime, sunt sintetizate la sfârşitul perioadei de creştere
exponenţială sau la începutul fazei staţionare. În condiţii suboptime (de exemplu deficit de Mg 2+), condiţii
care se pot întâlni şi în ţesuturile infectate, aceste proteine pot fi sintetizate în tot cursul fazei
exponenţiale.
b). Filtratele culturilor de S. aureus coagulează plasma recoltată de la o serie de specii animale sub
acţiunea coagulazei, care este cel mai important marker pentru S. aureus. S-au descris mai multe
coagulaze antigenic distincte. Există totuşi şi tulpini de stafilococ implicate patogenic care sunt coagulază-
negative. Unele tulpini coagulază-negative produc o metaloproteinază care are o activitate asemănătoare
cu cea a coagulazei, ceea ce poate crea probleme în identificare.
Coagularea necesită prezenţa unui factor coagulazo-reactant (FCR), care este probabil un derivat de
protrombină. Complexul coagulazei realizat cu FCR converteşte fibrinogenul în fibrină. Procesul diferă de
coagularea normală prin faptul că nu sunt necesari o serie de factori (ex. Ca 2+) iar cheagul care se
formează este mai friabil şi nu se retractă. Studii recente demonstrează că TFPI (inhibitorul căii factorului
tisular), prin secvenţa sa C-terminală, joacă un rol antimicrobian împotriva S. aureus şi împotriva altor
bacterii Gram-pozitive (Bacillus subtilis), Gram-negative (Escherichia coli şi Pseudomonas aeruginosa) şi
chiar împotriva fungilor Candida albicans şi Candida parapsilosis  (6).
c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:
- stafilokinaza, care determină liza cheagului (prin convertirea plasminogenului în plasmină) sub controlul
unui material genetic fagic;
- nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN, generând 3'-
nucleotide;
- diferite lipaze evidenţiabile prin opacifierea agarului cu gălbenuş de ou sau prin scindarea substanţei
numită Tween; contribuie la supravieţuirea stafilococului la nivel dermic;
- hialuronidaza;
- ureaza;
- diferite proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează).
d). În momentul se faţă se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpină anume poate
produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug şi alte celule, ducând la o necroză locală şi
pot avea efecte letale asupra animalelor de experienţă. Principalele caractere ale hemolizinelor sunt
următoarele:
1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizină produsă de S. aureus. Are activitate maximă asupra
hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile. Afectează trombocitele şi celulele umane în
cultură. Are efect dermonecrotic asupra animalul de experienţă (injectată local) şi efect letal (injectată
intravenos). Efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale muşchilor netezi vasculari.
S-a identificat receptorul de pe suprafaţa membranei eritrocitului, o sialoglicoproteină. Este secretată sub
forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjează în contact cu un receptor de
membrană, formând un hexamer cilindric care străpunge membrana celulei şi proemină la suprafaţa ei,
generând un por cu un diametru de 23 nm (există asemănări cu complexul litic C5b-C9 al C').
2.   β-hemolizina este produsă de majoritatea stafilococilor identificaţi la animale, dar numai de 10-20%
dintre stafilococii umani. Produce o hemoliză de tip „cald-rece“. Este de fapt o sfingomielinază C, activată
de Mg2+, nu însă şi de Ca2+. Efectul (în ordine descrescătoare) se exercită asupra hematiilor de oaie, om,
cobai (ceea ce corespunde cu concentraţia de sfingomielină a hematiilor). Este citotoxică pentru diferite
culturi de celule. În doze mari, este toxică pentru animalele de experienţă.
3. g-hemolizina este un complex de două proteine bazice care acţionează în cooperare. Hematiile
susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu şi cele de cal sau pasăre. Efectul ei este inhibat de agar şi de
diferiţi polimeri sulfataţi. Nu are efect atunci când se utilizează plăci cu agar-sânge. Acţiunea este inhibată
de colesterol şi de alte lipide.
4. d-hemolizina este produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus.  Constă din agregate
heterogene de subunităţi de circa 5.000 Da. Acţionează pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de
mamifere cultivate) şi nu are specificitate de specie.
e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai multe activităţi
patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen mai pronunţat la nivelul
limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal toate celule T); cresc toxicitatea
endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blochează funcţia de clearance a sistemului reticuloendotelial);
produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip întârziat. Efectul piretogen se realizează
cel puţin în parte prin stimularea producerii de IL-1. Din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A şi
B, enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri serologice) şi respectiv TSST-1, cauza sindromului de şoc
toxic stafilococic. Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine.
Aproximativ 15% produc TSST-1. Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A şi B.
f). Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus şi acţionează numai asupra
polinuclearelor şi macrofagelor de om şi iepure. Are două componente, F şi S. Componenta S se fixează
pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holerică) şi activează o fosfolipază endogenă, legată de
membrană. Produşii acesteia se fixează apoi pe componenta F, inducând apoi un canal ionic pentru K +şi
conducând astfel la citoliză.
g). Exfoliatina (toxina epidermolitică) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o proteină
termolabilă şi acid-labilă, cu greutatea moleculară de 24.000 Da, produsă de circa 5% din tulpinile de S.
aureus. S-au descris două variante antigenice, ETB (codificată de un plasmid) şi respectiv ETA (codificată
cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine. Toxina acţionează prin clivarea stratului granular al
epidermului, probabil prin scindarea desmosomilor care unesc celulele acestui strat.
29. 2. 6. 3.Bacteriocine
S. epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) şi Pep5, care sunt lantibiotice. S.
gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte în special asupra bacteriilor Gram-pozitive,
chiar şi asupra unor tulpini de stafilococi din altă specie decât cea producătoare.

29. 2. 7. Răspuns imun

Imunitatea postinfecţioasă este specifică faţă de produşii extracelulari (toxine, enzime) şi faţă de
antigenele legate de corpii bacterieni. Titrul anticorpilor antistafilococici este scăzut (creşte, eventual, în
cursul unor infecţii generalizate, dar nu influenţează evoluţia spre vindecare) şi nu are utilitate practică în
diagnostic. Există un însemnat potenţial de producere a unui vaccin stafilococic care să poată fi acceptat
în Uniunea Europeană (deocamdată nici un astfel de produs nu are licenţă la nivelul UE).
S. aureus  are posibilitea de a îşi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV (small colony
variants), pentru a scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie cronică. Un studiu pe modele
celulare a arătat că printre tehnicile de persistenţă se află modificarea expresiei factorilor de virulenţă,
auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism de a sintetiza un compus organic necesar procesului de
creştere) dar şi această diversitate fenotipică, care s-a dovedit a fi un proces extrem de dinamic,
fenotipurile SCV transformându-se rapid înapoi în fenotipurile sălbatice complet virulente în momentul
părăsirii localizării intracelulare (7).
 

29. 2. 8. Caractere de patogenitate

Atât S. aureus cât şi o parte dintre SCN sunt incluşi în categoria microorganismelor condiţionat patogene.
S. aureus  apare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul tegumentelor şi
mucoaselor, însoţite de formarea de puroi, dar cu potenţial de generalizare. Tulpinile de S. aureus au
capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, în special datorită prezenţei acidului lipoteichoic,
proteinei A şi altor adezine. După aderare şi multiplicare, în cursul infecţiilor pot fi produse o serie de
substanţe cu rol în patogenitate (enzimele şi toxinele elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6).
De menţionat şi faptul că stafilococii reprezintă unele dintre primele microorganisme pentru care s-a
descris fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice. Rezistenţa la penicilină (mediată de o β-lactamază) a
fost evidenţiată încă din anul 1947. Ulterior, pe măsura utilizării în infecţiile stafilococice a unor diferite
antibiotice (inclusiv a „penicilinelor penicinilazo-rezistente“), s-au selectat tulpini rezistente la meticilină,
oxacilină, tetraciclină, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc.
Un studiu recent a evaluat prevalenţa portajului de MSSA şi de MRSA în departamentele de urgenţă din
SUA, la pacienţi în principal fără manifestări sugestive pentru infecţia stafilococică. Prevalenţa portajului
MSSA a fost estimată la 39% iar prevalenţa colonizării cu MRSA a fost de 5%. Dintre pacienţii colonizaţi
MRSA, 80% au prezentat şi cel puţin o colonizare extranazală, pe când 45% au prezentat colonizare
exclusiv extranazală (8).
Până în anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecţie al infecţiilor cu S. aureus rezistent la alte
antibiotice şi chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare sau rezistente la
vancomicină. În privinţa sensibilităţii/rezistenţei la vancomicină au fost descrise trei variante de S. aureus,
respectiv:
 S. aureus  cu un nivel intermediar de rezistenţă la vancomicină (VISA),
 S. aureus  cu hetero-rezistenţă la vancomicină (hVISA) şi
 S. aureus  rezistent la vancomicină (VRSA).
În mod clasic era considerat că o tulpină de S. aureus intră în categoria VISA în cazul în care CMI este ≥ 6
μg/ml (determinare prin „E test”) şi în categoria VRSA în cazul în care CMI este ≥ 32 μg/ml. Conform
EUCAST (2010), o tulpină de stafilococ este rezistentă la vancomicină în cazul în care CMI este > 2 μg/ml.
Opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate. O clasă de antimicrobiene care poate fi utilizată
în tratamentul VRSA este reprezentată de streptogramine (quinupristin/dalfopristin, pristinamicina,
virginiamicina, NXL 103, etamycin).
Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea
tratării S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa acestui fenotip fiind însă redusă,
de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide,
lincosamide şi streptogramina B (10).

29. 3. Patologie specifică şi principalele afecţiuni produse

Stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare şi invazivitate, fie prin
multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi îmbinarea acestor mecanisme).
Determinanţii patogenităţii stafilococului includ produsele toxice şi enzimatice, care au fost prezentate la
punctul 29. 2. 6. Spre exemplu, a-toxina are rol în generalizarea infecţiilor şi respectiv apariţia sepsisului; d-
hemolizina şi leucocidina explică de ce S. aureus este mai dificil de distrus prin fagocitoză în comparaţie cu
SCN; lipaza este importantă în mecanismul de producere a furunculelor; coagulaza contribuie la
localizarea şi persistenţa infecţiei; hialuronidaza contribuie la invazivitate etc. Ar fi de menţionat că
tulpinile izolate de la nivelul unor furuncule sunt mai bogate în lipază şi mai sărace în hialuronidază faţă
de cele izolate din impetigo bulos. Tulpinile capsulate sunt mai virulente (împiedică fagocitoza); frecvenţa
lor pare a fi mai mare „in vivo”, deci rolul capsulei pare a fi mai important decât se credea anterior.
Datorită faptului că nici unul din caracterele enumerate nu pare a fi decisiv în virulenţa stafilococilor,
tulpinile de S. aureus nu pot fi clasificate net în patogene şi nepatogene, aşa cum se poate face de ex. în
cazul tulpinilor de Corynebacterium diphteriae, tox+sau tox-.
S. aureus  este implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu puroi), începând
cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu panariţii, furuncule, abcese
profunde, infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fără generalizarea infecţiei. Pe de altă parte, ar fi de
menţionat toxinozele (datorate în special toxinelor elaborate) şi anume toxiinfecţiile alimentare, necroliza
toxică a epidermului, sindromul de şoc toxic etc.
Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în care s-au
multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de greţuri, crampe
abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore după ingestia alimentelor contaminate. Se vindecă
în general în circa 24 de ore. Alimentele sunt contaminate în general de către cei care le manipulează (de
exemplu bucătarul prezintă un panariţiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brânza,
îngheţata, carnea şi produsele din carne (acestea pot constitui adevărate medii de cultură pentru bacterii).
Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea ce impune păstrarea
alimentelor la frigider, atât înainte cât şi după preparare.
Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativă generalizată (boala Ritter) care poate apărea la nou
născut; epidermonecroza toxică (întâlnită la copii şi eventual la adulţi); impetigo bulos şi „scarlatina
stafilococică” (spre deosebire de cea streptococică, nu afectează limba şi palatul). Leziunile apărute sunt
extinse, de multe ori impresionante, dar este posibilă vindecarea fără cicatrici deoarece sediul leziunilor
este în stratul granular al pielii (sub ele rămânând un strat suficient de gros pentru evitarea unor pierderi
masive de lichid şi pentru a proteja straturile profunde de infecţii supraadăugate). În mod frecvent,
stafilococii care au produs toxinele implicare patogenic nu sunt izolaţi de la nivelul leziunii.
Sindromul de şoc toxic cuprinde un complex de simptome provocat ca urmare a unor infecţii locale cu S.
aureus producător de TSST-1 (toxina 1 a şocului toxic). Principalele semne şi simptome sunt reprezentate
de apariţia stării de şoc, febră mare, greţuri, vărsături, diaree, trombocitopenie, insuficienţă renală şi
hepatică acută, rash (erupţie) scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor şi plantelor).
Mortalitatea în cazurile necomplicate este de circa 2%. În formele complicate, mortalitatea poate ajunge la
50%. Un procent important (circa 80%) dintre cazuri apar la femei. Unele mărci de tampoane destinate
igienei intime feminine s-au dovedit a stimula producţia de TSST-1 de către tulpini „proprii“ de stafilococ.
Deoarece s-a demonstrat că TSST-1 creşte toxicitatea endotoxinei germenilor Gram-negativi, cazurile cele
mai grave au apărut atunci când infecţia stafilococică locală s-a asociat cu o infecţie cu germeni Gram-
negativi.
Stafilococii coagulază-negativi sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-chirurgicale care
penetrează bariera cutaneo-mucoasă (cateterisme, implante, protezări intravasculare etc). Ar mai fi de
amintit infecţiile tractului urinar şi genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere).
O infecţie gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai ales a
prematurului, situaţie în care administrarea necontrolată / abuzivă a antibioticelor poate produce
disbacteriemii cu consecinţe grave). În etiologia enterocolitei postantibiotice sunt recunoscute mai multe
specii de stafilococi, S. aureus ocupând primul loc.

29. 4. Diagnostic de laborator

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi este doar bacteriologic (direct) şi respectă
etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, începând cu recoltarea şi transportul produsului patologic, de
obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschisă, superficială, fie din leziuni închise, profunde).
Cultivarea în vederea obţinerii de colonii izolate se continuă cu identificarea în care pe lângă caracterele
morfologice, de cultură şi biochimice se face testul coagulazei pe lamă şi/sau în tub. Antibiograma
completează în mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecţii stafilococice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi vom alege drept
reprezentative infecţiile purulente ale tegumentelor şi mucoaselor şi ne vom referi numai
la Staphylococcus aureus.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În funcţie de
maladia provocată se pot recolta următoarele produse patologice: secreţii purulente (din foliculite, abcese,
celulite, fistule, infecţii ale plăgilor şi arsurilor), lichide (de puncţie sinusală, otică, mastoidiană, articulară,
peritoneală, pleurală, pericardică), exsudat nazal sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreţie
vaginală, tampoane vaginale, lichid de vomă, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaţa
cateterelor şi a inserţiilor iv. ale acestora. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat
de puroi (vezi anexa nr. 6; A. 6. 1.).
De menţionat că din anul 2002 a fost pusă la punct o tehnică PCR pentru identificarea S. aureus rezistent
la meticilină, direct în produsul patologic (vezi „Direcţii de cercetare”).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel
tegumentar (eventual modificate faţă de normal), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi
prezenţa cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi
sau în grămezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are în vedere locul de unde a
fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dacă se recoltează de ex. prin puncţie-aspirare dintr-o
colecţie purulentă profundă şi este foarte probabil contaminat cu floră de asociaţie dacă a fost recoltat
dintr-o leziune superficială).
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează cât mai rapid (pentru a diminua
riscul modificărilor ce ar putea apărea în structura microbiană) şi în aşa fel încât să se poată obţine colonii
izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Stafilococii se dezvoltă în
general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul
cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată (ex. pigment auriu). Pe mediul geloză-
sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară. Stafilococii se pot multiplica pe medii
hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). În cazul în care produsul
este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul conţine mai multe specii de
microorganisme) este recomandată utilizarea mediilor hiperclorurate.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
 Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm, dispuşi în
lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate.
 Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge pot produce
hemoliză.
 Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ.
Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere de acid. Capacitatea de
acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S. aureus  (manită-
pozitiv) şi SCN (manită-negativ). S. aureus  este catalază-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca și ceilalți
stafilococi). De importanță egală taxonomică și recomandat drept al doilea test de confirmare a
apartenenței la specia S. aureus  este testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face şi testul
 fosfatazei (poate fi pozitiv și la unele specii coagulază-negative). Există sisteme multitest care se
pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc).
 Caractere antigenice: Pentru diferențierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste comerciale care
includ fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de aglutinare
indirectă). Se pot utiliza şi truse cu anticorpi monoclonali faţă de endo-β-N-acetil-glucozaminidazei
stafilococice.
 Caractere de patogenitate:
o Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi anexa nr. 2); factorul care produce coagularea pe
lamă poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul
coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv pentru S.
lugdunensis şi S. schleiferi (subspecia schleiferi).
o  Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA sau aglutinarea
pasivă inversată (vezi şi capitolele 20 şi 23).
 Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea litică a bacteriofagilor a fost
sistematizată pentru tulpinile de S. aureus  într-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de
referinţă. Există un set de bază de bacteriofagi, care permit încadrarea S. aureus  în unul din grupele
I, II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluată comparativ cu capacitatea „discriminatorie” a
testelor care au ca mecanism biologia moleculară (ex. ribotiparea).
 Alte caractere / teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) teste care se
bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (studiul acizilor graşi celulari, al unor enzime sau al
unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricţie ale materialului genetic, hibridarea
moleculară, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici rapide utilizând truse de identificare şi
instrumenteautomatizate pentru evidenţierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A,
coagulaza legată), a enzimelor elaborate în aliment sau lichidul de hemocultură (testul pentru
termonuclează) şi a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează
markeri moleculari pentru evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină, de ex.
amplificarea genică, PCR pentru gena mecA, dar şi pentru genele femA, femB) şi/sau pentru
diferenţierea intraspecifică la S. aureus  şi SCN.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor infecţii
grave trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 7). Pentru a identifica tulpinile rezistente la
meticilină (MRSA) se poate detecta prezenţa genei mecA (după amplificare genică, prin PCR).

29. 5. Tratament
Multe persoane sunt purtătoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar dacă
stafilococii ar fi eliminaţi complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar produce foarte rapid
(4).
Totuşi, în anumite situaţii (ex. pacienţi supuşi dializei peritoneale sau hemodializei, pacienţi infectaţi cu
HIV sau la personalul medical care lucrează de ex. în secţii de arşi) încercarea de eliminare a stării de
purtător are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocină. Este încă în studiu utilizarea
lizostafinei în acest scop (lizostafina este o enzimă litică produsă de o tulpină de S. simulans; atacă puntea
pentaglicinică de la nivelul lanţurilor de peptidoglican ai S. aureus; au fost făcute experimente pe animale
de laborator obţinându-se rezultate promiţătoare) (11).
Tratamentul unei stafilococii, în cazul în care este necesară antibioterapia, se va face conform
antibiogramei.
Principial, dacă un stafilococ este sensibil la penicilină (majoritatea tulpinilor au devenit rezistente prin
producerea de beta-lactamază, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui să includă acest antibiotic. Din
experiența centrului de referință din INCDMI ”Cantacuzino”, procentul tulpinilor sensibile la penicilină este
de circa 5%. Datorită rezistenței la penicilină au fost produse peniciline rezistente la acțiunea beta-
lactamazelor (penicilinele M – de la ”meticilină”), de ex. oxacilina, cloxacilina și derivații acestora.
Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente.
Ca şi principiu de tratament, MRSA răspunde potențial la tratamentul cu vancomicină. VRSA poate
răspunde la streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la
streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea tratării S. aureus rezistent la streptogramina B cu
lincosamide, prevalenţa acestui fenotip fiind însă redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8%
a tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide şi streptogramina B (10).

În cazul colecţiilor purulente reamintim şi considerăm că este de reţinut ca fiind de primă importanţă
utilizarea inciziei şi drenajului, fără de care antibioterapia nu are nici un sens. De multe ori, incizia şi
drenajul sunt suficiente.

29. 6. Epidemiologie
Stafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecţie cea mai comună este reprezentată de leziunile stafilococice de
la nivelul tegumentului. De menţionat posibilitatea răspândirii infecţiei cu stafilococi rezistenţi la
antibiotice (de spital), atunci când persoanele purtătoare sunt reprezentate chiar de personalul medical şi
auxiliar.
Referitor la sindromul de şoc toxic stafilococic (SSTS), în SUA s-au raportat 157 de cazuri în 1997, 138
de cazuri în 1998 şi 113 cazuri în 1999, cu o incidenţă anuală de 0,05 0/0000. În anul 2005 au fost raportate
numai 90 de cazuri (incidenţa fiind 0,040/0000). Tot în anul 2005 s-au raportat 2 cazuri de infecţie cu S.
aureus cu sensibilitate intermediară la vancomicină (VISA) şi 3 cazuri de infecţie cu S. aureusrezistent la
vancomicină (VRSA).
În România nu sunt disponibile (la nivel naţional) date privind SSTS sau rezistenţa la vancomicină a
tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino”,
inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor izolate din infectii invazive pe baza
protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net (din 2010), în România nu au fost semnalate tulpini
de S. aureus rezistente la vancomicină.
Laboratorul de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino” poate detecta prin metode
moleculare prezenţa genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton Valentine, TSST1, în culturi de S.
aureus.

29. 7. Profilaxie
Prevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În spital, secţiile cu
risc sunt cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi saloanele unde se află pacienţi cu
cancer aflaţi sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. În aceste situaţii, personalul medical
trebuie investigat prin metode de laborator şi este de preferat ca persoanele purtătoare de stafilococi
coagulază-pozitivi să nu aibă acces în aceste incinte şi să nu aibă contact direct cu pacienţii în cauză. Ca
alternativă trebuie să se pună accentul pe proceduri adecvate, care să evite contaminarea pacienților.
Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a portajului nazal
(ex. lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile. (11)
Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de ex. la pacienţi
care necesită hemodializă, prezenţa de catetere etc. Din păcate la nivel internaţional (EU) nu există un
vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare. În ţara noastră vaccinul stafilococic produs de
INCDMI ”Cantacuzino” a avut autorizație de utilizare până în anul 2010.

30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes

30. 1. Definiţie. Încadrare
Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care formează perechi sau lanţuri în cursul diviziunii celulare.
Sunt larg răspândiţi în natură. Unii fac parte din flora umană normală; alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane
importante datorate parţial infecţiei streptococice şi parţial răspunsului imun al gazdei.
Nu există încă un sistem perfect pentru clasificarea tuturor speciilor de streptococi. Totuşi, pentru a
contura o imagine legată de numărul acestora, NCBI a creat un browser taxonomic unde putem găsi
speciile cunoscute până în acest moment. (1)
Dintre numeroasele specii, unele au importanţă medicală (în patologia umană) şi dintre acestea
amintim Streptococcus pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparţine florei
normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc.
Streptococii sunt imobili, nesporulaţi şi pot avea sau nu capsulă.
În anul 1906 a fost descris Streptococcus faecalis iar în 1919, Streptococcus faecium. Împreună cu o a treia
specie, S. durans (foarte asemănătoare cu S. faecium), în 1937 a fost definit grupul enterococilor, incluşi în
grupul D al genului Streptococcus. Din 1984, pe baza studiilor de hibridizare moleculară s-a decis că aceste
specii fac parte dintr-un gen separat, genul Enterococcus (vezi 30. 9). Enterococii pot fi izolaţi din flora
enterică normală. Sunt nonhemolitici (ocazional alfa-hemolitici); dau o reacţie pozitivă la bilă-esculină.
Tolerează NaCl în concentraţie de 6,5%. Sunt rezistenţi la multe antibiotice şi chimioterapice. Tratamentul
infecţiilor cu enterococi poate reprezenta o problemă foarte serioasă.

30. 1. 1. Sisteme de clasificare

O perioadă de timp, clasificarea streptococilor s-a bazat pe o serie de observaţii privind:
a). Morfologia coloniilor şi hemoliza produsă pe agar sânge;
b). Specificitatea antigenică a substanţelor specifice de grup (clasificarea Lancefield) şi de tip;
c). Reacţiile biochimice;
d). Rezistenţa la factori fizici şi chimici;
e). Diferite caracteristici ecologice.
După 1980 s-au introdus teste biochimice adiţionale precum şi studiile de genetică moleculară.
În funcţie de hemoliza produsă pe agar sânge, streptococii se împart în trei grupe: cei care produc α
hemoliză, β hemoliză şi streptococii γ hemolitici.  (Figura nr. 1, Fotografia nr. 1)
Clasificarea Lancefield împarte streptococii în grupe serologice (A-H şi K-U), în funcţie de polizaharidele
din compoziţia peretelui, în timp ce proteina M subîmparte streptococii din grupul A în tipuri serologice.
(Tabelul nr. 1) Specificitatea antigenică a polizaharidelor capsulare este folosită pentru a clasifica S.
pneumoniae în peste 90 de tipuri şi pentru tipizarea streptococilor de grup B (S. agalactiae).

30. 1. 2. Streptococi de interes medical

 30. 1. 2. 1.S. pyogenes. Cei mai mulţi dintre streptococii care conţin antigenul de grup A sunt
streptococi piogeni. Ei sunt beta-hemolitici (produc în mod caracteristic zone largi de hemoliză
clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici, punctiforme). S. pyogenes este principalul microb
asociat cu invazia locală sau sistemică şi cu tulburări imunologice poststreptococice. De regulă
streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină. Structura de tip capsular pe care unele tulpini o
prezintă este chimic similară cu ţesutul conjunctiv al organismului gazdă (acid hialuronic), fiind ca
atare neantigenică. Membrana sa citoplasmatică are antigene similare cu miocardul, muşchii
scheletici şi muşchiul neted, fibroblaştii valvelor cardiace şi ţesutul nervos.
 30. 1. 2. 2.S. agalactiae. Face parte din flora normală a tractului genital feminin şi poate
reprezenta o importantă cauză de sepsis şi meningită neonatală. Sunt beta-hemolitici şi produc
zone de hemoliză care sunt doar puţin mai extinse decât coloniile (1-2 mm în diametru).
Streptococii de grup B hidrolizează hipuratul de sodiu şi dau o reacţie pozitivă în testul CAMP
(folosind discuri impregnate cu toxină β stafilococică) (2).
 30. 1. 2. 3.Grupele C şi G. Aceşti streptococi sunt izolaţi uneori din nazofaringe şi pot cauza
sinuzită, bacteriemii sau endocardită. Deseori formează colonii asemănătoare cu cele ale
streptococilor piogeni şi sunt beta-hemolitici. Sunt identificaţi prin reacţii cu antiser specific pentru
grupele C sau G.
 30. 1. 2. 4.S bovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparţine florei normale. Ocazional
produce endocardită sau bacteriemie la pacienţii cu carcinom de colon. Nu produce hemoliză şi dă
o reacţie pozitivă la bilă-esculină.
 30. 1. 2. 5.S. pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creşterea lor este inhibată de
optochin iar coloniile sunt distruse de bilă şi săruri biliare (vezi capitolul 31). În continuare
reprezintă o cauză importantă de morbiditate și mortalitate (prin pneumonie comunitară).
 30. 1. 2. 6.S. viridans. Fac parte din flora normală la nivelul tractului respirator superior. În mod
caracteristic sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici. Creşterea lor nu este inhibată de
optochin. Pot ajunge în torentul sanguin ca urmare a unei traume şi reprezintă o cauză importantă
a endocarditei care survine la pacienţi cu valve cardiace patologice. Unii streptococi viridans
(exempluS. mutans) sintetizează polizaharide care contribuie la geneza cariilor dentare.
 30. 1. 2. 7.Peptostreptococii. Cresc numai în condiţii anaerobe sau microaerofile şi produc în mod
variabil hemolizine. Fac parte din flora bucală normală, flora tractului respirator superior, intestinal
şi genital feminin. Participă, adesea în asociere cu alte specii bacteriene, în infecţiile anaerobe
polimicrobiene abdominale, pelviene, pulmonare sau cerebrale.

 
30. 2. Caractere generale
30. 2. 1. Habitat
Streptococii piogeni se pot găsi la nivelul tractului respirator superior uman. Condiţiile în care ar trebui
eliminaţi se stabilesc de la caz la caz. O parte dintre speciile de streptococi colonizează exclusiv suprafaţa
dentară şi devin detectabile numai după erupţia dentară. Pentru alte specii de streptococi, datele
referitoare la habitat au fost prezentate mai sus.

30. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm, imobili, nesporulaţi. Se divid într-
un plan perpendicular pe axa lor lungă şi sunt aranjaţi în lanţuri (de până la 50 elemente bacteriene).
Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu.
Unii streptococi elaborează o capsulă polizaharidică comparabilă cu cea pneumococică. Cele mai multe
din speciile de grup A, B şi C produc capsulă din acid hialuronic. Capsulele sunt mai evidente în culturile
tinere şi împiedică fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperiţi de acid lipoteichoic şi au rol în aderenţă.

30. 2. 3. Caractere de cultură

Cei mai mulţi streptococi cresc pe medii solide şi formează colonii discoide, de tip S, cu diametrul de 1-2
mm. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formează colonii punctiforme. Speciile care produc
material capsular adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M). Cei mai mulţi streptococi sunt
aerobi, facultativ anaerobi. Peptostreptococii sunt strict anaerobi.
Necesităţile nutritive variază mult în funcţie de specie. Streptococii implicaţi în patologia umană sunt în
general germeni pretenţioşi, necesitând o varietate de factori de creştere. Un mediu de cultură util (atât ca
mediu îmbogăţit cât şi ca mediu diferenţial) este mediul geloză-sânge. Pe acest mediu streptococii se pot
diferenţia în funcţie de capacitatea de a produce hemoliză. Distrugerea completă a eritrocitelor cu
eliberarea de hemoglobină poartă numele de beta-hemoliză şi reprezintă un caracter util în identificarea
streptococilor piogeni (colonii mici, de tip S, înconjurate de o zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult
mai mare decât diametrul coloniei). Liza incompletă a eritrocitelor cu formarea de pigment verde se
numeşte alfa-hemoliză (sau hemoliză viridans). Hemoliza incompletă fără o nuanţă verzuie poartă numele
de hemoliză alfa prim. În cazul în care streptococii nu produc hemoliză sunt clasificaţi drept streptococi
gama.
În funcţie de producerea hemolizei, mai frecvent implicaţi în patologia umană sunt streptococii beta-
hemolitici, iar dintre aceştia în mod special streptococii beta-hemolitici din grupul A. Streptococul piogen
beta-hemolitic de grup A elaborează două hemolizine: 1) streptolizina O, o proteină antigenică având
greutatea moleculară de 60.000 Da, hemolitic activă în stare redusă (grupări –SH disponibile), dar
inactivată rapid în prezenţa oxigenului şi 2) streptolizina S care nu este imunogenă.

30. 2. 4. Caractere biochimice

Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea hemolizei.
Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care necesită pentru dezvoltare adăugarea în mediul de
cultură a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puţin utilizarea ca mediu de cultură a gelozei-sânge
sau a bulionului nutritiv. Streptococii degradează glucoza pe calea glicolitică. O mare parte dintre specii
pot fermenta şi alte tipuri de zaharuri şi alcooli zaharaţi utilizând o serie de enzime inductibile (sintetizate
doar în prezenţa carbohidratului respectiv şi în absenţa glucozei). În mod uzual streptococii piogeni sunt
sensibili la bacitracină. Sunt catalază negativi.

30. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Streptococul piogen este distrus în 30 de minute la 56ºC, dar poate supravieţui în secreţii uscate, la
temperatura camerei şi întuneric timp de câteva săptămâni. Deoarece nu este sensibil la acţiunea
coloranţilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate fi utilizat în mediile de cultură selective.

30. 2. 6. Structură antigenică

Streptococii hemolitici pot fi divizaţi în grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate cu literele mari
ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent în structura peretelui multor streptococi (grupele
Lancefield). Specificitatea serologică a carbohidratului specific de grup este determinată de un zahar
aminat, care pentru streptococii de grup A este ramnoză-N-acetil-glucozamină, pentru grupul B ramnoză-
glucozamină-polizaharid etc. Cele mai importante sunt grupele A, B, C, F şi G (includ streptococi β-
hemolitici).
Streptococii beta-hemolitici din grupul A prezintă la nivel parietal proteina M, cel mai important factor de
patogenitate pentru acest grup streptococic. Anticorpii faţă de proteina M conferă imunitate specifică de
tip. Deoarece există mai mult de 100 de tipuri de proteină M (dar nu toate au şi proprietăţi de prevenire a
fagocitozei), o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de diferite tipuri. Proteina
M a fost identificată şi la streptococi din grupul G.
Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către:
- proteina asociată proteinei M (MAP);
- substanţa T care permite diferenţierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu antiser specific;
- peptidaza C5a (care clivează fragmentul C5a al sistemului complement);
- proteina R, care este un antigen de suprafaţă;
- proteina F, cu rol de adezină, ce interacţionează cu fibronectina;
- nucleoproteine (substanţe P) care probabil alcătuiesc cea mai mare parte din corpul streptococic;
- diferite toxine şi enzime:
1. streptokinaza (fibrinolizina) care transformă plasminogenul în plasmină; poate fi utilă în tratamentul
administrat intravenos în embolia pulmonară, tromboza arterială şi venoasă şi în infarctul miocardic acut;
este o structură antigenică;
2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizează ADN-ul; după infecţii streptococice, în special
după infecţii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-ază;
3. hialuronidaza scindează acidul hialuronic, o componentă importantă a substanţei fundamentale din
ţesutul conjunctiv;
4. toxina eritrogenă solubilă, distrusă prin fierbere într-o oră, stă la originea rash-ului (erupţiei
caracteristice) care apare în scarlatină; toxina eritrogenă este elaborată numai de streptococii lizogenizaţi;
există un singur tip de toxină eritrogenă;
5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi;
6. hemolizinele (streptolizinele); Semnificaţia biologică a streptolizinei O este încă neclară. Se ştie că
administrată intravenos duce la animalele de laborator la deces în câteva secunde prin acţiunea sa directă
la nivel cardiac. Totuși, nu este cert că  streptolizina S ar fi  produsă și in vivo. (2)
În momentul de faţă se studiază modul în care SGB activează sistemul imun pe o altă cale, cale
descoperită în ultimii ani şi încă insuficient studiată, inflamazomul NLRP3. S-a descoperit, prin studii
efectuate pe şoricei, că celulele dendritice răspund la SGB prin secreţia de IL-1β şi IL-18. IL-1β necesită
pentru a se forma pro- IL-1β şi clivaj proteolitic dependent de caspaza 1. Aici intervine inflamazomul.
Acesta, la rândul lui, pentru a fi activat are nevoie de secreţia de β-hemolizină de către SGB. S-a
determinat şi faptul că atunci când inflamazomul cu toate compomentele sale lipseşte, şoriceii sunt mai
susceptibili la infecţie. (Figura nr. 2) (3)

30. 2. 7. Răspuns imun

Rezistenţa împotriva infecţiei streptococice are specificitate de tip. Imunitatea faţă de infecţia cu
streptococi de grup A este legată de prezenţa anticorpilor specifici anti-proteină M. Pentru că există mai
mult de 80 de tipuri de proteină M, o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de
tipuri diferite. Structura şi funcţia proteinei M au fost mult studiate. Molecula are o structură de tijă
încolăcită care separă domeniile funcţionale, permiţând astfel schimbarea unui număr mare de secvenţe în
timp ce funcţia este menţinută. Au fost identificate două clase majore (I şi II) de proteină M. Anticorpii
anti-proteină M pot fi identificaţi serologic.
Deoarece există un singur tip de toxină eritrogenă, în cazul infecţiei streptococice care duce la scarlatină
imunitatea după boală este durabilă, menţinându-se eventual chiar şi pentru toată viaţa.
În cursul infecţiilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizină O; aceştia pot fi identificaţi prin teste
serologice (ex. reacţia ASLO). Titrul anticorpilor poate fi util în diagnosticarea bolilor streptococice şi
poststreptococice.

30. 2. 8. Caractere de patogenitate

Proteina F are rol de adezină (se leagă de fibronectina celulelor gazdei) şi are un rol în invazivitate.
Proteina M reprezintă cel mai important factor antigenic şi de patogenitate pentru streptococul beta-
hemolitic din grupul A. Proteina M apare ca o excrescenţă la nivelul peretelui celular. Proteina M formează
structuri fibrilare care se extind cu 50-60 nm în afara celulei bacteriene, fiind ancorate cu cealaltă
extremitate în membrana citoplasmatică (există un grad de omologie cu proteina A stafilococică). S-a
dovedit experimental că atunci când proteina M este prezentă, streptococii sunt virulenţi. În absenţa
anticorpilor specifici de tip anti-proteină M, streptococii sunt capabili să reziste fagocitării de către
leucocitele polimorfonucleare. Proteina M este implicată şi în aderarea la celulele epiteliale ale gazdei.
Streptococii de grup A lipsiţi de proteina M sunt avirulenţi.
Se pare că proteina M şi probabil şi alte antigene streptococice au un rol important în patogeneza „febrei
reumatice” (reumatismului articular acut). Domeniile antigenice conservate din proteinele de clasă M (în
special clasa I) reacţionează încrucişat cu structuri ale muşchiului cardiac uman. Alte tipuri M au similarităţi
cu miozina, keratina sau α-tropomiozina.
Unele tulpini de S. pyogenes formează o structură capsulară compusă din acid hialuronic şi produc colonii
mucoide pe geloză-sânge (materialul capsular nu este imunogenic); poate avea rol în virulenţa anumitor
tulpini.
Hialuronidaza facilitează răspândirea microorganismelor infectante.
Difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi; această
substanţă permite microorganismului să distrugă leucocitele.
Toţi streptococii piogeni produc C5a peptidază, o serin-protează care scindează componenta C5a
(rezultată în cascada sistemului C’). C5a este unul dintre principalii factori care atrag PMN la sediul
procesului infecţios.
Toxina eritrogenă, elaborată numai de către streptococii beta-hemolitici din grupul A lizogenizaţi, este
implicată în patogenia erupţiei din scarlatina streptococică.

30. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Streptococii sunt potenţial implicaţi într-o mare varietate de boli.
În principal patogenitatea lor se datorează multiplicării şi capacităţii de invazivitate.
Proprietăţile biologice ale microorganismelor infectante, natura răspunsului gazdei şi poarta de intrare a
infecţiei au o mare influenţă asupra tabloului clinic. Infecţiile streptococice ar putea fi grupate astfel mai
multe categorii.
 

30. 3. 1. Boli invazive datorate streptococilor piogeni

Tabloul clinic este determinat de poarta de intrare. În fiecare caz poate apărea o extindere rapidă şi difuză
a infecţiei de-a lungul căilor limfatice, însoţită de o supuraţie minimă. Infecţia se poate extinde la nivel
circulator. În această categorie se pot include
 Erizipelul- apare atunci când poarta de intrare este reprezentată de tegument (formă particulară
de celulită); este caracterizat prin leziuni „lucioase”, eritemtoase, indurate, sub forma unei plăci cu
margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A şi mai rar de grupurile C sau G.
(Fotografia nr. 2)
 Febra puerperalăse dezvoltă în cazul unei infecţii streptococice intrauterine.
 Sepsisul streptococic - în 1992, American College of Chest Physicians şi Society of Critical Care
Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat câteva criterii care pot orienta medicul spre a pune
diagnosticul de sepsis, criterii care au fost revizuite în 2001. (Tabelul nr. 2) (4)
 Infecţiile osoase şi articulare;
 Fasciita necrotizantă- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel intestinal. Prevalenţă
este mai ridicată la persoanele ce folosesc droguri pe cale intravenoasă. Este cunoscută și drept
gangrena streptococică, streptococul primind (în mass-media) numele de „bacteria mâncătoare de
carte”. Această entitate clinică poate avea determinare polimicrobiană, cu floră aerobă şi anaerobă,
incluzând şi Clostridium perfringens, Bacteroides  spp. Când infecţia se localizează la nivelul
perineului se numeşte gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febră, durere foarte intensă,
eritem, tromboză la nivelul microvascularizației care conduce la necroză, gangrenă, şoc si
insuficienţă renală. În multe dintre cazuri evoluția este nefastă, spre exitus. (Fotografia nr. 3)
 Meningita etc

30. 3. 2. Boli localizate

În acest grup sunt incluse:
  Faringita streptococică care este cea mai obişnuită infecţie datorată streptococilor beta-
hemolitici. Streptococii virulenţi de grup A aderă la epiteliul faringian prin intermediul acidului
lipoteichoic. Fibronectina glicoproteică de la nivelul celulelor epiteliale serveşte probabil ca ligand
pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian şi eventual la nivelul altor structuri poartă
numele de angină streptococică. Boala se manifestă cu durere în gât, rinofaringită, amigdalită
„roşie” şi purulentă (pultacee), ganglioni limfatici cervicali măriţi şi dureroşi, febră (39-40°C). Poate
avea loc (în special la copiii mici) extinderea infecţiei către urechea mijlocie, mastoidă şi meninge.
De menţionat că circa 10-20% din infecţii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4)
 Impetigo streptococic reprezintă o infecţie localizată la nivelul straturilor superficiale ale pielii, în
special la copii. La majoritatea pacienţilor nu se găseşte o leziune predispozantă. Totuşi, amintim ca
factori de risc generali mediul umed şi igiena deficitară. Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule
sau bule ce se rup şi formează o crustă gălbuie, durere uşoara sau disconfort şi prurit. (Figura nr. 5)
 Celulita streptococică (aşa cum știm, poate fi şi stafilococica) este o infecţie acută a pielii şi
ţesutului subcutan. Clinic, pacientul se prezintă cu durere, eritem ce se extinde rapid, edem, febră,
limfadenopatie regională. Cel mai adesea este cauzată de S. pyogenes  (infecţie difuză, rapid
progresivă datorată enzimelor secretate) dar la pacienţii diabetici este întâlnit şi S. agalactiae.
Infecţia apare mai des la nivelul membrelor inferioare, tipic unilateral. Peteşiile sunt adesea
întâlnite, se pot dezvolta vezicule şi bule ce se pot rupe. (Figura nr. 6)
 Pneumonia poate fi rapid progresivă şi severă; de obicei apare ca o complicaţie, în urma unei
infecţii virale (de exemplu gripă, pojar etc.; infecţia cu virusul sinciţial respirator la copilul mic poate
fi urmată de asemenea de o pneumonie streptococică).
 Endocardita infecţioasă poate fi acută sau subacută. În cazul endocarditei acute, în cursul
bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate anterior. Distrugerea
rapidă a valvelor, în lipsa tratamentului antibiotic corespunzător şi uneori a protezării valvulare,
evoluează frecvent spre un deznodământ fatal în zile sau săptămâni. Endocardita subacută implică
mai frecvent valvele anormale (malformaţii congenitale, leziuni reumatice sau aterosclerotice).

30. 3. 3. Boli datorate producerii de toxine

 Sindromul de şoc toxic streptococic, foarte asemănător celui produs de către S. aureus, apărut
datorită eliberării de toxine. Mortalitatea este mai ridicată ca în cazul sindromului stafilococic. În
majoritatea cazurilor duce la sindrom de detresă respiratorie acută şi mai rar la o reacţie cutanată
cum este cazul S. aureus. Are un debut brusc, febră 39°-40,5°C, hipotensiune, eritem difuz macular,
coagulopatie, leziuni hepatice.
 Atunci când streptococii sunt lizogenizaţi (infectaţi cu un bacteriofag specific), produc toxină
eritrogenă. Dacă pacientul nu are imunitate antitoxică apar erupţia caracteristică şi scarlatina.
Antitoxinele faţă de toxina eritrogenă previn apariţia rash-ului (dispare la presiune, apare mai ales
pe abdomen şi torace lateral, iniţial ca papule mici apoi ca linii ce durează 2-5 zile), dar nu interferă
cu infecţia streptococică.

30. 3. 4. Bolile poststreptococice

Bolile poststreptococice includ reumatismul articular acut (RAA), cardita reumatismală şi glomerulonefrita
acută poststreptococică (GNA).
După o infecţie acută cu streptococi beta-hemolitici de grup A urmează o perioadă de latenţă (circa 1-4
săptămâni), după care se pot dezvolta bolile poststreptococice.
Perioada de latenţă sugerează faptul că boala poststreptococică nu se datorează efectului direct al
diseminării bacteriene, ci reprezintă un răspuns în cadrul unei stări de hipersensibilitate care urmează unor
infecţii repetate, netratate sau tratate necorespunzător, cu streptococi piogeni, beta-hemolitici, din grupul
A.
30. 3. 4. 1.Glomerulonefrita acută poate apărea la circa 3 săptămâni după infecţia streptococică (adesea
tegumentară), în special dată de tipurile 12, 4, 2, 49, 59-61.
Glomerulonefrita se datorează unui mecanism de hipersensibilitate de tip III, prin producerea în exces de
complexe imune antigen-anticorp, care circulă şi se depun la nivelul membranei bazale glomerulare. Toţi
glomerulii sunt afectaţi, mari şi infiltraţi cu PMN, monocite şi eozinofile. În nefrita acută apar hematurie
microscopică şi macroscopică, proteinurie pâna la sindrom nefrotic, edeme la nivelul feţei (ex.
periorbitale), hipertensiune arterială, retenţie de uree, oligurie şi anurie, ascită, congestie sistemică
(dispnee, tuse, stază în jugulare, cardiomegalie, galop, edeme); nivelul complementului seric este scăzut.
30. 3. 4. 2.Reumatismul articular acut (RAA) reprezintă cea mai serioasă sechelă a infecţiei streptococice
(tegumentară dar mai ales respiratorie - la care par să fie predispuşi cei cu grupa de sânge A II), deoarece
duce la afectarea valvelor şi a muşchiului cardiac. Anumite tipuri de streptococi de grup A conţin antigene
care reacţionează încrucişat cu structuri din ţesutul cardiac uman sau cu structuri de la nivelul ganglionilor
bazali.
RAA este precedat de o infecţie streptococică.
În patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, în special cele de tip II (citotoxică) şi de
tip IV (mecanism celular / întârziat), dar şi fenomene autoimune. Semnele şi simptomele specifice din RAA
includ febră, poliartrită migratorie şi semne legate de inflamaţia la nivel cardiac (cardita reumatismală).
(Tabelul nr. 3)
Nu dorim să intrăm în toate detaliile care vor fi studiate în cadrul modulului de cardiologie, dar dorim să
punctăm câteva aspecte. RAA este o boală inflamatorie acută neinfecţioasă, nesupurativă. Apare în
comunităţi aglomerate, nivel economic scăzut, igienă precară, alimentaţie defectuoasă, tulburări de
imunitate. Incidenţa maximă a fost înregistrată la grupele de vârstă 5-15 ani. Nu există predispoziţie de
sex dar leziunile cardiace sunt diferite în funcţie de sex.

30. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

Streptococcus pyogenes
Diagnosticul de laborator este în mod uzual bacteriologic (direct) şi include în mod necesar recoltarea şi
transportul (în maxim 2 ore) produsului patologic, cu examinarea microscopică a acestuia, cultivarea de
obicei pe geloză-sânge şi identificarea pe baza caracterelor morfologice, de cultură, biochimice şi
antigenice a microorganismelor din coloniile izolate. Antibiograma nu este, în general, necesară deoarece
streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea la penicilină. Deşi cultivarea rămâne metoda standard în
diagnostic, datorită faptului că rezultatul este obţinut abia după circa 18 ore, au fost puse la punct teste
rapide, care pot identifica antigenele streptococice în circa 10 minute (extracţie enzimatică urmată de
latex aglutinare în prezenţa anticorpilor specifici pentru grupul A).
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni alegem faringita
streptococică.
În vederea confirmării unei boli poststreptococice vom discuta reacţia ASLO (vezi şi capitolul 22).

30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic

30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, în faringita streptococică.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic, secreţia purulentă de la nivelul faringelui, trebuie să
se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi
primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi
fără să se fi spălat pe dinţi, fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă aceste condiţii nu au
fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore etc.) (vezi şi anexa nr. 6).
Produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să treacă mai mult
de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore). În cazul în care se estimează depăşirea
acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex. mediul Stuart (vezi şi anexa nr. 2). Chiar
şi în această situaţie, nu ar trebui să treacă mai mult de 24 de ore până la prelucrarea p.p.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel
faringian, prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-pozitivi aşezaţi
separat, în perechi sau în lanţuri, dar şi a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are
doar un rol orientativ.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Streptococii
piogeni sunt germeni pretenţioşi care nu se dezvoltă pe medii de cultură obişnuite. Mediul cel mai
frecvent folosit este agar-sânge, pe care cultura apare în 18-48 ore, la 35-37°C. În cazul în care nu
remarcăm apariţia de colonii caracteristice după 24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi.
Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de β-hemoliză (zonă
clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul coloniei). În cursul însămânţării, pe cel
puţin una dintre laturile „poligonului” descris trebuie să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel încât
inoculul să ajungă mai în profunzime. Această manevră (există şi alte variante tehnice) este necesară
pentru a permite activitatea hemolizinei O (hemolizina O este inactivată în prezenţa oxigenului). Speciile
care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M).
Se pot folosi pentru cultivare şi medii selective (de ex. agar-sânge plus trimetoprim-sulfametoxazol).

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

 Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm.
Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune în lanţuri (de până la 50
elemente). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu.
 Caractere de cultură: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă
de β-hemoliză sau colonii de tip M.
 Caractere biochimice:
- Streptococii piogeni produc hemoliză de tip beta.
- Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente există şi teste comerciale,
rapide, pentru testul PYR).
- Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic produs de Bacillus
licheniformis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puţin de 1% sunt rezistente
la bacitracină (vezi anexa nr. 2).
- Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol.
 Caractere antigenice:
o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizaharidului specific de grup
A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimatică (ex. cu pronază).
Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latex-aglutinare), coaglutinarea sau ELISA.
o Prin reacţii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lamă, sau precipitare se pot
determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.
o S. pyogenes  este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 100 de
serotipuri) prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (peste 28 serotipuri) prin reacţia
de aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de referinţă.
 Alte teste utilizate în identificare:
o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea directă a streptococilor de grup A în
exsudatul faringian.
o După amplificare genică (PCR) pot fi identificate secvenţele genetice care codifică pentru
diferitele tipuri de proteină M (genele enm). Au fost descoperite peste 120 de secvenţe
genetice diferite, această metodă fiind mai discriminativă în comparaţie cu metoda clasică,
de tipizare a S. pyogenesşi tinde să completeze şi eventual să înlocuiască această metodă.
o Relativ recent a fost propusă tehnica MLST (multilocus sequence typing), accesibilă
unorcentre de referinţă.
5. Streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină (au fost identificate în ultima
perioadă tulpini „tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de către penicilină, 2003).
Pentru pacienţii cu hipersensibilitate ("alergici") la beta-lactamine se poate alege pentru tratament
eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament antimicrobian şi în acest caz
antibiograma devine necesară. În general antibiograma se realizează în scop epidemiologic, pentru
supraveghere şi cercetare.

30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic

30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic
Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii β-hemolitici din grupul A ar putea consta
din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi titrul anticorpilor, în cadrul
diagnosticului serologic), fie a răspunsului imun de tip celular.
În continuare nu vom discuta decât diagnosticul serologic, care are importanţă practică.

Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA),
identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecţii
streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt mai complexe, dar
includ dovedirea prin metode de laborator a unei infecţii streptococice în antecedente.
Diagnosticul serologic se realizează de obicei, în România, prin reacţia ASLO, care identifică titruri ale
anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 22). Testarea se face în dinamică, pe seruri recoltate la
interval de 7-10 zile.
Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO.
Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de calitate.
Tot strict necesară este evaluarea rezultatelor în contextul clinic.

Există teste serologice pentru determinarea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte structuri
antigenice (streptodornază, hialuronidază, streptokinază). Titrul anticorpilor anti-streptodornază este
crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se suspicionează prezenţa unei
glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-
MAP (prin latex aglutinare).

31. Streptococcus pneumoniae

31. 1. Definiţie. Încadrare
Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în
general în diplo pe axul longitudinal, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ
anaerobi. Pe geloză-sânge determină a-hemoliză, la fel ca Streptococcus viridans. Creşterea îi este
favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C. Streptococcus pneumoniae este unul dintre
principalele microorganisme implicate în etiologia otitei medii şi în alte infecţii respiratorii, incluzând
pneumonia. Meningita pneumococică reprezintă însă o entitate nosologică redutabilă.
Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la antibiotice o reprezintă
apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte medicamente antimicrobiene. Gravitatea acestei
situaţii rezultă din incidenţa crescută a pneumoniilor pneumococice (40 - 50% din etiologia pneumoniilor
comunitare) şi din valorile extrem de alarmante ale incidenţei tulpinilor de pneumococi penicilino -
rezistenţi (20-40% din tulpinile izolate în Europa Occidentală sau în America de Nord), uneori cu
multirezistenţă la antibiotice.

31. 2. Caractere generale

31. 2. 1. Habitat
Pneumococii se pot izola de la persoane sănătoase, făcând parte din flora normală a tractului respirator
superior (în special bucală, nazală şi faringiană). Cu toate că frecvenţa portajului orofaringian este estimată
la 30-70%, în recentul studiu la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de
facultate (date nepublicate, 2007), nu am identificat nici un purtător de Streptococcus pneumoniae.
31. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi (cu o capsulă comună),
imobili, nesporulaţi. În coloraţia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou în jurul pneumococilor.
Utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul
patologic (de exemplu spută), prin reacţia de umflare a capsulei.
31. 2. 3. Caractere de cultură
            Pneumococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, aerobi, facultativ
anaerobi. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M, înconjurate de o zonă de a-hemoliză (la
fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de
37°C. Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează enzime
zaharolitice, proteolitice şi lipolitice.
            În mediile de cultură lichide pneumococii tulbură omogen mediul.
31. 2. 4. Caractere biochimice
Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează enzime
zaharolitice, proteolitice şi lipolitice. Fermentarea inulinei reprezintă un caracter biochimic important, util
în diferenţierea pneumococilor de S. VIRIDANS  (ambele tipuri de streptococi producând pe geloză-sânge
o hemoliză de tip viridans).
Produc enzime autolitice. Autoliza este indusă şi accelerată de bilă, săruri biliare, acizi biliari; testul este util
în identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld).
Sunt sensibili la optochin (etil-hidro-cupreină), sensibilitatea la această substanţă fiind de asemenea utilă
în identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans.
31. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Pneumococii pot supravieţui câteva luni în spută uscată, la întuneric. În mediul extern rezistenţa lor este
scăzută. În timp, microorganismele devin Gram-negative şi tind să se lizeze spontan.Autoliza
pneumococilor este intensificată de agenţii tensioactivi de suprafaţă.
31. 2. 6. Structură antigenică
La nivelul peretelui există un polizaharid specific de grup, comun tuturor pneumococilor. Polizaharidul C
include acidul teichoic (legat de peptidoglican).
Cel mai important determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică (antigenul K), ce
protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivitatea. Structura polizaharidului capsular este
specifică fiecărui serotip în parte. Până în prezent au fost identificate peste 90 de serotipuri capsulare
diferite, a căror structură a fost determinată pentru majoritatea serotipurilor. Există două sisteme diferite
folosite pentru clasificarea tipurilor capsulare. Sistemul american a numerotat tipurile capsulare în ordinea
descoperirii acestora. Sistemul danez grupează mai multe tipuri antigenic înrudite. Spre exemplu, grupul
19 din clasificarea Statens Serum Institute grupează tipurile 19A-C şi 19F, care în sistemul american de
clasificare erau numerotate cu 19, 57, 58 şi respectiv 59. Au fost produse seruri specifice anticapsulare
polivalente şi monovalente, utile în identificarea pneumococilor cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei.
Este descris şi acidul lipoteichoic numit şi antigen F (Forsman); anticorpii faţă de antigenul F reacţionează
încrucişat cu polizaharidul C de la streptococii piogeni.
Fosfocolina (FC) se găseşte atât în acidul lipoteichoic, cât şi în acidul teichoic parietal. Prezenţa reziduurilor
de FC este necesară atât în diviziune, în fenomenul de autoliză, cât şi în fenomenul genetic de
transformare. FC are şi rol de adezină (se leagă de „choline-binding proteins” de pe suprafaţa celulelor
gazdei).
Toţi pneumococii secretă IgA1 protează (una dintre Zn-proteinazele produse de S. pneumoniae).
31. 2. 7. Răspuns imun
Imunitatea faţă de infecţia pneumococică are specificitate de tip şi depinde atât de anticorpii care apar
împotriva polizaharidului capsular, cât şi de funcţia fagocitelor. Vaccinarea induce producerea de anticorpi
faţă de polizaharidul capsular.
31. 2. 8. Caractere de patogenitate
S. pneumoniae este un microb condiţionat patogen care, atunci când este implicat în patologia umană, se
manifestă prin multiplicare şi invazivitate. Virulenţa pneumococilor depinde de capsulă, care conferă
rezistenţa la fagocitoză. Un ser care conţine anticorpi împotriva polizaharidelor specifice de tip protejează
împotriva infecţiei. Dacă un astfel de ser este absorbit cu polizaharide specifice de tip îşi pierde puterea
protectoare.
Alţi factori de patogenitate ar fi reprezentaţi de:
- IgA1 protează;
- hemolizina intracelulară (pneumolizina), eliberată prin autoliză (inhibă chemotactismul pentru PMN,
inhibă proliferarea limfocitelor şi sinteza de anticorpi);
- proteinele de suprafaţă (PspA) care au unele asemănări cu proteina M de la S. pyogenes;
- neuraminidazele (NanA şi NanB) şi hialuronidaza.
Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purtători de pneumococi, mucoasa
respiratorie normală are un grad important de rezistenţă naturală faţă de aceste microorganisme. Printre
factorii care predispun la infecţie ar fi de menţionat:
- anomalii constituţionale sau dobândite ale tractului respirator (infecţii virale, alergii locale, obstrucţii
bronşice, afectări ale tractului respirator datorate unor substanţe iritante etc.);
- intoxicaţia cu alcool sau droguri, care deprimă activitatea fagocitară şi reflexul de tuse;
- consumul de tutun (fumatul);
- malnutriţia, debilitatea generală, hiposplenismul sau deficienţele sistemului complement.

31. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
În majoritatea infecţiilor pneumococice există o fază iniţială bacteriemică, perioadă în care
microorganismul ar putea fi izolat prin hemocultură. Pneumococul este patogen prin multiplicare şi
invazivitate, conducând la apariţia unor variate infecţii ale tractului respirator superior şi inferior, ale
urechii medii, ale sinusurilor, dar şi alte infecţii produse prin diseminare hematogenă (ex. meningită,
endocardită, care pot fi foarte grave).
Pneumonia pneumococică se însoţeşte de prezenţa edemului alveolar şi a unui exsudat fibrinos, urmat de
apariţia de hematii şi leucocite. În exsudat se identifică prezenţa a numeroşi pneumococi. Debutul
pneumoniei este adesea brusc, cu febră mare, frison, junghi toracic. Sputa caracteristică este ruginie
(semn patognomonic). Aspectul radiologic este caracteristic atunci când este prins un singur lob şi constă
într-o opacitate cu aspect triunghiular, cu baza la periferie şi vârful către mediastin (pneumonie francă
lobară).

32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria

gonorrhoeae
32. 1. Definiţie. Încadrare
Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exemplu  Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella.
În genul Neisseria, speciile importante pentru patologia umană sunt N. meningitidis  (meningococul) şi N.
gonorrhoeae  (gonococul), dar se pot aminti şi N. lactamica, N. sicca, N. subflava, Neisseria bacilliformis  etc.
Există şi o specie (N. elongata) în care tulpinile au aspect cocobacilar şi sunt oxidază-negative (1).
Pe baza studiilor filogenetice, speciile Neisseria au fost clasificate în cinci grupe şi anume: N.
meningitidis, N. flavescens, N. cinerea,  N. pharyngis  şi N. elongata  (12 specii în total).
Anterior, Moraxella (Branhamella) catarrhalis aparţinea genului Neisseria; studii de genetică moleculară au
demonstrat că există diferenţe între aceste microorganisme.

32. 2. Caractere generale

32. 2. 1. Habitat. Caractere fiziologice
N. lactamica a fost evidenţiată la nivel nazal sau faringian în cazul a 3-40% din purtătorii sănătoşi. Studii
epidemiologice arată că prezența acestei bacterii poate avea efecte favorabile (înregistrându-se activitate
bactericidă serică îndreptată împotriva N. meningitidis; studiul s-a efectuat iniţial pe şoricei, ulterior pe
oameni). Cu toate că este improbabilă realizarea unui vaccin cu tulpini vii de N. lactamica, înţelegerea
mecanismului inducerii unei imunitaţi încrucişate şi a activitaţii serice bactericide ar putea utilă pentru
studiile legate de vaccin. (2, 3)
Marea majoritate a speciilor din genul Neisseria  sunt coci Gram negativi. În urmă cu caţiva ani se
considera că N. elongata  este singura specie de origine umană cu aspect bacilar. Totuşi, un studiu publicat
de Journal of Clinical Microbiology în 2006 raportează izolarea şi caracterizarea a 8 tulpini bacilare
de Neisseria  de la pacienţi cu infecţii localizate fie la nivelul cavităţii orale, fie la nivelul tractului respirator.
Două dintre ele au fost izolate din sânge. Din punct de vedere genetic asemănarea era de <96% cu
celelalte specii din gen. Analiza acizilor graşi celulari a arătat o similaritate mare. Microorganismele sunt
Gram negativ si măsurau 0.6μm /1.3-3.0μm. Cresc pe geloză-chocolate. Sunt oxidază pozitivi, indol
negativi şi nu produc acid la fermentarea cu dextrozei, lactozei, maltozei şi sucrozei. Aceste teste au dus la
concluzia că se poate descrie o specie nouă, denumită Neisseria bacilliformis. (4)
Moraxella catarrhalis a fost identificată în flora normală a tractului respirator superior, la 40-50% din copiii
de vârstă şcolară sănătoşi şi la circa 5% dintre adulţi, dar poate fi implicată şi într-o serie de infecţii
(bronşite, traheobronşite, pneumonii, sinuzite, otite, conjunctivite), în special la gazde cu deficienţe ale
capacităţii de apărare. Există studii care estimează că un procent de circa 15% din otitele medii ar fi
produse de Moraxella catarrhalis. Speciile de Moraxella sunt de regulă Gram-negative (totuşi, există
elemente care rezistă decolorării cu alcool-acetonă). M. catarrhalis a aparţinut iniţial genului Neisseria,
ulterior genului Branhamella, astăzi făcând parte din genul Moraxella. Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în
diplo, dar pot forma şi lanţuri scurte. Se pot dezvolta atât la 35-37ºC cât şi la 28-30ºC. Pot forma colonii
pe medii care conţin colistin. Dacă în urmă cu 35 de ani prezenta sensibilitate la penicilină, actualmente se
cunoaşte faptul că produce β-lactamază (3 tipuri enzimatice diferite); prezintă, de regulă, rezistenţă la
penicilină, ampicilină, meticilină, clindamicină şi vancomicină. Este unul dintre micro-organismele care,
alături de S. pneumoniae şi tulpinile ne-tipabile de H. influenzae, este studiat în vederea producerii unui
vaccin care să prevină apariţia otitei medii.
N. gonorrhoeaese poate găsi la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate (indiferent dacă infecţia
este sau nu simptomatică). A fost remarcată pentru prima dată de Albert Neisser (1879): coci intra-
leucocitari la examenul secreţiei purulente din uretra masculină, la pacienţi cu gonoree. Cultivarea a fost
realizată cu 3 ani mai târziu. Cea mai recent definită subspecie de N. gonorrhoeae a fost identificată în
secreţii conjunctivale (N. gonorrhoeae subspecia kochii).
Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant în microbiota vaginală, au fost evidenţiate în strânsă
legătură cu un risc scăzut de infectare în urma expunerii la N. gonorrhoeae. Lactobacillus   scade
aderenţa N. gonorrhoeae  cu până la 50% şi inhibă invazia celulelor epiteliale cu până la 60%. Mai mult
decât atât, lactobacilii au posibilitatea să disloce gonococii aderaţi ceea ce ne poate conduce cu la ideea
că ar putea ajuta la profilaxia postexpunere. (5)
N. meningitidis a fost izolată la persoane sănătoase de la nivel nazal sau faringian. La pacienţii cu
meningită meningococică, germenul se multiplică în lichidul cefalorahidian (LCR). A fost izolată pentru
prima dată în anul 1887 din LCR de la un pacient cu meningită acută.
În prima decadă a secolului 20 meningita meningococică netratatată avea o rată a mortalitaţii de 75-80%.
În 1913, Simon Flexner a fost primul care a gândit o formă de terapie folosind serul antimeningococic
cabalin intratecal. Mortalitatea a fost redusă la 31% pe un lot de 1.300 pacienţi. În perioada 1928-1936
169 de copii au fost trataţi în acest fel la spitalul Bellevue din New York iar mortalitatea a scăzut la 20%. În
1930 odată cu introducerea sulfonamidelor mortalitatea a scăzut la 5-15%. Totuşi, odata cu ”era
antibioticelor” a început şi ”era rezistenţei la antibiotice”. (6)
Atât adulţii cât şi copiii pot fi colonizaţi de mai multe specii de Neisserii, în acelaşi timp (de ex. Neisseria
spp. nepatogene şi N. meningitidis). Neiseriile saprofite / comensale au fost descrise pentru prima dată în
1906, purtând iniţial alte denumiri. Ceea ce este relativ interesant, N. flavescens (1930) şi N.
lactamica (1969) au fost izolate din LCR, motiv pentru care se presupune că pot determina meningită.
Ultima specie de Neisseria a fost definită în 1993, drept N. weaweri (numele iniţial fiind grupul CDC M-5;
de origine canină şi rar izolată din rănile pacienţilor muşcaţi de câini).
În continuare vor fi prezentate doar două dintre speciile enumerate, respectiv N. gonorrhoeae  şi N.
meningitidis, microorganisme cu necesităţi nutritive complexe şi care se pot dezvolta doar la 35-37ºC.
32. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Atât meningococul cât şi gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili, înconjuraţi de o
structură capsulară comună, cu o structură de polifosfat sau polizaharid-polifosfat (în cazul
meningococului), situaţie în care capsula este mai evidentă. (Figura nr. 1 și Figura nr. 2) În funcţie de
structura capsulei există mai multe serogrupuri.
32. 2. 3. Caractere de cultură
Ambele microorganisme au nevoie în vederea izolării de utilizarea unor medii de cultură îmbogăţite,
necesităţile nutritive fiind mult mai mari în cazul gonococului (există tulpini de meningococ care se pot
dezvolta pe medii simple, cu săruri minerale, lactat şi aminoacizi). Principial se pot multiplica în cazul
folosirii mediului Mueller-Hinton (amintit şi la antibiograma difuzimetrică), la o temperatură de incubare
de 35-37ºC şi în condiţiile unei atmosfere de 3-10% CO 2. (Figura nr. 3, exsicatorul) Gonococul nu se
multiplică în lipsa unor surse energetice (glucoză, piruvat, lactat). Coloniile apar în 24-48 de ore, mai rapid
în cazul meningococului.
Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate,
transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de
colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminată în cazul în care nu se dezvoltă
colonii după 72 de ore.
Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1 mm. Tulpinile încapsulate (A, C) pot
conduce la apariţia unor colonii de tip M.
32. 2. 4. Caractere biochimice
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu, gonococul
poate metaboliza glucoza (nu şi maltoza), în timp ce meningococul metabolizează ambele zaharuri
menţionate. (Figura nr. 4)
Produc citocrom-oxidază, ceea ce reprezintă un test cheie în identificare; se utilizează de exemplu benzi
de hârtie de filtru îmbibată cu reactiv, respectiv tetrametil-p-fenilendiamină. Reacţia pozitivă apare în circa
10 secunde (vezi şi anexa nr. 2). (Figura nr. 5)
32. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Neisseriile implicate în patologia umană sunt foarte sensibile la uscăciune, lumină solară şi la variaţii de
temperatură, precum şi la majoritatea antisepticelor şi dezinfectantelor. Produc enzime autolitice.
32. 2. 6. Structură antigenică
În cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se găseşte lipopolizaharidul (endotoxina).
Spre deosebire de lipopolizaharidul (LPZ) din structura enterobacteriilor, care conţine multiple unităţi
repetitive, neisseriile au lanţuri zaharidice scurte, motiv pentru care denumirea corectă ar fi cea de
lipooligozaharid (LOZ). În funcţie de structura lipooligozaharidului există mai multe serotipuri, 6 în cazul
gonococului şi 12 în cazul meningococului. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic
diferite.
Lipopolizaharidul (lipooligozaharidul) a fost denumit şi endotoxină, deoarece este eliberat din perete după
distrugerea germenilor. Lipooligozaharidul se fragmentează în lipidul A (responsabil pentru toxicitate) şi
respectiv în polizaharidul (oligozaharidul) O.
Neisseria gonorrhoeae
În cazul gonococului heterogenitatea antigenică este remarcabilă. Acest microorganism este capabil să îşi
modifice structurile de suprafaţă „in vitro” (probabil şi „in vivo”), evitând mecanismele de apărare ale
gazdei. Ar fi de menţionat şi următoarele structuri antigenice:
- pilii, cu rol în ataşarea de celulele gazdei, care protejează gonococul faţă de fagocitoză şi au o structură
proteică. Capătul C-terminal are o structură variabilă. Pilinele diferă de la o tulpină la alta şi chiar în cazul
aceleaşi tulpini (există sute de tipuri de piline posibile). Există şi pili cu rol în procesul de conjugare
genetică;
- mai multe tipuri de proteine, spre exemplu porinele (proteina I), care formează pori la suprafaţa celulei
bacteriene. Fiecare tulpină prezintă un tip de porină, dar porinele diferă de la o tulpină la alta. Această
structură este utilă pentru serotiparea gonococilor. Proteina II (OPA) este identificată la tulpinile care
produc colonii opace şi este utilă pentru aderarea gonococului.
- proteina care leagă fierul (iron binding protein) este similară ca greutate cu porinele; se exprimă atunci
când aportul de Fe este insuficient;
-  adezina cu greutate moleculară 36 kDa;
- proteina Rmp, o proteină localizată la suprafaţa membranei externe; are secvenţe care prezintă
omologie parţială cu proteine identificate la Shigella dysenteriae sau E. coli; anticorpii anti-Rmp pot fi puşi
în evidenţă la pacienţi sau convalescenţi cu gonoree, la nivel sanguin sau în secreţiile genitale;
- IgA1 proteaza;
- pseudo-capsula din polifosfat;
- proteine de stres asemănătoare proteinelor de şoc termic Hsp60.
Variaţia antigenică este importantă, cu o valoare de circa 10 -3 (pentru OPA, LOZ, piline) şi este utilă pentru
eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei. De menţionat prezenţa anumitor plasmide implicate în
rezistenţa la antibioticele beta-lactamice.
Gonoreea apare adesea în cadrul coinfecţiei cu HIV. LOZ induce imunitatea înnăscută legându-se de TLR4.
S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite de Neisseria gonorrhoeae   asupra infecţiei HIV şi a
provirusului din macrofage. Macrofagele care conţineau LOZ au devenit rezistente la infecţia HIV şi la
provirus. (7)
Neisseria meningitidis
În cazul meningococului, pe lângă LOZ mai este important de menţionat structura capsulară, care permite
subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre aceste grupuri serologice (notate cu litere), mai importante
datorită implicării în patologie sunt grupele: 29E, A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z şi W-135. Vaccinurile conţin
numai o parte dintre aceste antigene.
Atât pilii, cât şi tipurile de proteine menţionate mai sus sunt prezente şi în cazul meningococului (piline de
clasa I şi II, porine de clasa 1, 2 şi 3, proteina Rmp, proteina OPA de clasă 5 etc), însă fără fenomenele de
variaţie antigenică (genetică) menţionate.
32. 2. 7. Răspuns imun
În infecţiile cu gonococ apare un răspuns imun, dar datorită fenomenelor prezentate mai sus, practic nu
există imunitate postinfecţioasă; aceeaşi persoană poate face infecţii repetate.
În cazul meningococului, imunitatea este asociată cu prezenţa serică a anticorpilor anti-capsulari, anti-
lipooligozaharid şi anti-membrană externă, care apar după infecţii subclinice. Nou-născuţii sunt în general
protejaţi datorită anticorpilor de tip IgG proveniţi de la mamă. Infecţiile meningococice reprezintă o
problemă în special pentru persoanele care au un deficit al sistemului complement (mai ales
componentele C6-C9).
LCR conţine molecule implicate în imunitatea înnăscută (ex. sistemul complement), molecule esenţiale în
controlul infecţiei şi în activarea infiltrării cu fagocite (neutrofile, monocite). Totuşi, celulele epiteliale ale
stratului ependimal care intră în structura tubului neural sau ale plexului coroid ar putea fi foarte
vulnerabile la atacul citotoxic şi citolitic al componentelor complementului. Un studiu publicat în 2006 (8)
a arătat capacitatea celulelor epiteliale cerebrale de a exprima la nivelul membranei receptori pentru
reglarea activității complementare (CD35, CD46, CD55, CD59). Prin studii de dublă imunofluorescenţă
pentru markeri ai celulelor ependimale (GFAp, S100, ZO-I) şi ai receptorilor pentru reglarea
complementului s-a ajuns la concluzia că aceste celule au o cantitate mare de CD55 şi CD59 şi mai mică
de CD46 şi CD35. La nivel tisular s-a observat că CD55 era slab exprimat la nivelul plexurilor coroide şi
celulelor ependimale de control dar exprimarea era crescută în meningită. Anti-CD59 era prezent la nivelul
ambelor epitelii în timp ce CD59 a fost identificat doar la nivelul plexurilor coroide inflamate. CD46 şi
CD35 nu au fost identificate în ţesuturile de control. Pe de altă parte, în meningită aceste molecule erau
puternic exprimate. Acest studiu arată posibilitatea structurilor cerebrale de a raspunde şi susţine
imunitatea înnăscută mediată de complement. (8)
Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o creştere a incidenței infecţiilor
cu Neisseria meningitidis.  S-au făcut teste în acest sens şi s-a recoltat sâange şi ser de la pacienţi adulţi
care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienţii aveau de asemenea deficit de mannose-binding lectin
(MBL). Proliferarea meningococilor introduşi în sânge a fost evaluată prin numărul de CFU (colony-forming
unit) şi prin Real-time PCR. S-a investigat activitatea bactericidă serică şi cea opsono-fagocitică a
granulocitelor incluzând ser inactivat termic postvaccinare pentru a evalua influenţa anticorpilor
antimeningococici. Proliferarea meningococică a fost de 2log 10  pentru CFU şi 4 sau 5log10  copii ADN.
Proliferarea a scăzut moderat după corectarea deficitului de C2, dar după corectarea deficitului de C5 toţi
meningococii au fost distruși (remarcându-se și un titru mare de anticorpi).  Activitatea opsono-fagocitică a
fost strict dependentă de C2, a apărut în serul normal şi a crescut în serul postvaccinare. Activitatea
bactericidă serică a depins doar de C2, C5 şi titrul anticorpilor. MBL nu a influenţat în nici un fel aceşti
parametri. (9)
Imunitatea adaptativă este pilonul cel mai important. Ţesutul limfoid asociat nazofaringelui (NALT) este
locul principal al răspunsului imun. LTCD4+ interacţionează în cele din urmă cu LB şi duc la secreţie de IgA
şi IgG. IgA facilitează clearance-ul microciliar, aglutinarea patogenilor şi împiedicarea adeziunii epiteliale
precum şi neutralizarea toxinelor secretate. (10)
32. 2. 8. Caractere de patogenitate
În cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datorează existenţei factorilor care permit ataşarea de
celulele gazdei, multiplicării la poarta de intrare şi respectiv capacităţii de invazivitate. Prezenţa capsulei şi
a lipooligozaharidului contribuie în mod diferenţiat (mai important în cazul meningococului) în patogenia
bolilor produse.
Pentru câteva detalii, luăm în discuție Neisseria meningitidis  unde aderarea are loc la nivelul
nazofaringelui. Acest prim pas este mediat de pili. Aceştia se pare că se leagă de o proteină reglatoare a
complementului de pe membrana celulară, CD46. Pilii duc la modificări post-transcripţionale în cele din
urmă glicozilarea acestora poate accelera detaşarea bacteriană de pe suprafaţa celulei unde deja s-au
format colonii. Prin alterearea acestui mecanism, de adeziune, bacteriile scapă din agregate şi pot
disemina şi forma noi agregate în noi locuri. (11)
Pentru a particulariza doar o parte din fenomenele desfășurate în cursul procesului infecțios, vom lua
drept exemplu infecția cu N. meningitidis. În timpul invaziei, meningococul se localizează preferenţial în
capilarele cerebrale unde viteza de curgere a sângelui este redusă, la fel ca în capilarele din nazofaringe,
viteza căreia trebuie sa îi reziste în timpul colonizării. De asemenea, el trebuie să reziste şi forţelor
mecanice, mucusului, răspunsului inflamator şi tusei. Prin intermediul anumitor structuri pe care le deține,
meningococul duce la polimerizarea actinei şi auto-protecţie (formarea unor structuri de protecție). În
plus, meningococii formează la suprafaţa celulei biofilme alcătuite din lipide şi polizaharide (evitând astfel
contactul cu sistemul imun).  Procesul poate continua pe 2 căi: transcelulară sau paracelulară.
Nu doar LOZ este util în aderare, dar şi de proteinele Opa şi Opc. Opc se leagă de proteinele matrixului
extracelular, precum vibronectina. Opa se leagă de moleculele de adeziune celulară a antigenului
carcinoembrionar, de heparan sulfat şi integrine.
O altă moleculă cu o importanţă foarte mare este TspA (T-cell stimulating protein A) care duce la
proliferarea LT și LB.  Nu este cunoscut bine mecanismul de acțiune.
Luând în discuție capsula, portajul este favorizat de pierderea capsulei (aceasta inhibă aderenţa şi
formarea biofilmului), în schimb, în cursul procesului infecțios prezența capsulei este necesară (11).

32. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Neisseria gonorrhoeae
Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică inclusiv în ţările
cu o economie dezvoltată (vezi şi 30.3.6). Acest fapt se datorează şi apariţiei / răspândirii tulpinilor de
gonococ rezistente la antibiotice/chimioterapice şi existenţei unui număr important de infecţii
asimptomatice (în special la femei).
După pătrunderea în organismul receptiv, în funcţie de calea de transmitere, gonococul se ataşează de
mucoase (genito-urinară, oculară, rectală, faringiană etc.) şi produce, local, o supuraţie acută. În timp
poate apărea invazia tisulară şi în consecinţă, instalarea unor fenomene inflamatorii cronice şi apariţia
fibrozei (în special în cazurile netratate).
La bărbaţi apare, de regulă, uretrita gonococică (manifestată prin secreţie galben-verzuie, cremoasă,
însoţită de usturimi şi dureri la micţiune); în lipsa tratamentului, aceasta poate afecta prin invazie
epididimul şi prin fibroză poate determina apariţia stricturilor uretrale.
În cazul sexului feminin, gonoreea se localizează endocervical, dar se poate extinde la nivelul uretrei,
vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine (în ultimul caz, cu posibilitatea apariţiei unor fibroze şi
obstrucţii care conduc la sterilitate). Dacă mama are gonoree şi nou-născutul se naşte pe cale naturală, va
apărea oftalmia gonococică (prevenită de ex. prin instilaţii cu soluţie de nitrat de Ag 1% în sacul
conjunctival).
Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguină (bacteriemie), cu apariţia unor leziuni dermice, artrite,
tenosinovite gonococice etc.
Neisseria meningitidis
Meningococul poate produce şi alte infecţii, dar este important de menţionat că reprezintă una din
primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături de Haemophilus influenzae şi Streptococcus
pneumoniae). Contagiozitatea este mare, dar se estimează că meningita meningococică apare la 1/1.000
din persoanele contaminate.
În producerea meningitei sunt implicate succesiv colonizarea mucoasei respiratorii (portaj = o relaţie de
comensalitate între bacterie şi gazdă, fără ca gazda să prezinte vreun semn sau simptom care să ne ducă
cu gândul la patologie), invazia locală, bacteriemia (favorizată de prezenţa capsulei), invazia meningeală,
alterarea barierei hemato-encefalice, inflamaţia în spaţiul subarahnoidian şi creşterea presiunii
intracraniene. Apariţia vasculitei cerebrale şi scăderea fluxului sanguin la nivel cerebral reprezintă factori
de agravare. Activarea mai multor cascade inflamatorii (în special datorită eliberării unor cantităţi
importante de endotoxină) pot conduce la instalarea unui sindrom de coagulare intravasculară diseminată
şi la o evoluţie nefastă spre deces.

32. 4. Diagnostic de laborator

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) atât în gonoree cât şi în meningita meningococică,
dar trebuie să fie orientat de examenul clinic. În cazul meningitei, de mare importanţă este utilizarea unor
examene paraclinice complementare.
32. 4. 1. În gonoree, recoltarea produsului patologic se realizează diferenţiat (într-o oarecare măsură) în
funcţie de vârstă, sex şi de practicile sexuale ale individului infectat. În cazul gonoreei la femei, recoltarea
se va face de la nivelului colului uterin. La bărbaţi, recoltarea se va face de la nivelul uretrei, eventual
utilizând un tampon steril uretral, introdus cu blândeţe circa 2 cm în uretra anterioară. Transportul trebuie
realizat foarte rapid (şi în condiţii care să permită supravieţuirea microorganismului) sau pe medii speciale
de transport, dar ar fi de preferat inocularea imediată pe mediul de cultură.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). La bărbat se
prelevează secreţia uretrală (eventual „picătura matinală”), iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe
masă ginecologică de la nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin (vezi şi anexa nr. 2, A. 6. 1.). Secreţiile
au de obicei un aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultură potrivite şi în
atmosferă de CO2. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie
realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Chiar şi în cazul utilizării mediilor de transport
(ex. mediul Amies plus cărbune activat), acesta nu ar trebui să dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar
putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. În
cazul în care nu există nici o secreţie, se poate utiliza urina care trebuie centrifugată şi
însămânţată imediat pe medii de cultură.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor, a celulelor
inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili,
înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar. Aspectul microscopic este
acelaşi ca şi în urmă cu aproape 130 de ani.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Gonococii sunt
germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza
medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective
(ex. mediul GC, geloză-sânge sau geloză-chocolate cu diferite suplimente nutritive; se recomandă
utilizarea pulberii de hemoglobină şi nu a sângelui proaspăt). Este preferată cultivarea „în dublu”, pe medii
selective şi neselective; în cazul în care p.p. este reprezentat de secreţie de la nivelul rectului sau de
secreţie faringiană se vor folosi numai medii selective. Este necesară o atmosferă de 3-10% CO2, la o
temperatură de 35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip S, cu
dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat
faptul că în aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita
identificarea. Placa este eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii, după 72 de ore.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
·         Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, eventual
înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi. Se poate utiliza şi „coloraţia” fluorescentă.
·         Caractere de cultură: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).
·         Caractere biochimice:
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Gonococul metabolizează
glucoza dar nu şi maltoza.
Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2).
 Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv.
Auxotipia evaluează necesităţile nutriţionale ale gonococului.
Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM,
Minitek, Gonochek II etc).
Utilizând galeriaAPI NH(manuală) putem identifica specii
de Neisseria, Haemophilus şi Branhamella catarrhalis,  în circa 4 ore.
·         Caractere antigenice:
În funcţie de structura lipooligozaharidului există 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan mai multe
structuri antigenic diferite, ceea ce creează probleme tehnice. Aceste testări se realizează în centre de
referinţă.
Prezenţa gonococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin coaglutinare (suspensie de S.
aureus tip Cowan I stabilizată şi sensibilizată cu Ac monoclonali antiproteină I din membrana externă a
gonococilor) sau printr-o tehnică imunoenzimatică, ELISA (cu Ac policlonali).
Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscuţi, pentru identificare gonococului prin tehnica imunofluorescenţei
directe.
·         Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.:
Există diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în
centrele de referinţă.
·         Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte bună; se pot utiliza
fie pornind de la culturi fie de la p.p.
- Sondele nucleotidice (ADN) pot hibridiza cu ARNr extras din celulele microbiene.
PCR
LCR (Ligase Chain Reaction); această metodă se poate utiliza pornind de la urină sau de la secreţii vaginale
dar are un dezavantaj - costul.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului) este
recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC suplimentat
nutritiv dar fără pulbere de hemoglobină). Au fost identificate tulpini rezistente la penicilină (fie datorită
unui plasmid care codifică o β-lactamază de tipul TEM, fie datorită unor mutaţii cromozomiale). Este
necesară testarea producerii de β-lactamază (de ex. folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea CMI se
poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 7).
32. 4. 2. În meningita meningococică diagnosticul este urgent (risc de deces şi evoluţie cu sechele), de
importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator. Este de preferat realizarea
unei cultivări „la patul bolnavului”, chiar dacă pentru concentrarea germenilor este necesară
centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică a LCR este utilă în stabilirea etiologiei.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). Aşa cum am
menţionat, recoltarea LCR prin puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin
examinarea fundului de ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce
este necesar pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi
de LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). LCR poate fi purulent. În cazul în care
p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură
apropiată de 37°C). Meningococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau
faringiene etc. Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex
aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti - A, C, Y, W-135 şi
respectiv seruri monovalente anti - B (care pot fi utile şi în identificarea „încrucişată” a antigenului K 1 al E.
coli).
 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Dacă LCR este franc purulent, frotiurile se pot executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial
centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo,
reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Meningococii
sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot
utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) sau
neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-sânge sau geloză-chocolate) pe care formează colonii de tip S sau
de tip M. Este necesară o atmosferă de 3-5% CO2, la o temperatură de 37°C.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
·         Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi
de o structură capsulară comună, nesporulaţi.
·         Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2 mm.
Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tip M.
·         Caractere biochimice:
Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu meningococul
metabolizează atât glucoza cât şi maltoza.
Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2)
Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM,
Minitek etc).
·         Caractere antigenice: În funcţie de structura lipooligozaharidului există 12 serotipuri. Cel mai
important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura capsulară permite subdivizarea
speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y şi W-135.
Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare
sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 şi respectiv seruri
monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat posibilitatea unei reactivităţi
încrucişate faţă de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli.
Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate în cultură.
·         Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Există diferite tehnici (imunologice,
electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de referinţă. Utilizarea PCR
are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la pacienţii pentru care s-a iniţiat deja
antibioticoterapia.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului) este
recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Majoritatea tulpinilor de meningococ
au rămas sensibile la penicilină. Totuşi, realizarea antibiogramei poate fi utilă, orientând continuarea
tratamentului. În cazul unor infecţii grave antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi
capitolul 14).

32. 5. Tratament
Pentru tulpinile de gonococ sensibile se putea utiliza penicilina, având ca alternativă spectinomicina sau
ceftriaxona. În momentul actual unica atitudine corectă este izolarea tulpinii și tratamentul conform
antibiogramei. Ca o regulă generală este de reţinut că este strict necesar ca tratamentul să fie aplicat
tuturor partenerilor sexuali.
În meningita cu meningococ pot fi utile penicilina G, ceftriaxona sau cloramfenicolul, dar nu trebuie
neglijată utilitatea antibiogramei. Foarte recent (2007-2008), au fost identificate în SUA tulpini de
meningococ rezistente la ciprofloxacină. În meningită tratamentul este mai complex, avându-se în vedere
posibilele complicaţii.

33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale.

33. 1. Definiţie. Încadrare
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de genuri şi specii de microorganisme
semnificative din punct de vedere medical. Această familie reprezintă probabil cea mai larg reprezentată
grupare taxonomică, intens studiată, atât din punct de vedere al microbiologiei fundamentale cât şi
datorită implicaţiilor practice, clinice.
Numele acestei familii a fost propus în anul 1937, dar Serratia marcescens a fost descrisă şi a primit acest
nume în 1823. Este adevărat că tulpinile de S. marcescens, producătoare de pigment caracteristic de
culoare roşie, sunt uşor de identificat şi în acelaşi sens se estimează că prezenţa lor a fost luată în discuţie
cu circa 3 secole înainte de Hristos. Salmonella typhi a fost descrisă în 1884, iar Yersinia pestis, după încă
10 ani.
Dacă în 1974, familia includea 12 genuri şi 36 de specii, iar în 1994, 30 de genuri şi 107 specii, în
momentul de faţă familia Enterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de microorganisme
semnificative din punct de vedere medical şi peste 150 de specii (în cazul în care nu luăm în considerare
clasificarea genului Salmonella în peste 2.390 de specii) (vezi şi A.6.5.1. şi capitolele 37-42).
33. 2. Caractere generale
33. 2. 1. Habitat
Enterobacteriile se pot găsi în apă, pe sol, pe plante sau pot coloniza în mod normal intestinul omului şi
animalelor. Totuşi trebuie reţinut că peste 90% din flora intestinală normală umană este formată de
germeni anaerobi.
Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru om, în timp ce altele
(Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus  etc) cuprind specii saprofite sau condiţionat patogene (cu
excepţia anumitor tulpini, patogene) şi se găsesc în flora normală gastrointestinală, sau de ex. în flora
tractului respirator superior.
Când se utilizează termenul de „bacterii enterice”, unii autori includ şi alte genuri
precum Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia Enterobacteriaceae.
33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii având o dimensiune de aproximativ 2-3 / 0,6μm), cu capete
rotunjite, care nu se pot diferenţia prin microscopie optică, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella
spp, Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella spp., Yersinia pestis, Klebsiella spp.), nesporulaţi; unele specii pot
prezenta capsulă (ex. Klebsiella pneumoniae).
33. 2. 3. Caractere biochimice şi caractere de cultură
Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizează
fermentativ glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidază-negativi, catalază-pozitivi, reduc nitraţii la
nitriţi, se pot cultiva pe medii obişnuite formând colonii de tip S, R („vechi”) sau M (pentru speciile
capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau nu lactoza (ex. Salmonella spp., Shigella
spp.). De altfel, caracterele biochimice sunt foarte importante în identificarea enterobacteriilor. În Tratatul
de Microbiologie şi Infecţii Microbiene (Topley and Wilson’s, 2005), nu mai puţin de 11 pagini de tabele
(1.319-1.329) sunt dedicate caracterelor biochimice ale enterobacteriilor (de menţionat că această
prezentare reprezintă o simplificare şi prescurtare privind acest subiect).
33. 2. 4. Structura antigenică
33. 2. 4. 1. Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este format din:
- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxică, format din unităţi dizaharidice de glucozamină fosforilată
de care se ataşează acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (ex. acidul β-hidroximiristic cu 14 atomi de
carbon), care este prezent la toate enterobacteriile şi care se găseşte în natură numai în această structură
particulară, lipidul A. De lipidul A se ataşează:
- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative şi o serie de unităţi
terminale repetitive care diferă de la specie la specie (antigenul O). Antigenul O este termostabil, rezistent
la alcool. Poate fi detectat prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice. Antigenul O este asimilat cu
termenul de endotoxină. Formele „R” sintetizează un LPZ care nu conţine elementele repetitive ale
polizaharidului O, caracteristice culturilor „S”.
Faţă de antigenul O apar în special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde antigene O specifice, dar
un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de exemplu:
- pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella;
- pot exista reacţii încrucişate între E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella;
- anumite structuri antigenice O de la E. coli reacţionează încrucişat cu structuri antigenice izolate de la
genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte antigene de suprafaţă de la celulele animale.

33. 2. 4. 2. Antigenul H este de natură proteică; denaturat de alcool (50°) şi de temperatură (70°C). Este
localizat la nivelul flagelilor (nu există la speciile imobile). Are antigenicitate mai mare decât antigenul O
(dominant); de aceea, pentru a putea apărea combinaţia cu antigenul O, în anumite situaţii, antigenul H
trebuie denaturat în prealabil. Antigenul H poate fi detectat prin reacţii de aglutinare cu antiseruri
specifice (în special cu anticorpi din clasa IgG).
Anticorpii anti-H imobilizează bacteria, atenuând virulenţa microorganismelor mobile, fiind probabil cauza
apariţiei variaţiei de fază la Salmonella. Variaţia de fază este proprietatea bacteriei de a altera exprimarea
unui anumit tip de antigen flagelar.

33. 2. 4. 3. Antigenul K se situează extern faţă de antigenul O, la bacteriile capsulate. Este un antigen
polizaharidic, parţial stabil la temperatură. Dacă este organizată o structură capsulară, aglutinarea cu
antigenul O va fi inhibată. Au fost identificate şi structuri asemănătoare antigenului tipic capsular; spre ex.
la E. coli există antigenul K1. Antigenul K este implicat şi în patogenitate, favorizând rezistenţa la fagocitoză
a bacteriei şi contribuind la invazivitate.

33. 2. 4. 4. La Salmonella typhi există în mod suplimentar antigenul Vi (de virulenţă) care face parte din
antigenele „de înveliş” ale acestei bacterii, are structură polizaharidică şi este implicat în scăderea
complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagică. Poate „masca” antigenul
O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice.
Clasificarea antigenică a enterobacteriilor indică adesea prezenţa fiecărui antigen specific, de exemplu E.
coli O55:K5:H21 etc.

33. 2. 4. 5. Unele enterobacterii elaborează şi exotoxine, spre exemplu toxina SHIGA PRODUSĂ

DE SHIGELLA DYSENTERIAE TIPUL 1, VEROTOXINA PRODUSĂ DE E. COLI O157:H7 ETC.
33. 2. 4. 6. Majoritatea enterobacteriilor prezintă fimbrii, de natură proteică (există 6 tipuri de fimbrii);
unele enterobacterii prezintă şi proteine filamentoase (ex. E. coli) care par să aibă rol în patogenitate.
33. 2. 5. Caractere de patogenitate
Adezinele
Practic toate bacteriile Gram-negative prezintă fimbrii (pili), indispensabili pentru aderarea de mucoase,
acesta fiind primul pas în vederea colonizării şi multiplicării iniţiale.

Toxinele
a). Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella şi la unele tulpini de E. coli),
toxina LT (termic labilă) la E. coli (asemănătoare cu exotoxina vibrionului holeric) etc. Ar mai fi de
menţionat existenţa unor citotoxine produse de E. coli care sunt alfa-hemolizine (exotoxine); beta-
hemolizinele rămân legate de celulă şi inhibă fagocitoza şi chemotaxia leucocitelor.
b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse în peretele tuturor germenilor Gram-negativi, putând determina
în cazul unei eliberări masive (distrugerea brutală a unui număr mare de bacterii) şocul endotoxic.
Administrarea experimentală a lipopolizaharidului la animal determină febră, leucopenie,
trombocitopenie, CID (coagulare intravasculară diseminată), activarea sistemului complement şi eliberarea
de substanţe vasoactive proinflamatorii.

Achiziţia de fier
O serie de enterobacterii sintetizează o componentă care are capacitatea de a chela fierul (siderofor),
complexul format fiind apoi recaptat de către bacterie (de exemplu, aerobactina de la E. coli).

Structurile capsulare
Antigenele de tip K ale  E. coli  au structură proteică şi sunt importante în colonizare; diminuă opsonizarea
şi fagocitoza. Antigenul K1 este un polimer al acidului N-acetil-neuraminic. Este similar cu structuri proprii
gazdei şi este slab imunogen.
Klebsiella prezintă un antigen K (şi respectiv o capsulă) bine reprezentat.
Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoperă (maschează) antigenul O şi are importanţă în invazivitate.

Plasmidele
Sunt importante pentru faptul că transmit atât informaţii genetice legate de rezistenţa la antibiotice
(factor R) cât şi pentru virulenţă.
33. 3. Povestire adevărată
Un pacient de sex masculin, în vârstă de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de leucemie acută
promielocitară de circa 1,5 ani; se internează pentru administrarea tratamentului chimioterapic şi pentru
realizarea unui transplant de celule stem.
La circa 3 ore de la administrarea profilactică de imunoglobuline pe cale i.v., pe un cateter fixat anterior,
pacientul devine febril (temperatură 39,5ºC).
S-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi după aceasta s-a administrat o asociere între o cefalosporină de
generaţia a 3-a şi gentamicină. Sângele a fost însămânţat în bulion sânge, cu trecere „oarbă” după 18 ore,
pe geloză-sânge şi pe un mediu care conţinea eozină şi albastru de metilen. După încă 24 ore, apar culturi
(de tip „S/M”) pe ambele medii, se apreciază că este vorba de colonii lactoză-pozitive, iar examenul
microscopic al coloniilor izolate relevă prezenţa unor bacili Gram-negativi.
Se realizează teste biochimice pe „medii multi test”, microorganismul fiind glucoză-pozitiv şi lactoză-
pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil, indol-negativ, urează-negativ. Analiza preliminară
orientează spre o enterobacterie, dar, se face testul oxidazei care este pozitiv. Efectuând şi alte testări,
diagnosticul final a fost: infecţie cu Agrobacterium radiobacter la un pacient cu imunodepresie. Testarea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a recomandat continuarea tratamentului cu imipenem.
Evoluţia a fost favorabilă, iar la 3 săptămâni de la episodul acut s-a putut realiza tratamentul chimioterapic
şi pacientul a fost pregătit pentru transplantul cu celule stem.
Discuţie
Nu orice bacil Gram-negativ, glucoză-pozitiv şi lactoză-pozitiv este o enterobacterie. Testarea sensibilităţii
la antibiotice şi chimioterapice a revelat o tulpină rezistentă la majoritatea medicamentelor testate,
prezentând sensibilitate numai la ticarcilină, imipenem şi ciprofloxacină. Având în vedere faptul că a fost
vorba de o infecţie la o gazdă imunodeprimată, diagnosticul bacteriologic şi testarea sensibilităţii le
medicamentele antibacteriene sunt strict necesare.

34. Genul Escherichia. Escherichia coli

34. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae, cuprinde germeni comensali
care se găsesc ubicvitar (în apă, pe sol, etc). La nivelul intestinului uman au rol în sinteza unor vitamine
(simbioză). Sunt bacili Gram-negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactoză pozitivi.
Sunt grupați în şase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris și E. albertii. Cu excepţia
speciei E. blattae, izolată de la insecte, toate celelalte specii de Escherichia au fost izolate din prelevate
umane.
Specia tip, reprezentată de Escherichia coli, şi-a căpătat numele în 1919, în memoria lui Theodor Escherich
care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o din materii fecale  denumind-o Bacterium coli
commune.

34. 2. Caractere generale

34. 2. 1. Habitat
E. coli  se găsește în intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind considerată componentă a
florei intestinale normale. Acest rezervor primar a făcut ca E. coli să fie selectată de Organizaţia Mondială a
Sănătaţii ca indicator de poluare fecală (1). Studii întreprinse în ultimii ani indică însă o mult mai mare
complexitate a populaţiei genului Escherichia, ai cărui membri pot circula şi persista autonom, în afara
tractului gastrointestinal, fiind prezenţi în rezervoare secundare din mediul ambiant (2).
34. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi drepţi sau uşor incurbaţi, cu capete rotunjite şi dimensiuni cuprinse între 2-
5µm / 0,5-1µm (pot avea uneori aspect filamentos, pot exista şi forme cocobacilare). În majoritate sunt
mobili, prin prezența flagelilor (în preparatele native). Unele tulpini prezintă capsulă (antigene capsulare
de tip K).
34. 2. 3. Caractere de cultură
Se dezvoltă bine pe medii simple de cultură; pe geloză se pot dezvolta colonii de tip S, lactoză pozitive,
convexe, umede, cu suprafaţă lucioasă, margini netede, uşor emulsionabile în soluţie salină fiziologică sau
colonii de tip R, uscate, cu marginile crenelate, care se emulsionează greu şi neuniform în soluţie salină
fiziologică; există forme intermediare între coloniile S şi R, după cum există şi colonii mucoide de tip M.
34. 2. 4. Caractere biochimice
Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvoltă în limite largi de temperatură şi pH. Asemenea
celorlalte enterobacterii, specia E. coli este catalază pozitivă, oxidază negativă şi fermentează glucoza.
Capacitatea majorităţii tulpinilor de E. coli de a fermenta lactoza este utilă în diferenţierea de alte
enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. coli testate pe medii de identificare
biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H2S, produc indol şi lizindecarboxilază, dar nu urează si
fenilalanindezaminază. În plus, E. coli nu poate creşte pe un mediu care are ca unică sursă de carbon
citratul (caracter metabolic important pentru diferenţierea de alte enterobacterii).
Tulpinile EHEC/VTEC, de regulă, nu fermentează sorbitolul.
34. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Germenii supravieţuiesc în mediul extern (sol, apă) luni de zile. E. coli  este distrus prin expunere la 60ºC în
30 minute. Este sensibil la acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor uzuale.
34. 2. 6. Structură antigenică
Ca şi în cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafața tulpinilor de E.
coli servesc aşa numitei serotipizări, metodă utilă în epidemiologia infecţiilor cauzate de aceste
microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacţii serologice antigen-anticorp (ex. reacţia
de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar) și antigenul K (capsular). Antigenul O
(LPZ) a fost descris la caracterele generale ale enterobacteriilor şi defineşte serogrupul (numerotarea
grupului antigenic este de utilitate epidemiologică; ex. serotipurile O55 şi O111 sunt implicate în izbucniri
epidemice de meningită neonatală). Există peste 170 de variante de Ag O.
În cadrul unui serogrup O, pe baza diversităţii antigenelor H (prezente numai la tulpinile mobile, care
posedă flageli) şi K (prezente la tulpinile care posedă capsulă) se definesc serotipuri. Serogrupurile şi
serotipurile se noteazţ printr-o combinaţie de litere şi cifre (ex. O55:K59:H6). Structurile de suprafaţă pot
masca prezenţa antigenului somatic O.
În majoritatea cazurilor, tipizarea serologică a tulpinilor de E. coli se rezumă la identificarea antigenelor O
şi H (ex. O157:H7).
Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie menţionat că nu
antigenele de suprafaţă conferă virulenţă bacteriei. Cu toate acestea, definirea serotipului poate fi
sugestivă pentru identificarea unor clone virulente (ex. serotipul E. coli O157:H7, marker pentru subgrupul
EHEC din patotipul VTEC).
Datorită faptului că au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de tipuri de antigen
H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K şi o serie de tipuri antigenice fimbriale (antigene F), prin
combinaţiile acestora rezultă peste 1.000 de tipuri antigenice de Escherichia coli.
Unele dintre tulpinile de  E. coli elaborează exotoxine (vezi 37.2.8 şi 37.3). Acestea pot fi, la rândul lor,
structuri antigenice identificate in vitro prin reacţii antigen-anticorp.
34. 2. 7. Răspuns imun
Apare un răspuns imun umoral care nu are semnificaţie nici în ceea ce priveşte protecţia faţă de boală şi
cel mai adesea nici în diagnostic. De reţinut însă că, un titru înalt al anticorpilor anti O157, detectat la
pacienţii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul indirect (imunologic) al
infecţiei cu E. coli O157:H7 (3).
34. 2. 8. Caractere de patogenitate
Tulpinile de E. coli domină microflora facultativ anaerobă a colonului la individul sănătos, marea majoritate
întreţinând cu aceasta relaţii de simbioză benefice ambilor. Ele pot produce infecţii în condiţiile în care
gazda este imunodeprimată sau când depăşesc bariera intestinală şi ajung în zone normal sterile.
Există însă şi tulpini de E. coli care au o virulenţa intrinsecă, putând declanşa variate procese infecţioase la
indivizii imunocompetenţi. Tulpinile patogene de E. coli sunt clasificate în aşa numite patotipuri. Ele
generează simptomatologii similare prin mecanisme de patogenitate comune.
În prezent sunt descrise şase patotipuri de E. coli implicate în sindromul diareic (patotipuri intestinale) (4)
şi un patotip implicat în infecţii extraintestinale (ex. infecţiile tractului urinar, meningite, septicemii, etc.) şi
denumit E. coli cu patogenitate extraintestinală (ExPEC) (5). Patotipurile intestinale sunt: E.
coli enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxigen (ETEC), E. coli enteroinvaziv (EIEC), E. coli producător de
verotoxine (VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC) și E. coli cu aderenţă difuză (DAEC). În cadrul patotipului
VTEC se distinge, pentru a se sublinia în principal asocierea cu manifestări clinice severe (ex. colita
hemoragică), subgrupul de tulpini de E. coli enterohemoragic (EHEC), care are ca prototip serotipul
O157:H7.
Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulenţă, care afecteaza variatele procese desfăşurate la
nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcţia citoscheletului, diviziunea celulară, secreţia de ioni,
funcţia mitocondriilor, apoptoza etc.). Aceşti factori de virulenţă sunt codificaţi de structuri genetice
localizate în cromozom sau pe plasmide şi intervin în mecanismele de patogenitate folosite de bacterie
pentru a învinge sistemele de apărare ale gazdei.
 Adezinele sunt structuri de aderenţă aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile de E.
coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la suprafaţa membranei
externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezintă factori de virulenţa
importanţi, care permit bacteriei să colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subţire, tract urinar,
vagin), in care nu rezidă în mod normal.
Toxinele sunt o altă categorie de factori de virulenţă. Endotoxinele fac parte din structura membranei
externe (lipidul A din complexul LPZ) şi sunt invariabil prezente la toate bacteriile Gram negative, nu
numai la E. coli, indiferent de potenţialul lor de patogenitate. Eliberate în urma distrucţiei peretelui
bacterian îşi manifestă efectele toxice, fiind implicate în apariţia febrei şi şocului toxic din septicemii.
Exotoxinele sunt sintetizate şi secretate în cursul metabolismului bacterian, fiind specifice nu numai
speciei, ci diverselor patotipuri de E. coli. În prezent se cunosc structura si funcţiile a numeroase toxine
responsabile de patogenitatea tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabilă şi termostabilă produse de
tulpinile ETEC, verotoxinele 1 şi 2 sintetizate de tulpinile VTEC, enterotoxina termostabilă enteroagregativă
1 a tulpinilor EAEC, etc.).
Multe dintre tulpinile ExPEC implicate în producerea meningitei neonatale sau a infecţiilor urinare prezintă
capsulă, o altă componentă importantă pentru patogenitatea speciei. Rolul principal al capsulei este de a
inhiba acţiunea complementului seric şi fagocitoza, conferind astfel rezistenţă bacteriei. Antigenul
polizaharidic capsular K1 este prezent în 80% din tulpinile de E. coli izolate din cazuri de meningită
neonatală (6).  

35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae.

35. 1. Definiţie. Încadrare
Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate printr-o
intensă activitate metabolică asupra hidraţilor de carbon pe care îi hidrolizează cu producerea de acizi şi
uneori de gaz. Glucoza este degradată cu producere de gaz.
Specia tip a fost descrisă în 1885 sub numele de Bakterium lactis aerogenes. Numele actual datează din
1954 fiind atribuit în onoarea microbiologului german Edwin Klebs. Klebsiella pneumoniae  este cunoscută
şi sub numele de Bacillus Friedländer.
Există mai multe specii de exemplu K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis  şiK. oxytoca, aceste
tulpini fiind şi cele mai des implicate în patologia umană. În ultima perioadă se consideră K. ozaenae şi K.
rhinoscleromatis drept subspecii ale K. pneumoniae.
Recent, câţiva membri ai genului Klebsiella  au fost reclasificaţi pentru a forma un nou gen, Raoultella, pe
baza informaţiilor din studii genetice. Membrii acestui nou gen pot fi implicaţi şi în patologia umană, iar
denumirea a fost adoptată la nivelul comunităţii ştiinţifice internaţionale [1].

35. 2. Caractere generale

35. 2. 1. Habitat
Klebsiella pneumoniae este larg răspândită în natură (sol, apă), dar şi în intestinul omului şi animalelor; în
mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezistente ce pot coloniza tractul urinar sau respirator la adult
sau tractul intestinal la copil, mai ales după terapia prelungită cu antibiotice cu spectru larg.
Mai multe studii au urmărit „pattern-ul” de colonizare cu cu Klebsiella pneumoniaea indivizilor, cu scopul
de a determina factorii de risc pentru infecţii. S-a demonstrat astfel că aproximativ o treime din
persoanele testate prezintă portaj de Klebsiella  în fecale. Spitalizarea şi folosirea de antibiotice a crescut
numărul celor colonizaţi de bacterii din genul Klebsiella, cât şi numărul acestor bacterii per gram de fecale.
Personalul medical prezintă Klebsiella pe mâini după ce îngrijesc pacienţi (într-un studiu, 17% din
asistentele unei secţii de terapie intensivă; rate şi mai mari au fost înregistrate în cursul unui focar
epidemiologic activ – 30 % [2]).
35. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulaţi (capsula are dimensiuni de 2-3 ori mai mari
decât diametrul bacteriei), imobili, nesporulaţi. Se pot dispune în diplo, în special în organismul uman.
35. 2. 3. Caractere de cultură
Se cultivă cu uşurinţă pe medii uzuale fără cerinţe nutritive speciale. Pe medii gelozate s-au descris mai
multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M): colonii mari, opalescente, uneori cenuşii, cu
suprafaţa umedă care după o incubare prelungită prezintă tendinţă la confluare şi „curgere” pe suprafaţa
mediului. Pe medii lactozate sunt lactoză-pozitive. Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt
selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. S-a raportat apariţia unor tulpini ce dezvolta
colonii hipermucoide, aceste tulpini având şi o virulenţă crescută [3].
35. 2. 4. Caractere biochimice
Pe mediile multitest germenii au următorul comportament enzimatic: pe mediul TSI sunt glucoză-pozitivi
şi uneori fermentează glucoza cu producere de gaz, sunt lactoză-pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe
mediul MIU sunt imobili, indol-negativi şi urează-pozitivi; pot creşte pe medii având citratul drept unică
sursă de carbon. Sunt germeni catalază pozitivi, oxidază negativi.
35. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Sunt puţin rezistenţi la căldură (distruşi în 5-7 minute la 100°C); pe sol, în alimente rezistă un mare număr
de zile. Dezinfectantele obişnuite îi distrug în intervale de timp cuprinse între 30 de minute şi 2 ore.
35. 2. 6. Structură antigenică
Particularităţile morfologice ale klebsiellelor se reflectă în structura antigenică. Au fost descrise antigene
somatice O (LPZ) specifice de grup şi antigene capsulare polizaharidice K, specifice de tip. Există peste 80
de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin reacţia de umflare a capsulei şi (prin analize serologice sau
de microbiologie moleculară).
35. 2. 7. Caractere de patogenitate
Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiţionat patogen, care poate fi implicat în patologia
umană prin multiplicare şi invazivitate.
 Factorii de patogenitate sunt reprezentaţi de capsula (antigenul K) care îi conferă rezistenţă faţă de
fagocitoză şi de endotoxina (antigenul O) eliberată după distrugerea bacteriei.
Sideroforii membranari sechestrează Fe2+ în focarul infecţios, pentru a asigura un nivel adecvat creşterii
bacteriene. Deşi nu reprezintă un rol central în patogenitate, într-un model murin de peritonită, s-a
demonstrat creşterea virulenţei tulpinilor de Klebsiella prin introducerea genei care codifică sideroforul
aerobactin.
Biofilmul reprezintă o matrice extrem de bine organizata ce înconjoară bacteriile. Ele favorizează aderarea
bacteriană pe suprafaţa cateterelor.
Adezinele cele mai întâlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul 1 şi 3. Există o
interrelaţie între adezinele exprimate şi cantitatea de biofilm produs [4].

35. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Considerată iniţial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit că numai 1-3 % din pneumonii
sunt produse de  Klebsiella pneumoniae, dar aceste pneumonii pot fi extrem de grave (pneumonii
necrotice şi hemoragice), în special la pacienţi cu un sistem de apărare deficitar.
Klebsiella pneumoniae poate fi implicată într-o mare varietate de boli precum toxiinfecţii alimentare de tip
infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii urinare etc. Din ce în ce mai frecvent acest
microorganism apare în infecţii nosocomiale (de spital), la fel ca şi Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae a
fost izolată din mucoasa nazală a pacienţilor cu ozenă (atrofie progresivă a mucoasei cu pierderea
mirosului) iar  Klebsiella rhinoscleromatis s-a izolat de la pacienţi cu rinosclerom (granulom distructiv al
nasului şi faringelui).
Tulpini aparţinând serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar, hepatic, cerebral. Dintre
acestea o tulpină de Klebsiella pneumoniae deosebit de virulentă a fost izolată în special în ţările asiatice,
această tulpină produce majoritatea abceselor hepatice primare bacteriene [5-7]. Într-un model murin,
secvenţa de evenimente ce a condus la constituirea unui abces bacterian primar după inoculare orală a
fost:
·         colonizare intestinală (la 12 ore),
·         diseminare extraintestinală (între 12 şi 24 ore),
·         replicare hepatică (la 36 ore),
·         metastazare septică (după 48 ore).
S-a tentat identificarea unor gene care favorizează producerea abcesului hepatic [8-10].
În ultima vreme tulpini de Klebsiella  producătoare de β-lactamaze sunt tot mai des responsabile de
infecţii nosocomiale mai ales la pacienţi iimunocompromişi. De o importanţă particulară sunt enzimele cu
activitate β-lactamazică cu spectru extins (Extended Spectrum Beta Lactamaze, ESBL); tulpinile
de Klebsiella producătoare de ESBL sunt recunoscute în patologia umană datorită dificultăţii tratamentului
curativ.
Tratamentul de primă linie pentru tulpinile de K. pneumoniae producătoare de ESBL a fost reprezentat de
carbapeneme. În 1996 s-a identificat pentru prima oară în SUA o tulpină producătoare de carbapenemaze
(Klebsiella pneumoniae  Carbapenemase - KPC).

35. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

Klebsiella
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
Cu toate că nu este cea mai reprezentativă entitate clinică pentru acest gen, vom discuta în continuare
diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include elemente
clinice, paraclinice (ex. examenul radiologic) şi de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util în
stabilirea etiologiei şi tratamentului antibiotic corespunzător.
Diagnosticul bacteriologic (direct) include etapele cunoscute.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientul să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct
de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, etc.). În infecţiile
produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urină, sânge, puroi, etc. În continuare vom
discuta cazul în care p.p. este reprezentat de spută (vezi şi anexa nr. 6). Din punct de vedere macroscopic,
sputa poate avea un aspect mucoid, de culoare roşu închis, „în jeleu de coacăze”.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel
alveolar (ex. macrofage alveolare), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa bacililor
Gram-negativi, de dimensiuni relativ mari, încapsulaţi (înconjuraţi de o capsulă voluminoasă).
Examinarea microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o
identificare prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi anexa nr. 6). În coloraţia cu albastru de
metilen, capsula apare ca un halou în jurul klebsielelor. Utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o
identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacţia de umflare a capsulei (vezi şi anexa
nr. 2).
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Klebsiella
pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Se preferă utilizarea
unor medii de cultură slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt
selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella
pneumoniae formează colonii lactoză-pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, în „picătură de
miere”, care dau aspectul de „curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă de confluare. Se
poate realiza şi inocularea la animale de laborator sensibile, şoarecele alb (vezi şi anexa nr. 2).
Există medii de cultură selective/diferenţiale care pot ajuta în diagnosticul rapid al infecţiilor
cu Klebsiella sau aducând informaţii epidemiologice de valoare (izolarea de tulpini producătoare de ESBL,
datorită rezistenţei la o doză de antibiotic inclusă în mediu). Valorile de sensibitilitate şi specificitate a
acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie să fie folosite cu prudenţă, pentru a nu oferi rezultate fals-
negative prin limitarea altor germeni posibili implicaţi în procesul patogenic. [11]
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
·         Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulaţi, capsula fiind
voluminoasă, dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi. În mediul de cultură pot pierde capsula.
·         Caractere de cultură: produc colonii lactoză-pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4
mm la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în „picătură de miere”, care dau aspectul de „curgere” pe
suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare. Pe mediul MacConkey coloniile apar roşii
(fermentează lactoza, cu producerea de gaz).
·         Caractere biochimice:
·         Klebsiella este un microorganism lactoză-pozitiv, ceea ce se poate evidenţia încă din etapa de
izolare pe mediul MacConkey (virează culoarea mediului în roşu);
·         alte caractere biochimice se studiază după repicarea unor colonii pe medii multi- test (TSI, MIU), pe
mediul Simmons sau în sisteme multi-test comerciale de tip API;
·         Klebsiella pneumoniae este glucoză-pozitivă (cu producere de gaz), lactoză-pozitivă, nu produce
H2S, imobilă, urează-pozitivă, indol-negativă, care se dezvoltă folosind citratul ca unică sursă de carbon; K.
oxytoca e indol-pozitivă acesta fiind un caracter ce poate fi folosit în schema de diagnostic de laborator
diferenţial.
·         produce acetoină din glucoză, caracter evidenţiat prin reacţia Voges-Proskauer (adăugarea de
hidroxid de potasiu duce la virarea în roşu a unei  culturi bacteriene în care se află acetoină, în prezenţa
unui indicator de pH precum alfa-naftol).
·         Caractere antigenice: se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor
de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare, ELISA [12], Western Blot sau latex aglutinare. Există
peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiella pneumoniae. Aceste reacţii se practică în laboratoare de
referinţă.
·         Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la şoarecele alb (vezi şi anexa nr. 2).
·         Alte caractere / teste utilizate în identificare care se pot utiliza (în centre de referinţă):
·         testarea sensibilităţii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite în Institutul Cantacuzino);
·         gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice;
·         bacteriocinotipie;
·         caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu
identificarea plasmidelor implicate în virulenţă etc.).
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului)
este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI şi CMB poate fi
necesară (vezi capitolul 7). Klebsiella pneumoniae reprezintă unul dintre microorganismele cu o rezistenţă
remarcabilă faţă de antibiotice şi chimioterapice. Când sunt detectate, tulpinile producătoare de β-
lactamaze şi carbapenemaze necesită teste moleculare pentru a determina cu exactitate substratul
rezistenţei.

36. Genul Proteus

36. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Proteus este format din germeni pleomorfi, foarte mobili, Gram-negativi, care nu fermentează
lactoza, produc urează, sunt nesporulaţi, necapsulaţi. Există 2 specii principale,  Proteus
mirabilis  şi Proteus vulgaris  (P. morganii a devenit Morganella morganii, iar P. rettgeri a
devenit Providencia rettgeri); celelalte 3 specii sunt P. myxofaciens, P. penneri şi P. hauseri.
Majoritatea tulpinilor din genurile înrudite (Proteus, Morganella, Providencia) au anumite caractere
comune (ex. mobilitatea, rezistenţa la KCN, producerea de indol).

36. 2. Caractere generale

36. 2. 1. Habitat
Germenii din genul Proteus sunt răspândiţi în natură ubicvitar, se pot identifica în materiile organice în
putrefacţie, în alimente. Fac parte din flora intestinală umană.
36. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde şi numele, derivat din mitologia antică),
pe frotiu putându-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de până la 50-80 µm. Prezintă un mare
număr de cili peritrichi care le conferă mobilitatea caracteristică (dar există şi tulpini aciliate). Sunt
necapsulaţi şi nesporulaţi.
36. 2. 3. Caractere de cultură
Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui miros caracteristic de
putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH. Pe mediile diferenţiale (cu lactoză) nu se pot
obţine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie (migrare). Cultura se întinde pe toată suprafaţa
plăcii (sau tubului) în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat
prin incorporarea în mediu de săruri biliare, tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide, neomicină,
cărbune activat etc.
Dacă pe o placă cu mediu solid se cultivă 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, acestea se vor dezvolta
invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea o linie de demarcaţie între cele
2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaţie).
Cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens al unui tub cu geloză înclinată incubat în poziţie
verticală, va conduce (în cazul în care în produsul patologic există o tulpină de Proteus spp.) la obţinerea în
24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorită mobilităţii acestor microorganisme (fenomenul de
„căţărare”).
36. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab şi moderat selective pe care fenomenul de migrare a fost
inhibat, speciile de Proteus dezvoltă colonii de tip S, lactoză-negative (vezi 36. 4.). Microorganismele din
genul Proteus sunt glucoză-pozitive, lactoză-negative, produc H 2S, sunt urează-pozitive, indol-pozitive
(exceptând P. mirabilis şi P. myxofaciens) iar pe mediul MIU se poate constata mobilitatea.
36. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Are o rezistenţă relativ crescută în mediu, în alimente etc şi poate rezista în soluţii antiseptice sau în
detergenţi, ceea ce poate crea probleme deosebite în mediul de spital. Rezistă mai multe luni la
temperaturi joase, inclusiv în alimentele congelate. Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este
considerabilă.
36. 2. 6. Structură antigenică
Prezintă antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. După constatarea că serul bolnavilor de tifos
exantematic aglutinează cu o tulpină de proteus s-a demonstrat că genul include o serie de tulpini (OX-2,
OX-19, OX-K) care au înrudiri antigenice cu microorganisme aparţinând genului Rickettsia.
Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri.
36. 2. 7. Răspuns imun
Postinfecţios apare un răspuns imun umoral care însă nu are utilitate practică.
36. 2. 8. Caractere de patogenitate
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate, în condiţii speciale (părăsirea habitatului
natural, colonizarea unor gazde cu deficienţe ale sistemului imunitar).
La fel ca şi ceilalţi germeni Gram-negativi, eliberează de la nivel parietal, după distrugere, endotoxina
(antigenul O, LPZ).
Mobilitatea deosebită îi permite invadarea tractului urinar.
Producerea de urează alcalinizează urina şi favorizează formarea de calculi (de ex. de struvită). Existenţa
calculilor favorizează apariţia altor infecţii urinare sau cronicizarea acestora.
Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este remarcabilă.

36. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
De regulă microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic în afecţiuni ce apar în afara
tractului digestiv. Există totuşi şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios în care aceşti germeni au
reprezentat agenţii cauzali.
În mod frecvent se discută despre infecţiile cu proteus la nivelul tractului urinar, dar sunt posibile mai rar
şi alte infecţii (genitale, pleurezii, alte localizări în cursul unei bacteriemii) de regulă la pacienţi cu status
imun deficitar sau în spital (infecţii nosocomiale).

39. Genul Salmonella

39. 1. Definiţie. Încadrare
Importanţa clinică a microorganismelor din genul Salmonella a fost cunoscută cu mult înainte de studiile
omologiei ADN sau de realizarea secvenţelor ARNr 16S. Pe baza unei omologii ADN-ADN de aproximativ
90%, Salmonella şi E. coli ar fi să facă parte din acelaşi gen, dar protestul microbiologilor şi clinicienilor
obişnuiţi cu vechile denumiri a împiedicat acest lucru.
Una dintre clasificările acceptate la ora actuală grupează genul în 3 specii (Ewing):
- S. typhi patogenă numai pentru om;
- S. choleraesuis, patogenă la porc şi ocazional la om (numită ulterior S. enterica), cu 1.416 serotipuri;
- S. enteritidis, cauză de diaree la om şi la animal.
Serotipurile nu se scriu cu litere italice. De ex. S. typhimurium ar putea fi scrisă actual Salmonella ser.
Typhimurium, sau Salmonella Typhimurium sau pe scurt Typhimurium.
Sunt autori care consideră că serotipul corespunde speciei şi în acest caz, în genul Salmonella ar putea fi
luate în considerare peste 2.390 specii.
Salmonella, ca şi E. coli, a reprezentat un subiect de studiu, servind ca model pentru metabolismul
bacterian, genetica bacteriană sau studii de virulenţă. Este de asemenea un indicator al gradului de
siguranţă al conductelor de apă, dar relativ de curând a apărut „rolul” ei în a onora o persoană publică
cum ar fi S. mjordan (cu referire la baschetbalistul american).

39. 2. Caractere generale

39. 2. 1. Habitat
Salmonelele sunt foarte larg răspândite în natură şi prezente la toate speciile de animale, păsări, peşti,
şerpi, insecte. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor. Veriga alimentară este esenţială în infectarea
umană.
39. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili peritrichi (cu excepţia S.
galinarum pullorum), necapsulaţi, nesporulaţi.
39. 2. 3. Caractere de cultură
Se multiplică pe medii de cultură simple şi formează colonii de tip S sau R (prin
„îmbătrânire”). Salmonella ser. Paratyphi B poate produce colonii de tip M.
Pe mediile selective cu lactoză dau naştere unor colonii lactoză-negative. Pe geloza Wilson-Blair formează
colonii caracteristice, opace, cu suprafaţa rugoasă şi margini neregulate, prezentând un halou negru şi
luciu metalic.
39. 2. 4. Caractere biochimice
Fermentează glucoza cu formare de gaz (nu şi S. typhi), nu fermentează lactoza, formează hidrogen
sulfurat (există şi excepţii), nu formează indol, nu produc urează, cresc pe mediul cu citrat ca unică sursă
de carbon (Simmons pozitiv), sunt aerobi, facultativ anaerobi.
39. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Se pot multiplica într-un interval larg de temperatură (7-48ºC) şi la un pH între 4 şi 8. Sunt puţin rezistente
la căldură (spre exemplu sunt distruse în 5-7 minute la 100°); pe sol (păşuni) rezistă circa 200 de zile, în
alimente rezistă 10-180 de zile (rezistă 4 ani în pulberea de ouă, a cărei utilizare în alimentaţie este
contraindicată). Dezinfectantele obişnuite le distrug în intervale de timp cuprinse între 30 de minute şi 2
ore.
39. 2. 6. Structură antigenică
Modul în care o tulpină este definită din punct de vedere antigenic cuprinde 3 părţi (antigenul O, faza 1
de la antigenul H şi faza 2 de la antigenul H).
Antigenul O este caracteristic tuturor microbilor Gram-negativi. Există peste 60 de structuri antigenice O
diferite care definesc 46 de serogrupuri O; unul sau mai mulţi factori asociaţi determină formula
antigenică a unei anumite grupe serologice care este notată cu literele mari ale alfabetului sau doar cu
cifrele respective (A…Z, O51…O67) (1 ... 51 ... 67). A fost descris fenomenul de variaţie genetică în legătură cu
antigenul O.
Antigenele de înveliş includ de exemplu antigenul Vi la S. typhi şi Salmonella ser. Paratyphi C; structurile
antigenice Vi reprezintă substratul de fixare a bacteriofagilor, acoperă antigenul O şi nu permit reacţia de
aglutinare; se asociază virulenţei şi invazivităţii (determină leucopenie, nu permit legarea componentei
C3b şi în acest mod inhibă fagocitoza şi determină capacitatea de multiplicare intrafagocitară).
Antigenul H este de natură proteică, se găseşte la nivelul cililor peritrichi, este determinant de tip, cu
posibilitatea unei variaţii de fază. Majoritatea serotipurilor de Salmonella pot exprima alternativ două
tipuri de flageli cu specificităţi antigenice diferite. Din 1986 s-a văzut că unele tulpini de Salmonella pot
exprima trei sau mai multe tipuri de flageli cu antigenicitate distinctă.
Variaţia antigenică se poate realiza de ex. prin transducţie existând mai multe posibilităţi: pot pierde
antigenul H şi devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se „transformă” în colonii R; pot pierde
parţial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N acetil-galactosaminuronic).
Există antigene şi la nivelul fimbriilor. Apariţia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la pacienţi cu febră tifoidă
sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariţia unor reacţii fals-pozitive în cadrul analizei
serice cantitative (reacţia de aglutinare în tuburi).
Schema de clasificare Ewing a fost prezentată anterior. Schema de identificare serologică Kaufmann-White
subîmparte genul Salmonella în foarte multe grupe şi „specii”, spre ex. în grupul A, S. paratyphi A; în
grupul B, S. paratyphi B, S. typhimurium; în grupul C, S. paratyphi C; în grupul D, S. typhi, S. enteritidis etc.
Conform schemei Kaufman-White există S. dublin, care în schema Ewing poartă numele de S.
enteritidis serotipul dublin. Există şi alte scheme de clasificare.
39. 2. 7. Răspuns imun
Apare răspuns imun umoral detectabil în special după infecţiile extraintestinale. Este certă apariţia
răspunsului imun după infecţii produse de S. typhi  şi paratyphi  (Paratyphi), cu punerea în evidenţă a
anticorpilor circulanţi anti O, anti H şi anti Vi. Anticorpii anti O şi anti Vi au rol protector. Apariţia
anticorpilor din clasa IgA secretorii pot împiedica ataşarea la nivelul epiteliului intestinal.
39. 2. 8. Caractere de patogenitate
Salmonella spp., devine patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Primul pas, obligatoriu, este reprezentat
de colonizare, realizată cu ajutorul unor structuri de aderare, adezinele şi fimbriile, care induc modificări la
nivelul membranei celulare. Studii de fiziopatologie fundamentală au reprezentat prima dovadă a
existenţei unui receptor hormonal afectat prin ataşare şi invazie bacteriană.
De menţionat faptul că la genul Salmonella a fost pus în evidenţă un grup de gene (genele de
invazivitate), unele din ele fiind asemănătoare cu gene identificate la genul Yersinia.
Salmonella spp., supravieţuieşte intrafagocitar datorită prezenţei unor structuri de suprafaţă precum şi prin
sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca răspuns la fagocitare. Antigenul Vi
contribuie (pentru S. typhi şi Salmonella Paratyphi C la rezistenţa la fagocitoză şi rezistenţa după
fagocitoză).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat după distrugerea germenilor, are un rol important în patogenitate.
Tulpinile care produc toxiinfecţii alimentare secretă „enterotoxine” cu proprietăţi antigenice şi biologice
asemănătoare toxinei holerice.

39. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Principial infecţiile produse de salmonele se pot împărţi în salmoneloze minore (enterocolite) şi
salmoneloze majore (febra tifoidă).
Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecţia alimentară de tip infecţios, salmoneloza) apare după ingestia a
105-108 salmonele. După ingestie are loc ataşarea şi adsorbţia la nivelul celulelor epiteliale în porţiunea
terminală a intestinului subţire, apoi penetrarea prin celule şi migrarea în lamina propria, în regiunea
ileocecală. La acest nivel are loc multiplicarea în foliculii limfoizi determinând hipertrofia şi hiperplazia SRE
(sistemului reticulo-endotelial). Acumularea de PMN determină o reacţie inflamatorie cu eliberare de
prostaglandine care duc la stimularea secreţiei intestinale, urmată de diaree (nesanguinolentă), greaţă,
vărsături; mai pot apărea febră, dureri abdominale, mialgii, dureri de cap (cefalee). Persoana infectată
poate fi contagioasă timp de circa 3 luni. Simptomele sunt mai severe la copiii mai mici de 10 ani şi la
bolnavii imunocompromişi (ex. infectaţi cu HIV / SIDA).
Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 10 3 salmonele. După ingestie are loc
ataşarea şi trecerea S. typhi prin şi printre celulele epiteliale de la nivelul ansei ileocecale, urmată de
multiplicarea activă în submucoasă şi de fagocitarea de către macrofage. Aici bacilii rămân vii şi se
multiplică (în macrofagele din formaţiunile limfoide intestinale), apoi trec în ganglionii mezenterici, apoi în
canalul toracic, producând bacteriemia iniţială (care reprezintă debutul clinic al bolii), urmată de invadarea
altor organe şi formaţiuni limfatice.
Multiplicarea crescută mai ales în organele SRE (ficat, splină) este urmată de o a doua bacteriemie masivă
şi de eliminarea prin bilă şi / sau urină. La sfârşitul primei săptămâni de boală, salmonella se elimină din
foliculii intestinali şi prin bilă în materiile fecale, excreţia prelungindu-se mult timp în convalescenţă. Pot
apărea angiocolită, colecistită; bolnavul poate deveni purtător (portaj de Salmonella) după vindecare.
Simptomatologia generală (afectarea stării generale, febră, stare de şoc) este determinată în special de
endotoxină care activează diferite cascade inflamatorii şi producerea de citokine, iar simptomatologia
digestivă (anorexie, dureri, constipaţie sau diaree) este consecinţa agresiunii intestinale, hepatice şi asupra
vezicii biliare.

40. Genul Shigella

40. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Shigella include bacili Gram-negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, oxidază-negativi, lactoză
negativi. Shigella spp. nu aparţine florei normale intestinale. Genul Shigella ar trebui să facă parte, conform
studiilor de biologie moleculară, dintr-un gen care să includă şi Escherichia spp., genul Escherichia-
Shigella. Cu toate acestea, este în continuare acceptată tratarea separată a celor două genuri
înrudite. Există mai multe specii. Pe baza structurii antigenice au fost diferenţiate patru subgrupe (A-D)
respectiv Shigella dysenteriae (serotipuri), S. flexneri (6 serotipuri care se pot subdiviza în sub-serotipuri), S.
boydii (18 serotipuri) şi S. sonnei (1 serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R şi S).

40. 2. Caractere generale

40. 2. 1. Habitat
Germenii se pot găsi în intestinul şi scaunul omului bolnav. În funcţie de anumite condiţii, shigellele se pot
izola din apă, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul muştelor.
40. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi, imobili, cu dimensiuni de 2-3 µm / 0,5-0,8 µm, necapsulaţi, nesporulaţi.
40. 2. 3. Caractere de cultură
Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S. Pe mediile cu lactoză (ex. ADCL, AABTL) formează colonii
de tip S, lactoză-negative. Pentru izolare din materiile fecale sunt utilizate medii diferenţiale (cu lactoză şi
indicator de pH) şi / sau medii selective (mediul Shigella-Salmonella cu săruri biliare etc).
40. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi, glucoză-pozitivi fără producere de gaz, lactoză-negativi, nu
produc H2S, urează-negativi, indol-negativi, imobili. Subgrupele A-D se pot diferenţia pe baza fermentării
manitei (subgrupul A este manită-negativ).
40. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Shigellele sunt inactivate în 10 minute la 50-60ºC. ÎN PRAF USCAT REZISTĂ CIRCA 10 ZILE, PE LENJERIE
POT SUPRAVIEŢUI PESTE 2 SĂPTĂMÂNI. ÎN APE, LA O TEMPERATURĂ DE 7-10ºC POT SUPRAVIEŢUI CIRCA
9 ZILE, ÎN ALIMENTE CIRCA 1-2 SĂPTĂMÂNI, IAR ÎN GHEAŢĂ PÂNĂ LA 2 LUNI.
40. 2. 6. Structură antigenică
Subgrupele sunt divizate pe baza structurii antigenului O (LPZ). Subgrupul A (Sh. dysenteriae) include 10
serotipuri dintre care cel mai patogen este tipul 1, Shigella shiga. Subgrupul B (Sh. flexneri) include mai
multe tipuri şi subtipuri serologice. Subgrupul C (Sh. boydii) cuprinde 15 serotipuri iar subgrupul D (Sh.
sonnei) cuprinde o singură specie în 2 faze distincte antigenic (S şi R).
Există tulpini care prezintă la suprafaţă structuri antigenice de tip K.
Sh. shiga elaborează şi o exotoxină termolabilă, cu structură proteică.
40. 2. 7. Răspuns imun
Infecţia cu Shigella spp. duce la stimularea răspunsului imun umoral, cu apariţia de anticorpi care însă nu
conferă protecţie. Apariţia de anticorpi locali de tip IgA (eventual după administrarea de vaccinuri vii
atenuate) ar putea avea o utilitate în prevenirea infecţiei.
40. 2. 8. Caractere de patogenitate
Shigella este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. În cazul serotipului 1 din subgrupul A (Sh. shiga)
este implicată şi toxigeneza.
La fel ca toate microorganismele Gram-negative, shigellele elaborează lipopolizaharidul parietal, care se
eliberează ca endotoxină, după distrugerea bacteriei. Endotoxina (antigenul O) este implicată în patogenia
dizenteriei, având o acţiune iritativă la nivel intestinal.
Exotoxina shiga afectează atât intestinul (fiind implicată în mecanismul de producere al diareei), cât şi
sistemul nervos central (putând conduce la apariţia unor fenomene de meningism sau chiar pierderea
stării de conştienţă, comă). Faţă de animalele de experienţă are efect letal.

40. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Infecţiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate apărea după
ingestia a numai 100 de bacterii, care se localizează, se multiplică şi invadează epiteliul intestinal (pot
apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la nivelul ileonului terminal, abcese care evoluează spre
ulceraţie, necroză, hemoragie).
După o perioadă de incubaţie de circa 2-5 zile, în cazul unei dizenterii tipice apar brusc febră, diaree
apoasă, dureri abdominale intense. Ulterior se elimină scaune foarte numeroase (20-40 / zi), nefecaloide,
cu mucus, puroi şi sânge, însoţite de colici intestinale şi tenesme rectale. Starea generală se înrăutăţeşte
(mai grav în cazul unei infecţii produse de Sh. shiga) şi problema principală este reprezentată la fel ca şi în
cazul altor diarei, de pierderile hidro-electrolitice şi instalarea unui sindrom de deshidratare acută. În lipsa
tratamentului corespunzător (în special în lipsa reechilibrării hidro-electrolitice) evoluţia poate fi fatală.
În afară de dizenterie, shigelele pot produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.

41. Genul Yersinia

41. 1. Definiţie. Încadrare
Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili Gram-negativi, care prezintă
coloraţie bipolară. Nu formează spori, pot prezenta structuri de tip capsular. Sunt aerobi facultativ
anaerobi, catalază-pozitivi, oxidază-negativi. Majoritatea au drept gazdă naturală animalele şi pot produce
boli (uneori foarte grave) umane.
Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru om: Yersinia pestis (cauza ciumei), Y.
pseudotuberculosis şi Y. enterocolitica. Numele Yersinia a fost dat în onoarea lui Alexander Yersin, care a
izolat bacilul pestei, în Hong-Kong, în anul 1894

41. 2. Caractere generale

41. 2. 1. Habitat
Microorganismul poate fi identificat numai la animale (ex. rozătoare - şobolani) sau la omul bolnav. Se
poate transmite prin plăgi muşcate, de la o rozătoare la alta sau ocazional la om prin intermediul
purecilor. Rezultă infecţii grave, posibil mortale. În USA, ultimul caz de transmitere interumană a fost
raportat în 1924.
41. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Y. pestis este un bacil Gram-negativ, imobil, care prezintă o coloraţie bipolară. Pe frotiuri bacilii pot apare
atât izolaţi cât şi dispuşi în lanţuri scurte şi sunt nesporulaţi. Există şi forme cocobacilare. În organismele vii
şi în culturile tinere, prezintă un înveliş pseudocapsular.
41. 2. 3. Caractere de cultură
Aerob facultativ anaerob, se dezvoltă mai rapid pe medii ce conţin sânge sau fluide organice şi la 30°C dar
se poate multiplica şi pe medii simple. În culturi pe geloză-sânge la 37°C coloniile pot fi foarte mici şi apar
după circa 24 ore. O inoculare a unor microorganisme virulente recoltate direct din ţesutul infectat
conduce la apariţia unor colonii de tip S, sau cu aspect mucoid, vâscoase şi colorate alb-gri. După
realizarea unor pasaje în laborator, coloniile devin neregulate şi aspre (de tip R); capsula dispare.
41. 2. 4. Caractere biochimice
Yersinia pestis are o activitate biochimică relativ scăzută şi cu un grad de variabilitate. Este un germen
aerob, facultativ anaerob, fermentează glucoza şi în mod variabil fermentează lactoza. Y. pestis şi Y.
pseudotuberculosis au caractere biochimice similare.
41. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Sunt germeni puţin rezistenţi faţă de agenţii fizici şi chimici, dar în mediul extern pot supravieţui până la
circa 2 săptămâni în puroi sau în spută şi câteva luni în cadavre.
41. 2. 6. Structură antigenică
Yersiniile, la fel ca toate microorganismele Gram-negative, prezintă la nivelul peretelui antigenul O (LPZ,
endotoxina).
Y. pestis produce mai multe antigene şi toxine care acţionează ca factori de virulenţă.
Anvelopa conţine o proteină (fracţiunea I, F-1) care este produsă în principal la 37°C, conferă proprietăţi
antifagocitare şi activează complementul. Tipul virulent sălbatic de Y. pestis elaborează antigenele proteice
V şi W care sunt codificate cromozomial sau plasmidic. Dintre toxinele produse, una este letală pentru
animalele de laborator. Toxina (exotoxină) are structură proteică.
Y. pestis produce şi o bacteriocină (pesticină).
Câteva dintre antigenele Y. pestis reacţionează încrucişat cu antigene ale altor yersinii.
41. 2. 7. Răspuns imun
Există imunitate postinfecţioasă. Se pot utiliza vaccinuri pentru prevenirea îmbolnăvirii (protecţia nu este
absolută).
41. 2. 8. Caractere de patogenitate
Yersinia pestis este un microorganism patogen în special prin multiplicare şi prin invazivitate, rolul
patogenic al diferitelor structuri sintetizate în cursul metabolismului nefiind complet elucidat. Doza
infectantă este foarte redusă, 1-10 bacili sunt suficienţi pentru producerea bolii.
Rolul esenţial pare a reveni structurilor care conferă proprietăţile de rezistenţă la fagocitoză, spre ex.
fracţiunea I, proteică, de la nivelul suprafeţei celulare, şi respectiv structurii pseudocapsulare (virulenţa
scade în lipsa pseudocapsulei).
Structurile cu rol în virulenţă (rol dovedit in vitro şi pe animalele de experienţă) sunt codificate plasmidic
sau cromozomial. S-a dovedit implicarea esenţială a unor astfel de structuri genetice, care nu au fost
identificate în cazul tulpinilor avirulente. Aceste tulpini pot fi utile în producerea unor vaccinuri.
Dintre toxinele menţionate mai sus, una este letală pentru animalele de laborator (doză de numai 1 mg în
cazul şoarecelui). Această proteină cu GM de 74.000Da, produce blocade β-adrenergice şi este
cardiotoxică la animale. Rolul său în infecţiile umane nu a fost elucidat.

41. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
În cursul „prânzului”, vectorul se hrăneşte dintr-o rozătoare infectată cu Y. pestis, microorganismul ajunge
în intestinul puricelui şi prin intermediul unei coagulaze blochează peristaltismul la nivel gastric. Bacteriile
se multiplică. Masa bacteriană şi structura fibrinoasă blochează tranzitul intestinal, puricele înfometat
muşcă din nou şi regurgitează microorganismele în animalul muşcat. Datorită blocajului intestinal, cu
toate că aspiră sânge, puricele nu se poate hrăni, devine şi mai înfometat şi pierde selectivitatea naturală
pentru rozătoarele respective; astfel ajunge să muşte gazda umană. Microorganismul inoculat la om este
fagocitat, dar se poate multiplica atât intra cât şi extracelular. În scurt timp ajunge la nivel limfatic şi apare
o inflamaţie hemoragică la nivelul ganglionilor care se hipertrofiază, suferi o necroză şi devin fluctuenţi. În
cursul invaziei, Y. pestis poate ajunge în torentul sanguin şi infecţia se poate generaliza. Se dezvoltă leziuni
hemoragice şi necrotice în toate organele (ex. meningite, pneumonii şi pleuropericardite
serosangvinolente). Aceasta este forma de pestă bubonică, în care letalitatea în lipsa tratamentului este de
peste 50%.
Pesta pneumonică primară (forma pulmonară) poate apare prin inhalarea de nuclei de picătură (de obicei
de la un pacient care tuşeşte) sau prin embolizări septice la nivel pulmonar; se manifestă prin pneumonie
hemoragică, septicemie şi deces în peste 90% din cazuri.

42. Genul Acinetobacter

42. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Acinetobacter a fost descris pentru prima dată la începutul secolului XX.
În 1911, Martinus Willem Beigerinck, microbiolog olandez, descoperă o bacterie aerobă, gram negativă,
nonfermentativă, care face parte astăzi din genul Acinetobacter. În anii ’70,  Acinetobacter începe să fie
recunoscut ca un microorganism implicat în infecţii „de spital”; totuşi în acea perioadă, putea fi distrusă de
către medicamentele antimicrobiene uzuale.
În 1986, Bouvet și Grimont au definit (folosind tehnicile de hibridizare moleculară) 12 grupuri în cadrul
genului Acinetobacter. Ei au propus includerea a 4 specii noi, printre care și A. baumannii, (recunoscut
astăzi şi datorită dezvoltării rezistenței la antibiotice şi chimioterapice). Acinetobacter baumannii și speciile
numerotate 3 și 13TU formează “Complexul A. baumannii”. Cele 3 specii au cea mai mare importanță
clinică, fiind responsabile de majoritatea infecțiilor; nu pot fi diferențiate prin teste de rutină (ale
microbiologiei clasice). În anul 2004, CDC a raportat că 80% din infecțiile cu Acinetobacter sunt produse
de A. baumannii.
Alte genomospecii implicate în patologia umană sunt: A. lwoffii, A. haemolyticus   și A. johnsonii.
Diferențierea speciilor se realizează prin biotipare, serotipare, bacteriocino-tipare.

43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa

43. 1. Definiţie. Încadrare

Familia Pseudomonodaceae are patru genuri, dintre care numai genul Pseudomonas include specii
importante din punct de vedere medical. Genul Pseudomonas cuprinde pe baza omologiei ARNr cinci
grupuri, o parte din speciile incluse anterior în acest gen aparţinând actualmente genului Burkholderia (B.
mallei, B. pseudomallei etc). Pseudomonas maltophilia a fost redenumită Xanthomonas maltophilia şi a
devenit actualmente Stenotrophomonas maltophilia. Cea mai importantă specie a genului
este Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, „bacilul puroiului albastru”), specie implicată relativ
frecvent în infecţii la persoane cu reactivitate scăzută, precum şi în infecţii nosocomiale (infecţii „de
spital”). Pseudomonas aeruginosa reprezintă una din principalele bacterii oportuniste.
În anul 1981 se considera că există circa 800 de specii de Pseudomonas, contaminând în special plantele.
Genul cuprinde bacili aerobi, facultativ anaerobi, nesporulaţi, Gram-negativi, cu dimensiuni de 1-5 / 0,5-
1mm, mobili datorită prezenţei unuia sau mai multor flageli (polari).
3. 2. Caractere generale
43. 2. 1. Habitat
Microorganism foarte răspândit în natură (agent de putrefacţie a materiei organice animale şi vegetale),
poate fi pus în evidenţă la circa 15% dintre persoanele sănătoase, la nivel intestinal, axilar, perineal etc,
preferând zonele cu un grad de umiditate. Poate contamina obiectele din grupurile sanitare, camera de
baie, chiuvetele (în special sifonul de scurgere) etc. Elaborează o piocină (bacteriocină), cu efect inhibitor
asupra unor tulpini din aceeaşi specie.
43. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Este un bacil Gram-negativ subţire, cu dimensiuni între 1-5mm / 0,5-1mm, mobil, cu 1-3 cili polari (există
şi tulpini neciliate), nesporulat. Uneori prezintă capsulă.
43. 2. 3. Caractere de cultură
Din punct de vedere nutriţional sunt germeni puţin pretenţioşi. Se pot cultiva uşor pe medii simple în
condiţii aerobe. Unele specii din genul Pseudomonas se pot multiplica la 4°C, dar cele mai multe au
temperatura optimă de multiplicare cuprinsă între 30 şi 37°C (Pseudomonas aeruginosa se poate
multiplica şi la 42°C). Posibilitatea cultivării la 42°C permite diferenţierea de celelalte specii.
Pe medii solide formează colonii care se pigmentează în mod specific, însoţindu-se de pigmentarea
mediului (albastru sau galben-verde). De menţionat că pot apărea colonii (de tip S) cu aspecte diferite,
dând impresia prezenţei concomitente de bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al
florilor de tei. Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa recoltate de la pacienţi cu fibroză chistică formează
colonii mucoide.
În bulion tulbură mediul, formând şi o peliculă la suprafaţă, sub care se evidenţiază pigmentul.
43. 2. 4. Caractere biochimice
Produce diferiţi pigmenţi, dintre care mai importanţi sunt piocianina (albastru) şi pioverdina (galben-
verzui fluorescent). Este un germen catalază-pozitiv, degradează oxidativ glucoza, nu fermentează lactoza
şi este oxidază-pozitiv.
43. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori chimici şi fizici
Este sensibil la căldură, fenol, alcool de 80°, dar rezistent la acţiunea compuşilor cuaternari de amoniu.
În spital se selectează tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini care pot fi
implicate în infecţii de spital.
43. 2. 6. Structură antigenică
Pseudomonas aeruginosa posedă antigenul flagelar H (proteic) şi antigenul somatic O (lipopolizaharidic).
Pe baza existenţei mai multor factori antigenici O şi H, s-au descris mai multe serotipuri în cadrul speciei,
utile în special în investigaţii epidemiologice.
43. 2. 7. Răspuns imun
Există un răspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi (opsonine, aglutinine), însă cu titruri
nesemnificative şi fără eficacitate protectivă.
43. 2. 8. Caractere de patogenitate
Speciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (întâlnite în apă, pe sol, pe plante etc, sau fac parte din flora
microbiană umană). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat în diferite soluţii apoase, inclusiv soluţii
dezinfectante sau chiar soluţii de antibiotice, având o deosebită capacitate de a supravieţui în medii
umede. Pseudomonas aeruginosa este un microorganism oportunist, condiţionat patogen.
Dintre factorii de virulenţă ai bacilului piocianic am putea aminti prezenţa pililor (care mediază ataşarea
bacteriană la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte histotoxice), a unei lipaze, sinteza de
hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa 20.000 de ori mai toxică decât endotoxina), precum
şi existenţa endotoxinei (lipopolizaharidul din structura peretelui).
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacienţi cu fibroză chistică deţin un glicocalix foarte
dezvoltat care mediază aderenţa la nivelul mucoaselor respiratorii şi împiedică opsonizarea. În infecţiile
cronice, la aceşti pacienţi, a fost demonstrată trecerea tulpinilor din forme S în forme de tip M, datorită
unor mutaţii care au fost identificate recent (2008).

43. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Datorită capacităţii de adaptare şi supravieţuire în diferite medii, precum şi datorită factorilor de virulenţă
enumeraţi, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecţii foarte variate, de la infecţii tegumentare
superficiale până la septicemii fulminante. La persoanele cu reactivitate normală, infecţiile sunt de obicei
localizate (foliculite, otite, infecţii oculare etc), urmând contaminării cu diferite soluţii apoase sau
după înot în piscină. Prezenţa piocianicului ar putea fi semnalată de culoarea albastră verzuie a
pansamentelor. La nivel dermic, procesul infecţios poate avea şi o evoluţie gravă, cu apariţia de vezicule
care se sparg şi se refac pe o bază necrotică. Procesul poate progresa în profunzime (ecthyma
gangrenosum), asemănător cu patologia întâlnită la pacienţii neutropenici la care infecţia poate fi produsă
şi de alte microorganisme.
La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuată şi supuse unor manevre medico-chirurgicale invazive
(intubaţii, cateterizări etc), precum şi la persoanele cu arsuri, P. aeruginosa poate produce infecţii
localizate, dar potenţialul diseminării şi apariţiei unor complicaţii grave (bacteriemie, osteomielită,
meningită, endocardită, septicemie) este foarte important. În lipsa tratamentului adecvat (dificil datorită
rezistenţei la antibiotice), evoluţia procesului infecţios poate fi gravă sau deosebit de gravă (80% din
septicemiile cu piocianic au evoluţie letală). Infecţia pulmonară cronică la pacienţii cu fibroză chistică
(mucoviscidoză) este produsă de un fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa.

44. Genul Vibrio

44. 1. Definiţie. Încadrare
Speciile din genurile Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Campylobacter, Helicobacter  sunt larg răspândite în
natură şi făceau iniţial parte din aceeaşi familie. Vibrionii se găsesc în apele marine şi de
suprafaţă. Aeromonas se găseşte predominant în apa proaspătă şi ocazional contaminează animalele cu
sânge rece. Plesiomonas  se găseşte la animalele cu sânge cald, dar şi la cele cu sânge
rece. Aeromonas şi Plesiomonas au fost asociate cu boli diareice la om. Helicobacter pylori se asociază cu
gastrită şi ulcer gastroduodenal.
Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (1965), alături
de Aeromonas, Photobacterium şi Plesiomonas. Genul Vibrio include mai mult de 48 de specii (12 dintre
acestea fiind potenţial patogene pentru om). Vibrionul holerei produce o enterotoxină care determină
holera. Vibrionii sunt bacili Gram-negativi, drepţi sau uşor încurbaţi, foarte mobili, necapsulaţi, nesporulaţi.
44. 2. Caractere generale
44. 2. 1. Habitat
Habitatul natural al vibrionilor include sursele de apă dulce şi sărată, unde există liberi sau în asociaţie cu
diferite vietăţi acvatice. Vibrio cholerae se găseşte în intestinul şi în materiile fecale ale omului bolnav de
holeră. Prezenţa vibrionului holeric în mediul extern este explicată prin contaminarea fecală şi
supravieţuirea vibrionilor, existând şi posibilitatea unui ciclu de viaţă extraintestinal.
44. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
La izolarea primară, V. cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de virgulă a devenit mai mult o
„reprezentare istorică”), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui flagel polar.
44. 2. 3. Caractere de cultură
Sunt germeni puţin pretenţioşi şi se pot dezvolta pe medii de cultură simple, inclusiv în apa peptonată,
ceea ce este util în izolarea primară (formează un văl la suprafaţa mediului). V. cholerae se dezvoltă bine la
un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de pH având rolul de medii de îmbogăţire.
V. cholerae produce pe mediile de cultură solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu un aspect opac. Se
dezvoltă foarte bine la 37°C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii ce conţin săruri minerale şi
asparagină ca surse de carbon şi azot. Creşte bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bilă-sucroză-agar), pe care
produce colonii galbene.
44. 2. 4. Caractere biochimice
V. cholerae fermentează de obicei sucroza şi manoza. Fermentează glucoza. În funcţie de fermentarea
zaharurilor vibrionii se pot subîmpărţi în grupe. Au metabolism respirator şi fermentativ. Sunt aerobi,
facultativ anaerobi.
Testul oxidazei (pozitiv în cazul vibrionului holeric) este un test cheie în identificarea preliminară.
Majoritateavibrionilor sunt halotoleranţi şi adesea prezenţa NaCl le stimulează creşterea prin alcalinizarea
mediului.
 
44. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Vibrionii holerici sunt foarte sensibili la lumina solară şi la acţiunea căldurii (la 100° sunt distruşi aproape
instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. ÎN ALIMENTE TRĂIESC (CU UNELE EXCEPŢII) PÂNĂ LA 7 ZILE. ÎN
APĂ SUPRAVIEŢUIESC UN NUMĂR DE ZILE, ÎN FUNCŢIE DE EFICACITATEA TRATAMENTULUI APLICAT
APELOR UZATE. ÎN INTESTINUL BOLNAVILOR NETRATAŢI SE POT MENŢINE CÂTEVA SĂPTĂMÂNI.
44. 2. 6. Structură antigenică
Vibrionul holeric prezintă la nivel parietal antigenul O (lipopolizaharid). În funcţie de structura antigenului
somatic de grup O, vibrionii holerici au fost împărţiţi în 6 serogrupe; vibrionul holeric clasic şi biotipul El
Tor fac parte din grupul O:1, ceilalţi vibrioni fiind non-O:1NAG (non-aglutinabili cu seruri anti-O:1); aceste
microorganisme nu pot fi distinse biochimic de vibrionul holeric O:1. Abordări taxonomice au demonstrat
că Vibrio cholerae O:1 şi non-O:1 reprezintă de fapt aceleaşi specii. Antigenul serogrupului O:1 are
determinanţi care fac posibilă diferenţierea serotipurilor. ÎMPĂRŢIREA VIBRIONULUI HOLERIC ÎN
SEROTIPURI ŞI BIOTIPURI ESTE UTILĂ ÎN STUDII EPIDEMIOLOGICE, DAR TESTELE SE FAC NUMAI ÎN
LABORATOARE SPECIALIZATE.
Există antigene la nivelul pililor.
Fiind mobil, vibrionul prezintă antigenul H la nivel ciliar.
Vibrionul holeric şi vibrionii înrudiţi produc o enterotoxină labilă faţă de căldură, cu masa moleculară de
84.000 Da, alcătuită din două subunităţi A şi B (activă şi de legare).
44. 2. 7. Răspuns imun
Aciditatea gastrică furnizează o oarecare protecţie în cazul ingerării unui număr mic de vibrioni.
După holeră apare imunitate faţă de reinfecţie, dar durata şi gradul acesteia nu sunt cunoscute. La
animalele de experienţă apar anticorpi specifici de tip IgA în lumenul intestinal. Anticorpii faţă de
antigenul O protejează animalele de laborator faţă de infectare. Anticorpi similari apar în serul uman după
infecţie şi se consideră că sunt asociaţi (într-o oarecare măsură) cu protecţia faţă de colonizarea cu
vibrioni patogeni. Prezenţa anticorpilor antitoxină nu se asociază cu protecţia.
44. 2. 8. Caractere de patogenitate
Microbiologia medicală este interesată în cunoaşterea următorilor vibrioni patogeni sau cu patogenitate
condiţionată, potenţial periculoşi pentru sănătatea omului: Vibrio cholerae O:1, cu biotipurile cholerae şi El
Tor (fiecare din aceste biotipuri putând fi clasificat în serotipurile Inaba, Ogawa, Hikojima); Vibrio
cholerae grup non O:1; Vibrio mimicus; Vibrio parahemolyticus; V. damsela; V. furnissii; Vibrio vulnificus; V.
fluvialis.
Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae constă în aderarea la epiteliul celular
(adezine/pili), urmează colonizarea şi apoi invadarea mucoasei, care permit infiltrarea germenilor cu
producerea unor variate substanţe biologic active, incluzând enzime extracelulare, enterotoxine,
citotoxine, hemolizine, factori asociaţi cu virulenţa bacteriană.
Capacitatea chemotactică faţă de epiteliile mucoase este mai evidentă la formele monotriche, depinzând
şi de cantitatea şi calitatea mucusului.
Majoritatea germenilor ce colonizează ţesutul uman posedă pe suprafaţă componente proteice
numite ²adezine² care se leagă stereochimic de structurile moleculare complementare tisulare. Aceşti
factori de adezivitate par a fi asociaţi cu fimbriile sau pilii. Factorii de virulenţă implicaţi în colonizare sunt
sintetizaţi în paralel cu producerea enterotoxinei în cazul Vibrio cholerae (toxina holerică) şi sunt sub
coordonarea aceleiaşi gene. Se presupune că pilii (proprietate importantă asociată virulenţei germenilor
din mediu) se pierd o dată cu instituirea infecţiei.
Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existenţa unui strat adiţional S
extern faţă de peretele celular, care oferă protecţie faţă de agenţii litici (bacteriofagi, proteine serice).
Enterotoxina holerică este principala cauză a diareei secretorii din holeră. De exemplu, la voluntarii care au
ingerat mai puţin de 10μg de toxină purificată, în 2 zile a apărut diareea, cu un volum de peste 20 l, cu
caracter „exploziv”.
Toxina holerică (la fel ca şi enterotoxina produsă de E. coli) este compusă dintr-o subunitate A şi 5
subunităţi B, totalizând aproximativ 84.000 daltoni. Subunităţile B au o mare afinitate pentru receptorii
gangliozidici GM de pe suprafaţa celulelor ţintă. După legare, subunităţile A intră în citoplasmă şi
catalizează transferul ADP-ribozei la NAD, fiind astfel activată o proteină reglatoare asociată membranei,
numită Gs. Rezultatul este un nivel crescut al AMPc în celulele mucoase ale intestinului subţire, urmat de
hipersecreţia clorurilor şi bicarbonatului care va determina un eflux important de apă.
Fiind germeni Gram-negativi, după distrugerea acestora din peretele celular se eliberează endotoxina

44. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
În condiţii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru oameni. S-a dovedit că pentru realizarea
infecţiei şi bolii este necesară ingerarea a 108–1010 microorganisme.
Holera nu este o boală invazivă. Germenii nu ajung în torentul circulator, ci rămân cantonaţi la nivelul
tractului intestinal. Vibrionii colonizează marginea în perie a celulelor epiteliale, apoi se multiplică şi
eliberează toxina holerică (iar atunci când sunt distruşi eliberează şi endotoxina).
După o perioadă de incubaţie de 1-4 zile apar brusc greaţă, vărsături, diaree abundentă (20-30 litri / zi) şi
crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme („apă de orez”) conţin mucus, celule epiteliale şi un mare
număr de vibrioni. Există o pierdere rapidă de fluide şi electroliţi care duce la deshidratare, colaps
circulator şi anurie. Rata mortalităţii în lipsa tratamentului este 25-50%.
Infecţiile cu Vibrio cholerae  grup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterită şi cu infecţii
extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la adulţi cu imunitate
deficitară). Totuşi, a fost raportat un caz de sepsis cu Vibrio cholerae  grup non O:1 plus gastroenterită la
un copil de 8 ani, pacientul prezentând diaree cu sânge, febră și deshidratare severă; vibrionii non O:1 au
fost izolaţi din sânge și din materiile fecale. (1)

45. Genul Campylobacter. Genul Helicobacter.

Helicobacter pylori
45. 1. Definiţie. Încadrare
Microorganismele descrise în acest capitol erau anterior grupate împreună cu vibrionii şi erau cunoscute
ca patogeni ai unor variate specii animale la care produceau septicemii, avorturi sau enterite (1963,
vibrioni microaerofili). Ulterior s-a identificat specia Campylobacter jejuni ca agent etiologic al diareei
umane iar aceşti „vibrioni” au fost încadraţi, având la bază secvenţierea ARNr 16S, precum și caracterele
de cultură și biochimice diferite în genurile Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter și Wolinella.

45. 2. Genul Campylobacter

Genul Campylobacter conține 18 specii și subspecii, iar genul Arcobacter conține 4. Pentru o listă cu
denumirile acestor specii puteți consulta Tabelul nr. 1.

45. 2. 1. Caractere generale

45. 2. 1. 1. Habitat
Habitatul natural al microorganismelor din genul Campylobacter cuprinde păsările, atât cele domestice,
cât și cele sălbatice, acestea reprezentând principalele surse ale infecției pentru oameni.
45. 2. 1. 2. Caractere morfotinctoriale
Bacteriile din genul Campylobacter sunt bacili gram negativi curbați, mobili, iar majoritatea speciilor au un
singur flagel polar. După cultivarea prelungită sau după expunerea la oxigen, microorganismele
dobândesc o formă cocoidă (ceea ce ar putea preta la confuzii de interpretare).
45. 2. 1. 3. Caractere de cultură
Sunt bacterii microaerofile, spre anaerobe. Se dezvoltă cel mai bine într-o atmosferă săracă în oxigen (5-
10%) și îmbogațită cu CO2 (10%). În mod obișnuit, sunt utilizate medii de cultură selective, de exemplu
mediul Skirrow care conține vancomicină, polimixină B și trimetoprim cu scopul de a inhiba creșterea altor
bacterii. Temperatura optimă de dezvoltare pentru C. jejuni, C. coli și C. lari este de 42°C (bacterii fiind
cunoscute sub numele de “grupul termofil”, deși nu sunt bacterii termofile în sensul strict al cuvântului, a
 se vedea 3. 5). Coloniile sunt incolore sau gri și pot fi convexe și rotunde sau apoase cu tendință la
confluare.
45. 2. 1. 4. Caractere biochimice
Sunt oxidază și catalază pozitive. Nu fermentează carbohidrații.
45. 2. 1. 5. Rezistența față de factori fizici și chimici
Sunt mult mai sensibile în comparație cu majoritatea bacteriilor. Sunt distruse de procedeele obișnuite de
pasteurizare ale laptelui. C. jejuni supraviețuiește în apă la 4°C timp de câteva săptămâni, dar acest timp
este mult scurtat la temperaturi de peste 15°C.
45. 2. 1. 6. Structura antigenică
Structura antigenică a bacteriilor din genul Campylobacter este similară cu cea a tuturor
microorganismelor Gram negative. Menționăm lipopolizaharidul (de fapt un lipooligozaharid) cu activitate
de endotoxină și porinele membranei externe. De asemenea, există și antigenul flagelar.
45. 2. 1. 7. Răspunsul imun
Anticorpii serici de tip IgG și IgM înregistrează un maxim la 2-4 săptămâni după infecție, apoi scad rapid.
Pacienții expuși frecvent la bacterii din genul Campylobacter au concentrații crescute de IgA care sunt
însoțite de imunitate. Pacienții care au infecție cu Campylobacter pot avea un test fals pozitiv pentru
anticorpi anti-Legionella.
45. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate.
Caracterele de patogenitate specifice genului Campylobacter reprezintă subiectul unor cercetări aflate încă
în desfășurare. Pe scurt, cele mai importante sunt :
1.      Variabilitatea genetică caracterizează C. jejuni și este cauzată de mecanisme intragenomice (variații de
fază, duplicări și deleții de gene, mutații punctiforme) precum și de schimbul genetic între tulpini (transfer
orizontal de plasmide și de ADN cromozomial). Acest transfer are loc atât in vitro cât și în timpul
colonizării păsărilor.

2.      Lipooligozaharidul are rol în aderența la celula epitelială și în invazivitate. Unele componente  ale sale,
datorită asemănarii structurale cu părti ale mielinei, declanșează un răspuns imun încrucișat cu acestea. A
se vedea 45. 2. 2. pentru detalii.

3.      Flagelul: motilitatea este importantă pentru colonizarea gazdei de către bacterie. C. jejuni prezintă
chemotaxie pentru aminoacizii și alte componente ale mucusului tractului intestinal.

4.      Toxina CDT (Cytolethal Distending Toxin) este produsă și de alte bacterii (E. coli, Haemophilus
ducreyi, Helicobacter hepaticus). Aceasta cauzează oprirea ciclului celular în celulele-gazdă. Mecanismele
precise prin care CDT ajunge la nivelul nucleului sunt încă în studiu.

5.      Molecule de adezivitate: sunt utilizate diferite proteine de adezivitate cum ar fi CadF, JlpA, Peb1.

45. 3. Genul Helicobacter

Genul cuprinde 18 specii, cum ar fi:
·         Helicobacter pylori
·         Helicobacter heilmannii (a fost identificat la pisici, câini, unele primate; atunci când afectează oamenii,
cauzează doar o gastrită moderată, deși infectia cu H. heilmannii este întâlnită deseori în asociere cu
Limfomul de tip MALT (Suerbaum) (1)
·         Helicobacter fennelliae  (2)
·          Helicobacter cinaedi  (2)
Ultimele 2 specii se comportă din punct de vedere clinic asemănător cu Campylobacter jejuni.

45. 3. 1. Caractere generale

45. 3. 1. 1. Habitat
Helicobacter pylori colonizează stomacul în 60-70% din dispepsiile fără ulcer şi mult mai frecvent în ulcerul
peptic. Este identificat la polul luminal al celulelor epiteliului gastric, sub stratul de mucus sau în zonele
profunde ale acestuia,  fără a invada mucoasa gastrică. Ureea reprezintă un important element nutritiv, iar
amoniacul produs de urează îi asigură pH-ul optim necesar multiplicării.
ureeureazaH2O 2CO2+2NH3'>
Prima cultură de H. pylori a fost obţinută în anul 1982 (vezi 45.13.1). Germenii izolaţi de la pacienţii cu
gastrite şi ulcer duodenal au primit iniţial numele de Campylobacter like, apoi Campylobacter
pyloridis, Campylobacter pylori, iar din 1989 fac parte din noul gen, genul Helicobacter cu specia
tip H.  pylori.
45. 3. 1. 2. Caractere morfotinctoriale
Helicobacter pylori are aspect de vibrion Gram-negativ, cu o lungime de 2,5 µm şi o grosime de 0,5 µm, cu
unul sau mai mulţi flageli polari, mobil, cu mişcări caracteristice, uneori cu formă de spiril, necapsulat,
nesporulat. Poate prezenta şi cili laterali (Figura nr. 1). S-au descris și forme cocoide despre care se crede
că reprezintă o formă de rezistență.
45. 3. 1. 3. Caractere de cultură
Se dezvoltă în 2-7 zile pe medii de cultură neselective (agar-chocolate, medii cu infuzie de creier şi
inimă sau agar-Brucella suplimentat cu 5-7% sânge de cal) sau pe medii selective în care se adaugă de
exemplu amfotericină B şi polymixină sau cefsulodină, în condiţii de umiditate relativ ridicată şi un procent
de 5-10% CO2.
45. 3. 1. 4. Caractere biochimice
H. pylori nu reduce nitraţii, nu desface hipuratul de sodiu; unele tulpini produc H 2S pe mediul TSI,
elaborează urează şi catalază. Pe abilitatea H. pylori de a produce urează se bazează mai multe teste
diagnostice (a se vedea 45. 3. 3).
45. 3. 1. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
H. pylori este foarte susceptibil la deshidratare; rezistă relativ puţin în mediul extern. Este dotat cu
capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica la nivelul mucoasei gastrice.
45. 3. 1. 6. Structură antigenică
Componentele morfologice ale H. pylori conturează şi structura antigenică, respectiv un antigen somatic
O (termorezistent), antigenul H flagelar (termolabil), un antigen de colonizare (aderare) precum proteinele
membranei externe. Porinele sunt printre cele mai bine caracterizate familii de proteine ale membranei
externe, incluzând mai multe canale care permit difuzarea pasivă a nutrienților. O altă proteină, BabA este
prezentată în detaliu în Anexa nr. 1 la fel ca și diferitele caractere de patogenitate.
45. 3. 1. 7. Răspuns imun
Pacienţii infectaţi cu H. pylori prezintă un răspuns imun ce constă în producerea de IgM specifici. Sunt
produşi de asemenea anticorpi de tip IgG şi IgA, aceştia persistând sistemic şi la nivelul mucoasei gastrice,
cu un titru mai ridicat în cazul infecţiilor cronice.
O dată colonizat stomacul unui individ, întrebarea care se impune este: cum este realizată persistența
acestei infecții? De ce sistemul imun al individului respectiv nu reușește să combată infecția? Răspunsul
este că de-a lungul timpului, H. pylori a reușit să evite sistemul imun prin mai multe mecanisme care vor fi
detaliate în continuare.
În primul rând, după cum am mai subliniat, H. pylori stă sub stratul de mucus, fără a invada epiteliul
gastric, dincolo de “locul de acțiune” al celulelor sistemului imun. Cu toate acestea, răspunsul imun al
gazdei este activat de atașarea bacteriei de celulele epiteliale. H. pylori se poate atașa de MHC II
(complexul major de histocompatibilitate) de pe suprafața celulelor epiteliale, declanșând apoptoza
acestora. O metodă importantă de activare a sistemului imun este descrisă în documentul suplimentar
(Anexa nr. 1) mai precis stimularea secreției de IL8 de către acidul diaminopimelic.
Pentru a evita răspunsul imun înnăscut, este necesară “neutralizarea” receptorilor Toll-like (prescurtați în
continuare TLR). Aceștia recunosc PAMPs (pathogen associated molecular patterns), adică recunosc
anumite molecule specifice pentru o mare varietate de agenți patogeni care sunt diferite din punct de
vedere structural de moleculele organismului gazdă. Astfel, receptorii TLR-5 recunosc flagelina
caracteristică mai multor specii bacteriene, însă nu și pe cea conținută de H. pylori. TLR-9 recunosc ADN
nemetilat al majorității bacteriilor, dar H. pylori are un ADN puternic metilat. LPS (lipopolizaharid) a suferit
modificări, astfel încât este recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu însă și de receptorii aflați pe
celulele epiteliale gastrice. Unul din puținele mecanisme ale imunității înnăscute care încă este activat de
catre H. pylori este calea acid diaminopimelic→NOD1→stimularea NFkB→secreție IL8→neutrofile (NOD
like receptors sunt un alt tip de pattern recognition receptors, receptori care recunosc PAMPs).
Pentru imunitatea dobândită sunt necesare prezentarea antigenelor și proliferarea LT, evenimente
inhibate de către vacA, după am prezentat în Anexa nr. 1.
În timpul răspunsului imun dobândit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenția fie în Th1 (care secretă IL2 și
IFNγ), fie în Th2 (care secretă IL4, 5 și 10). Th2 stimulează LB care produc anticorpi împotriva patogenilor
extracelulari, în timp ce Th1 stimulează răspunsul imun celular, caracteristic pentru infecțiile cu microbi
intracelulari. În mod paradoxal H. pylori generează un răspuns predominant Th1. Studiile pe șoareci au
arătat ca acest raspuns predominant Th1 este asociat cu apariția gastritei, în timp ce un răspuns Th2 este
protector față de inflamația gastrică (gastrita se pare că este cauzată de secreția de IFNγ, o citokină
caracteristică răspunsului imun tip Th1). Studiile epidemiologice la om au arătat o polarizare mai puțin
pronunțată a răspunsului imun. (Tabelul nr. 3 și Figura nr. 4)
45. 3. 1. 8. Caractere de patogenitate
H. pylori prezintă structuri cu rol în patogenitate, respectiv antigenul de suprafaţă (de colonizare, aderare),
antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxică care iniţiază inflamaţia locală acţionând asupra
celulelor din epiteliul gastric şi duodenal şi toxina care inhibă secreţia acidului clorhidric la nivelul celulelor
parietale gastrice (Anexa nr. 1)
Se pare că un rol destul de important în patogenitate îl au ureaza, ca şi prezenţa cililor.

45. 3. 2. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Helicobacter pylori poate fi agent etiologic al gastritei, al ulcerului gastric și duodenal, al cancerului gastric
(este considerat carcinogen clasa I, adică în mod sigur cauzează cancer) și al limfomului MALT (Mucosal
associated lymphoid tissue). S-a demonstrat relația de dublă cauzalitate între H. pylori și limfom, în sensul
că atât infecția cu H. pylori crește riscul de limfom, cât și eradicarea infecției cu H. pylori conduce la
regresia limfomului MALT în majoritatea cazurilor.
Pentru ințelegerea evoluției ulterioare a infecției cu H. pylori, este necesară explicarea rolului bacteriei în
homeostazia secreției acide. (Figura nr. 5) Astfel, H. pylori acționează asupra celulelor de tip D cauzând
scăderea nivelului de somatostatină, ceea ce duce la creșterea cantității de gastrină.

În acest moment, devine importantă localizarea infecției cu H. pylori, și

implicit  localizarea răspunsului inflamator. În cazul gastritei, răspunsul inflamator de la
nivelul celulelor parietale inhibă funcția acestora cu suprimarea producției de acid, iar
secreția gastrică este caracterizată de nivele crescute ale pH-ului. Hipoacidemia crește
suplimentar gastrina care reprezintă un stimul proliferativ pentru epiteliile gastrice.
Inflamația și proliferarea continuă duc la pierderea glandelor gastrice și instalarea
gastritei atrofice. Atrofia gastrică reprezintă unul dintre cei mai importanți factori de risc
pentru cancerul gastric, mai multe ipoteze fiind formulate pentru a explica trecerea de la
atrofie la cancer. Cea mai cunoscută dintre acestea cuprinde secvența
atrofie→metaplazie intestinală→displazie→adenocarcinom. (Figura nr. 6)
 
Gastrita predominant antrală se caracterizează prin hipergastrinemie care de această
dată acționează prin stimularea celulelor parietale care vor crește secreția de acid,
răspunsul final fiind reprezentat de ulcerul duodenal. Ulcerul duodenal este asociat cu
scăderea pH-ului secreției gastrice, în timp ce ulcerul gastric este asociat cu scăderea
mijloacelor de apărare ale mucoasei stomacului.

45. 3. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse

de Helicobacter pylori
Având în vedere particularitățile acestor infecții, abordarea acestui subcapitol va fi puțin diferită și vom
începe prin discutarea unor teste care par a nu avea legătură cu materia studiată în anul 2, însă trebuie
avute în vedere ca atare.
Este importantă o clasificare a metodelor de diagnostic pentru infecția cu H. pylori așa cum sunt ele
utilizate de medicul clinician, în colaborare cu medicul microbiolog și medicul care efectuează testele
paraclinice.
În diagnosticul infecțiilor produse de H. pylori, pornindu-se de la elementele clinice, se vor realiza
următoarele teste:
45. 3. 3. 1. Teste non-endoscopice
A. Testarea serologică se referă la determinarea nivelurilor de anticorpi prin tehnici de tip ELISA. Se
utilizează antigene cunoscute ca fiind specifice H. pylori (fie celule întregi, fie celule sonicate sau extracte
antigenice purificate) pentru a determina dacă pacientul are sau nu anticorpi-anti Helicobacter. Nivelele
crescute de IgG se mențin pe perioade mari de timp care variază de la o persoană la alta, din acest motiv
acest tip de testare nu va fi utilizat pentru evaluarea post-tratament, deși este un test care poate fi util în
screeningul inițial al infecției cu Helicobacter pylori.  
B. Testul respirator la uree: reprezintă standardul în testarea non-invazivă a infecției cu H. pylori.
Pacientul va bea un lichid care conține uree marcată cu C 13 (izotop nonradioactiv) sau cu C14 (utilizat mai
rar din cauza radioactivității). Ureaza produsă de H. pylori va descompune ureea în amoniac și CO2 marcat
care va fi măsurat din aerul expirat de pacient. Cantitatea de CO 2 din aerul expirat este un indicator al
cantității de uree aflata în stomac. Testul respirator la uree poate fi folosit atât pentru diagnosticarea
inițială, cât și pentru monitorizarea răspunsului la tratament.
C. Testul antigenelor din materiile fecale: se utilizează tot un test de tip ELISA, însă spre deosebire de
cel de la punctul 1 suntem în situația inversă: în kit avem anticorpii, ceea ce trebuie să determinăm este
prezența sau absența antigenelor din fecale. Testul antigenelor din fecale este unul care certifică infecția
activă (daca nu mai sunt microorganisme în stomac, acestea nu vor mai fi eliminate pe cale digestivă), deci
reprezintă un test eficace atât pentru screeningul inițial, cât și pentru evaluarea post-terapie.
45. 3. 3. 2. Teste endoscopice
Cu ajutorul endoscopiei se prelevează biopsii de țesut gastric care vor fi analizate prin una din modalitățile
următoare:
A. Metode bazate pe urează: țesutul biopsiat se plasează într-o soluție de uree și un indicator de pH.
Prezența ureazei va descompune ureea și va crește pH-ul ceea ce va determina virarea culorii indicatorului
de pH.
B. Teste care țin de diagnosticul de laborator microbiologic: fragmentele bioptice obținute din corpul
și antrul stomacului sunt strivite pe o lamă (amprentare), fixate cu alcool metilic timp de 1 minut, uscate și
apoi colorate timp de 20 de minute cu soluție Giemsa1/10 preparată extemporaneu. Se poate utiliza și
impregnarea argentică  Warthin-Starry (aceasta a fost metoda orginală de evidențiere a Helicobacter de
către Warren și Marshall în 1983) Apare morfologia caracteristică de vibrioni sau spirili. (Figura nr 8)
Cultivarea, deși reprezintă o modalitate foarte specifică și prezintă în plus avantajul de a putea permite
testarea sensibilității la antibiotice nu se realizează în mod curent din cauza unor dificultăți tehnice și a
sensibilității reduse (un număr relativ mare de infecții cu H. pylori nu au fost validate utilizând această
modalitate de diagnostic). H. pylori este un microorganism pretențios, cu creștere lentă, care are nevoie
de condiții speciale pentru a se dezvolta. Totuși, considerăm că ar fi necesare mai multe eforturi în acest
sens.

46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulaţi. Genul

Corynebacterium 
46. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Corynebacterium cuprinde o serie de specii de bacili Gram-pozitivi (se pot colora neuniform), uşor
încurbaţi, măciucaţi, aşezaţi în V, L sau în „palisade”, nesporulaţi, necapsulaţi, imobili, aerobi şi facultativ
anaerobi, catalază-pozitivi. Speciile genului (62, dintre care 38 cu relevanţă medicală) pot fi grupate în
funcţie de habitat şi patogenitate.
Studii recente au delimitat în cadrul genului grupul „Corynebacterium diphtheriae”în care sunt incluse
speciile C.  diphtheriae, C.  pseudotuberculosis şi C.  ulcerans (ultimele două fiind urează-pozitive). Cultivă
mai bine pe medii îmbogăţite (de ex. cu adaos de ser sau sânge). Au capacitatea (în cazul conversiei
genetice) de a elabora exotoxină. Specia cea mai importantă este Corynebacterium diphtheriae (bacilul
difteric). C. diphtheriae include patru biotipuri: gravis, mitis, intermedius şi belfanti.
Difteria a fost descrisă încă din antichitate (Hipocrate). În 1821 difteria a fost diferenţiată de alte infecţii ale
tractului respirator, iar în 1883 în „falsele membrane” au fost evidenţiaţi bacili Gram-pozitivi.
Bacteriile corineforme nu reprezintă o unitate distinctă din punct de vedere taxonomic, însă au primit
acest nume generic datorită faptului că se aseamănă din punct de vedere morfologic, sunt bacili Gram-
pozitivi, nu produc spori, au formă neregulată, unii prezintă capete umflate şi este important să fie
diferenţiate de agentul etiologic al difteriei (pot exista confuzii de diagnostic).
46. 2. Caractere generale
46. 2. 1. Habitat
C. diphtheriae poate fi identificat în tractul respirator superior uman (la 3-5% din persoanele sănătoase),
precum şi la nivel tegumentar (de regulă în leziuni dermice).
46. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
După cultivare pe mediu Loeffler, apar ca bacili Gram-pozitivi, măciucaţi (Korynee înseamnă măciucă,
ciomag), cu tinctorialitate inegală datorită prezenţei granulelor de polifosfat (corpusculi Babeş-Ernst) şi cu
o dispoziţie care ar putea fi comparată cu literele V, L etc. sau cu nişte „litere chinezeşti”. Se poate afirma
că bacilul difteric, cu o compoziţie a peretelui celular care cuprinde mai puţină mureină (circa 50-60%),
este Gram-pozitiv la limită. Pe alte medii de cultură morfologia este mai puţin caracteristică.
Bacilii difteroizi (de exemplu  C. hoffmanni, C. xerosis etc) prezintă o colorare uniformă şi sunt dispuşi în
palisade.
46. 2. 3. Caractere de cultură
Bacilul difteric este izolat în cultură pură pentru prima oară în anul 1884, când Loeffler utilizează un mediu
cu ser coagulat de bou (mediul Loeffler). Deşi este inclus într-o singură specie, bacilul difteric prezintă
variabilitate în ceea ce priveşte caracterele de cultură şi de metabolism, deosebindu-se mai multe tipuri.
Coloniile au aspect de creştere de tip R (rough). Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile se dezvoltă în
8-12-18 ore, iar aspectul pe frotiu este cel caracteristic.
Trei tipuri de colonii (cu grade variate de patogenitate) se evidenţiază pe mediile cu telurit (de exemplu
Gundel-Tietz): tipul gravis produce colonii nehemolitice, mari, cu suprafaţă granulară, gri-negre, în
„margaretă”, cu margini crenelate; tipul mitis produce colonii hemolitice, convexe, cu margini circulare, de
tip S; tipul intermedius produce colonii nehemolitice, mici, cu margini circulare, cu suprafaţa granulară.
În cursul diagnosticului unei infecţii cu bacil difteric este necesară utilizarea mediului de îmbogăţire OCST
(ou-cisteină-ser-telurit), un mediu lichid.
46. 2. 4. Caractere biochimice
Deşi se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o dezvoltare mai favorabilă pe medii
îmbogăţite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou).
Capacitatea de fermentare a mono şi dizaharidelor permite identificarea speciei în cadrul genului, iar
fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) în cadrul speciei.
Bacilul difteric produce cistinază (care descompune cistina, eliberând H 2S), reduce sărurile de telur şi
elaborează bacteriocine.
46. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Poate rezista în fragmente din „falsele membrane”. Este distrus de căldura umedă (10 minute la 60º),
alcool sau antiseptice uzuale, precum şi de antibiotice (eritromicină, penicilină etc).
46. 2. 6. Structură antigenică
Există diferenţe serologice între diferitele tulpini de Corynebacterium diphtheriae, dar nu s-a putut elabora
o clasificare serologică satisfăcătoare. În diagnostic nu se folosesc identificările serologice.
Cea mai importantă structură antigenică este reprezentată de toxina difterică, un polipeptid termolabil cu
greutatea moleculară de 62.000 Da, care conţine cel puţin patru determinanţi antigenici diferiţi.
46. 2. 7. Răspuns imun
Determină un răspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificaţi, dar nu oferă protecţie
(sunt specifici de tip). Anticorpii antitoxină (care este identică la toţi bacilii difterici toxigeni) oferă
protecţie (neutralizează toxina). Titrul protector trebuie să fie mai mare de 0,03 UA / ml.
46. 2. 8. Caractere de patogenitate
Bacilul difteric poate fi patogen prin multiplicare (la poarta de intrare) şi toxinogeneză (tulpinile
lizogenizate). Toxina (exotoxină) este aceeaşi pentru toate tulpinile toxigene. Infectarea cu bacteriofagul
temperat poate duce la starea de lizogenizare. Deoarece există fagi tox+ şi fagi tox-, există tulpini
lizogene care produc şi tulpini lizogene care nu produc toxină difterică.
În cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul că prezenţa fierului este esenţială, producţia optimă
realizându-se la concentraţii care variază între 0,14-0,50 mg Fe / ml.
Toxina difterică este alcătuită din două fragmente legate prin punţi disulfidice. Fragmentul B (greutate
moleculară 38.000 Da), reprezintă fragmentul de legare pe receptorii specifici ai celulelor susceptibile şi
facilitează pătrunderea fragmentului A. Fragmentul A este activ şi inhibă elongarea lanţurilor polipeptidice
în curs de formare, catalizând inactivarea translocazei ARN t (numit factor de elongare 2) prezentă numai în
celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este necesar pentru translocarea polipeptidil-ARN t de pe situsul
acceptor pe situsul donor al ribozomului celulei eucariote; prin inactivarea lui nu mai are loc interacţia
ARNm-ARNt şi se stopează adăugarea a noi aminoacizi lanţului polipeptidic în curs de formare.
În mod practic, toxina difterică (fragmentul A) catalizează o reacţie prin care se eliberează nicotinamidă şi
adenozin difosfat riboză, care cuplându-se cu factorul de elongare 2 formează un complex inactiv (o
toxină asemănătoare ca mod de acţiune poate fi produsă de unele tulpini de P. aeruginosa). O moleculă
de toxină opreşte sinteza proteică în celulă pentru mai multe ore. Doza letală este de 0,1 mg / kg.

46. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Poarta de intrare a bacilului difteric poate fi reprezentată de tractul respirator (faringe, nas), de leziuni
tegumentare sau, mai rar, de mucoasa genitală. După multiplicare rezultă o inflamaţie locală. În acelaşi
timp, în cazul tulpinilor lizogene (infectate cu bacteriofagi tox+) începe sinteza toxinei. Toxina difterică
poate afecta orice tip de celulă din organism, dar are un „tropism” special pentru celulele de la nivel
cardiac (miocardită), nervos (demielinizare), renal (necroză tubulară), suprarenalian, muscular şi hepatic.
Cel mai probabil oprirea bruscă a sintezei proteice este responsabilă de efectele necrotice, neurotoxice
etc.
În câteva zile de la debutul infecţiei (şi producerii de toxină), Corynebacterium diphtheriae sintetizează o
„structură” compusă din fibrină la care se adaugă leucocite, eritrocite, celule epiteliale respiratorii distruse,
bacterii, structură care a fost numită „falsa membrană” de culoare gri-maronie (diphtera înseamnă
membrană).
Încercarea de a îndepărta „falsa membrană” (foarte aderentă) duce la sângerări la nivelul submucoasei
prin ruperi de capilare. Această structură se poate forma local (amigdalian, faringian, nazal, genital) sau se
poate extinde, acoperind faringele, obstrucţionând arborele traheobronşic (posibil cu asfixie mecanică,
situaţie numită „crup difteric”) etc. La adăpostul „falsei membrane”, bacilul îşi continuă multiplicarea şi
sinteza de toxină care difuzează pe cale sanguină şi conduce la apariţia unor tulburări la distanţă (tulburări
de ritm cardiac, miocardită, dificultăţi vizuale, de vorbire, de înghiţire etc).
Cu cât diagnosticul este mai tardiv, cu atât rata mortalităţii prin difterie creşte.
Au fost înregistrate forme de difterie invazivă, cu tulpini netoxigene, la persoane care se droghează sau la
alcoolici (artrită septică, osteomielită, endocardită difterică).
Datorită faptului că în ultimii aproape 22 ani nu au mai fost înregistrate cazuri de boală în ţara noastră,
există riscul nerecunoaşterii acestei patologii de către medicii care nu au văzut niciodată un caz de difterie.
Riscul apariţiei cazurilor există iar sistemul de sănătate trebuie să fie în permanenţă pregătit pentru a
reacţiona prompt, din toate punctele de vedere (recunoaştere clinică, stabilire diagnostic, instituire
tratament, intervenţie „în focar” etc).

47. Alţi bacili Gram-pozitivi nesporulaţi de importanţă

medicală (Gabriela Loredana Popa, Alina Borcan, MI
Popa)
47. 1. Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum)
Este un bacil difteroid, frecvent prezintă pleomorfism, se poate găsi la nivel tegumentar la persoanele
sănătoase. Este Gram-pozitiv, cu un capăt mai umflat; are dimensiuni de 0,3-0,8 / 2-7 μm. Nu prezintă
mobilitate. Se poate dispune în grămezi sau lanţuri scurte.
Este catalază-pozitiv. Produce lipaze şi prin eliberarea de acizi graşi liberi poate stimula un proces
inflamator local care se pare că este implicat în apariţia acneei. Se multiplică în glandele sebacee.
A fost identificat, ocazional, în hemoculturi. În astfel de situaţii este strict necesară diferenţierea unei
eventuale situaţii patologice de o posibilă contaminare fără semnificaţie clinică. Poate fi implicat în infecţii
ale protezelor valvulare precum şi în infecţii meningeale.
În situaţiile care necesită aceasta, tratamentul se putea face cu tetraciclină. Pentru că un procent
semnificativ dintre tulpini prezintă rezistenţă la eritromicină, tetraciclină etc., în cazurile în care este
dovedit efectul patogen, trebuie testată sensibilitatea la antibiotice.
47. 2. Genul Listeria
Numele iniţial al genului a fost Listerella (1926), în onoarea lordului Lister, numele actual fiind stabilit în
1940. Genul cuprinde specii dintre care cea mai importantă este L. monocytogenes, specie care poate
produce infecţii variate, umane şi animale. Infecţiile produse de această specie au fost luate pentru prima
dată în consideraţie în anul 1929. Mai rar au fost izolate tulpini din speciile L. ivanovii şi L. seeligeri. Sunt
bacili fini, Gram-pozitivi, aerobi facultativ anaerobi, mobili la 25ºC, care se dezvoltă preferenţial la 30ºC
dar se pot multiplica şi la temperatura frigiderului („îmbogăţire la rece”).
47. 2. 1. Habitat
Sunt bacterii larg răspândite în natură (la nivelul solului, plantelor), infectează animale domestice (mai ales
ovine) şi sălbatice, păsări, reptile, peşti. Pot fi izolate din alimente (ex. brânzeturi). L. monocytogenes a fost
identificată în lapte şi produse lactate, carne crudă sau prelucrată, produse vegetale, fructe de mare etc.
47. 2. 2. Morfologie
C), prezentând subterminal, flageli.m, Gram-pozitive. În culturi tinere pleomorfismul este şi mai accentuat.
L. monocytogenes este mobilă (în special la temperaturi cuprinse între 18 - 22m / 0,5 - 0,8 În culturi
tinere au aspect pleomorf (forme cocoidale, cocobacilare şi bacilare) fine, cu dimensiuni între 0,5 - 5
47. 2. 3. Caractere de cultură
C). În culturile iniţiale, temperatura scăzută favorizează multiplicarea Listeria spp.C (temperatura optimă
de multiplicare este cuprinsă între 20 şi 30Se poate multiplica la temperaturi ce variază între 2 - 45
Creşte pe medii complexe, speciale, în atmosferă de 5 - 10% CO2. Produce colonii de tip S, mici în
picătură de rouă. Şansele de identificare cresc în cazul în care culturile primare se fac pe medii cu sânge.
Pe aceste medii, coloniile sunt beta-hemolitice.
47. 2. 4. Caractere biochimice
Nu lichefiază gelatina, nu produce indol, nu reduce nitraţii. Produce catalază. Are o activitate fermentativă
redusă şi puţin specifică. Poate produce acid dar nu gaz fermentând o serie de carbohidraţi.
47. 2. 5. Acţiunea agenţilor fizico-chimici
Este un germen foarte rezistent în condiţiile mediului extern. În produse alimentare, vegetale, furaje, sol,
ape de suprafaC şi o umiditate de 25 - 35%. Rezistă la diferiţi agenţi chimici.ţă, pe obiecte, poate
supravieţui săptămâni sau luni de zile, putându-se chiar multiplica. Multiplicarea este favorizată de
temperatura de 18 - 20
47. 2. 6. Structură antigenică
L. monocytogenes prezintă antigene somatice (14 tipuri) şi respectiv antigene flagelare H (15 tipuri).
Dintre structurile antigenice somatice amintim acidul ribitol-teichoic şi acidul lipoteichoic. Secretă o serie
de proteine antigenice. Clasificarea în funcţie de structura antigenică se face numai în laboratoare de
referinţă şi poate avea utilitate epidemiologică.
47. 2. 7. Caractere de patogenitate
Listeria monocytogenes este patogenă prin multiplicare şi invazivitate (prezintă o structură asemănătoare
proteinei M streptococice, produce diferite substanţe cu rol în invazivitate, inclusiv lecitinaza, fosfolipaza C
şi listeriolizina O, cu efect hemolitic). Infectează probabil iniţial celulele intestinale, supravieţuieşte
intracelular; se multiplică şi intramacrofagic.
Listerioza este o zoonoză. Infecţia umană apare accidental şi foarte frecvent evoluează inaparent. Dintre
manifestările clinice grave amintim listerioza perinatală, probabil o infecţie intrauterină (avort spontan,
naştere prematură, sepsis cu deces înainte sau relativ repede după momentul naşterii etc). La adulţi pot
apărea meningoencefalită, bacteriemie urmată de metastaze septice (mai ales la imunodeprimaţi) şi mai
rar, diferite infecţii focalizate.
Dintre toate tipurile antigenice, 90% dintre tulpinile izolate la om aparţin tipurilor Ia, Ib şi IVb. Tipul IVb a
fost mai frecvent asociat cu consumul de brânză făcută din lapte nepasteurizat. Asocierea unor epidemii
de listerioză cu consumul de alimente contaminate sugerează calea gastrointestinală drept cea mai
importantă cale de pătrundere.
47. 2. 8. Forme clinice
Dintre manifestările clinice grave se poate aminti listerioză perinatală, probabil o infecţie intrauterină, care
se manifestă ca sepsis cu deces înainte sau relativ repede după momentul naşterii. La adulţi pot apare
meningoencefalită, bacteriemie (mai ales la imunodeprimaţi) şi mai puţin frecvent, diferite infecţii
focalizate.
47. 2. 9. Diagnostic de laborator
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Listeria monocytogenes este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). Diagnosticul
de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea microorganismului, în special din sânge şi / sau din
LCR. În infecţiile produse de Listeria monocytogenes se mai pot recolta lichid amniotic, placentă, ţesut
fetal, dar şi prelevate patologice contaminate cu alţi germeni precum materii fecale, secreţii genitale,
alimente, probe din mediul extern etc.
m, dispuşi izolat, în perechi sau în lanţuri scurte, intra sau extracelular.m / 0,5 - 0,8 2. Examinarea
microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic
recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram.
Listeria monocytogenes se prezintă ca bacili sau cocobacili Gram-pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5
C); în culturile iniţiale, temperatura scăzută favorizează multiplicarea L. monocytogenes („îmbogăţire la
rece”); tolerează o atmosferă de 5 - 10% CO2 precum şi concentraţii de peste 5% NaCl.C (temperatura
optimă fiind de 20-303. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât
să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). De
menţionat că se poate multiplica la temperaturi ce variază între 2-45
În cazul p.p. necontaminate (sânge, LCR etc) vom utiliza spre ex. agar glucozat sau triptozat, suplimentat
cu 5% sânge de berbec. Atunci când dorim să realizăm izolarea pornind de la p.p. contaminate (alimente,
materii fecale etc) este necesar să folosim medii de cultură selective spre exemplu însămânţăm iniţial o
parte p.p. în 9 părţi de bulion peptonă-triptonă cu extract de carne şi drojdie, suplimentat cu acid nalidixic
şi acriflavină iar după 2-7 (sau chiar 30) zile de incubare la temperatura frigiderului, incubăm încă 18-24 de
ore la 35-37ºC. Ulterior realizăm o repicare pe medii selective (ex. agar, acriflavină, polimixină B, clorură de
litiu, ceftazidimă etc). Există şi alte strategii folosite pentru izolarea L. monocytogenes.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
• Caractere morfotinctoriale:
m, dispuşi separat sau grupaţi în palisade, în perechi sau „în formă de litere” (asemănător
corynebacteriilor);m / 0,5 - 0,8 sunt bacili fini sau cocobacili Gram-pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5
în culturile tinere predomină formele cocobacilare în timp ce în culturile vechi se caracterizează prin
pleomorfism şi pot apărea forme filamentoase;
în preparatul proaspăt se poate demonstra mobilitatea, în special dacă s-a menţinut cultura la 18-25ºC
(sau la temperatura camerei);
• Caractere de cultură:
cultura degajă un miros de lapte acidulat;
L. monocytogenes formează colonii de tip S; după 1-2 zile de incubare la 35-37ºC pe agar glucozat,
coloniile ating un diametru de 1-1,5 mm (mai mici pe agarul triptozat); pot să aibă aspect de picături de
rouă;
pe agar-sânge, coloniile sunt înconjurate de o zonă discretă de β-hemoliză;
dacă însămânţăm prin înţepare o coloană de mediu semisolid, datorită mobilităţii va apărea creşterea „în
umbrelă”, caracteristică pentru L. monocytogenes;
multiplicarea la temperaturi extreme (2-45ºC) poate fi utilă pentru identificare;
• Caractere biochimice:
L. monocytogenes produce o zonă discretă de β-hemoliză;
utilizarea unor tulpini standard de Staphylococcus aureus (pentru L. monocytogenes şi L. seeligeri) sau de
Rhodococcus equi (pentru L. ivanovii) în cadrul testului CAMP este utilă pentru identificare;
L. monocytogenes este catalază-pozitivă, oxidază-negativă; fermentează o serie de carbohidraţi (fără
producere de gaz);
se pot utiliza truse comerciale manuale (ex. API Listeria sau API 20 Strep) şi respectiv truse automate (ex.
rapid ID 32 Strep) care permit identificarea L. monocytogenes în 4-24 de ore, în funcţie de trusa utilizată;
• Caractere antigenice:
se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Listeria monocytogenes, prin
tehnici imunologice, în funcţie de Ag somatice sau flagelare;
serotiparea este utilă în scop epidemiologic; există 13 serotipuri (serovaruri) majoritatea tulpinilor izolate
la om aparţinând tipurilor Ia, Ib şi IVb;
• Sensibilitatea la bacteriofagi: lizotiparea poate fi foarte utilă în scop epidemiologic; există tulpini care nu
pot fi testate prin această metodă;
• Caractere de patogenitate:
în general, tulpinile de Listeria monocytogenes izolate de la pacienţi sunt virulente; în laboratoare de
referinţă pot fi efectuate însă şi teste de patogenitate;
se poate realiza cultivarea în bulion timp de 24 de ore, urmată de inocularea unei picături de cultură în
sacul conjunctival la iepure sau cobai; tulpina virulentă va determina apariţia unei conjunctivite purulente
în 1-3 zile;
alte modalităţi de studiere a virulenţei tulpinilor izolate sunt reprezentate de inoculări la şoareci
imunocompromişi (inoculare intraperitoneală) sau de inocularea membranei chorioalantoidiană a oului
embrionat de găină;
• Alte teste rezervate centrelor de referinţă: în scop epidemiologic sau în cadrul unor studii taxonomice se
pot utiliza Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE), analiza macrorestricţiei ADN (RFLP), RAPD-PCR sau
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE).
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului)
poate fi necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul infecţiilor grave se vor
determina CMI şi CMB (vezi capitolul 7).
47. 2. 10. Tratament
Tratamentul etiologic se poate face cu penicilină, ampicilină sau cu penicilină asociată cu un
aminoglicozid. Prezintă, de regulă, rezistenţă la chinolone, cicline şi cefalosporine.
47. 2. 11. Epidemiologie
În România nu s-a raportat nici un caz de listerioză în 2003-2004 şi 2006, au fost raportate 2 cazuri în
2005, iar în 1998-2002 a fost raportat câte un singur caz pe an. Comparând aceste informaţii cu datele
raportate la CDC, se pot trage o serie de concluzii, inclusiv faptul că există un deficit în ceea ce priveşte
diagnosticul şi raportarea acestor cazuri, în ţara noastră.
Autorităţile de sănătate publică americane consideră listerioza o maladie rară, dar cu potenţial sever şi în
acest context au decis ca listerioza să fie inclusă în lista bolilor care se raportează la nivel naţional,
începând cu anul 2000. În această perioadă au fost raportate între 613 (2001) şi 896 (2005) cazuri în
fiecare an, incidenţa în anul 2005 fiind de 0,270/0000. Cele mai multe cazuri au fost înregistrate la
persoane cu vârsta mai mare de 60 de ani. În vederea diagnosticului şi detectării izbucnirilor epidemice, în
SUA tulpinile au fost iniţial izolate în culturi şi apoi tipizate prin metode ale biologiei moleculare (PFGE).
Atâta timp cât în România se va considera că diagnosticul de listerioză poate fi pus prin tehnici serologice,
nu vom putea discuta nici de identificarea cazurilor (diagnostic) şi nici de identificarea unor posibile
izbucniri epidemice (supraveghere, investigaţie epidemiologică).
47. 3. Genul Erysipelothrix. Erysipelothrix rhusiopathiae
Genul cuprinde o singură specie E. rhusiopathiae, specie foarte răspândită în natură. Este agentul etiologic
al infecţiei numite „erizipelul lui Rosenbach” şi a unor infecţii la animale.
Morfologie
Bacil Gram-pozitiv, imobil, necapsulat, nesporulat, care seamănă cu Listeria.
Caractere de cultură
Creşterea este mult îmbunătăţită dacă se adaugă glucoză, ser de cal, acid oleic.Creşte pe medii simple
şi face colonii de tip S. Pe geloză-sânge de oaie face hemoliză de tip
Caractere biochimice
Prezintă o slabă activitate fermentativă. Nu produce indol, nu reduce nitraţii, nu creşte pe mediul cu citrat.
Este catalază şi urează-negativ. Pe mediu TSI fermentează glucoza, lactoza şi produce H2S.
Acţiunea agenţilor fizico-chimici
Este un germen foarte rezistent, în formă uscată poate persista câţiva ani. Rezistă la sărare, afumare,
acidifiere. Este distrus prin fierbere.
Patogenie
E. rhusiopathiae devine patogen prin multiplicare şi invazivitate. Produce o serie de infecţii, în special la
animale (de ex. la porci). La om produce o formă de erizipel, infectând tegumentele care au soluţii de
continuitate. Manifestările clinice includ durere, edem şi un eritem caracteristic care se extinde periferic cu
o zonă centrală clară. La om mai pot apare infecţii după contactul cu carne (ex. carne de peşte)
contaminată.
Diagnostic de laborator
Diagnosticul de laborator este bacteriologic şi se bazează pe izolarea microorganismului din piese
bioptice tegumentare. E. rhusiopathiae se poate dezvolta pe agar-chocolate, în atmosferă de 5-10% CO2.
Tratament
Tratamentul de elecţie se face cu penicilină. Se mai poate administra şi ampicilină.
47. 4. Povestiri adevărate
47. 4. 1. Diagnosticul în listerioză este un diagnostic bacteriologic, direct
O familie de tineri căsătoriţi, se prezintă la medicul obstetrician pentru evaluare clinică, soţia fiind
însărcinată. Medicul recomandă o serie de analize, inclusiv „serologia pentru Listeria”. Buletinul de analiză
serologică menţionează: serologie pozitivă pentru Listeria spp. (tinerii nu îşi amintesc care a fost titrul
reacţiei).
În baza acestui rezultat, se prezintă la medic care recomandă tratament cu ampicilină, timp de 3
săptămâni, „pentru prevenirea transmiterii listeriozei la făt”. Tânăra începe tratamentul în dozele şi la
intervalele prescrise. După 1 lună, la următorul consult, i se recomandă să se prezinte pentru o nouă
testare serologică. La a doua testare, buletinul de analiză menţionează: serologie pozitivă pentru Listeria
spp. (tinerii nu îşi amintesc care a fost titrul reacţiei, dar ştiu că a fost mai mare decât la prima analiză).
Se recomandă continuarea tratamentului cu ampicilină.
În urma unei întâlniri întâmplătoare, ni se cere sfatul în legătură cu această situaţie. Având în vedere că
structurile antigenice ale Listeria spp. au o serie de asemănări cu structurile antigenice ale unor alte
bacterii (în special Gram-pozitive) foarte frecvent întâlnite, dar şi faptul că unica variantă corectă de
diagnostic pozitiv în listerioză este examenul bacteriologic, am recomandat întreruperea tratamentului.
Recomandarea a fost urmată, mama a născut la termen un nou-născut normal, iar la o verificare de rutină,
buletinul de analiză serologică a menţionat: serologie pozitivă pentru Listeria spp.
47. 4. 2. Exemple de izbucniri epidemice de listerioză
Contaminarea cu Lysteria monocytogenes a unor produse alimentare vândute la scară industrială pare să
fie la originea epidemiilor apărute în Europa Occidentală, în ultimele decade. Spre exemplu, în Franţa,
probabil influenţat şi de consumul de produse lactate (sub formă de brânzeturi) au fost raportate două
izbucniri epidemice („outbreak”), în 1992 (cu 279 cazuri) şi în 1993 (cu 39 cazuri). Investigarea acestor
izbucniri epidemice a fost realizată folosind tehnica studiilor de tip „caz-control”. Oare câte astfel de studii
sunt discutate şi eventual aplicate de către studenţii facultăţii de medicină din Bucureşti? Ne aducem
aminte faptul că la sfârşitul facultăţii nu înţelesesem deloc importanţa acestor demersuri; au trecut
aproape 10 de ani până am realizat cât sunt de importante.
Investigaţia epidemiologică a evidenţiat modul de transmitere a acestui bacil Gram- pozitiv, reprezentat
de contaminarea următoarelor produse alimentare: „limbă de porc în 1992” şi „pate din limbă de porc în
1993”, adică din produse diferite faţă de situaţia „aşteptată”. De altfel, ar fi bine să reţinem că în însăşi
definiţia „epidemiei”, cuvântul „neaşteptat” reprezintă un element esenţial.
Detectarea celor două izbucniri epidemice a fost realizată de către Laboratorul Naţional de Referinţă
pentru Listeria (din cadrul Institutului Pasteur, Paris), a căror coordonatoare, autorii au avut deosebita
plăcere să o cunoască, în anul 1994. Studiul epidemiologic a fost coordonat de către Reţeaua Naţională de
Sănătate Publică. În 1933, detectarea unei anumite mărci de pate de porc ca şi vehicul, a dus la retragerea
de pe piaţă a acelui produs de către producător. În timpul epidemiei din 1993, recomandările făcute
femeilor gravide de către Autorităţile de Sănătate Publică, au dus la scăderea cazurilor de îmbolnăvire şi
respectiv la scăderea riscului de transmitere a infecţiei la făt.
Am dori să subliniem o noţiune, dintre cele menţionate în cadrul acestui capitol, noţiune de interes şi
importanţă generală, cu posibile repercusiuni în cazul nerespectării sau interpretării greşite a datelor şi
recomandărilor existente: diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct, cu izolarea în cultură pură şi
identificarea agentului etiologic. Studiile privind prezenţa anticorpilor anti-Listeria pot fi utile în cercetare.

48. Bacili Gram-pozitivi sporulaţi. Genul Bacillus. Bacillus

anthracis
48. 1.  Definiţie.  Încadrare
 
Genul Bacillus aparţine familiei Bacillaceae şi cuprinde un număr foarte mare de specii,
dintre care în patologie sunt mai frecvent implicate B. anthracis, B. cereus şi B. subtilis.
Mai putem aminti B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis etc., unele
cu utilitate practică (vezi capitolele 3 şi 4). Cele mai multe dintre specii includ bacili lungi,
imobili, sporulaţi, cu sau fără capsulă, aerobi, facultativ anaerobi.
 
Genul Bacillus include mai mult de 90 de specii, una dintre acestea izolată sub formă de
spori, din structuri cu o vechime foarte mare (în Triasic), la o adâncime de peste 2,5
km, Bacillus infernus. Studiile din ultimii ani au demonstrat că o parte din specii trebuie
să fie clasificate în alte genuri, de ex. B. polymyxa face actualmente parte din
genul Paenibacillus, B. brevis face parte din genul Brevibacillus, iar B.
steatothermophilus (util în verificarea eficacităţii sterilizării) face parte din
genul Geobacillus.
 

48. 2.  Caractere generale

 

48. 2. 1. Habitat

 
Bacillus anthracis se găseşte în ţesuturile şi umorile animalelor bolnave; poate fi eliminat
în mediu prin dejecţiile acestora. Pe sol condiţiile sunt nefavorabile, iar germenul
sporulează. Sporii sunt extrem de rezistenţi, rezervorul principal pentru B. anthracis fiind
reprezentat de sol (bacil teluric).
 

48. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

 
Sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiuni relativ mari având 3-10µm / 2µm, cu capetele
tăiate drept, imobili, incapsulaţi (în ţesuturile animalelor bolnave). Sunt dispuşi în lanţuri,
dar şi 2 câte 2 sau izolaţi. Atunci când sporulează, sporul are diametrul mai mic decât
grosimea bacilului şi este dispus central.
 

48. 2. 3. Caractere de cultură

 
Germen aerob facultativ anaerob, se dezvoltă pe medii simple, la 35-37ºC. Pe mediul cu
agar formează colonii relativ mari, alb-cenuşii, de tip R, rugoase, „în cap de meduză” sau
„coamă de leu”. În bulion, lasă mediul limpede şi formează flocoane care se depun pe
pereţii eprubetei.
 

48. 2. 4. Caractere biochimice

 
Reduce nitraţii, este indol-negativ, urează-negativ, produce acetil-metil-carbinol,
lichefiază gelatina, hidrolizează cazeina.
 

48. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

 
Rezistenţa formelor vegetative este similară cu a celorlalte bacterii, fiind distruse de
exemplu în 30 de minute la 60ºC. Sporii sunt însă deosebit de rezistenţi. Sunt distruşi la
temperatura de fierbere în circa 10 minute şi prin autoclavare. În frotiuri fixate şi colorate
nu îşi pierd vitalitatea. La temperaturi de -5ºC pot rezista până la 10 ani. S-a reuşit
germinarea sporilor păstraţi la întuneric şi la temperatura camerei după mai mult de 30
ani.
 
 48. 2. 6. Structură antigenică

 
Bacilul antraxului are două grupe majore de antigene: celulare (somatice) şi
componentele complexului exotoxinic.
 
Antigenele somatice sunt reprezentate de polizaharidele peretelui celular, de antigenul
polipeptidic capsular şi de antigenele din spori (studiate în special după evaluarea
riscurilor unui atac bioterorist folosind spori de B. anthracis). Capsula are determinism
plasmidic. Are proprietăţi antifagocitare, protejează microorganismul de anticorpii litici
şi pare să aibă un rol important în patogenitate.
 
Exotoxina are de asemenea un determinism plasmidic şi constă dintr-un amestec de trei
proteine imunogene: 1. factorul edematos (EF); 2. antigenul protectiv (PA), capabil să
inducă producerea de anticorpi; 3. factorul letal (LF).
 

48. 2. 7. Răspuns imun

 
Infecţia cu bacilul antraxului este urmată de apariţia de anticorpi faţă de toxină şi faţă de
polipeptidul capsular, anticorpi care pot fi detectaţi prin metode de laborator.
 

48. 2. 8. Caractere de patogenitate

 
Principalii factori de virulenţă ai germenului sunt polipeptidul capsular (antigenul K) şi
toxina. Componenta PA a toxinei se leagă de membrana celulelor ţintă, facilitând
legarea în continuare a celorlalte două elemente (EF şi LF). Efectele biologice ale EF
include edem local şi inhibiţia funcţiilor PMN, fiind mediate de AMPc. Pătrunderea LF în
celule, mediată de PA, determină moartea acestora, mecanismul fiind însă necunoscut.
 

48. 3.  Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

 
Manifestările clinice ale infecţiilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate
de:
 
a). Antraxul cutanat, forma cea mai frecventă la om, este cunoscută sub numele de
„pustulă malignă”. Leziunea apare la nivelul unui traumatism cutanat (faţă, gât, membre
superioare), prin care pătrund sporii germenului. După o perioadă de incubaţie de 2-5
zile, la locul inoculării apare o o papulă care se transformă în veziculă. Aceasta se sparge
în cele din urmă, lăsând locul unei cruste de culoare neagră, înconjurată de o zonă de
edem considerabilă. Netratată, infecţia poate disemina pe cale limfatică sau sangvină,
determinând septicemie;
 
b). Antraxul pulmonar, apărut prin inhalarea de praf conţinând spori de bacil antrax, se
manifestă iniţial prin simptome uşoare şi nespecifice, similare cu cele ale unei infecţii de
căi aeriene superioare. În 2-3 zile (dar perioada de incubaţie poate atinge chiar şi 6-8
săptămâni) apar semne de insuficienţă respiratorie acută (febră, dispnee, hipoxie,
hipotensiune), decesul purând surveni în 24 de ore de la declanşarea bolii;
 
c). Antraxul gastrointestinal apare prin ingerarea cărnii insuficient preparate provenite de
la animalul bolnav. Manifestările clinice sunt variabile şi includ febră, greaţă, vărsături,
dureri abdominale, diaree sangvinolentă şi uneori ascită formată brusc. Rata mortalităţii
este foarte crescută în această formă de boală.
 

48. 4.  Diagnostic de laborator

 
Constă, de regulă, în evidenţierea bacililor pe frotiuri colorate efectuate din exsudatele
recoltate din leziunile cutanate, în demonstrarea anticorpilor prin metoda fluorescentă
directă sau prin efectuarea de culturi din produsul patologic de la nivelul leziunilor
respective.
 
48. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct trebuie realizat cât mai rapid;
sunt urmate etapele cunoscute dar există anumite particularităţi.
 
Diagnosticul cazului de antrax porneşte de la datele clinice şi epidemiologice. Examenul
bacteriologic va putea confirma diagnosticul.
 
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând
regulile cunoscute (vezi anexa nr. 6), în special recoltarea cât mai rapid după debutul
bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai
frecvent de secreţii de la nivelul leziunilor cutanate dar se pot recolta şi aspirat din
edemul local şi / sau din ganglionii regionali, spută, materii fecale, alimente incriminate,
lichid cefalorahidian, probe necroptice, sânge (pentru hemoculturi) etc, în funcţie de
forma clinică. În cazul în care este de presupus că p.p. este contaminat se pot folosi o
serie de metode, spre ex. utilizarea mediilor selective, tratarea termică sau tratarea cu
alcool a p.p. În cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent utilizat este
polimixina B. În cazul celei de a treia variante, utilizăm etanol steril de 95º. Vom
suspensiona p.p. în proporţie egală în etanol pentru o durată de 30-60 minute, la
temperatura camerei, după care vom preleva circa 0,25 ml din suspensie pe care o
cultivăm pe mediul de cultură ales. În cazul în care estimăm că transportul către
laborator va dura mai mult de 60 minute, asigurăm o temperatură de transport de 2-
8ºC. Trebuie să menţionăm faptul că atunci când presupunem diagnosticul de antrax,
trebuie luate măsuri de biosecuritate speciale.
 
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care
se colorează cu albastru de metilen şi Gram; cel puţin un frotiu se va păstra de rezervă.
Se mai pot utiliza albastru de metilen policrom (McFadyean) sau coloraţia
imunofluorescentă, pentru evidenţierea capsulei bacteriene. În p.p. se pot remarca
structuri tisulare, leucocite şi bacili Gram-pozitivi, cu capetele „tăiate drept”, de
dimensiuni mari (1-1,5m / 3-10m), capsulaţi, dispuşi izolat, în perechi sau lanţuri
scurte, incluşi într-o capsulă comună. În coloraţia cu albastru de metilen policrom bacilii
apar albaştri iar capsula apare ca un halo de culoare roz.
 
Relativ recent au fost realizaţi anticorpi care, marcaţi fluorescent, pot permite
identificarea formelor vegetative (Ac anti-Ag din perete sau anti-Ag K) sau sporilor de B.
anthracis (Ac policlonali anti-Ag sporale; pentru eliminarea reacţiilor încrucişate, se
poate face o „pre-tratare” cu Ac-anti spori de B. cereus).
 
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi
anexa nr. 2). Putem utiliza geloză nutritivă sau geloză-sânge, în condiţii de aerobioză, la
o temperatură de 37ºC (deşi se poate multiplica între 15 şi 42ºC). În cazul în care este de
presupus că p.p. este contaminat se pot folosi metodele menţionate mai sus. Pentru
izolarea B. anthracis se poate folosi un mediu cu polimixină B, lizozim, EDTA şi acetat de
thalium, mediul PLET.
 
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai
multor caractere:
 
·         Caractere morfotinctoriale
 
sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiuni de 1-1,5m / 3-10m, care
se pot dispune în lanţuri lungi;
 
dacă începe procesul de sporogeneză, sporul este oval, situat
central, mai mic decât grosimea bacilului respectiv;
 
·         Caractere de cultură
 
-          pe medii simple produc colonii de tip R, mari, cu diametrul de
2-; marginile sunt neregulate, cu prelungiri laterale filamentoase
care au permis asemănarea acestora cu „capul de meduză” sau
„coama de leu”;
 
-          pe mediile cu sânge, poate apărea o zonă discretă de β-
hemoliză deşi în mod caracteristic B. anthracis este non-hemolitic;
 
-          pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei
polipeptidice;
 
-          pe mediul PLET produc colonii mici, de tip S;
 
·         Caractere biochimice
 
-          Bacillus anthracis  este catalază-pozitiv, produce lecitinază şi
este sensibil la penicilină (faţă de majoritatea speciilor din
genul Bacillus, rezistente la penicilină); există şi alte teste biochimice
care sunt efectuate la nivelul centrului de referinţă;
 
-          un alt caracter care trebuie investigat se referă la motilitate,
absentă în cazul B. anthracis  şi prezentă la majoritatea speciilor din
genul Bacillus; în acest scop putem însămânţa o coloană de geloză
 moale, cu incubare la 37ºC pentru 1-4 zile şi urmărim dezvoltarea
culturii faţă de traseul pe care am însămânţat asemănător cu
interpretarea aspectelor pe mediul MIU, în cazul enterobacteriilor;
 
·         Caractere antigenice
 
-          Identificarea toxinelor (componentele PA, EF şi LF) prin tehnici
de tip ELISA;
 
·         Caractere de patogenitate
 
-          testarea producerii capsulei in vitro, caracteristică tulpinilor
virulente de  B. anthracis  se poate realiza prin cultivare (repicare) pe
un mediu care conţine bicarbonat de sodiu (0,7%), la 37ºC şi în
prezenţa unui procent crescut de CO2; după 24 de ore, tulpinile
capsulate vor produce colonii mucoide iar prezenţa capsulei se va
demonstra microscopic (ex. coloraţia McFadyean sau Giemsa);
 
-          testarea patogenităţii la şoarecele alb (vezi anexa nr. 2);
 
·         Testarea sensibilităţii la bacteriofagul 
 
·         Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă
 
-          testarea sensibilităţii la penicilină, pe de o parte ar putea fi
utilă în identificarea unei tulpini de B. anthracis obişnuite (sensibilă
la penicilină), dar ar putea permite şi demonstrarea apariţiei unor
tulpini mutante (aşa cum s-a întâmplat în cadrul izbucnirii epidemice
din regiunea Sverdlovsk);
 
-          testări biochimice suplimentare;
 
-          examen microscopic (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru
identificarea prezenţei globulelor lipidice de β-hidroxibutirat);
 
-          alte teste pentru demonstrarea sensibilităţii la penicilină (ex.
testul colierului de perle);
 
-          tehnici de biologie moleculară (depistarea prezenţei
plasmidelor pX01 şi pX02).
 
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) nu este
necesară. Bacillus anthracis este sensibil la penicilină, tetraciclină, cloramfenicol,
gentamicină ciprofloxacină etc (care se pot utiliza în cazul pacienţilor cu HS de tip I la
penicilină).
 
48. 4. 2. În ceea ce priveşte diagnosticul imunobiologic, în România a fost pusă la
punct tehnica IDR cu antraxină (Bălteanu-Toma). Această tehnică este încă utilizată în
unele dintre statele care au făcut parte din URSS.
 
48. 4. 3. Este de o deosebită importanţă punerea diagnosticului de antrax la animale (în
special ierbivore), principalul rezervor pentru Bacillus anthracis.
 
În acest scop, se pot utilizat tehnici ale diagnosticului bacteriologic (evidenţierea
microscopică a bacililor în leziuni, obţinerea de culturi, identificarea antigenelor prin
reacţii de precipitare sau tehnici de tip ELISA; pentru reacţia Ascoli - vezi capitolul 20)
sau ale diagnosticului imunologic (intradermoreacţia cu antraxină).
 

48. 5.  Tratament

 
Se efectuează cu Penicilina G, administrată în doze de 2 milioane de unităţi la 6 ore,
timp de 7-10 zile (la adulţi). În caz de alergie la penicilină se pot folosi de ex.
eritromicină sau tetraciclină, la fiecare 6 ore. Cloramfenicolul poate fi de asemenea util în
terapia acestei afecţiuni.
 

48. 6.  Epidemiologie

 
Antraxul uman este de obicei o boală cu caracter profesional, apărând de exemplu la
îngrijitorii de animale, la ciobani, lucrătorii din abatoare, măcelari, tăbăcari, blănari etc.
 
Cazurile de antrax, semnalate în România în anul 1998, au fost în număr de 12, incidenţa
bolii fiind de 0,050/0000, în timp ce în anul 2000 au fost raportate 51 de cazuri, cu o
incidenţă de 0,20/0000 (a fost vorba de o izbucnire epidemică de antrax, într-un an secetos,
care a condus la un mare număr de cazuri la animale şi ulterior şi la om). Nici unul dintre
plicurile testate de Institutul „Cantacuzino” în perioada septembrie - decembrie 2001 nu
au fost pozitive pentru spori de Bacillus anthracis, dar au fost înregistrate, în alte
condiţii, 7 cazuri de antrax în anul 2001 (incidenţă 0,030/0000). În perioada 2002-2006 au
fost raportate între 1 (2003 şi 2006) şi 7 cazuri (2004) pe an.
 
În SUA nu s-au înregistrat cazuri de antrax uman în perioada 1997-1999 şi respectiv
2004-2005. Dacă în anul 2000 s-a înregistrat un caz iar în 2002, 2 cazuri, în cursul
„atacului terorist” din 2001 au fost înregistrate 23 de cazuri de antrax, dintre care o parte
au avut evoluţie nefastă, către deces..
 
Antraxul provoacă încă pierderi importante de animale (în special cornute mari) în
Orientul mijlociu, Africa, Asia, dar boala la animale este înregistrată şi în ţările dezvoltate.
 

48. 7.  Profilaxie

 
La animale, boala (cărbunele) poate fi controlată prin imunizarea cu vaccinuri atenuate.
Resturile animalelor moarte de antrax trebuie arse sau îngropate la mare adâncime.
 
Lucrătorii din sectorul veterinar şi din alte sectoare cu risc crescut pentru antrax ar trebui
imunizaţi cu un vaccin preparat din antigenul capsular protectiv. Este de asemenea
importantă aplicarea măsurilor de igienă în aceste locuri de muncă, pentru a păstra
incidenţa bolii la un nivel scăzut.

49. Genul Clostridium. Clostridium tetani

Genul Clostridium include peste 170 de specii (faţă de 83 specii listate în 1986) care se pot găsi în
intestinul animalelor şi se pot elimina în mediul exterior prin materiile fecale. O parte dintre aceste specii
sporulează. Cele mai multe dintre specii sunt anaerobe.
Fenomenul de anaerobioză a fost descoperit în anul 1861, de către Louis Pasteur, care a identificat şi
fermentaţia butirică produsă de Vibrion butyrique (numele actual fiind Clostridium butyricum). Până în anul
1880, aceste specii erau incluse în genul Bacillus.

Reprezintă un grup foarte heterogen, în cazul căruia secvenţierea ARN r 16S nu a condus la o clasificare
suficient de clară. Se discută despre existenţa a 19 sub-grupuri.

Spre exemplu, primul sub-grup include: Clostridium tetani, C. botulinum, C. baratii, C. butyricum etc. Trei
dintre aceste sub-grupuri includ peste 70% din flora normală intestinală.

Sunt bacili Gram-pozitivi (uneori „la limită”), de dimensiuni mari, aşezaţi în perechi sau lanţuri, mobili cu
cili peritrichi (ex. cu excepţia C. perfringens sau a C. butyricum). Multe dintre specii sintetizează exotoxine.

În cele ce urmează vom discuta despre speciile care produc tetanosul, botulismul şi gangrena gazoasă.

Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare şi toxinogeneză
(produce o exotoxină neurotropă). Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibaţi de către glicină şi
acidul  aminobutiric. Toxina blochează eliberarea acestor mediatori ceea ce determină excitarea
neuronilor motori spinali, cu apariţia de spasme severe şi dureroase ale musculaturii striate (paralizie
spastică). Conştienţa este păstrată. Toxina poate ajunge la nivelul SNC şi retrograd prin propagare pe cale
axonală de la poarta de intrare sau pe cale sangvină. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale
musculaturii din zona contaminată, apoi ale muşchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se
mai poate deschide) şi facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern
precipită un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.

Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conţin toxina produsă de Clostridium botulinum,
fiind o toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxină preformată în aliment). Toxina botulinică este cea mai
puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este de circa 1-2 g. După ingerare, toxina se resoarbe
la nivel intestinal, ajunge în circulaţie, iar pe această cale la nivelul plăcilor neuromotorii unde împiedică
eliberarea de acetilcolină (determină paralizie flască). Paralizia începe la extremitatea cefalică (ex. paralizia
muşchilor globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie şi se manifestă prin diplopie) şi evoluează
descendent. Decesul poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei muşchilor respiratori). Botulismul infantil
(posibil şi la adulţi) este urmare a formării toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a
sporilor ingeraţi. Mortalitatea în botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plăgilor poate apărea la
persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau prezintă leziuni contaminate cu pământ.

Gangrena gazoasă este produsă de două sau mai multe dintre următoarele specii: C. perfringens, C.
novyi  (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C. sporogenes etc. Sporii clostridieni ajung la nivel
tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). În condiţii de anaerobioză sporii germinează, formele
vegetative se multiplică, fermentează zaharuri şi apare gaz. Distensia tisulară, obstrucţia mecanică a
structurilor vasculare în conjuncţie cu sinteza de toxine favorizează diseminarea infecţiei. Enzimele
(toxinele) produse contribuie şi la alterarea gravă a stării generale. Gangrena gazoasă este caracterizată
prin edeme dure, crepitante (datorită prezenţei de gaz) şi necroză. Necroza tisulară se extinde,
multiplicarea bacteriană se amplifică, apare anemie hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20-80% din cazuri)
către deces.
Clostridium tetani
Tetanosul a fost cunoscut încă de pe vremea lui Hipocrate, sau chiar şi înainte de menţiunile făcute de
acesta. Etiologia tetanosului a reprezentat un mister până în anul 1884 (anul vizualizării la microscop a
bacilului tetanic); în anul 1889 au fost obţinute primele culturi de C. tetani.

49. 1. Definiţie. Încadrare

Sunt germeni strict anaerobi, sporulaţi, necapsulaţi, mobili, cu cili peritrichi, care se poate identifica pe sol
(germeni telurici). Clostridium tetani reprezintă o specie patogenă prin toxinele (exotoxine) neurotrope
elaborate.

49. 2. Caractere generale

49. 2. 1. Habitat
În stare vegetativă sunt prezenţi în intestinul omului şi al animalelor. Eliminaţi în mediul extern (pe sol),
sporulează. Sporii sunt foarte rezistenţi.

49. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, cu capetele rotunjite, mobili, cu cili peritrichi. În prezenţa oxigenului
sporulează, formând un spor terminal, mai mare decât diametrul celulei bacteriene, care conferă
germenului aspectul de băţ de chibrit.

49. 2. 3. Caractere de cultură

Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză, formând colonii rotunde, de tip S, înconjurate de o zonă
pufoasă.

49. 2. 4. Caractere biochimice

Elaborează o hemolizină, o exotoxină neurotropă, proteaze, gelatinaze etc.

49. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Formele vegetative sunt distruse de expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 55-60°C şi de
substanţe dezinfectante.

Sporii rezistă la temperatura de 100°C, dar sunt distruşi prin autoclavare la 120°C şi 1 atm, timp de 30 de
minute şi la pupinel timp de 1 oră la 180°C.

49. 2. 6. Structură antigenică

Prezintă antigene flagelare de tip H, de perete (antigenul somatic O) şi o exotoxină cu structură proteică.
Toţi bacilii tetanici elaborează un singur tip de toxină, sub control plasmidic.

49. 2. 7. Răspuns imun

Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din punct de
vedere al protecţiei şi nici în scop diagnostic.
49. 2. 8. Caractere de patogenitate
Cl. tetani este patogen prin multiplicare la poarta de intrare (nu are capacitate de invazivitate) şi
toxinogeneză (produce o toxină neurotropă).

49. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Filtratul de cultură are două componente tetanolizina, care produce liza hematiilor unor specii animale şi
tetanospasmina, care inhibă eliberarea acetilcolinei, interferând astfel cu activitatea sinapsei
neuromusculare şi inhibă neuronii spinali postsinaptici, blocând eliberarea unor mediatori inhibitori,
determinând astfel spasme musculare generalizate, hiperreflexie şi convulsii.

Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibaţi de către glicină şi acidul  aminobutiric. Toxina blochează
eliberarea acestor mediatori, ceea ce determină excitarea neuronilor motori spinali, cu apariţia de spasme
severe şi dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastică). Conştienţa este păstrată. Toxina poate
ajunge la nivelul SNC şi retrograd prin propagare pe cale axonală de la poarta de intrare sau pe cale
sangvină.

Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminată, apoi ale
muşchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) şi facies de tip risus
sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipită un atac de tetanos. Moartea se
poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.

49. 4. Diagnostic de laborator

Diagnosticul este clinic, epidemiologic şi bacteriologic. Se recoltează produsul patologic de la nivelul
plăgii (puroi) şi se realizează frotiuri care se colorează cu albastru de metil sau prin coloraţia Gram.
Antibiograma nu este necesară; C. tetani  este sensibil la penicilină.

49. 5. Tratament
Tratamentul trebuie realizat de urgenţă, prin administrarea de ser antitetanic (cu măsurile de precauţie
necesare în cazul seroterapiei) şi eliminarea focarului tetanigen, pentru a se împiedica formarea unor noi
cantităţi de toxină. La tratamentul specific se asociază administrarea anatoxinei tetanice.

49. 6. Epidemiologie
Sursa de infecţie este reprezentată de om şi animale (prin dejectele acestora care ajung pe sol).

Transmiterea se face prin intermediul pământului contaminat cu spori. Poarta de intrare este de obicei o
plagă contaminată cu pământ ce conţine spori de bacili tetanici (plagă cu risc tetanigen).

În anul 1998, în România au fost înregistrate 23 cazuri de tetanos ceea ce corespunde unei incidenţe de
0,10/0000; în timp de în anii 1999-2000 au fost raportate 19, respectiv 14 cazuri de tetanos. Numărul de
cazuri raportate şi respectiv incidenţa, au avut o evoluţie fluctuantă în perioada 2001-2006, tendinţa
generală fiind de scădere (cel mai mare număr de cazuri a fost raportat în 2001, 24 de cazuri iar cel mai
mic în 2005, 8 cazuri). În anul 2006 au fost raportate 10 cazuri de tetanos, incidenţa fiind 0,05 0/0000).

În SUA au fost notificate 50 de cazuri în 1997 (incidenţă 0,02 0/0000) şi respectiv 41 cazuri în 1998 şi 40 de
cazuri în 1999. În perioada 2000-2005 au fost raportate între 20 (2003) şi 37 (2001) în fiecare an. În anul
2005 au fost raportate 27 cazuri (incidenţă 0,01 0/0000). Este de menţionat că s-a înregistrat decesul în cazul
a două paciente (una în vârstă de 94 ani care nu a fost niciodată vaccinată anti-tetanic şi a doua în vârstă
de 73 de ani, la care nu au putut fi găsite date cu privire la vaccinări efectuate anterior).

49. 7. Profilaxie
Se adresează plăgilor cu risc tetanigen, plăgilor contaminate cu alte bacterii aerobe piogene care
consumă oxigen şi cele contaminate cu pământ; acestea asigură condiţii de anaerobioză, în care sporii
trec în formă vegetativă, se multiplică şi elaborează exotoxina ce ajunge la nivelul centrilor motori bulbari.

Se face profilaxia tetanică a următoarelor tipuri de plăgi:

- plăgi înţepate profunde, în care nu există o suprafaţă de contact cu oxigenul;

- plăgi traumatice mari, profunde, cu margini neregulate, cu resturi de ţesuturi devitalizate care consumă
oxigenul din plagă şi care creează condiţii de anaerobioză;

- plăgi postoperatorii (septice) sau posttraumatice.

În orice situaţie este obligatorie toaleta chirurgicală a plăgii, ce constă în:

- deschiderea largă a plăgii;

- desfacerea marginilor plăgii şi tăierea „franjurilor”;

- îndepărtarea resturilor tisulare;

- spălarea cu apă şi săpun;

- administrarea de substanţe oxidoreducătoare (H 2O2) (nu spirt medicinal).

În plus, dacă persoana a fost corect imunizată, se face rapel cu ATPA (anatoxină tetanică purificată şi
adsorbită). Anticorpii antitoxină tetanică vor apărea în aproximativ 2 zile.

Dacă persoana nu a fost vaccinată, atitudinea este următoarea:

- se face vaccinare cu ATPA;

- se administrează şi ser antitetanic (în altă zonă decât cea în care s-a efectuat vaccinarea);

- se administreaza penicilină timp de 10 zile (sau eritromicină în cazul în care există hipersensibilitate faţă
de penicilină).

Profilaxia specifică se realizează prin vaccinare DTP (vezi şi 32. 7).

- vaccinarea începe la 2 luni (3 administrări succesive), cu 2 rapeluri;

- la 6-7 ani se face un nou rapel cu DT;

- ulterior se fac eventuale rapeluri cu ATPA sau dT (este indicată administrarea de anatoxină tetanică, la
fiecare 10 ani).

50. Clostridium botulinum

Cu toate că informaţii privind o boală cu manifestări care puteau fi determinate de infecţia cu C.
botulinum au fost descrise şi înainte, despre botulism se discută în mod clar începând cu anul 1817, în
Germania, după ce 71 de persoane (din 174) au decedat dat orită asfixiei, după ce au consumat cârnaţi
incomplet preparaţi termic („în sânge”). În urma acestei izbucniri epidemice s-a stabilit numele
de botulinum (botulus = cârnat).

50. 1. Definiţie. Încadrare

Sunt germeni strict anaerobi sporulaţi, necapsulaţi, Gram-pozitivi, mobili, cu cili peritrichi. Sporii sunt
foarte rezistenţi. Clostridium botulinum reprezintă o specie patogenă prin producerea de toxine
(exotoxine) neurotrope.

50. 2. Caractere generale

50. 2. 1. Habitat.
În stare vegetativă se poate evidenţia în intestinul omului şi al animalelor. Dacă sunt eliminaţi în mediul
extern (pe sol), sporulează. Sporii sunt rezistenţi (germeni telurici).

50. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, necapsulaţi, mobili, cu cili peritrichi. În prezenţa oxigenului sporulează.

50. 2. 3. Caractere de cultură

Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză şi formează colonii rotunde, netede, de tip S, înconjurate
de o zonă pufoasă.

50. 2. 4. Caractere biochimice

Elaborează exotoxine cu neurotropism faţă de sistemul nervos periferic. Toxinele A, B, E sunt mai comune
la om, în zona noastră geografică. Produc şi enzime proteolitice, cu formare de gaz, ceea ce se poate
observa în cazul unor conserve alimentare bombate şi care nu trebuie utilizate. Cl. botulinum sintetizează
bacteriocine.

50. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Formele vegetative sunt distruse la expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 55- precum şi
de acţiunea dezinfectantelor.

Sporii rezistă la , dar sunt distruşi prin autoclavare la , timp de 30 de minute, la presiunea de 1 atmosferă
sau prin menţinerea în pupinel timp de 1 oră la .
50. 2. 6. Structura antigenică
Cl. botulinum prezintă antigene flagelare de tip H, antigene la nivelul peretelui precum şi antigene solubile
(exotoxine). Există 8 tipuri de bacili botulinici, în funcţie de exotoxinele elaborate (A, B, C cu 2 variante, D,
E, F, G, H). Tipul G nu a fost asociat cu afecţiuni umane. În România au fost identificate mai frecvent cazuri
de toxiinfecţie alimentară cu Cl. botulinum tipurile A şi B.

Relativ recent, s-a demonstrat că o tulpină poate deţine concomitent gene care codifică pentru sinteza
mai multor tipuri de toxină.

50. 2. 7. Răspuns imun

Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din punct de
vedere al protecţiei şi nici în scop diagnostic.

50. 2. 8. Caractere de patogenitate

Cl. botulinum nu se multiplică în organism. Se multiplică în alimente şi produce o exotoxină (dacă este
lizogenizat), care este distrusă prin fierbere la 100ºC, timp de 20 minute. Se discută implicarea acestui
microorganism în botulismul neo-natal, în care se pare că este vorba de o multiplicare în intestinul
sugarilor care consumă de exemplu miere, contaminată cu spori de Cl. botulinum.

50. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Botulismul apare, mai frecvent, prin ingestia de alimente care conţin toxina, putând fi considerat o
toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxina este preformată în aliment). Spre exemplu, unele conserve
produse în gospodăria proprie, în finalul prelucrării pot asigura condiţii de anaerobioză, iar sporii care au
contaminat respectivul produs trec în formă vegetativă şi produc toxină (conservele al căror capac
„bombează” pot semnifica multiplicarea şi producerea de gaz datorită unui microorganism; nu trebuie
consumate).

Se recunosc următoarele forme de botulism: a. toxiinfecţia alimentară; b. botulismul plăgilor; c. botulismul

intestinal (mai ales la sugari); d. botulismul prin inhalare de spori; e. botulismul în care sursa este
necunoscută.

Toxina botulinică este cea mai puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este de 1-2 g.

În prima formă de botulism, după ingerarea alimentului, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge în
circulaţie, iar pe această cale la nivelul plăcilor neuromotorii (faţă de care are afinitate). Aici împiedică
eliberarea de acetilcolină, determinând o paralizie flască. Paralizia începe la extremitatea cefalică (de
exemplu, paralizia muşchilor globilor oculari, care apare la 18-24 ore de la ingestie şi se manifestă prin
diplopie-vedere dublă sau paralizie bulbară, manifestată prin imposibilitate de înghiţire şi de vorbire) şi
este descendentă, ajungând până la paralizia musculaturii respiratorii. Moartea poate surveni prin asfixie
(datorită paraliziei muşchilor respiratori). Bolnavul rămâne conştient până aproape de exitus. Rata
mortalităţii în această formă de botulism este mare. Se estimează, în SUA, că managementul unui caz de
botulism „costă” câteva milioane de USD (spitalizare, tratament, acţiuni în justiţie, solicitare de daune,
campanii mass-media etc).

Botulismul intestinal (mai frecvent la sugari, posibil şi la adulţi), este urmarea formării toxinei botulinice
prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingeraţi. Manifestările clinice sunt similare cu cele ale
toxiinfecţiei alimentare cu toxina preformată (paralizie respiratorie). Mortalitatea este foarte mare. Nu se
cunoaşte motivul pentru care cel mai mare număr de cazuri este raportat în SUA. Autorităţile americane
recomandă evitarea ingestiei de miere la sugar (copii mai mici de 1 an).

Botulismul plăgilor poate fi suspectat atunci când apar manifestări neurologice anormale şi nu pot fi
implicate alimentele drept sursă pentru toxina botulinică. Boala afectează persoanele care folosesc droguri
injectate intravenos, cele cu leziuni traumatice contaminate cu pământ sau gravidele la care s-a efectuat o
cezariană.

50. 4. Diagnostic de laborator

Fiind o toxiinfecţie alimentară de tip toxic, nu se face diagnostic bacteriologic.

Se poate încerca determinarea a tipului (toxic) de Cl. botulinum implicat, prin toxinotipie. Din aliment se
extrage structura antigenică în formă solubilă. Produsul se tratează prin fierbere (toxina botulinică este
inactivată prin fierbere). Produsul în care presupunem prezenţa toxinei, atât fiert (şi răcit) cât şi nefiert, se
inoculează la şoareci după o schemă care va fi detaliată la lucrările practice (vezi şi capitolul 22 şi anexa 2 -
A.2.6.). Se investighează eventuala prezenţă a toxinelor mai frecvent întâlnite în ţara noastră (A, B). În cazul
în care în produs există toxină botulinică, semnele clinice apar la circa 24 de ore iar şoarecii mor după
circa 48 de ore de la inocularea produsului care nu a fost supus fierberii (apariţia decesului înainte de
2 ore sau după 48 de ore de la inoculare semnifică prezenţa unei alte cauze).

Se poate încerca identificarea toxinei botulinice şi printr-o reacţie de tip ELISA.

Tehnicile de biologie moleculară (PCR) pentru determinarea genei care codifică pentru toxina botulinică
se pot efectua numai în cazul obţinerii culturii de Cl. botulinum, nu şi pornind de la produsul patologic (ex.
un aliment).

50. 5. Tratament
Se administrează ser antibotulinic, preferabil monovalent (dacă se cunoaşte tipul de toxină implicată);
dacă nu, se foloseşte ser polivalent. Se poate administra ser trivalent (A, B, E), prompt, pe cale i.v., cu
precauţiile seroterapiei, în condiţii de ventilaţie asistată.

50. 6. Epidemiologie
Botulismul apare în întreaga lume, fiind asociat în principal cu consumul de conserve preparate în casă
(conserve de fructe, legume, peşte).

Sursa este reprezentată de alimentele care conţin toxina botulinică preformată (în majoritatea cazurilor de
botulism) sau de către solul contaminat cu spori de Cl. botulinum (ex. în botulismul plăgilor).
Transmiterea se poate face şi prin ingestia de alimente contaminate cu spori (în botulismul infantil şi cel al
adultului) sau prin inhalarea acestora.

Cazurile de botulism, înregistrate în România în anul 1999, au fost în număr de 19, în timp ce în anul 2000
au fost raportate 29 de cazuri, incidenţă 0,10/0000. În perioada 2000-2005 au fost raportate între 14 (2002 şi
2006) şi 29 (2000) cazuri de botulism în fiecare an. Incidenţa în anul 2006 a fost de 0,06 0/0000.

În SUA, în 1997 s-au raportat 132 de cazuri de botulism (incidenţă 0,05 0/0000), 116 cazuri în 1998 şi 154 de
cazuri în 1999, cu o incidenţă de 0,060/0000. În perioada 2000-2005 au fost înregistrate între 118 şi 155
cazuri de botulism în fiecare an. În afară de sistemul de supraveghere „de rutină”, autorităţile de sănătate
publică americate menţin un sistem activ de supraveghere, pentru botulism. În plus, urmăresc cazurile de
botulism în funcţie de etiologie, respectiv cazurile de toxiinfecţie alimentară (19 cazuri în 2005, cu un
număr de cazuri înregistrate în perioada 1998-2005 care au variat între 16 şi 39), cazurile de botulism la
nou-născut (85 cazuri în 2005, cu un număr de cazuri înregistrate în perioada 1998-2005 care au variat
între 65 şi 97) şi botulismul rănilor sau alte condiţii în care cauza nu a fost identificată. Majoritate
cazurilor de botulism al rănilor a fost înregistrat la persoane care se droghează pe cale intra-venoasă
(100% în 2005). În anul 2005 s-au înregistrat 2 decese la cazurile de botulism - toxiinfecţie alimentară.

50. 7. Profilaxie
Este nespecifică şi constă în prelucrarea termică adecvată a alimentelor conservate (preferabil produse
industrial), prevenirea contaminării rănilor, prevenirea consumului de droguri pe cale i.v. etc.

51. Clostridiile gangrenei gazoase

51. 1. Definiţie. Încadrare
Germenii fac parte din genul Clostridium, sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, mobili sau imobili (C.
perfringens), anaerobi, care formează spori. Principalele specii clostridiene implicate în apariţia gangrenei
gazoase sunt reprezentate de C. perfringens, C. novyi  (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum şi C.
sporogenes.

Prima dintre aceste specii a fost identificată de către Louis Pasteur, în 1877, sub numele Vibrion
septique (numele actual Clostridium septicum). În 1892 a fost identificat Bacillus aerogenes capsulatum, cu
numele actual Cl. perfringens, ulterior identificându-se şi alte specii (C. novyi - 1894, C. histolyticum -
1916); în anul 1935 a fost sesizată prezenţa în flora microbiană normală de la nivelul intestinului gros a
speciei Clostridium difficile.

Despre gangrena gazoasă, numită şi mionecroza clostridiană, a început să se discute în special din timpul
primului război mondial. Au fost descrise cazuri de mionecroză clostridiană, chiar şi în urma unor operaţii
chirurgicale „curate”, sau la pacienţi la care s-a injectat adrenalină sau insulină.

51. 2. Caractere generale

51. 2. 1. Habitat
Clostridiile sunt ubicuitare în natură; sunt prezente în mod normal în tractul digestiv al omului sau al
animalelor (ca forme vegetative), fiind apoi eliminate pe sol (prin dejecte), unde în condiţii nefavorabile,
sporulează. Sporii sunt foarte rezistenţi. Sursa principală pentru contaminare este reprezentată de sol
(germeni telurici).

51. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, de dimensiuni mari 1µm / 6-10µm. C. perfringens este încapsulat şi
imobil; celelalte specii menţionate includ bacili care în forma vegetativă sunt mobili, cu cili peritrichi. În
condiţii de anaerobioză formează spori mai mari decât diametrul bacililor, localizaţi central sau terminal.

51. 2. 3. Caractere de cultură

Se pot multiplica pe medii simple, în condiţii de anaerobioză. C. perfringens creşte mai repede (în
câteva ore) la 45C, formând colonii de tip S sau R. Pe geloză sânge produce hemoliză de tip cald-rece
(prima zonă de hemoliză apare la termostat şi este înconjurată de o a doua zonă de hemoliză mai largă,
după menţinere în gheaţă).

Celelalte clostridii formează colonii mai întinse, cu aspect de „grenadă explodată” (datorită mobilităţii).

51. 2. 4. Caractere biochimice

Toţi aceşti germeni elaborează enzime cu caracter de toxine care prezintă histotropism şi pot
distruge orice tip de ţesut, cu producere de gaz. Exemple de astfel de toxine sunt: lecitinaza, care
acţionează asupra lecitinei din ţesutul nervos, diferite proteaze, hialuronidaze, colagenaze, sialidaza etc.
Singura structură care are numai un caracter enzimatic este -toxina (lecitinaza C).

Pe geloză glucozată cu gălbenuş de ou, tulpinile producătoare de -toxină descompun lecitina şi conduc
la opacifierea mediului.

Cl. sporogenes şi Cl. perfringens elaborează bacteriocine cu efect asupra Cl. botulinum.

51. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Formele vegetative sunt distruse de menţinerea timp de 15-20 de minute la 55-60C şi de acţiunea
dezinfectantelor uzuale. Sporii rezistă la temperatura de 100C, fiind distruşi prin autoclavare la 120C şi 1
atm. timp de 30 de minute, precum şi la pupinel, timp de 1 oră la 180°C. În mediu, pe sol, sporii rezistă
timp îndelungat.

51. 2. 6. Structură antigenică

Bacilii genului Clostridium au antigene parietale (somatice), antigene capsulare de tip K (la C. perfringens),
antigene flagelare de tip H (la C. novyi, C. septicum, C. histolyticum şi C. sporogenes) şi antigene solubile,
reprezentate de exotoxine.

Spre exemplu, C. perfringens poate elabora mai multe tipuri de toxine. Dacă în trecut erau cunoscute
toxinele notate A-D, ulterior A-F, în momentul de faţă se conosc patru toxine majore (numite α, β, ε şi θ),
nouă toxine minore şi enterotoxinele implicate în toxi-infecţii alimentare.
51. 2. 7. Răspuns imun
Apare un răspuns imun umoral cu sinteză de anticorpi anti-toxici, care nu au utilitate în cursul bolii.
Sinteza de anticorpi după administrarea de anatoxine ar putea fi însă utilă.

51. 2. 8. Caractere de patogenitate

Clostridiile gangrenei gazoase sunt patogene prin multiplicare, invazivitate şi toxinogeneză. Germenii se
multiplică la poarta de intrare. Au proprietăţi invazive, înaintând din aproape în aproape, prin distrugerea
ţesuturilor (efecte necrolitice, hemolitice şi letale). Enzimele (toxinele; vezi 51.2.6) produse contribuie la
invazivitate şi alterarea gravă a stării generale.

51. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Infecţia cu aceşti germeni determină gangrena gazoasă, caracterizată prin edeme dure, crepitante (cu
apariţia de gaz, în urma fermentării zaharurilor), necroză şi gangrenă (necroză). Sporii clostridieni ajung la
nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). În condiţii de anaerobioză sporii germinează, formele
vegetative se multiplică, în cursul metabolismului fermentează zaharuri şi apare gaz. Distensia tisulară,
obstruarea mecanică a structurilor vasculare (scade aportul sanguin) în conjuncţie cu sinteza de toxine cu
efect necrotizant şi sinteza de hialuronidază, favorizează diseminarea infecţiei. Necroza tisulară se extinde,
multiplicarea bacteriană se amplifică, apare anemie hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20-80% din cazuri)
către deces. De regulă gangrena gazoasă apare printr-o infecţie concomitentă cu 2 sau mai multe dintre
speciile clostridiene menţionate.

51. 4. Diagnostic
Se face pe baza aspectelor clinice şi a istoricului bolii. Diagnosticul poate fi bacteriologic, cu recoltarea şi
transportul produsului patologic (ţesuturi devitalizate, puroi), care trebuie examinat microscopic, cultivat şi
coloniile izolate în condiţii de strictă anaerobioză trebuie identificate.

În continuare, vom prezenta câteva elemente privind diagnosticul de laborator în infecţiile clostridiene.
Înainte de a încerca această particularizare, dorim să menţionăm faptul că există şi alte microorganisme
anaerobe de interes medical (bacili Gram-pozitivi nesporulaţi, bacili Gram-negativi, coci Gram-pozitivi şi
Gram-negativi precum şi spirochete anaerobe).

Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de germenii anaerobi este laborios, costisitor şi de

regulă poate fi definitivat numai în laboratoare specializate. Sunt necesare dotări speciale şi un personal
medical cu experienţă.

Privind diagnosticul bacteriologic în infecţiile produse de microorganismele din genul Clostridium, facem

următoarele precizări.

1. Etapa de recoltare şi transport a p.p. este esenţială; trebuie menţinute condiţiile

de anaerobioză (vezi şi anexa nr. 2 şi anexa nr. 6).
2. Din punct de vedere macroscopic am putea menţiona mirosul putrid al p.p., prezenţa unor fragmente
de ţesut necrotic, a unor secreţii de culoare închisă, existenţa de sânge şi puroi în plagă etc.

Examenul microscopic are rol orientativ. Pentru majoritatea laboratoarelor este unica activitate care poate

fi realizată atunci când agentul etiologic este un microorganism anaerob. În rezumat, examenul
microscopic direct trebuie să fie realizat, iar observaţiile se vor interpreta în context.

C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 mm / 2-18 m şi poate prezenta un spor rotund localizat terminal,

C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 m / 3-20 m şi poate prezenta un spor oval localizat central sau
subterminal iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 1,5-19 m şi poate prezenta un spor oval
localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite în acelaşi timp un control al calităţii p.p.
(evidenţiind prezenţa celulelor inflamatorii şi a celulelor lezate) şi ar putea servi la alegerea terapiei
antimicrobiene (de ex. „disocierea” între ceea ce vedem la examenul microscopic şi lipsa apariţiei culturii,
ne poate face să ne gândim la o infecţie cu germeni anaerobi şi să alegem pentru tratamentul „de primă
intenţie” medicamente cu eficacitate asupra acestor microorganisme).

3. Pentru cultivarea p.p. vom pregăti cel puţin 3 medii de cultură: bulion VF (viande-foi) cu acid tioglicolic
şi albastru de metilen (care testează digestia cărnii de către clostridii), mediul geloză-sânge suplimentat cu
neomicină 100 g / ml incubat în anaerobioză şi mediul geloză-sânge incubat în condiţii aerobe. Pentru
p.p. provenite din abcese sau din plăgi care sugerează gangrena gazoasă am putea folosi şi mediul Nagler
(cu gălbenuş de ou) care permite evaluarea producerii de lecitinază şi lipază.

Pentru a distruge formele vegetative şi a reţine sporii putem proceda aşa cum am arătat în capitolul 10
(tehnici de izolare speciale).

Incubarea în condiţii de anaerobioză durează 24-48 de ore la 35-37ºC.

Înainte de a trece la etapa de identificare trebuie să încercăm să dovedim că am izolat germeni anaerobi şi
să verificăm puritatea culturii care urmează a fi identificată. În condiţiile în care p.p. a fost însămânţat pe 2
plăci cu geloză-sânge incubate aerob şi anaerob, este util să realizăm examenul microscopic al coloniilor.
Dacă apar colonii asemănătoare în ambele plăci iar din punct de vedere microscopic prezintă caractere
similare, este vorba de microorganisme facultativ anaerobe. Dacă pe frotiurile din coloniile izolate pe
mediul incubat în anaerobioză apar şi alte tipuri morfologice, înseamnă că există microorganisme strict
anaerobe. Pentru a verifica puritatea culturii obţinute, înainte de a trece la etapa de identificare, repicăm
coloniile suspecte în bulion VF regenerat (prelevăm colonia prin decupare cu geloza subiacentă). Incubăm
timp de 24 ore la 35-37ºC. În cazul în care există multiplicare bacteriană procedăm la a. realizarea unui
frotiu colorat Gram (şi comparăm rezultatele cu cele obţinute anterior); b. repicarea pe o pantă de geloză
nutritivă cu incubare în aerobioză (nu trebuie să apară cultură bacteriană în cazul în care bacteriile izolate
anterior sunt anaerobe). Dacă rezultatele sunt corecte, trecem la identificarea microorganismelor.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere, aşa cum
am discutat şi în capitolele precedente.

        
Caractere morfotinctoriale:
 sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiunile menţionate mai sus;
în culturi învechite bacteriile pot fi Gram-negative şi se pot detecta endosporii (care
deformează bacilii);
în cazul în care la examenul microscopic nu evidenţiem spori vom repica cultura pe mediul
Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36ºC şi apoi la temperatura camerei;
urmărim sporularea pe un nou frotiu colorat Gram; putem evalua fenomenul de sporogeneză
şi prin metode de cultură (vezi mai jos);

        
Caractere de cultură:
speciile mobile (marea majoritate) formează la suprafaţa mediului colonii de tip S, cu margini
ondulate, neregulate, cu tendinţă de invadare a mediului (datorită mobilităţii);
în jurul coloniilor remarcăm prezenţa β-hemolizei;
dacă a avut loc inocularea şi în profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos;
Clostridium perfringens (specia imobilă) formează colonii de dimensiuni mari, de tip S,
rotunde, cu margini regulate, convexe dar care pot avea şi aspect rugos;
majoritatea tulpinilor produc hemoliză dublă (zona internă, de β-hemoliză, este mai îngustă în
timp ce zona externă, de -hemoliză este mai largă); există şi tulpini care produc zone foarte
largi de hemoliză precum şi tulpini slab hemolitice;
 prin cultivare putem să evaluăm şi fenomenul de sporogeneză (cunoscut fiind că sporii rezistă
timp de 10 minute la temperatura de 80ºC);

        
dacă pe frotiul din cultură colorat Gram nu evidenţiem spori, pregătim 2 tuburi cu bulion peptonă,
glucoză, amidon şi extract de levură;

        
repicăm coloniile suspecte în cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi în supunem unei temperaturi de 80ºC, 10
minute;

        
incubăm cele 2 tuburi la 35-37ºC până apare multiplicarea bacteriană;

        
dacă bacteriile se dezvoltă în ambele tuburi, am dovedit existenţa sporilor;

        
dacă după o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacteriană în tubul supus la temperatură
crescută, nu există spori;

        
Caractere biochimice:

-         
există foarte numeroase caractere biochimice care pot fi utile în diferenţierea speciilor de clostridii
(testarea este „rezervată” centrelor specializate);

-         
în identificarea microorganismelor din acest gen utilizăm iniţial testarea producerii de lecitinază şi lipază;

        
pe mediul Nagler inoculăm „în striu” tulpina (se pot testa concomitent mai multe tulpini);

        
pentru aprecierea producerii de lecitinază incubarea durează 48 de ore;

        
în cazul în care testul este pozitiv (precipitat opac în mediul din jurul striului de cultură) poate fi vorba de
o tulpină de C. perfringens; testul este negativ pentru C. tetani sau pentru C. botulinum;

        
pentru tulpinile lecitinază-pozitive, se mai pot testa mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de
lipază, urează, hidroliza gelatinei, digestia cărnii etc.;

        
pentru aprecierea producerii de lipază incubarea durează 1 săptămână;

        
în cazul în care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultură şi în mediul adiacent)
poate fi vorba de o tulpină de C. botulinum; testul este negativ pentru C. tetani şi C. perfringens;
-         
testul plăcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referinţă;

        
folosim o placă cu mediul Nagler;

        
pe jumătate din placă etalăm anti-toxină (lecitinază);

        
după uscarea plăcii inoculăm „în striuri” o tulpină martor pozitiv, o tulpină martor negativ şi câteva tulpini
de testat;

        
incubăm timp de 18-24 de ore la 35-37ºC în anaerobioză;

        
C. perfringens (ca şi tulpina M+) dă un rezultat pozitiv doar pe jumătatea de placă fără anti-toxină;
-         
testul inhibiţiei sialidazei se poate realiza în 2-6 ore; este pozitiv pentru C. perfringens şi negativ pentru C.
septicum;
-         
Creşterea în lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar în laptele
turnesolat);
-         
Clostridiile sunt sensibile la vancomicină şi rezistente la colistin; alţi autori propun testarea sensibilităţii la
metronidazol;

        
Caractere antigenice: pot fi evaluate în centrele de referinţă;

        
Alte teste care pot fi efectuate la nivelul centrelor de referinţă
-         
demonstrarea prezenţei tetanospasminei prin seroneutralizare la şoareci (un animal este protejat cu 1-
2 ore înainte de test prin injectare subcutanată a 1.000 de UAI de anti-toxină tetanică; injectăm la ambele
animale 0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat supravieţuieşte, iar celălalt va prezenta
semne tipice de tetanos);
-         
testarea (la om) a prezenţei anti-toxinei tetanice în titruri protective prin ELISA sau hemaglutinare (T  0,01
UAI / ml);
-         
demonstrarea prezenţei toxinei botulinice în alimente, materii fecale, ser sau în medii de cultură;

        
spre ex. prelevăm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacteriană, centrifugăm iar
supernatantul îl împărţim în 2 tuburi;

        
unul dintre tuburi îl supunem temperaturii de 100ºC (toxina botulinică este termosensibilă);

        
inoculăm intraperitoneal p.p. la două loturi de şoareci;

        
dacă şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinică;

        
urmărim şoarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariţia semnelor de botulism (reducerea mobilităţii,
respiraţii ample, contracţii ale muşchilor abdominali urmate de convulsii şi deces);

        
prezenţa toxinei botulinice poate fi confirmată prin seroneutralizare (protejăm spre ex. un animal de
laborator cu anti-toxină de tip A şi un alt animal de laborator cu anti-toxină de tip B după care îi injectăm
cu p.p. respectiv; dacă animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieţuieşte iar celălalt animal
moare cu semne caracteristice pentru botulism, în mediul de cultură a existat C. botulinum de tip A);
-         
Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. în vena cozii şi curbe standard
pentru interpretare, pentru fiecare serotip);
-         
Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnică de tip ELISA (poate detecta până la 10 picograme);
-         
Utilizarea tehnologiei de amplificare genică (PCR) pentru structurile care codifică sinteza diferitelor toxine
etc.
5. Antibiograma nu se realizează, de regulă. Clostridiile sunt sensibile la penicilină, cefalosporine,
vancomicină, tetracicline, metronidazol etc, însă tratamentul este mult mai complex; în unele dintre bolile
clostridiene eficacitatea tratamentului cu antibiotice sau chimioterapice nu a fost dovedită.

51. 5. Tratament
Tratamentul trebuie instituit de urgenţă şi include în primul rând toaleta chirurgicală a plăgii (debridări
extinse, eliminarea ţesuturilor devitalizate), administrarea de penicilină, administrare de oxigen hiperbar
precum şi administrarea de ser antigangrenos.

51. 6. Epidemiologie
Sursa de infecţie este reprezentată de om şi animale, care elimină germenii pe sol prin dejecte.

Transmiterea se face prin pământ contaminat cu spori; poarta de intrare în organism este de regulă o
plagă cutanată.

51. 7. Profilaxie
Se realizează prin tratamentul corespunzător al plăgilor, în special al celor anfractuoase, contaminate cu
pământ, praf etc. Utilizarea imunoglobulinelor antitoxice poate fi utilă. Vaccinurile (anatoxine) sunt
utilizabile, dar nu au intrat în practica curentă.

52. Genul Mycobacterium. Mycobacterium tuberculosis

52. 1. Definiţie. Încadrare
Identificarea şi tratarea infecţiilor datorate mycobacteriilor a început să fie realizată după descoperirea
bacilului tuberculozei (numit iniţial „Bacterium tuberculosis”) şi a bacilului leprei (Bacillus leprae). Primele
încercări de clasificare s-au realizat în anul 1896, când s-a propus ca genul Mycobacterium să includă M.
tuberculosis şi M. leprae.

Cu ajutorul unei clasificări bazate pe caractere morfologice (bacili, imobili) şi tinctoriale (bacili acid-alcoolo
rezistenţi, BAAR), cele două specii se diferenţiau cu oarecare dificultate de speciile aparţinând altor genuri
precum: Nocardia, Rhodococcus sau Corynebacterium.  Din acest motiv putem afirma că elementele
minimale necesare stabilirii apartenenţei la genul Mycobacterium ar putea fi reprezentate de: 1. rezistenţa
la decolorarea cu acid-alcool; 2. prezenţa unor acizi mycolici care conţin 60-90 atomi de carbon şi care pot
fi clivaţi prin piroliză în acizi graşi cu 22 şi respectiv 26 atomi de carbon; 3. un conţinut procentual de G+C
de 61-71%.

În afară de M. tuberculosis şi M. leprae, au fost descoperite o serie de alte mycobacterii considerate
anterior saprofite dar care fiind condiţionat patogene, sunt relativ frecvent implicate în patologia
gazdelor imunocompromise. Aceste mycobacterii au fost denumite în mod diferit, fie folosind termenul
de mycobacterii ne-tuberculoase (non-tuberculous mycobacteria, NTM), fie alte denumiri sinonime
(mycobacterii „atipice”, mycobacterii altele decât M. tuberculosis, MOTT etc).

Există diferite sisteme de clasificare care ar putea fi utilizate pentru gruparea speciilor mycobacteriene. În
mod clasic toate speciile de NTM sunt incluse în patru grupe, pe baza ratei de multiplicare şi a
pigmentogenezei. În acest sistem, elaborat de Ernst Runyon, pigmentogeneza este evaluată atât după, cât
şi fără expunere la lumină. Mycobacteriile cu ritm lent de multiplicare fotocromogene, ale căror colonii se
pigmentează numai după expunere la lumină (ex. M. kansasii, M. marinum) fac parte din grupul I.
Mycobacteriile cu ritm lent de multiplicare scotocromogene, ale căror colonii se pigmentează la întuneric
(ex. M. scrofulaceum, M. gordonae, M. szulgai) fac parte din grupul al II-lea. Mycobacteriile cu ritm lent de
multiplicare nefotocromogene (ex. complexul M. avium) fac parte din grupul al III-lea. Din grupul al IV-lea
fac parte mycobacteriile cu ritm de multiplicare rapid (ex. M. fortuitum, M. chelonae).

În momentul de faţă în genul mycobacterium sunt clasificate peste de specii diferite, multe dintre acestea
fiind larg răspândite în natură.

52. 2. Caractere generale

52. 2. 1. Habitat
Mycobacteriile ne-tuberculoase se întâlnesc ubicvitar. M. tuberculosis (hominis, bovis, africanum) se
găseşte în organismele infectate, de regulă la nivel pulmonar şi în cazul infecţiei-boală poate fi eliminat în
mediul extern prin tuse (în spută sau în nuclei de picătură) sau prin lapte (dacă este cazul unui animal
bolnav, infectat cu M. bovis).

52. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

În ţesuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoşi apar ca bastonaşe subţiri, rectilinii, cu dimensiunea de
0,4 / 3 µm, acid-alcoolo rezistenţi (apar roşii pe fond albastru la coloraţia Ziehl-Neelsen), imobili,
necapsulaţi, nesporulaţi.

Examenul microscopic rămâne o etapă esenţială în diagnosticul unei infecţii mycobacteriene atât în
momentul examinării unui produs patologic (examenul microscopic direct) cât şi în momentul când prin
microscopie se confirmă (sau infirmă) morfologia şi tinctorialitatea microorganismelor dintr-o colonie
izolată, respectiv acid-alcoolo rezistentă şi apartenenţa la genul Mycobacterium. În tabelul următor este
ilustrată modalitatea de interpretare a rezultatelor examenului microscopic.

Tabelul nr. 5 Rezultatele examenului microscopic (coloraţie fluorescentă şi Ziehl-Neelsen)

 Fluorescenţă (200 -
250 ) Notare semicantitativă Ziehl-Neelsen (900-
1000 )

0 BAAR negativ 0

1-2/30câmpuri ± 1-2/300câmpuri

1-9/10câmpuri 1+ (+) 1-9/100câmpuri

1-9/1câmp 2+ (++) 1-9/10câmpuri

10-90/1câmp 3+ (+++) 1-9/1câmp

>90/1câmp 4+ (++++) >9/1câmp

 

Fiecare treaptă a gradaţiei cantitative se referă la aceeaşi suprafaţă de frotiu examinată (câmpul vizual
examinat prin metoda fluorescentă este de circa 10× mai mare decât în cazul coloraţiei Ziehl-Neelsen).
Notaţia semicantitativă este obligatorie deoarece exprimă unitar densitatea BAAR pe frotiu indiferent de
metoda folosită, permiţând comparaţii între laboratoare diferite, între bolnavi diferiţi şi pentru acelaşi
bolnav în momente evolutive diferite. Dacă rezultatul final este „nedeterminat“ trebuie să facem încă un
frotiu din acelaşi produs patologic şi să indicăm recoltarea unui nou produs patologic.

52. 2. 3. Caractere de cultură

În momentul actual, la nivel mondial există o mare varietate de medii de cultură, unele dintre acestea fiind
produse în mod special pentru mycobacteriologie, mycobacteriile dezvoltându-se în general pe medii
complexe. Singura specie cu semnificaţie clinică necultivabilă este M. leprae. Principial, mediile de cultură
utilizate în diagnosticarea unei infecţii mycobacteriene se împart în 3 grupe principale: medii de cultură
lichide (bulion 7H9 etc), medii de cultură pe bază de ou (ex. mediul Löwenstein) şi medii de cultură bazate
pe compoziţia în agar. Pentru izolarea primară a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din
fiecare grup menţionat. Mediile pe bază de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă, făină de
cartof, săruri, asparagină şi glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substanţe reprezintă
elementele de bază ale mediului clasic Löwenstein-Jensen. Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum şi a
tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizată de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a
mediului Löwenstein-Jensen.

Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară, este necesar ca mediile de cultură să se incubeze într-o
atmosferă de 8-10% CO2. Culturile se incubează de rutină la o temperatură de 35-.

Mediile de cultură solide se vor examina zilnic în prima săptămână după inoculare iar apoi săptămânal
până la împlinirea a 6-8-12 săptămâni, deoarece mycobacteriile tuberculoase au o rată de diviziune de
minim 12 ore (30 minute la E. coli).

M. tuberculosis şi respectiv M.. bovis-BCG formează colonii R, rugoase, neregulate, conopidiforme,

grunjoase, greu de emulsionat. Tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S. M.
bovis formează colonii de tip S, rotunde, netede, umede, uşor emulsionabile.

52. 2. 4. Caractere biochimice

În cazul că mycobacteria izolată este non-cromogenă (nu produce pigmenţi) se vor examina caracterele
de cultură (colonii de tip R-rugoase pentru M. tuberculosis sau M. bovis, sau S-netede pentru M. bovis) şi se
va trece la identificarea speciei pe baza a câteva teste fenotipice clasice şi anume: testul producerii de
niacină, testul reducerii nitraţilor, testul catalazei la şi la , hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida
acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) şi susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS).

Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (în timp ce pentru M. bovis numai al 3-lea test
este pozitiv). Testul catalazei la şi respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii
(hidroliza Tween 80 poate fi pozitivă pentru M. tuberculosis). M. tuberculosis se dezvoltă pe mediul cu TCH
în timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de către această substanţă). Testul este util în special în
cazul tulpinilor de M. bovis care prezintă reacţii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste.

52. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Mycobacteriile, datorită structurii particulare a peretelui celular au o rezistenţă mai mare atât în mediul
extern cât şi faţă de diferite substanţe chimice. Diferiţi coloranţi, precum verde malachit, care au efecte
bacteriostatice faţă de alte bacterii, pot fi incorporati în mediul de cultură fără a inhiba multiplicarea
bacililor tuberculoşi. Acizii şi bazele pot fi utilizate în procesul de decontaminare al produselor patologice
(ex. al sputei) distrugând microorganismele din flora asociată, dar permiţând supravieţuirea M.
tuberculosis.

Bacilii tuberculoşi sunt rezistenţi la uscăciune şi rezistă mult timp în sputa uscată, la întuneric. Sunt
sensibili la acţiunea radiaţiilor UV.

52. 2. 6. Structură antigenică

Constituenţii peretelui celular sunt recunoscuţi pentru capacitatea de a induce apariţia unui răspuns imun
de tip celular şi respectiv a unei hipersensibilităţi de tip IV. Se acceptă faptul că aceşti constituenţi sunt
implicaţi în inducerea unui grad de rezistenţă faţă de o nouă infecţie (premuniţie).
Mycobacteriile prezintă la nivelul peretelui celular o cantitate importantă de lipide, inclusiv acizii mycolici
(cu lanţ lung de atomi de carbon, C78-C90), ceruri (ex. ceara D) şi fosfatide. Ceara D pare a fi implicată în
inducerea stării de hipersensibilitate. Lipidele sunt cuplate cu proteine şi polizaharide.

Numeroase polizaharide au fost identificate în structura mycobacteriilor. O parte dintre acestea reprezintă
antigene utilizate în identificarea prin metode imunologice a prezenţei anticorpilor anti-mycobacterieni.

În vederea evaluării stării de reactivitate faţă de infecţia tuberculoasă se poate utiliza intradermoreacţia la
tuberculină (PPD, derivat proteic purificat) substanţă proteică, mai precis filtratul unei culturi de M.
tuberculosis, filtrat care s-a dovedit că are în compoziţie mai multe proteine elaborate în cursul
metabolismului bacilului tuberculos. Faţă de proteinele mycobacteriene apar anticorpi care pot fi
individualizaţi prin metode de laborator.

52. 2. 7. Răspuns imun

Apare atât un răspuns imun de tip umoral (anticorpii anti-mycobacterieni pot fi evidenţiaţi prin diferite
tehnici, de ex. ELISA, însă metodologia nu este încă standardizată) cât şi un răspuns imun de tip celular.
Mecanismele imunităţii celulare sunt implicate atât în protecţia faţă de îmbolnăvire cât şi în unele
evenimente patologice care apar în cursul tuberculozei.

52. 2. 8. Caractere de patogenitate

Se estimează că la nivel mondial, numărul persoanelor infectate cu M. tuberculosis este de aproximativ 1,7
miliarde şi cu toate că aproximativ 1/3 din populaţia globului este infectată, doar circa 10 milioane de
persoane fac anual o formă de tuberculoză clinic manifestă. Cu alte cuvinte s-ar putea considera că M.
tuberculosis nu este un microorganism strict patogen ci condiţionat patogen. În plus, trebuie să reţinem că
atunci când este vorba de o persoană imunocompromisă, nu putem folosi termenul de mycobacterii
nepatogene.

M. tuberculosis  are capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica în macrofagele alveolare care nu sunt

activate. Interacţiunea iniţială între M. tuberculosis şi macrofage, determină atât un răspuns din partea LT
helper cât şi din partea LT citotoxice. Un subset al LT helper (Th2) stimulează sinteza de anticorpi, dar
aceşti anticorpi nu au nici un rol (dovedit) în ceea ce priveşte protecţia. Subsetul de LT helper Th1
sintetizează interferon γ (IFN-γ) cu rol în stimularea activităţii macrofagelor şi celulelor endoteliale.

Este probabil că la supravieţuirea intra-macrofagică să contribuie producerea unor substanţe numite

generic, invazine. Bacteriile sunt fagocitate, sunt incluse în fagolizozomi, dar o parte dintre ele rezistă şi
distrugând fagolizozomul revin în citoplasma macrofagului. M. tuberculosis  are capacitatea de a împiedica
acidifierea la nivel de fagolizozom, probabil prin inducerea sintezei de amoniac

Lipoarabinomananul (un glicolipid) din peretele mycobacterian inhibă activarea LT, acelaşi efect avându-l
şi antigenul 85 (proteic) care are capacitatea de a lega fibronectina.

Factorul cord (acid mycolic parietal, 6-6 dimicolat de trehaloză) pare a fi implicat în producerea
leziunilor tisulare şi în inhibarea migrării leucocitare.

Fosfolipidele sunt implicate în inducerea necrozei de cazeificare.

S-a identificat la şoareci o genă implicată în susceptibilitatea la infecţia cu tulpina vaccinală. O genă
similară se află la om la nivelul cromozomului 2q; se presupune că prin clonarea acestei gene s-ar putea
identifica grupele populaţionale susceptibile la tuberculoza-boală.

Totuşi trebuie menţionat că în ciuda a numeroase studii realizate în peste 100 de ani, nu s-a stabilit de
fapt care este structura implicată cu certitudine în patogenitatea mycobacteriană şi nici care este
mecanismul exact care face ca rezultatul interacţiunii microorganism-gazdă să fie atât de diferit de la un
caz la altul.

52. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Nucleii de picătură care au diametrul de 1-3 μm au capacitatea de a ajunge după inhalare până la nivel
alveolar. Intraalveolar chiar dacă sunt fagocitate, o parte dintre mycobacterii rămân viabile şi chiar se pot
multiplica în interiorul celulelor. Pe cale limfatică se poate realiza diseminarea la nivelul
majorităţii organelor (foarte rar însă apare o multiplicare necontrolată mycobacteriană la nivelul ficatului,
splinei sau măduvei hematogene). Microorganismele care colonizează lobii superiori pulmonari, rinichiul,
ţesutul osos, etc. se pot multiplica considerabil înaintea dezvoltării imunităţii specifice.

Imunitatea specifică este de obicei capabilă să limiteze multiplicarea bacililor; gazda rămâne
asimptomatică şi leziunile se vindecă. În general, la numai aproximativ 5% dintre persoanele infectate
controlul multiplicării microorganismelor este inadecvat şi tuberculoza-boală poate apare în primul an
după infecţie. În alte 5% dintre cazuri diminuarea imunităţii organismului la un moment mai îndepărtat de
momentul infecţiei face ca boala să apară. Astfel aproximativ 10% din persoanele infectate cu M.
tuberculosis vor dezvolta o formă de tuberculoză clinic manifestă în cursul vieţii.

Capacitatea de apărare a organismului poate fi diminuată în cursul unor boli precum silicoza, diabetul
zaharat sau boli asociate cu imunodepresie (ex. infecţia cu HIV / SIDA), sau datorită corticoterapiei sau
medicaţiei imunosupresoare. În aceste circumstanţe probabilitatea dezvoltării tuberculozei este mult mai
mare. Susceptibilitatea la tuberculoză poate fi de asemenea mare în primii doi ani de viaţă, la pubertate şi
în adolescenţă.

Tuberculoza poate avea localizări extrem de variate, dar cea mai frecvent întâlnită este tuberculoza
pulmonară. Pe de altă parte din punct de vedere epidemiologic, pacienţii cu tuberculoză pulmonară a
căror spută este pozitivă microscopic, reprezintă sursa de infecţie cea mai importantă. Tratamentul corect
şi complet al acestor pacienţi este esenţial.

52. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

M. tuberculosis
Tuberculoza poate avea localizări variate, dar cea mai frecvent întâlnită este tuberculoza pulmonară. Din
punct de vedere epidemiologic, pacienţii cu tuberculoză pulmonară (care elimină prin spută BAAR)
reprezintă sursa de infecţie cea mai importantă. Diagnosticul, tratamentul corect şi complet al
acestor pacienţi este esenţial.
Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice, paraclinice (ex. radiologice), alte elemente
de laborator, dar trebuie confirmat bacteriologic, prin izolarea şi identificarea M. tuberculosis.

52. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic este în mod esenţial bacteriologic, direct; se pot adăuga

datele obţinute în cadrul diagnosticului imunobiologic şi serologic. Diagnosticul de laborator bacteriologic
include etapele cunoscute.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie inclusiv protecţia
personalului medical implicat etc). În funcţie de forma clinică de tuberculoză se pot recolta următoarele
produse patologice: spută, lichid de spălătură bronşică, LCR, urină, lichide recoltate prin puncţie articulară,
peritoneală, pleurală, pericardică, probe obţinute prin biopsie, puroi etc. Uneori este necesară
concentrarea p.p. prin centrifugare. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat
de spută (vezi şi anexa nr. 6). Sputa trebuie decontaminată (de ex. prin tratare cu NaOH 4%) şi
neutralizată (ex. cu acid) în vederea baciloscopiei şi cultivării.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim trei frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu AM, Gram şi respectiv Ziehl-Neelsen.
Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivelul
tractului respirator (ex. macrofage alveolare), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi
prezenţa BAAR. În ţesuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoşi apar ca bastonaşe subţiri, rectilinii, cu
dimensiunea de 0,4 / 3 µm, acid-alcool rezistenţi (apar roşii pe fond albastru, toate celulele şi bacteriile
non-AAR sunt colorate în albastru, la coloraţia Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulaţi, nesporulaţi. Se poate
utiliza şi coloraţia fluorescentă. Examenul microscopic rămâne o etapă esenţială în diagnosticul unei
infecţii mycobacteriene atât în momentul examinării unui produs patologic (examenul microscopic direct)
cât şi în momentul când prin microscopie se confirmă (sau infirmă) morfologia şi tinctorialitatea
microorganismelor dintr-o colonie izolată.

Rezultatele examenului microscopic (coloraţie fluorescentă şi Ziehl-Neelsen) trebuie cuantificate prin

numărul de BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate (10-30 în cazul coloraţiei fluorescente, 100-
300 în cazul coloraţiei Z-N). Spre exemplu, prezenţa a 1-9 bacili / 10 câmpuri în microscopia cu
fluorescenţă şi respectiv a 1-9 BAAR / 100 de câmpuri în microscopia optică permite notificarea în
buletinul de analiză a unui rezultat cu 1+ în timp ce prezenţa a 10-90 bacili / 1 câmp în microscopia cu
fluorescenţă şi respectiv a 1-9 BAAR / 1 câmp în microscopia optică permite notificarea în buletinul de
analiză a unui rezultat cu 3+ (maxim fiind 4+, atunci când se identifică spre ex. peste 9 BAAR / 1 câmp la
coloraţia Z-N) (vezi şi tabelul nr. 5). Notaţia semicantitativă este obligatorie deoarece exprimă unitar
densitatea BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosită, permiţând comparaţii între laboratoare diferite,
între bolnavi diferiţi şi pentru acelaşi bolnav în momente evolutive diferite. Dacă rezultatul final este
„nedeterminat“ trebuie să facem încă un frotiu din acelaşi produs patologic şi să indicăm recoltarea unui
nou produs patologic. Baciloscopia negativă nu exclude diagnosticul de tuberculoză.

Din momentul obţinerii unui rezultat pozitiv la examenul microscopic direct se poate elabora strategia de
diagnostic pentru stabilirea cu exactitate a speciei implicate, urmat de precizarea sensibilităţii la
antibiotice. În momentul de faţă avem la dispoziţie 2 tipuri de abordare (eventual utilizate concomitent, în
măsura în care există dotarea tehnică necesară) şi anume folosirea unor metode de diagnostic
convenţionale şi respectiv folosirea unor metode de diagnostic moderne, mai rapide. Metodele rapide pot
fi utile atât după izolarea M. tuberculosis (sau a unei alte mycobacterii) în culturi, cât şi direct, pornind de la
produsul patologic.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine o
cultură pură, care se va identifica. În momentul actual, la nivel mondial, există o mare varietate de medii
de cultură. Mycobacteriile se dezvoltă în general pe medii complexe. Mediile de cultură utilizate în
diagnosticarea unei infecţii mycobacteriene se împart în 3 grupe principale: medii de cultură lichide (ex.
bulion 7H9), medii de cultură pe bază de ou (ex. mediul Löwenstein) şi medii de cultură bazate pe
compoziţia în agar (tip Middlebrook). Pentru izolarea primară a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte
variate, din fiecare grup menţionat. Mediile pe bază de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă,
făină de cartof, săruri, asparagină şi glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substanţe
reprezintă elementele de bază ale mediului clasic Löwenstein-Jensen la care se adaugă verde malachit
pentru selectivitate (în acelaşi scop se pot adăuga antibiotice). Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum
şi a tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizată de suplimentarea cu 0,4% piruvat de
sodiu a mediului Löwenstein-Jensen.

Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară, este necesar ca mediile de cultură să se incubeze într-o
atmosferă de 8-10% CO2. Culturile se incubează de rutină la o temperatură de 35-. Mediile de cultură
solide se vor examina zilnic în prima săptămână după inoculare iar apoi săptămânal până la împlinirea a 6-
8-12 săptămâni deoarece mycobacteriile tuberculoase au o rată de diviziune de 12-27 ore.

Se pot utiliza şi sisteme de cultivare „rapidă” (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creşterii mycobacteriene
în 4-25 de zile. În România aceste sisteme au început să fie utilizate în unele centre începând cu anul 1998.
Aceste sisteme permit testarea sensibilităţii la medicamentele anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate,
conform recomandărilor programului naţional.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

        
Caractere morfotinctoriale: în frotiul realizat din colonia izolată se evidenţiază BAAR;

        
Caractere de cultură:
M. tuberculosis şi respectiv M. bovis-BCG formează colonii R, rugoase, neregulate,
conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat, nepigmentate;
tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S;

        
Caractere biochimice:
identificarea speciei se realizează pe baza a câteva teste fenotipice clasice [testul producerii de
niacină, testul reducerii nitraţilor, testul catalazei la şi la , hidroliza Tween 80, susceptibilitatea
la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) şi susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic
(PAS)];
 primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (în timp ce pentru M. bovis numai
al 3-lea test este pozitiv);
testul catalazei la şi respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii (hidroliza
Tween 80 poate fi pozitivă pentru M. tuberculosis);
M. tuberculosis se dezvoltă pe mediul cu TCH în timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este
inhibat de către această substanţă); testul este util în special în cazul tulpinilor de M. bovis care
prezintă reacţii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste;

        
Caractere antigenice: se pot examina în centre de referinţă;

        
Caractere de patogenitate: M. tuberculosis  este patogen pentru cobai; inocularea p.p. la cobai este uneori
practicată în vederea diagnosticului;

        
Alte caractere / teste utilizate în identificare: se pot utiliza (la nivelul unor centre de referinţă) teste care se
bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic al acizilor graşi din peretele
celular) sau genotipice (fragmente de restricţie ale materialului genetic, sonde nucelotidice, PCR); există şi
posibilitatea testării sensibilităţii faţă de anumiţi mycobacteriofagi etc.
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) poate fi necesară şi se realizează conform recomandărilor Programului Naţional de
Control al Tuberculozei. Se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda
rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.

52. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic are la bază un mecanism de răspuns imun de tip celular. Se

utilizează intradermoreacţia cu tuberculină (PPD, derivat proteic purificat), vezi capitolele 17-18 şi anexa
nr. 3. IDR cu PPD este mai frecvent folosită în scop epidemiologic dar poate avea şi utilitate diagnostică, în
special atunci când se observă „virajul tuberculinic”, respectiv test tuberculinic negativ, urmat de
pozitivarea testului la o determinare ulterioară.

52. 4. 3. Diagnosticul serologic se bazează pe răspunsul imun de tip umoral (anticorpii anti-
mycobacterieni pot fi evidenţiaţi prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate că metodologia nu este
perfect standardizată, subliniem faptul că în diagnosticul tuberculozei nici un element nu poate fi
considerat ca fiind lipsit de importanţă într-un anumit context clinic, paraclinic şi epidemiologic.

52. 4. 4. Deşi nu am prezentat elementele necesare identificării mycobacteriilor netuberculoase, dorim să

menţionăm că, în cazul utilizării unui număr redus de teste, există riscul de a pune un diagnostic eronat şi
respectiv de a considera o tulpină drept Mycobacterium tuberculosis, cu toate că a fost izolată o
mycobacterie „atipică”.

52. 5. Tratament
Tratamentul nespecific include repausul (fizic, psihic) şi o nutriţie corespunzătoare. Tratamentul
medicamentos se realizează cu anti-tuberculoase în asociere (3 sau 4 medicamente diferite în funcţie de
situaţie). Mai frecvent utilizate sunt izoniazida (HIN), rifampicina, pyrazinamida şi ethambutolul
(medicamente de „primă linie”). Terapia este de lungă durată (minim 4 luni în formele uşoare, 6 luni în
majoritatea cazurilor) şi ar trebui să se realizeze strict supravegheat. Ţinta operaţională este vindecarea a
minim 85% dintre pacienţii cu tuberculoză pulmonară pozitivă la microscopie.

Datorită apariţiei şi extinderii fenomenului de rezistenţă şi multi-rezistenţă la antibiotice, pe lângă

medicamentele de primă linie menţionate mai sus există şi anti-tuberculoase „de rezervă” (ex.
ethionamida, prothionamida, cicloserina etc).

52. 6. Epidemiologie
Pacienţii cu tuberculoză pulmonară a căror spută este pozitivă microscopic, reprezintă sursa de infecţie
cea mai importantă. Transmiterea se face de obicei pe cale respiratorie, fiind favorizată de contactul
prelungit, intrafamilial sau în colectivităţi. Transmiterea prin intermediul laptelui contaminat şi netratat
termic corespunzător este posibilă.

Apariţia bolii este influenţată în mod decisiv de particularităţi ale gazdei, majoritatea încă neelucidate.
Totuşi se cunoaşte că anumite condiţii socio-economice, aglomerarea populaţională, vârsta (copilărie şi
16-21 de ani), o anumită structură genetică (ex. HLA BW15) şi imunodepresia, se asociază mai frecvent cu
apariţia tuberculozei manifestă clinic.

Pe lângă problematica TB, cunoscută de mai multe secole, în momentul de faţă se discută din ce în ce mai
frecvent epidemiologia TB produsă de microorganisme rezistente şi multi-rezistente la antibiotice şi
chimioterapice. De circa 15 ani s-au luat în considerare tulpinile de M. tuberculosis  numite „MDR-TB /
multi-drug resistant”. Tulpina MDR-TB este definită drept acea tulpină de M. tuberculosis rezistentă cel
puţin la hidrazida acidului izonicotinic (izoniazidă, HIN) şi la rifampicină.

Din anul 2005, în limbajul medical internaţional a intrat şi „tulpina XDR-TB” (Mycobacterium
tuberculosis extensiv rezistent la medicamente anti-TB). Tulpina XDR-TB este definită drept acea tulpină
de M. tuberculosis rezistentă atât la majoritatea medicamentelor anti-TB de „primă linie” (inclusiv la
izoniazidă şi rifampicină), cât şi la cele mai utilizate medicamente anti-TB de „linia a doua” (ex.
fluorochinolone şi la cel puţin unul din cele 3 medicamente injectabile, cum ar fi amikacina, kanamicina
sau capreomicina).

În România incidenţa tuberculozei a depăşit la un moment dat valoarea de 140 0/0000. Luând ca punct de
reper anul 1985 (incidenţa TB fiind de 560/0000, cea mai mică valoare istorică a incidenţei TB în România) şi
respectiv anul 2002 (anul în care incidenţa TB s-a menţinut staţionară, pentru al doilea an consecutiv,
valoarea incidenţei pentru cazurile noi fiind 1210/0000), putem spune că în ultimii ani, numărul de cazuri
raportate şi respectiv incidenţa, au scăzut, an de an. Cel mai mare număr de cazuri din ultima perioadă a
fost raportat în 2002 (număr total de cazuri 31.075, număr de cazuri noi 26.637, număr de recidive prin TB
4.438, număr de cazuri la copii 1.878). Numărul de cazuri noi de TB înregistrate ulterior (la adulţi) a fost de
25.245 (2003), 24.776 (2004), 22.860 (2005) şi respectiv 20.842 de cazuri în 2006, cu o incidenţă care s-a
„întors către” valoarea înregistrată în anul 1994 (96,6 0/0000). La copii, numărul de cazuri raportate a scăzut
de la 1.519 (2003) până la 1.066 cazuri în 2006.
În SUA s-au înregistrat 21.337 cazuri în 1996 (incidenţă 8,04 0/0000), 19.851 cazuri în 1997 (7,420/0000), 18.361
cazuri în 1998 (6,790/0000) şi respectiv 17.531 cazuri în 1999, corespunzând la o incidenţă de 6,43 0/0000. De
altfel, numărul de cazuri de TB în SUA a scăzut an de an în perioada 1998-2005. În 2005 au fost raportate
14.097 cazuri de TB (incidenţă 4,80/0000).

52. 7. Profilaxie
Depistarea precoce a surselor de infecţie precum şi tratamentul acestora corect şi complet reprezintă una
dintre cele mai importante măsuri de prevenire şi control.

Vaccinarea BCG este utilă cel puţin pentru prevenirea meningitei tuberculoase la nou-născut (afecţiune
extrem de gravă). Prima vaccinare se realizează în primele zile de viaţă, în maternitate. Revaccinările se pot
face numai la persoane IDR negative.

Pentru prevenirea TB, se recomandă în anumite situaţii chimioprofilaxia (de ex. administrarea HIN la
membrii de familie, contacţi ai unei persoane cu TB pulmonară pozitivă la microscopie).

Eradicarea tuberculozei la vite şi pasteurizare laptelui sunt de asemenea măsuri utile profilactic.

53. Germeni spiralaţi. Genul Treponema. Treponema

pallidum
53. 1. Definiţie. Încadrare
Spirochetele formează un grup relativ mare şi heterogen de microorganisme spiralate, mobile.
Familia Spirochaetaceae aparţine ordinului Spirochaetales şi include trei genuri de microorganisme.
Familia Treponemataceae include trei genuri patogene pentru om: 1. genul Treponema; 2. genul Borrelia şi
3. genul Leptospira. În genul Treponema sunt cuprinse mai multe specii de interes medical, dintre care
menţionăm Treponema pallidum agentul etiologic al sifilisului, T. reiter o tulpină de laborator, izolată de la
om, care se poate cultiva pe medii de cultură şi permite obţinerea unor antigene de diagnostic şi T.
pallidum (tulpina Nichols) menţinută în laborator prin inoculare intratesticulară la iepure, utilă pentru
obţinerea antigenelor de diagnostic.

53. 2. Caractere generale

53. 2. 1. Habitat
T. pallidum este un microorganism parazit exclusiv al omului, nu se poate identifica în mediul extern.
Transmiterea sexuală reprezintă calea de contagiune în imensa majoritate a situaţiilor. T. pallidum poate fi
izolată din serozitatea recoltată din şancrul sifilitic sau din sânge.

53. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Microorganismul tipic se prezintă sub forma unor spirale subţiri, măsurând aproximativ 0,25-0,3 m lăţime
şi 6-15 m lungime. Între buclele spiralei există o distanţă constantă de 1m. Prezintă mobilitate activă,
putându-se roti în jurul filamentului axial central, chiar şi după ce se ataşează de celule prin capetele
efilate. Spiralele sunt atât de subţiri încât nu se pot vizualiza decât prin imunofluorescenţă sau la
microscopul cu câmp întunecat (prin examinarea preparatului proaspăt între lamă şi lamelă). Aspectele
morfologice pot fi evidenţiate prin colorarea frotiurilor prin metode speciale (Giemsa, Fontana -
Tribondeau sau impregnarea argentică).

53. 2. 3. Caractere de cultură

Tulpinile de Treponema pallidum patogene pentru om nu au fost niciodată cultivate pe medii de cultură
artificiale. În anumite fluide şi în prezenţa substanţelor reducătoare, T. pallidum poate rămâne mobilă 3-6
zile, la 25C. În sângele total sau în plasma păstrată la 4C rămâne viabilă cel puţin 24 de ore, aspect
important care a dus la testarea sângelui donat şi pentru eliminarea riscului prezenţei T. pallidum în
unităţile folosite pentru transfuzii. Treponemele nepatogene (ex. tulpina Reiter) pot fi cultivate in vitro pe
medii de cultură în anaerobioză. T. reiter este înrudită antigenic cu T. pallidum.

Treponema pallidum (tulpina Nichols) este menţinută în laborator prin inoculare intratesticulară la iepure.

53. 2. 4. Caractere biochimice

Datorită necultivabilităţii, caracterele biochimice nu au putut fi la fel de bine precizate ca şi pentru alte
microorganisme. T. pallidum este un germen microaerofil.

53. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

T. pallidum este distrusă de uscăciune precum şi de creşterea temperaturii la 42C. Treponemele sunt
rapid imobilizate şi distruse de arsenicul trivalent, mercur şi bismut. Acest efect distructiv este accelerat de
către temperaturile înalte şi este parţial reversibil cu reactivarea treponemelor la tratarea cu compuşi
conţinând gruparea -SH (cisteină şi dimercaptopropanol). Suspensiile de treponeme pot fi menţinute timp
de mai mulţi ani la -70C.

53. 2. 6. Structură antigenică

Primul test utilizat în diagnosticul serologic al sifilisului a fost un test având la bază reacţia de fixare a
complementului (reacţia Bordet-Wassermann, RBW). Iniţial antigenul utilizat a fost extras din ficatul unui
fetus uman (cu sifilis congenital). Ulterior s-a descoperit faptul că acest antigen, lipoidic (difosfatidil
glicerol), numit cardiolipină, poate fi extras din muşchiul cardiac precum şi din alte structuri. De fapt
structura antigenică a T. pallidum se apreciază a fi complexă şi este incomplet elucidată până în prezent.

Antigenul lipoidic este un antigen nespecific, util în testele de screening.

În structura treponemelor există antigene proteice, un antigen specific de grup, extras din T. reiter şi altul
specific de tip.

Este descris şi un antigen cu structură polizaharidică, specific de tip, diferit de antigenele extrase din T.
reiter, responsabil pentru testul de imobilizare şi care se poate extrage din tulpina Nichols.

53. 2. 7. Răspuns imun

Rezistenţa la reinfecţie a fost verificată atât la om (voluntari) cât şi la iepure şi debutează la circa 3
săptămâni după apariţia leziunilor primare. Persistenţa unei infecţii latente previne reinfecţia, dar în cazul
în care boala este tratată corect, gazda redevine susceptibilă la infecţie. În vederea obţinerii rezistenţei la
infecţie este necesar atât răspunsul imun umoral cât şi celular.

53. 2. 8. Caractere de patogenitate

T. pallidum este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. T. pallidum afectează numai omul şi se
transmite de regulă prin contact sexual. Alte modalităţi de transmitere posibile ar fi pe cale sanguină sau
de la mamă la făt. Infectarea indirectă, ex. prin intermediul unor obiecte contaminate, se apreciază că ar fi
posibilă în circa 0,1% din cazuri.

53. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Infecţia naturală cu T. pallidum este limitată la gazda umană. Infecţia se transmite de obicei prin contact
sexual, iar leziunile de primoinfecţie sunt cantonate la nivelul tegumentelor şi mucoaselor din zona
genitală. Totuşi în 10-20% din cazuri, leziunile primare sunt localizate la nivel rectal, perianal sau oral. T.
pallidum poate probabil penetra mucoasele intacte sau pătrunde printr-o soluţie de continuitate de la
nivelul epidermului.

Spirochetele se multiplică local la poarta de intrare, iar unele se răspândesc în vecinătatea

nodulilor limfatici, de unde ajung în torentul circulator. În 2-10 săptămâni de la infecţie, la locul inoculării
se dezvoltă o papulă care se deprimă pentru a forma o ulceraţie cu baza curată, indurată (şancru dur).
Inflamaţia se caracterizează prin prezenţa limfocitelor şi a plasmocitelor. Această leziune „primară” se
vindecă întotdeauna spontan, dar după 2-10 săptămâni apar leziunile secundare, care constau în leziuni
eritematoase maculopapulare localizate oriunde pe corp şi papule umede, palide (condiloame) în
regiunile anogenitală, axilară şi în cavitatea bucală. Pot fi prezente de asemenea meningita sifilitică,
corioretinita, hepatita, nefrita (datorită apariţiei complexelor imune) sau periostita. Leziunile secundare se
remit şi ele spontan. Atât leziunile primare, cât şi cele secundare sunt bogate în spirochete şi foarte
contagioase. Leziunile contagioase pot reapărea la 3-5 ani de la infecţie, dar după aceea individul nu este
contagios. Infecţia sifilitică poate rămâne subclinică şi pacientul poate trece prin stadiile primar, secundar
sau prin ambele fără semne sau simptome, dezvoltând totuşi sifilis terţiar.

În aproximativ 30% din cazuri, infecţia sifilitică precoce progresează spontan către vindecare completă în
absenţa tratamentului. În alte 30% din cazuri, infecţia netratată rămâne latentă (evidenţiată în special prin
teste serologice pozitive). În celelalte cazuri, boala progresează spre stadiul terţiar, caracterizat prin
dezvoltarea de leziuni granulomatoase (gome) în piele, oase, ficat, prin modificări degenerative la nivelul
SNC (sifilis meningovascular, pareze, tabes), sau prin leziuni cardiovasculare (aortită, anevrism aortic,
insuficienţă aortică). În toate leziunile terţiare treponemele sunt foarte rare, iar reacţiile exagerate ale
ţesuturilor se datorează hipersensibilităţii la antigene treponemice.

În cazul sifilisului congenital, o femeie însărcinată infectată cu T. pallidum  poate transmite germenul
fătului prin placentă între săptămânile 10-15 de gestaţie. În unele cazuri se produc moarte in utero şi
avort spontan, iar în altele apare postmaturitate. Alţi feţi sunt născuţi vii, dar dezvoltă semne de sifilis
congenital în copilărie: keratită interstiţială, dinţi Hutchinson, nas în şa, periostită şi diferite anomalii ale
SNC. Tratamentul adecvat al mamei în timpul sarcinii previne sifilisul congenital. Titrul „reaginelor” în
sângele copilului creşte în infecţia activă, dar scade cu timpul dacă anticorpii au fost transferaţi pasiv de la
mamă. În infecţia congenitală, copilul produce anticorpi antitreponemici de tip IgM. Pentru prevenirea
sifilisului congenital, femeile însărcinate trebuie să fie testate pe parcursul sarcinii, recomandarea fiind
făcută de doctorul obstetrician încă de la prima vizită (recomandarea trebuie făcută de asemenea şi de
medicul de familie).

53. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse

de Treponema pallidum
Atât leziunile primare, cât şi cele secundare sunt bogate în spirochete şi foarte contagioase. În cele ce
urmează vom aborda diagnosticul de laborator în cazul sifilisului primar sau secundar. Diagnosticul
porneşte de la elemente clinice şi epidemiologice, dar trebuie confirmat prin metode de laborator.

Diagnosticul de laborator în sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.

53. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic

Treponema pallidum nu poate fi cultivată pe medii artificiale, în laborator. Din acest motiv, diagnosticul
bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasică a schemei diagnosticului direct.
Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat atât în sifilisul primar cât şi în sifilisul secundar.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute

(vezi anexa nr. 6), în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei, având o serie de particularităţi. Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul
clar (serozitatea) de la nivelul leziunilor primare în funcţie de localizare (penian, cervical, vaginal, perianal
etc), de la nivelul leziunilor secundare (condiloma lata, rozeole sifilitice etc), de la nivelul unor leziuni
„umede” bogate în treponeme în cazul sifilisului congenital timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii
limfatici regionali.

În cazul şancrului, vom recolta p.p. după îndepărtarea cu grijă (fără a produce sângerare) a crustelor care
acoperă leziunea. Ar putea fi necesar să comprimăm baza leziunii pentru a stimula acumularea de lichid
(clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice. Prelevăm lichidul fie cu ajutorul ansei
bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie aplicând pur şi simplu lama de sticlă pe „leziunea
umedă”. Acoperim cu o lamelă şi eliminăm prin uşoară apăsare eventualele bule de aer. Transportul
trebuie să fie realizat foarte rapid, de preferat în maxim 20 de minute astfel încât se recomandă ca
recoltarea să fie realizată într-un spaţiu corespunzător, în imediata vecinătate a laboratorului. Este o
etapă esenţială.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul microscopului cu fond
întunecat, fie prin imunofluorescenţă directă (există şi alte tehnici, care nu vor fi discutate în acest manual).

        
Pentru examenul microscopic pe fond întunecat, pregătim 2 lame (preferabil 3) pentru fiecare leziune
pe care dorim să o examinăm. Preparatele nu trebuie să conţină hematii, leucocite, fragmente de ţesut sau
bule de aer. În timp ce examinăm primul preparat microscopic vom introduce celelalte 2 preparate într-o
cutie Petri în care există puţină vată sau hârtie de filtru umezită, pentru a păstra atmosfera umedă şi a
preveni uscarea. Preparatul microscopic trebuie examinat sistematic (minim 10 minute în cazul unui
rezultat aparent negativ), iniţial cu obiectivul uscat, ulterior, după vizualizarea unor microorganisme care
par să aparţină genului Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul să aibă
experienţă în acest tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subţiri şi lungi (0,25-
0,3m / 6-14 m), spiralate, prezentând 8-14 spire (regulate, strânse, adânci şi rigide), mobile (spirele nu
se deformează), deplasarea în câmpul microscopic nu este foarte rapidă dar seamănă cu o mişcare de
înşurubare (există şi microorganisme care sunt imobile dar păstrează mişcările de translaţie, rotaţie lentă,
flexie uşoară de la un cap la celălalt sau flexie mediană cu revenire ca un resort), luminoase pe fondul
negru al câmpului microscopic. În cazul unui rezultat negativ putem repeta recoltarea şi examinarea. În
anumite situaţii se poate recomanda începerea tratamentului, iar evoluţia va fi monitorizată clinic şi
serologic (rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis). Rezultatul pozitiv, atunci când poate fi
exclusă prezenţa unor treponeme saprofite, pune diagnosticul de sifilis primar înainte ca anticorpii să
poată fi detectaţi serologic.

        
Imunofluorescenţa directă permite diferenţierea T. pallidum de alte treponeme cu ajutorul
anticorpilor marcaţi fluorescent (reacţie Ag-Ac); un alt avantaj este reprezentat de faptul că nu este
necesar ca treponemele să fie mobile. În plus, pentru că reacţia este specifică, se poate utiliza cu succes şi
în cazul unor leziuni foarte probabil contaminate cu treponeme saprofite (ex. orale, rectale). În cazul în
care examinarea nu poate fi realizată imediat secreţia poate fi recoltată într-un tub capilar care se închide
la flacără şi poate fi transportat la +4ºC; alternativ putem realiza frotiul, aşteptăm să se usuce în
vecinătatea becului de gaz şi putem să îl trimitem către laborator. Frotiul poate fi „colorat”:

·
cu Ac anti-T. pallidum obţinuţi de la pacienţi cu sifilis sau de la iepuri infectaţi cu T. pallidum; serul este
tratat pentru creşterea specificităţii cu tulpina Reiter (o tulpină nepatogenă de T. phagadenis) iar Ac sunt
apoi marcaţi cu izotiocianat de fluoresceină sau

·
cu Ac monoclonali anti-T. pallidum subspecia pallidum marcaţi fluorescent.
Subliniem încă odată importanţa examenului clinic urmat de recoltarea, transportul şi examinarea
microscopică a p.p.

În laboratoarele de referinţă ar mai putea fi utilizate şi alte metode în scop diagnostic (mai rar) sau pentru
cercetare:

        
Inocularea p.p. la animale de laborator reprezintă cea mai sensibilă metodă pentru detectarea T. pallidum.
Pentru menţinerea în laborator a unor treponeme viabile sau pentru determinarea infectivităţii au fost
utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc) însă cel mai util este iepurele. Iepurele poate fi inoculat
(intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p. cu condiţia ca între momentul recoltării şi inoculare să nu
treacă mai mult de 60 minute. În caz contrar, p.p. trebuie adus rapid la o temperatură de cel puţin -70ºC
(ex. în azot lichid) şi menţinut astfel până în momentul inoculării. Testul infectivităţii la iepure (RIT) rămâne
metoda standard; cu ajutorul RIT se apreciază sensibilitatea şi specificitatea oricărei alte metode care este
propusă pentru diagnosticul sifilisului.

        
În centrele de referinţă au mai fost utilizate şi tehnici ale biologiei moleculare (sondele nucleotidice, PCR).
Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostică atunci când p.p. este reprezentat de lichidul amniotic.
Treponema pallidum  îşi păstrează sensibilitatea la penicilină, medicament care rămâne de elecţie pentru
tratamentul sifilisului. Există şi o serie de alternative, dar dorim să subliniem că în vederea tratamentului
acestei maladii trebuie respectate recomandările făcute de către comisia de specialitate a ministerului
sănătăţii, pentru fiecare formă de sifilis în parte.

53. 4. 2. Diagnosticul serologic

Diagnosticul serologic se realizează folosind antigene nontreponemice şi antigene treponemice. Testele
nontreponemice (nespecifice) şi treponemice (specifice) sunt complementare; nu se exclud. Testele
nontreponemice sunt utilizate în screening, diagnostic şi monitorizarea pacienţilor în cursul tratamentului.
În vederea stabilirii diagnosticului vom utiliza şi testele treponemice în corelaţie cu cele nontreponemice
(nici unul dintre cele două tipuri nu pot „acoperi” din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului).
Cel mai frecvent utilizăm VDRL sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a doua
categorie). De obicei utilizăm serul provenit de la pacientul suspect, dar în anumite situaţii testul este
realizat folosind plasmă sau LCR.

53. 4. 2. 1. Reacţii serologice care utilizează antigene nontreponemice

        
Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite ţesuturi. Cardiolipina este un
difosfatidil-glicerol. Pentru creşterea sensibilităţii, cardiolipina este cuplată cu colesterol şi lecitină.
Anticorpii anti - cardiolipină au fost numiţi „reagine”. Sunt depistaţi în serul pacienţilor la 2-3 săptămâni şi
în LCR la 4-8 săptămâni de la debutul infecţiei, în cazurile netratate.
        
Reacţia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizată o lungă perioadă de timp,
începând cu 1906. Datorită faptului că RFC este o metodă laborioasă şi în special datorită apariţiei
unor alte tehnici, RBW este discutată în prezent din punct de vedere istoric. Există şi RFC Kolmer, care se
execută la 4ºC.
        
Tehnica actuală standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de floculare. Testele
de floculare se bazează pe faptul că particulele antigenice rămân dispersate în serul normal, dar formează
grunji vizibili atunci când se combină cu reaginele. Testele se pretează la automatizare şi la folosirea
pentru screening datorită costului redus. O variantă economică şi elegantă este microreacţia VDRL care
se practică în plăci cu godeuri.
·
Ag tip VDRL se prepară conform recomandărilor producătorului.

·
Pregătirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarifică prin centrifugare), inactivarea
timp de 30 minute la 56ºC şi o nouă centrifugare (în cazul apariţiei unor particule în suspensie). Nu vor fi
testate serurile infectate sau hemolizate. În cazul în care trec mai mult de 4 ore din momentul inactivării,
serul va fi inactivat din nou timp de 10 minute la 56ºC.

·
Temperatura din camera de lucru trebuie să fie între 23-29ºC. Testul se efectuează pe ser nediluat (pentru
monitorizarea evoluţiei sub tratament se pot face diluţii binare). Se pot testa mai multe seruri concomitent
şi este necesară o notare clară a godeurilor, pentru fiecare godeu în parte. Fiecare test va include martori
(seruri cu reactivitate cunoscută, martor pentru Ag). În fiecare godeu punem câte 0,05 ml ser (în godeul
pentru martor Ag punem soluţie salină fiziologică). După agitarea flaconului cu suspensia antigenică,
utilizând o seringă cu ac calibrat depunem câte o picătură (1/60 ml) în fiecare godeu. Acoperim placa şi o
aşezăm pe un agitator care poate fi reglat la 180 turaţii pe minut, pe o durată de 4 minute.

·
Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, începând cu martorii
(negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) şi continuând cu serurile de testat.

·
Rezultatul este negativ dacă lichidul nu prezintă flocoane şi este asemănător martorului negativ şi
martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci când vizualizăm flocoane de dimensiuni mici într-un
lichid uşor turbid în timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci când vizualizăm flocoane de dimensiuni
mari iar lichidul este clar. Repetăm rezultatele slab pozitive sau dificil de interpretat. În cazul în care
suspicionăm existenţa fenomenului de prozonă (inhibiţia totală sau parţială a floculării prin exces de Ac),
vom repeta testarea se va repeta pe diluţii de ser.

·
Rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla în perioada de incubaţie sau
poate fi cazul unui sifilis latent (evidenţiabil prin TPHA). În cazul unui pacient suspect pentru sifilis primar,
repetăm testul după 1 săptămână, 1 lună şi la 3 luni.

·
Vom lua în considerare un rezultat pozitiv în corelaţie cu rezultatul obţinut la testul treponemic, rezultatul
diagnosticului bacteriologic, elementele clinice şi epidemiologice. Un rezultat pozitiv în condiţiile în care
toate celelalte date sunt negative este de obicei un rezultat fals-pozitiv. Pot apărea rezultate fals-pozitive
la persoane cu hepatită virală acută, pneumonii virale, rujeolă, malarie, mononucleoză infecţioasă, alte
infecţii virale, la persoane care au fost recent vaccinate, precum şi la persoane cu boli ale ţesutului
colagen, persoanele cu lepră, persoane cu diferite neplazii, persoane care se droghează, la persoanele în
vârstă etc. Reacţii fals-pozitive pot apărea şi pe parcursul sarcinii.
·
Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util în următoarele situaţii:
scăderea de 4 ori a titrului în sifilisul recent, tratat, semnifică de regulă eficacitatea tratamentului; creşterea
de 4 ori a titrului sugerează o infecţie activă în evoluţie, o reinfecţie sau ineficacitatea tratamentului.
VDRL-CSF, reprezintă o variantă a VDRL, tehnica fiind utilizată în suspiciunea de
neurosifilis, pentru identificarea anticorpilor prezenţi în LCR.

        
Alte teste de floculare utilizate în practică

        
Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar mai multe
cercuri de . Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenică tip VDRL modificată (pentru a elimina
etapa de inactivare prin căldură). Reactivul conţine şi particule de cărbune. Antigenul RPR este amestecat
cu serul de cercetat în cercul de pe card. Daca Ac anti-T. pallidum sunt prezenţi, se combină cu particulele
lipidice din Ag şi produc aglutinarea lor. Particulele de cărbune coaglutinează cu Ac şi duc la apariţia
unor granule negre pe fondul alb al cardului. În absenţa Ac rezultă un aspect gri uniform. Testul se poate
realiza calitativ şi cantitativ (diluţii de ser).

·
Testul RST (Reagin Screen Test)

·
Testul USR (Unheated Serum Reagin)

·
Testul TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)

        
A fost pusă la punct şi o tehnică de tip ELISA cu acest tip de antigene.

        
Modul de interpretare al testelor nontreponemice depinde şi de populaţia care este supusă testării.
53. 4. 2. 2. Reacţii serologice care utilizează antigene treponemice

        
Au fost realizate şi tehnici serologice care utilizează antigene treponemice extrase din T. reiter (specifice
de grup) de tipul RFC şi CIE.
        
De mare utilitate practică sunt reacţiile serologice care utilizează antigene treponemice extrase din tulpina
Nichols de T. pallidum, cu o mare specificitate.

·
Pentru o lungă perioadă de timp, tehnica standard a fost testul imobilizării treponemelor (TIP). Tehnica a
fost pusă la punct în anul 1949. Serul de cercetat era diluat şi amestecat cu complement şi treponeme vii,
mobile, obţinute din şancrul testicular de la iepure. În prezenţa Ac specifici, treponemele erau imobilizate,
în timp ce în lipsa acestora, mobilitatea era păstrată (examinarea se făcea cu microscopul pe fond
întunecat).

·
Testele de imunofluorescenţă indirectă (Fluorescent Treponemal Antibody, FTA) au început să fie utilizate
în 1957, serul de cercetat fiind diluat 1/5. Datorită rezultatelor fals-pozitive, ulterior s-a trecut la diluarea
1/200 a serului (FTA-200). Din 1962 a început să fie utilizată tehnica pe care o avem la dispoziţie şi
astăzi, FTA-Abs. Pornind de la tulpina Reiter s-a obţinut prin ultrasonicare un extract antigenic, pentru a
îndepărta Ac care nu sunt specifici pentru T. pallidum. Probele de ser şi/sau LCR de la pacienţi sunt diluate
1/5 cu un extract care conţine Ag treponemice de grup (Reiter), comune treponemelor patogene şi
comensale. Astfel sunt înlăturaţi Ac nespecifici. Există lame pe care a fost fixată tulpina Nichols de T.
pallidum. Probele de ser şi/sau LCR absorbite şi martorii corespunzători se depun pe spoturile de pe lamă.
Dacă în ser/LCR există Ac specifici, aceştia se vor lega de treponemele fixate pe lamă formând complexe
antigen-anticorp. După îndepărtarea materialului nelegat prin spălări repetate, Ac legaţi se detectează
prin incubare cu un conjugat fluorescent anti Ig umane. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului
nelegat de complexele antigen-anticorp, lamele se examinează la microscopul cu fluorescenţă (UV). În
cazul în care serul de cercetat este pozitiv, treponemele de pe lamă apar fluorescente (galben-verzui).

·
Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus la punct în urmă
cu 30 de ani. În prezenţa unor Ac faţă de Ag adsorbite pe membrana lor, hematiile aglutinează în reţele
caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic este extras din tulpina Nichols şi adsorbit pe
suprafaţa hematiilor de oaie sau pasăre fixate (hematii sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii
fără Ag treponemice (nesensibilizate). În cazul în care în serul de cercetat sunt prezenţi Ac anti-T. pallidum,
hematiile sensibilizate aglutinează; hematiile nesensibilizate nu aglutinează şi se depun sub forma unui
„buton” pe fundul godeului. Pentru creşterea specificităţii, majoritatea truselor comerciale includ în diluent
un extract de treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat calitativ sau semi-cantitativ (diluţii ale serului
de cercetat). Există metode automate, utilizate pentru testarea sângelui donat.

·
Tehnica ELISA

·
Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este utilă pentru documentarea infecţie
intra-uterine.
·
Tehnica Western blot poate detecta atât Ac de tip IgM cât şi de tip IgG.
Aşa cum am mai menţionat, interpretarea rezultatelor obţinute se face ţinând cont de
contextul clinic, epidemiologic şi de laborator. Luând în considerare numai rezultatele de
laborator pentru testele menţionate în acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu,
dacă testul VDRL este negativ şi testul TPHA este tot negativ, de regulă infecţia este exclusă. Dacă ne
gândim că pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt încă nedectabili, repetăm testele după 3
săptămâni. În cazul în care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA este negativ, este posibil să ne aflăm în
situaţia de mai sus, la debutul bolii şi repetăm testele după 3 săptămâni. Dacă rezultatele rămân
nemodificate, este vorba de o reacţie fals-pozitivă. Pot fi luate în discuţie şi alte posibilităţi.

53. 5. Tratament
Penicilina în concentraţie de 0,003 unităţi / ml are activitate bactericidă dovedită şi continuă să
reprezinte tratamentul de elecţie în sifilis. În sifilisul mai vechi de 1 an sau în sifilisul latent, benzatin
penicilina G (2,4 milioane unităţi) se administrează de 3 ori la interval de câte o săptămână. În neurosifilis
se acceptă aceeaşi terapie, dar se utilizează cantităţi mai mari de penicilină (penicilina G apoasă, 20 de
milioane unităţi intravenos zilnic, timp de 2-3 săptămâni). La câteva ore de la începerea tratamentului se
poate produce o reacţie adversă (Jarish-Herxheimer), datorată eliberării masive de endotoxine din
treponemele distruse.

La persoanele care prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de penicilină se pot administra tetraciclină,
doxiciclină sau ceftriaxonă.

53. 6. Epidemiologie. Profilaxie

În prezent, incidenţa sifilisului şi a altor boli cu transmitere sexuală a crescut la nivel mondial. Cu excepţia
sifilisului congenital şi a expunerii profesionale la personalul sanitar, sifilisul este dobândit pe cale sexuală.
Incidenţa bolii este în mod particular crescută la bărbaţii homosexuali, iar reinfecţia la persoane tratate
este obişnuită. O persoană infectată poate rămâne infectată timp de 3-5 ani pe parcursul sifilisului
„precoce”. Sifilisul tardiv, mai vechi de 5 ani, este în mod normal contagios. În consecinţă, măsurile de
control depind de: 1. tratamentul prompt şi adecvat al tuturor cazurilor depistate, 2. supravegherea
surselor de infecţie şi a contacţilor, astfel încât aceştia să fie trataţi, 3. igienă sexuală, 4. profilaxia la
momentul expunerii. Atât profilaxia mecanică (prezervative), cât şi chimioprofilaxia (penicilină după
expunere) au limite.

De menţionat că relativ frecvent pot fi contractate simultan mai multe infecţii cu transmitere sexuală.
De aceea, atunci când se descoperă o infecţie cu transmitere sexuală trebuie să se ia în calcul şi
posibilitatea unei infecţii sifilitice.

În 1997, în România, s-au raportat 7.704 cazuri de sifilis, ceea ce corespunde la o incidenţă de 34,2 0/0000.
Numărul de cazuri raportate, la adulţi a crescut, anual, până în 2002 (12.702 cazuri raportate, incidenţă
58,280/0000). Începând cu 2003, numărul de cazuri de sifilis la adulţi a scăzut, raportându-se 9.698 cazuri în
2003, 8.838 cazuri în 2004, 6.862 cazuri în 2005 şi 5.661 cazuri în 2006, un număr istoric de mic,
corespunzând la o incidenţă de 26,20/0000. În aceeaşi perioadă de timp, numărul de cazuri de sifilis
congenital a crescut anual, atingând valoarea maximă de 423 cazuri raportate în 2002,
ulterior raportându-se 202 cazuri în 2003, 136 cazuri în 2004, 38 cazuri în 2005 şi 16 cazuri în 2006.
Comparând tendinţa evolutivă a sifilisului în România şi SUA, ne putem întreba dacă datele raportate
reprezintă situaţia reală, la fel cum ne puneam această întrebare şi în cazul gonoreei.

Incidenţa sifilisului primar şi secundar în SUA, în anul 1997, a fost de 3,19 0/0000 cu 8.550 cazuri; în anul 1998
au fost declarate 6.993 cazuri, în anul 1999, 6.657 cazuri iar în anul 2000 au fost raportate 5.979 cazuri.
Tendinţa de scădere a luat sfârşit în anul 2000; începând cu anul 2001, numărul de cazuri de sifilis primar
şi secundar, împreună, a crescut an de an, valoarea maximă înregistrându-se în anul 2005 (8.724 cazuri).

Luând în considerare numărul total de cazuri de sifilis raportate în SUA în anul 1999 (35.628), cifra
corespundea la o incidenţă de 13,070/0000, în continuă scădere, în ultimii 12 ani. Cel mai mic număr de
cazuri (indiferent de formă) a fost înregistrat în anul 2000 (31.575), însă începând cu anul 2001, numărul
de cazuri a crescut, depăşind în fiecare an cifra de 32.000, cu un maxim în 2003 (34.270 cazuri) şi peste
33.000 cazuri raportate în 2004 şi 2005.

În schimb, numărul de cazuri de sifilis congenital, în SUA, a scăzut continuu, de la o valoare de 801 cazuri
raportate în 1998, 441 cazuri raportate în 2001 şi respectiv 329 cazuri în 2005.

53. 7. Boli înrudite cu sifilisul

Toate aceste boli sunt date de treponeme care nu pot fi deosebite de T. pallidum. În toate cazurile apar
reacţii pozitive la testele treponemice şi nontreponemice pentru sifilis, iar unele reacţii încrucişate pot fi
demonstrate la animalele de laborator şi probabil la oameni. Nici una dintre aceste boli nu se transmite
sexual; ele se transmit de obicei prin contact direct. Nici unul dintre germenii implicaţi nu a fost cultivat pe
medii artificiale.

7. 1. Bejelul se întâlneşte în Africa, Orientul Mijlociu, Asia de Sud-Est şi în alte zone. În mod particular
apare la copii şi produce leziuni cutanate foarte contagioase; complicaţiile viscerale tardive sunt rare.
Penicilina este antibioticul de elecţie.

7. 2. Pianul este o infecţie endemică, ce apare în mod particular la copii, în ţările cu climat cald şi umed.
Agentul cauzal este T. pertenue. Leziunea primară, o papulă ulcerativă, apare de obicei pe braţe sau
picioare. Transmiterea se face prin contact direct la copii sub 15 ani. Nu au fost raportate infecţii
congenitale, transplacentare. În mod obişnuit se constată leziuni cutanate cu cicatrizare şi distrucţii
osoase, dar complicaţiile nervoase sau viscerale sunt excepţionale. S-a discutat dacă pianul reprezintă o
variantă de sifilis cu transmitere nesexuală în ţările cu climat cald. Se pare că există reactivitate imună
încrucişată între pian şi sifilis. Procedurile de diagnostic şi tratament sunt similare celor pentru sifilis.
Răspunsul la tratamentul cu penicilină este prompt.

53. 7. 3. Pinta este produsă de T. carateum. Boala se transmite prin contact direct. În transmiterea acestei
boli este incriminată şi o muscă vector (Hippelates). Pinta este endemică în Mexic, Filipine, unele zone din
Pacific, afectând persoane de toate vârstele. Leziunile primare sunt reprezentate de papule neulceroase
care apar la nivel tegumentar.
54. Genul Borrelia
54. 1. Definiţie. Încadrare
Sunt treponematacee cu spire largi şi inegale care produc spre exemplu febra recurentă, boală transmisă
de artropodele hematofage. Borreliozele transmise prin căpuşe poartă de obicei numele regiunii
geografice în care se găsesc preponderent.

Despre febra recurentă s-a discutat în special după un episod din Edimburgh (1843); după 30 ani, agentul
etiologic a fost numit Spirocheta recurrentis. Numele definitiv a fost stabilit în 1907, în amintirea şi onoarea
lui A. Borrel (Borrelia recurrentis).

54. 2. Caractere generale

54. 2. 1. Habitat
Borreliile sunt germeni strict paraziţi, care nu se întâlnesc niciodată în stare liberă în natură, existenţa
lor nefiind posibilă decât în organismele parazitate (rozătoare, artropode, om).

54. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Microorganismele caracteristice (ex. Borrelia recurrentis) au o formă spiralată, neregulată şi măsoară circa
8-30 m lungime şi 0,2-0,5 m lăţime. Distanţa dintre spire variază între 2 şi 4m. Sunt foarte flexibile şi se
deplasează atât prin rotaţie cât şi prin răsucire. Borreliile se colorează prin metode utilizate în hematologie
(coloraţia Giemsa sau Wright).

54. 2. 3. Caractere de cultură

Microorganismul poate fi cultivat pe medii fluide ce conţin sânge, ser sau ţesuturi, dar îşi pierde rapid
patogenitatea pentru animale când este transferat în mod repetat in vitro. Multiplicarea are loc rapid în
embrionul de găină când sângele de la pacient este inoculat în membrana chorioalantoidiană.

54. 2. 4. Caractere biochimice

Se cunosc destul de puţine date cu privire la necesităţile metabolice sau activitatea biochimică a boreliilor.
Sursa majoră de energie este reprezentată de carbohidraţi (în special, glucoza).

54. 3. Borrelia recurrentis (febra recurentă)

54. 3. 1. Aspecte generale şi date privind boala produsă
B. recurrentis supravieţuieşte mai multe luni în sângele contaminat sau în culturi la 4C. În anumite căpuşe,
bacteriile sunt transferate din generaţie în generaţie.
Tulpinile de B. recurrentis izolate în diverse părţi ale lumii, de la diferite gazde şi de la vectori diferiţi
(căpuşe sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate drept subtipuri ale speciei principale.

În urma infecţiei apare un răspuns imun umoral, putând fi detectaţi anticorpi aglutinanţi şi anticorpi
fixatori de complement. De remarcat faptul că, inclusiv în decursul unei singure infecţii apar modificări
antigenice, care explică recăderile. Ultima vindecare (după 3-10 recăderi) este asociată cu prezenţa
anticorpilor împotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea consecutivă infecţiei este de obicei de
scurtă durată.

După o perioadă de incubaţie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane şi creşterea rapidă a temperaturii.
În acest timp, spirochetele se află în număr mare în sânge. Febra persistă 3-5 zile, apoi scade. Perioada
afebrilă durează 4-10 zile şi este urmată de un al doilea atac de frisoane, febră, cefalee intensă şi stare de
rău. Pot apare succesiv până la 10 asemenea recăderi, a căror severitate scade în general progresiv.
Puseele febrile se asociază cu bacteriemie.
Febra recurentă este endemică în multe zone ale globului. Principalul rezervor este reprezentat de
rozătoare, sursă de infecţie pentru căpuşe. Distribuţia focarelor endemice şi incidenţa sezonieră a bolii
sunt în mare parte determinate de modul de răspândire al căpuşelor. La aceste insecte, Borrelia poate fi
transmisă transovarian din generaţie în generaţie. Spirochetele sunt prezente în toate ţesuturile căpuşelor,
care pot transmite bacteriile prin muşcătură sau atunci când sunt zdrobite. În cazul păduchilor, infecţia nu
se transmite generaţiilor următoare, iar boala la om se datorează contactului păduchilor zdrobiţi cu
leziunile determinate de înţepătură. La populaţiile infectate cu păduchi pot apărea epidemii severe,
transmiterea fiind favorizată de aglomeraţii, malnutriţie şi de climatul rece.

Prevenirea febrei recurente se bazează pe evitarea contactului cu căpuşe, păduchi şi prin despăduchiere
(curăţenie, dezinsecţie).

Marea variabilitate a remisiunilor spontane în cazul febrei recurente, face foarte dificilă evaluarea
eficacităţii chimioterapiei. Tetraciclina, eritromicina (şi alte macrolide), penicilina şi cefalosporinele de
generaţia a 3-a sunt considerate utile.

54. 3. 2. Diagnosticul de laborator în febra recurentă

Diagnosticul de laborator în borrelioza recurentă este bacteriologic, direct urmând etapele cunoscute.
Diagnosticul serologic poate oferi unele informaţii, în context.
54. 3. 2. 1. Diagnosticul borreliozelor porneşte de la elemente clinice, epidemiologice, anumite date de
laborator şi este confirmat prin diagnostic bacteriologic.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute
(vezi anexa nr. 6), în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge dar s-ar putea recolta şi
vectori (păduchi, căpuşe) sau LCR, lichid sinovial etc, în funcţie de manifestarea clinică.
Sângele trebuie recoltat în perioadele febrile. În cazul în care produsele nu se pot examina imediat,
recomandăm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4ºC) sau inocularea unor animale
receptive (ex. şoareci albi sau şobolani tineri) şi transportul acestora către laborator.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspăt între lamă şi
lamelă utilizând sângele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond întunecat. Borreliile se văd ca
spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 m / 8-30 m), cu spire largi şi inegale, foarte
mobile (cu mişcări de rotaţie şi răsucire), pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri subţiri sau
examenul picăturii groase, colorate Giemsa prelungit, May-Grünwald-Giemsa sau Wright precum şi cu
acridin-orange sau cu Ac monoclonali marcaţi fluorescent şi cu examinare la microscopul cu fluorescenţă.
Pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre
hematii. Examenul microscopic realizat de către un medic experimentat permite identificarea borreliilor în
circa 70% dintre cazuri, în condiţiile respectării normelor diagnosticului bacteriologic.

Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor infectaţi (păduche,

căpuşă). De menţionat faptul că în cazul acestui p.p. borreliile îşi menţin pentru o lungă durată de timp
forma şi mobilitatea caracteristice în timp ce în sângele recoltat de la gazda umană suferă modificări
datorită prezenţei anticorpilor specifici, iar în timp îşi pierd mobilitatea).

În ultima perioadă s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind de la
produsul patologic.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează de regulă la nivelul centrului de

referinţă, existând mai multe tehnici care ar putea fi utilizate.

Se pot inocula animale de experienţă sensibile (ex. şoareci sau şobolani), cu inoculare intraperitoneală.
Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic şi prin examinarea microscopică a sângelui (p.p. se poate recolta
de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (păduchi sau căpuşe) sau oul de găină embrionat (la
nivel intra alantoidian sau în membrana chorioalantoidiană).

Se pot utiliza şi medii de cultură artificiale speciale (cu agenţi reducători, N-acetilglucozamină, acizi graşi
nesaturaţi cu catenă lungă, ser de iepure), în condiţii de microaerofilie, cu incubare la 32-37ºC. Se
recomandă şi utilizarea mediilor selective care includ o combinaţie de agenţi antimicrobieni precum
rifampicină, amfotericină B şi fosfomicină. Datorită faptului că mediile de cultură sunt lichide, nu se obţin
colonii izolate. Creşterea microbiană trebuie verificată prin realizare de preparate proaspete examinate la
microscopul cu fond întunecat la fiecare 3 zile, pentru o durată de 2-6 săptămâni.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza:

        
Caracterelor morfotinctoriale
sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 m / 8-30 m), cu spire largi şi
inegale, foarte mobile (cu mişcări de rotaţie şi răsucire), pe fondul negru al preparatului;
pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate;

        
Caracterelor de cultură
-         
dacă are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultură acesta rămâne limpede, fără sediment, dar îşi
modifică culoarea (ex. virează de la roşu-portocaliu spre roz-gălbui)

        
Caracterelor biochimice
-         
Borreliile sunt microaerofile, fermentează glucoza producând bioxid de carbon şi acid lactic (dar aceste
teste nu sunt utilizate de regulă în diagnostic);
        
Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă
-         
tehnici ale biologiei moleculare (PCR).
5. Nu a fost pusă la punct o metodă pentru realizarea antibiogramei (verificarea sensibilităţii la antibiotice
şi chimioterapice). Febra recurentă se tratează cu tetraciclină, cloramfenicol, penicilină sau eritromicină. În
urma tratamentului poate apărea sindromul Jarisch-Herxheimer (frison sever, creşterea temperaturii,
hipotensiune, leucopenie).

54. 3. 2. 2. Diagnosticul serologic nu a fost considerat ca fiind foarte util, datorită variaţiilor antigenice

(care au loc inclusiv pe parcursul bolii) şi complexităţii fenomenului de recurenţă.
În ser pot fi decelaţi anticorpi aglutinanţi, imobilizanţi şi fixatori de complement. Sunt foarte puţine
laboratoare care practică aceste reacţii, de obicei în scop de cercetare. La pacienţii cu febră recurentă
epidemică (purtători de păduchi) pot apărea aglutinine faţă de Proteus OXK şi o reacţie VDRL fals-pozitivă.
În momentul de faţă se recomandă utilizarea unor tehnici de tip ELISA sau reacţia de imunofluorescenţă.
Dacă aceste reacţii sunt negative, rezultatul este considerat negativ. Dacă reacţiile sunt pozitive sau
„indeterminate”, confirmarea se face prin Western Blot.
54. 3. 2. 3. Se poate înregistra o leucocitoză de până la 25.000 PMN / mm 3 şi o creştere importantă a
VSH-ului (de până la 110 mm / oră).

54. 4. Borrelia burgdorferi (Boala Lyme)

Boala a fost denumită astfel după numele oraşului unde au fost identificate iniţial câteva cazuri. Este
determinată de spirocheta B. burdogferi care se transmite la om prin muşcătura unei mici căpuşe din
genul Ixodes. Rezervorul animal principal este reprezentat de şoareci şi cerbi, dar pot fi infectate şi alte
animale precum şi păsări. Cele mai frecvente expuneri apar vara, atunci când căpuşele sunt foarte
frecvente.

Numărul de cazuri de infecţie cu Borrelia burgdorferi a fost în scădere în SUA, în 1996 raportându-se
16.455 cazuri (cu o incidenţă de 6,210/0000) şi în 1997 12.801 cazuri, incidenţa ajungând la 4,79 0/0000. În 1998
şi 1999 au fost raportate anual peste 16.000 de cazuri de boală Lyme. În ţara noastră este în curs
de organizare un sistem de supraveghere, raportare şi control a cazurilor de borrelioză Lyme.
Răspunsul imun este foarte complex şi neelucidat în totalitate, însă reacţiile autoimune se pare că joacă un
rol important. Structura genetică a gazdei, pare a influenţa reactivitatea particulară ce apare în cursul
bolii Lyme.

Din punct de vedere clinic boala are manifestări precoce şi manifestări tardive. Faza precoce este frecvent
marcată de o leziune epitelială unică numită erithema cronicum migrans, la început este o leziune plată
eritematoasă în jurul muşcăturii căpuşei, care se extinde lent şi se clarifică în zona centrală. În asociere cu
leziunea tegumentară apare frecvent stare patologică asemănătoare gripei, cu febră, frisoane, mialgii şi
cefalee.
Cele mai frecvente manifestări clinice tardive (apărute după săptămâni sau luni de la momentul infectant)
sunt reprezentate de: 1) artralgii şi artrite ce se pot manifesta intermitent ani de zile; 2) manifestări
neurologice: meningită, paralizie de nerv facial, radiculopatie dureroasă; 3) afectare cardiacă cu tulburări
de conducere şi miopericardită. Spirochetele au fost izolate din toate aceste zone ale corpului, fiind
probabil ca aceste manifestări să fie datorate unui mecanism de hipersensibilitate cu depozitare de
complexe antigen-anticorp.
Din punct de vedere al diagnosticului de laborator, în vederea unui diagnostic bacteriologic (direct),
microorganismul a putut fi izolat din sânge, LCR şi din leziunile tegumentare, însă obţinerea culturii
reprezintă apanajul unor laboratoare specializate. Examinarea la microscopul cu fond întunecat după 3-5
zile de incubare la 32ºC poate fi utilă.

Diagnosticul este sugerat de istoricul bolii (înţepătură de căpuşă) în zonele endemice şi se bazează pe
evidenţierea anticorpilor serici de tip IgM care apar şi se menţin circa 3-6 săptămâni de la instalarea bolii.

În primele 2 săptămâni care urmează contaminării, serologia este negativă. În primul stadiu de boală,
serologia devine slab pozitivă, astfel încât un rezultat negativ, nu exclude diagnosticul.

Tehnicile serologice includ imunofluorescenţa indirectă, ELISA, hemaglutinarea pasivă, etc. De menţionat
posibilitatea apariţiei unei serologii fals-pozitive datorită unor reacţii imune încrucişate cu alte infecţii
spirochetale (sifilis, leptospiroză, febră recurentă), diferite infecţii virale (varicelă, mononucleoză
infecţioasă) sau în cazul unor maladii autoimune (lupus eritematos diseminat, artrită reumatoidă).
Tratamentul cu tetraciclină ameliorează simptomele precoce şi ajută la vindecarea leziunilor tegumentare.
Tetraciclinele pot fi mai eficace decât penicilinele în prevenirea manifestărilor tardive. Artrita răspunde
frecvent la doze mari de penicilină. În cazurile refractare, ceftriaxona s-a dovedit eficace.

55. Genul Leptospira

55. 1. Definiţie. Încadrare
Agentul etiologic al leptospirozei face parte din familia Spirochaetaceae, genul Leptospira. Se cunosc mai
bine speciile L. interrogans şi L. biflexa, denumirea derivând din forma particulară a extremităţilor celulei
bacteriene. Genul include peste 200 de serotipuri (numite serovaruri, de alţi autori). Din specia L.
interrogans fac parte 170 serotipuri patogene (complexul interrogans) care pot determina boala la animale
şi om, varietatea acestor serotipuri determinând şi numeroasele forme de manifestare a leptospirozei.
Specia L. biflexa reuneşte peste 50 de serotipuri saprofite.

Prima a fost descoperită specia saprofită (numită iniţial Spirocheta biflexa, 1914), ulterior una dintre
speciile patogene (Spirocheta icterohaemorrhagiae, 1915, în Japonia).

55. 2. Caractere generale

55. 2. 1. Habitat
Rezervorul principal de leptospire patogene este reprezentat de şobolan, şoarece şi de unele animale
domestice bolnave sau aparent sănătoase, în primul rând porcul. Leptospirele patogene persistă timp
nelimitat în organismul animalelor infectate. În mod frecvent animalele domestice se contaminează intre
ele, dar transmiterea se poate realiza şi de la şobolan, şoarece sau de la animale sălbatice.
55. 2. 2. Caractere morotinctoriale
În preparatul proaspăt examinat la microscopul cu câmpul întunecat, leptospirele apar ca filamente
regulat spiralate, cu diametrul mediu între 0,1 şi 0,15 µm şi lungimea medie între 5 şi 15 µm, luminiscente,
foarte mobile, descriind mişcări de burghiu imprimate de dispoziţia particulară a flagelilor.

Pe frotiul fixat, impregnat şi colorat prin tehnica Fontana-Tribondeau (impregnare argentică), examinat la
microscopul obişnuit, leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu extremităţile fin îngroşate sub
formă de „buton”, de culoare maro.

55. 2. 3. Caractere de cultură

Leptospirele utilizează ca sursă de carbon acizii graşi şi alcoolii graşi cu lanţuri lungi. Mediile de cultură,
atât cele clasice (mediul Korthof) cât şi mediile mai noi care conţin acizi graşi, vitamine din grupul B şi
fracţiunea 5 a albuminei bovine, necesită îmbogăţirea cu ser normal de iepure. Utilizează amoniacul ca
sursă de azot.

Deoarece sunt uşor microaerofile, leptospirele necesită medii de cultură lichide şi recipiente înguste
pentru cultivare. În condiţiile amintite leptospirele ating un nivel optim de dezvoltare în 7-10 zile.

55. 2. 4. Caractere biochimice

Leptospirele dispun de un bogat echipament enzimatic (hialuronidază, fosfolipază, oxidază, catalază).
Speciile patogene au o slabă activitate ureazică. Serul de iepure este strict necesar pentru multiplicarea
acestor microorganisme.

Sunt microorganisme aerobe sau microaerofile.

55. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori chimici şi fizici

În condiţii obişnuite leptospirele patogene supravieţuiesc greu în mediul exterior. Nu suportă uscăciunea,
lumina solară, temperatura sub 14C şi cea peste 28C, pH-ul acid şi intens alcalin.

Din cauza rezistenţei scăzute a leptospirelor patogene în mediul exterior, îmbolnăvirea omului prin
intermediul apelor de suprafaţă (mai ales a celor stătătoare) sau a solului contaminat este explicată printr-
o continuă alimentare cu leptospire dintr-o sursă stabilă (de exemplu numărul mare de animale
purtătoare de leptospire prin lipsa deratizării).

Leptospirele patogene sunt distruse de alcoolul alb, acizi, alcali, cloramină. Dintre antibiotice, beta-
lactaminele injectabile (mai ales penicilina) au efect bactericid.

55. 2. 6. Structură antigenică

Antigenele cunoscute sunt antigenul somatic specific de gen şi antigenele de suprafaţă specifice de grup
şi tip.

Antigenul somatic comun leptospirelor patogene şi saprofite este situat în profunzimea învelişului

bacterian, iar din punct de vedere chimic este un complex lipo-polizaharido-polipeptidic (structura nu este
încă elucidată, complet).
Antigenele de suprafaţă sunt reprezentate din punct de vedere chimic de un complex polizaharido-
polipeptidic. Serogrupurile se deosebesc prin compoziţia în monozaharide şi aminoacizi şi prin diferenţe
de ordin secvenţial. Antigenele de suprafaţă sunt imunogene in vivo. Anticorpii apăruţi în cursul bolii
conferă protecţie de grup şi tip pentru o perioadă variabilă (de ordinul anilor).

55. 2. 7. Răspuns imun

Antigenele de suprafaţă sunt imunogene in vivo. Anticorpii rezultaţi din trecerea prin boală pot conferi
protecţie pentru o perioadă variabilă, de ordinul anilor. Imunitatea postinfecţie este specifică serotipului
tulpinii infectante, respectiv tulpinii vaccinale. În cursul infecţiei apar anticorpi aglutinanţi, fixatori de
complement şi litici, care sunt evidenţiaţi în ser începând cu zilele 4-6 de la debutul bolii, ating nivelul
maxim între săptămânile 3-6 de boală şi scad apoi progresiv.

55. 2. 8. Caractere de patogenitate

Sunt proprii speciei L. interrogans, care este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Virulenţa este
explicată până în prezent prin mobilitate, gradul de încovoiere a extremităţilor celulei bacteriene şi prin
prezenţa factorului de virulenţă Vi existent la suprafaţa unor tulpini. Cu cât extremităţile celulei bacteriene
sunt mai curbate, cu atât puterea de penetrare a ţesuturilor de către leptospire este mai mare.

55. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Leptospiroza se caracterizează prin polimorfism, pe parcursul evoluţiei modificându-şi aspectul clinic (se
asociază noi sindroame sau apar atipii clinice).

După o perioadă de incubaţie de 1-2 săptămâni, debutul bolii poate fi marcat de febră. Microorganismul
circulă pe calea torentului sanguin şi se cantonează în organele parenchimatoase (ficat şi rinichi),
determinând hemoragii, necroză tisulară şi disfuncţii de organ (pot apărea icter, hemoragii, manifestări
datorită retenţiei azotate etc). Boala are destul de frecvent un aspect bifazic: după o ameliorare iniţială
urmează faza a doua a bolii, marcată de creşterea titrului de anticorpi IgM. Leptospiroza se poate
manifesta ca meningită „aseptică” (cu lichid clar, asemănător macroscopic cu LCR recoltat de la pacienţii
cu meningită virală).

Afectarea renală la multe specii de animale este cronică, având drept efect eliminarea unui număr de
leptospire prin urină; acesta reprezintă probabil principalul mod de contaminare la om. Urina umană
poate conţine spirochete în a doua şi a treia săptămână de boală.

Deşi din leptospire nu a fost izolat un factor toxic bine diferenţiat toxicitatea care conduce la apariţia
principalelor manifestări este determinată de eliberarea unei endotoxine. Intervenţia endotoxinei explică
modificările tisulare macro şi microscopice de tip toxic degenerativ; eficienţa mai scăzută a terapiei cu
antibiotice după 7-12 zile de la debutul bolii; producerea şocului endotoxic (datorită lizei masive a
leptospirelor), febra cu valori de peste 38,5ºC cu aspect bi şi uneori trifazic (relativ caracteristică pentru
leptospiroză) sau instalarea hipersensibilităţii celulare de tip IV în leptospiroza acută.
55. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de
Leptospira
Diagnosticul porneşte de la elemente clinice şi epidemiologice. Diagnosticul de laborator în leptospiroză
poate fi bacteriologic şi / sau serologic.
55. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectând etapele cunoscute şi este cel
mai frecvent realizat la nivelul centrului de referinţă; este laborios şi costisitor.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute
(vezi anexa nr. 6), în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de sânge sau LCR (în primele 7-10 zile), urină
(după 9 zile de la debut până la 2-8 săptămâni de boală), dar s-ar putea recolta şi lichid peritoneal, pleural
etc. Datorită fragilităţii leptospirelor şi fenomenului de autoliză, transportul trebuie să fie realizat rapid, în
maxim 1-3 ore, la temperatura camerei.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspăt (fără a folosi
însă lamela). Preparatul se examinează la microscopul cu fond întunecat. Există o serie de proceduri
utilizate pentru pregătirea preparatului. În cazul lichidului peritoneal, LCR etc., produsul de centrifughează
la 1.500g pentru o durată de 30 minute, utilizându-se sedimentul obţinut. În cazul sângelui, recoltarea se
face pe anticoagulant (dar nu cu citrat), urmând o primă centrifugare la 500g pentru o durată de 5
minute. Preluăm supernatantul pe care îl centrifugăm la 1.500g pentru o durată de 30 minute şi utilizăm
sedimentul obţinut. În aceste condiţii, un medic microbiolog cu experienţă ar putea stabili diagnosticul
prezumtiv. Leptospirele apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu mişcări de înşurubare şi
flexiune, dar şi cu o uşoară deplasare în spaţiu, pe fondul negru al preparatului.

Unii autori recomandă realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentică
(Fontana-Tribondeau), mai ales pentru preparatele histo-patologice; leptospirele apar ca filamente regulat
spiralate cu extremităţile fin îngroşate sub formă de „buton”, de culoare maro. A fost recomandată şi
colorarea imunofluorescentă (IF directă) în cazul suspicionării diagnosticului de leptospiroză. În ultima
perioadă, pornind de la p.p. (ser, urină, LCR etc) au fost puse la punct tehnici PCR.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează dificil, cu costuri ridicate, datorită
sensibilităţii în mediul extern şi particularităţilor de multiplicare a leptospirelor. De regulă cultivarea se
face la nivelul centrului de referinţă; utilizând medii de cultură lichide nu obţinem colonii izolate.

Există şi posibilitatea inoculării p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal. Starea clinică
trebuie monitorizată zilnic. Identificarea infecţiei se poate face prin diagnostic serologic, prin izolarea
leptospirelor (hemocultură) sau anatomopatologic şi bacteriologic după decesul sau sacrificarea
animalului respectiv.

În cazul utilizării mediilor de cultură este recomandat ca toate p.p. să fie însămânţate atât pe medii de
cultură selective cât şi neselective. Mediul de cultură cel mai cunoscut este mediul Korthof (cu acizi şi
alcooli graşi, care conţine şi ser de iepure), pregătind în acest scop mai multe tuburi în care însămânţăm
cantităţi progresive de p.p. (ex. pornim de la o picătură, continuăm cu 2 picături etc). Mediile selective
includ neomicină şi / sau 5-fluorouracil.
Realizăm incubarea la 28ºC. Multiplicarea bacteriană nu determină o tulburare a mediului (apariţia
turbidităţii reprezintă cel mai frecvent o contaminare cu o altă bacterie). După 3 zile, respectând cu
stricteţe normele de asepsie, realizăm preparate native pe care le examinăm la microscopul cu fondul
întunecat. În cazul în care rezultatul este negativ, repetăm această examinare la interval de circa 3 zile
pentru o durată totală de minim 4 săptămâni, sau până la obţinerea unui rezultat pozitiv. În general
creşterea bacteriană are loc în 3-14 zile de la momentul însămânţării.

Costul şi durata diagnosticului cresc şi datorită faptului că, pentru identificare sunt necesare cel puţin 1-2
repicări pe un alt mediu lichid, după detectarea microscopică a unor microorganisme care ar putea fi
implicate patogenic. O alternativă (şi mai costisitoare, utilizată mai ales dacă presupunem contaminarea
culturii cu o altă bacterie) este reprezentată de inocularea intraperitoneală a culturii respective la cobai.
După 30-60 minute, având în vedere faptul că leptospirele invadează sistemul circulator mai rapid în
comparaţie cu alte bacterii, după anestezierea animalului se recoltează sânge (prin puncţie cardiacă) şi
realizăm o hemocultură.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

        
Caractere morfotinctoriale:
 realizăm un preparat proaspăt (fără a folosi lamela) din mediul de cultură şi îl examinăm la
microscopul cu fond întunecat;
 leptospirele, cu dimensiuni de 0,1 m / 5-15 m, apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte
mobile, cu mişcări de înşurubare şi flexiune, dar şi cu o uşoară deplasare în spaţiu, pe fondul negru
al preparatului;
 se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentică (Fontana-
Tribondeau) precum şi prin IF directă;

        
Caractere de cultură: leptospirele nepatogene se multiplică la 11-13ºC în timp ce L. interrogans nu se
poate multiplica la această temperatură;

        
Caractere biochimice: leptospirele nepatogene sunt rezistente la 8-azaguanină în timp ce L.
interrogans este sensibilă la această substanţă chimică;

        
Caractere antigenice:
-         
se utilizează seruri de referinţă cu anticorpi faţă de serogrupurile cunoscute şi tulpina de identificat izolată
în cultură pură şi concentrată la o densitate standard, prin reacţii de aglutinare microscopică, la nivelul
centrului de referinţă care a elaborat protocolul standard de operare; în mod similar se poate identifica şi
serovarul implicat;

        
Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:
-         
tehnici ale biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obţinute prin restricţie
endonucleazică etc).
5. Antibiograma nu se realizează (nu a fost pusă la punct o tehnică în acest scop). Este cunoscut faptul că
leptospirele sunt sensibile la penicilină, amoxicilină, tetraciclină, doxiciclină etc dar tratamentul se
stabileşte în funcţie de forma şi gravitatea bolii.

55. 4. 1. Diagnosticul serologic
Anticorpii specifici se pot evidenţia în serul pacienţilor începând cu a 4-6-a zi de la debutul bolii, atingând
un nivel maxim între săptămânile 3-6 de boală, după care scad progresiv.

Tehnica de referinţă este reprezentată de reacţia de aglutinare microscopică, realizată pe seruri pereche
(primul recoltat la 1-2 săptămâni de la debut, al doilea recoltat la 3-4 săptămâni de la debut). O creştere
de 4 ori a titrului la a doua determinare semnifică un diagnostic pozitiv. Un titru  1/800 în prezenţa
unor semne clinice de leptospiroză, este foarte sugestiv.

 Trebuie să menţionăm că pentru unii pacienţi seroconversia are loc mai tardiv. O altă problemă este
reprezentată de faptul că se utilizează leptospire vii în calitate de Ag cunoscut, motiv pentru care această
reacţie nu se poate practica decât în centrul de referinţă.

La nivelul altor unităţi sanitare se pot practica reacţii de tip ELISA, reacţia de hemaglutinare indirectă sau
reacţia de aglutinare pe lamă utilizând Ag preparate din tulpini saprofite (sensibilitatea şi specificitatea
acestor reacţii este mai scăzută). Tehnica ELISA de identificare a anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul
infecţiei acute dar nu poate permite determinarea serogrupului implicat aşa cum se reuşeşte în cazul
tehnicii de referinţă.

55. 5. Tratament
Terapia cu antibiotice include în principal medicamente din grupa penicilinelor sau a tetraciclinelor (ex.
doxiciclină). Cloramfenicolul şi rifampicina nu au efect asupra leptospirelor.

55. 6. Epidemiologie
Leptospirozele sunt, în esenţă, infecţii ale animalelor, infecţia umană apărând accidental, de ex. prin
contactul cu apa sau cu alte materiale contaminate cu excremente ale animalelor. Principalele surse de
infecţie sunt reprezentate de şobolani, şoareci, rozătoare sălbatice, porci, câini sau vaci. Acestea excretă
leptospire prin urină şi fecale atât în timpul bolii active, cât şi în timpul evoluţiei asimptomatice.
Leptospirele rămân viabile mai multe săptămâni în apele stătătoare, omul putându-se infecta prin
îmbăiere, înot, prin consumul acestor ape sau prin ingestia de mâncăruri contaminate. Persoanele cu cea
mai mare probabilitate de a intra în contact cu apa contaminată de şobolani (mineri, lucrătorii din
canalizare, fermieri, pescari) au cel mai mare risc de infecţie. Copiii se pot infecta cu leptospire de la câini,
mult mai frecvent decât adulţii.

Cazurile de leptospiroză evidenţiate în anul 1998, în România, au fost în număr de 557, incidenţa bolii fiind
de 2,50/0000. În anul 1999, numărul de cazuri a crescut la 755, incidenţa ajungând la valoarea de 3,4 0/0000 iar
în anul 2000 au fost raportate 370 de cazuri. În perioada 2001-2004, numărul de cazuri înregistrate a fost
mai mic, între 244 (2003) şi 310 (2001), însă în ultimii ani au fost raportate peste 380 de cazuri / an,
respectiv 451 cazuri în anul 2005 (incidenţă 2,090/0000) şi 386 cazuri în 2006 (incidenţă 1,790/0000).

În SUA, în 1974, au fost raportate 8.351 cazuri de leptospiroză. În perioada 1975-1994 au fost raportate
între 31 şi 110 (o singură dată, în rest numărul de cazuri a fost ≤ 100) cazuri pe an. Din 1995 leptospiroza
nu mai face parte din lista de boli cu declarare obligatorie.

55. 7. Profilaxie
Controlul leptospirozei constă în prevenirea expunerii la apa potenţial contaminată şi reducerea
contaminării prin ţinerea sub control a rozătoarelor. Doxiciclina, administrată în doză de o dată pe
săptămână în timpul expunerii, are un caracter profilactic. Câinii pot fi vaccinaţi împotriva
infecţiilor leptospirotice.

56. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus.

56. 1. Definiţie. Încadrare
Microorganismele din acest gen sunt cocobacili polimorfi (pot exista chiar şi forme filamentoase), imobili,
nesporulaţi, Gram-negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni pretenţioşi; pentru a se dezvolta au
nevoie de prezenţa factorilor de creştere prezenţi în sânge (de unde şi numele genului). Există mai multe
specii. Genul Haemophilus a fost inclus în Familia Pasteurellaceae, împreună cu genurile Actinobacillus,
Pasteurella şi alte 4 grupuri ce cuprind peste 80 de specii bacteriene. Taxonomic, genul este într-o
permanentă schimbare; unele specii sunt eliminate ori candidate la excludere, altele sunt nou identificate.
În prezent genul Haemophilus  cuprinde peste 15 specii. Dintre speciile care colonizează/infectează omul,
amintim: H. influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus, H. ducreyi, H. aphrophilus, H. parainfluenzae, H.
parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. paraphrophilus şi H. segnis; în cadrul acestui capitolul vom
prezenta două specii, H. influenzae şi H. ducreyi.

56. 2. Haemophilus influenzae

A fost considerat agentul etiologic al gripei în pandemia de gripă din anii 1890-1892 (Pfeiffer). A fost
izolat în 1892. Numele a fost stabilit în 1917, în „amintirea erorii” din 1892.
56. 2. 1. Caractere generale
56. 2. 1. 1. Habitat
Se poate găsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza şi mucoasa conjunctivală,
precum şi tractul genital la 30-70% din persoanele sănătoase. Într-un studiu recent la care au participat în
mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre
studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus, nazal şi / sau faringian dar nici un student nu a fost
purtător de H. influenzae. Am identificat un caz de portaj pentru H. parainfluenzae.
56. 2. 1. 2. Caractere morfologice
În produsul patologic germenii sunt prezenţi sub formă de cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3mm),
uneori dispuşi în lanţuri scurte. În cazul anumitor tulpini pot apărea forme filamentoase,
aberante. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20 secunde, pentru că
hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu Streptococcus pneumoniae, iar recolorarea nu se face
cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci numai cu fucsină bazică 0,1% sau cu fucsină Ziehl diluată
1/10, timp de 5 minute.
În culturi apar în funcţie de vârsta culturii şi de mediul de cultură:
- în medii bogate, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă.
- în culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (probleme de diagnostic
diferenţial microbiologic). Polimorfismul apare odată cu „îmbătrânirea” culturii şi este caracteristic
tulpinilor în curs de trecere la forma „R”.
56. 2. 1. 3. Caractere de cultură
Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2, atmosferă umedă, la 35-37ºC,
pH=7,6 incubat pentru o perioadă de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de
creştere precum (factorii X şi V). Factorul X, termostabil (rezistă 45 minute la 120°C), este protoporfirina IX
sau o protohemă cu fier, prezentă în sânge sau în derivatele sale cu hemină şi asigurată în mediile de
cultură prin adaos de 5% sânge chocolatat, de suplimente XV, Fildes sau Levinthal, care conţin aproximativ
500 mg/ml factor X şi 150 mg/ml factor V, sau prin suplimentare cu hemină. Haemophilus
influenzae necesită pentru dezvoltare 0,1-10 mg/ml factor X, iar H. ducreyi 200 mg/ml hemină. Factorul V,
termolabil (rezistă numai 15 minute la 90°C), este nicotin-amid-adenin dinucleotidul (NAD) sau NADPH
(fosfat), prezent în hematii, dar eliberat, este distrus de pirofosfatază şi NAD-ază, prezente în sângele de
om, ovine, caprine, ori bovine (enzime inactivate prin chocolatizare). Surse de factor V sunt suplimentele
XV, extractul de drojdie, de cartof sau tomate, diferite bacterii: stafilococ, Enterococcus
faecalis, Pseudomonas aeruginosa mucos, Sarcina lutea, Escherichia coli, levuri şi preparatele de NAD sau
NADPH. Necesităţile de factor V pentru H. influenzae sunt de 0,2-1 mg/ml, pentru H. parainfluenzae de 1-
5 mg/ml sau, pentru unele tulpini, de 25 mg/ml. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară
eliberarea conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V
este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt
mai numeroase în jurul unor colonii de stafilococ (fenomenul de satelitism); util în identificare.
Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24
ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. Pe geloză-chocolate, coloniile ating 1-3
mm abia după 36-48 ore, având aspectul unor picături de rouă.
56. 2. 1. 4. Caractere biochimice şi de metabolism
Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi. Necesită pentru dezvoltare factorii X şi V. Fermentează inconstant
carbohidraţii. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol-pozitive (transformă triptofanul în indol). Pe baza
unor teste biochimice specia a putut fi împărţită în 8 biotipuri. Majoritatea tulpinilor izolate de la pacienţi
se încadrează în biotipurile I-IV; majoritatea tulpinilor cu capsulă de tip b fac parte din biotipul I.
56. 2. 1. 5. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici
Rezistenţa în mediu este scăzută. Prin uscare sunt distruşi rapid. În spută pot rezista până la 48 de ore.
Sunt distruşi de dezinfectanţii obişnuiţi sau de menţinerea timp de 30 minute la 56ºC. Datorită viabilităţii
reduse, cultura trebuie repicată pe mediu proaspăt la un interval de 5-6 zile. Totuşi, în tuburi închise (cu
geloză-chocolate), cultivate din abundenţă, culturile de H. influenzae ar putea rezista până la 4-5
săptămâni, la temperatura camerei. Cele mai bune metode de conservare sunt reprezentate de a.
liofilizare şi de b. menţinerea la -70ºC (după cultivare în mediu lichid, îmbogăţit, cu 20% glicerol).
56. 2. 1. 6. Structură antigenică
Tulpinile virulente prezintă o capsulă polizaharidică ce are o compoziţie diferită, în funcţie de tipul
serologic. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei şi de imunofluorescenţă folosind
seruri specifice. Cel mai răspândit şi mai patogen este tipul b, la care antigenul este poliribozil-ribitol-
fosfat (PRP) şi prezintă înrudiri antigenice cu Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes,
Stafiloccocus epidermidis, Enteroccocus feccalis, Bacillus pumilus (majoritatea microorganismelor din flora
normală a tractului respirator nu prezintă capsulă). Totuşi, răspunsul imun faţă de structura capsulară de
tip b este slab, ineficient, în primii ani de viaţă (0-2 ani), exact în perioada în care infecţiile cu H.
influenzae au potenţialul cel mai grav.
Antigenele somatice sunt reprezentate de cel puţin două proteine: substanţa M, un antigen de suprafaţă
labil şi substanţa P, care constituie o parte însemnată a corpului bacterian.
Endotoxina (Ag 0, LOZ) se poate extrage de exemplu din culturi realizate în mediu lichid, dar natura ei
antigenică nu este foarte clară.
Tulpinile din tipul antigenic b produc bacteriocine (hemocine). Hemocinele prezintă activitate faţă de
tulpini capsulate de alte tipuri, faţă de tulpinile necapsulate, faţă de alte specii de Haemophilus şi faţă de
unele enterobacterii.
56. 2. 1. 7. Răspuns imun
La nou-născuţi şi la sugarii sub 3 luni există o stare de imunitate, anticorpii provenind de la mamă. După
această vârstă, concentraţia de anticorpi scade. În SUA, Haemophilus influenzae este cea mai frecventă
cauză de meningită la copii între 5 luni şi 5 ani. Diferite studii demonstrează că la vârsta de 3-5 ani un
număr important de copii au anticorpi anti-PRP care contribuie la realizarea lizei dependentă de
complement şi stimulează fagocitoza.
Există o corelaţie (insuficient de bine precizată practic) între anticorpii bactericizi şi rezistenţa la infecţii
grave cu Haemophilus influenzae.
56. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate
Haemophilus influenzae este un microorganism condiţionat patogen. Prezintă adezine de suprafaţă
(filamentoase). Endoxina are un rol redus în patogenitate. Rolul antigenelor somatice urmează să fie
clarificat.
Rolul esenţial îl are capsula, iar din cele şase tipuri, tipul b apare în circa 90% din cazurile severe de infecţie
cu Haemophilus influenzae.
H. influenzae mai produce IgA protează şi 2 proteine pentru achiziţia de fier.
Tulpinile necapsulate se pare că îşi exercită virulenţa datorită structurii peptidoglicanului (cu acţiune pro-
inflamatorie), LOZ, Cu şi Zn-super oxid dismutaza.
56. 2. 2. Patogenie şi principalele boli produse
Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazie.
Microorganismul pătrunde pe cale respiratorie. Boala debutează ca o rinofaringită acută, probabil în
asociere cu o infecţie virală la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmată de epiglotită,
laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar de pneumonie, dar şi de meningită acută purulentă la copiii mici
preşcolari.
Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie locală (se poate nota faptul că Haemophilus
influenzae tip b şi pneumococul se numără printre agenţii etiologici comuni ai otitei medii bacteriene şi ai
sinuzitelor acute).
Dacă microorganismul pătrunde în torentul sanguin, pe această cale poate infecta meningele.
Ocazional infecţia cu H. influenzae poate duce la o laringotraheită obstructivă fulminantă care necesită
traheotomie sau intubare promptă a copilului respectiv.
56. 2. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Haemophilus
influenzae
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este bacteriologic, direct.
În vederea discutării examenului de laborator vom avea în vedere meningita. În meningita produsă
de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi / sau deces), de importanţă
maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator. Este de preferat realizarea unei cultivări
„la patul bolnavului”, chiar dacă pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR.
Analiza citologică şi biochimică a LCR este utilă în stabilirea etiologiei.
 Tulpinile capsulate (prezintă Ag de tip K) se pot identifica în produsul patologic (LCR sau urină, după
centrifugare) prin contraimunoelectroforeză, latex aglutinare, coaglutinare sau ELISA. Pot apărea reacţii
fals-pozitive datorită unor „înrudiri antigenice”, pentru că antigenele capsulare tip a, b, c şi f, conţin acizi
teichoici. O altă problemă tehnică este reprezentată de faptul că există şi tulpini „autoaglutinabile”.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile
produse de Haemophilus influenzae se pot recolta secreţii de la nivelul tractului respirator superior sau
inferior, secreţii din sfera ORL, lichide recoltate prin puncţie, sânge, LCR etc. În continuare vom discuta
cazul în care p.p. este reprezentat de LCR (vezi şi anexa nr. 6). Aşa cum am mai menţionat, recoltarea
LCR prin puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi)
trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar pentru pregătirea
frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi de LCR pentru examenul
citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator,
transportul trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C, refrigerarea este
contraindicată). H. influenzae ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau
faringiene etc. Din punct de vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Dacă LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial
centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, fini, capsulaţi,
dispuşi separat sau în grămezi „aranjate în aceeaşi direcţie”, uneori dispuşi în lanţuri scurte, situaţi intra
sau extraleucocitar. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia Gram,
ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă sau, recolorarea prelungită cu
fucsină (vezi şi 31.2.1.2.).
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi anexa nr. 2). Haemophilus
influenzae este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii de cultură
obişnuite. Unele tulpini de Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2. Este
necesară pentru incubare o atmosferă umedă, la 35-37°C, şi o durată de minim 24-48 de ore. Pentru
cultivare sunt necesari factori de creştere precum hemina (factor X) şi factorul V care poate fi înlocuit prin
NAD, NADP sau alte coenzime. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară eliberarea
conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V este
sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai
numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o tulpină
hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe de altă parte, atunci când produsele
însămânţate sunt potenţial contaminate, este necesară folosirea mediilor selective (ex. cu bacitracină,
vancomicină, clindamicină şi amfotericină B). Coloniile sunt de tip S sau M şi ating un diametru de 0,5-0,8
mm după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având aspectul unor picături de rouă pe geloză-
chocolate. Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în
primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3 mm), dispuşi separat sau în
grămezi, uneori dispuşi în lanţuri scurte. În medii complexe, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare,
care au şi capsulă. În culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (dificultăţi de
diagnostic diferenţial microbiologic).
Caractere de cultură: produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0,5-0,8 mm după 24 de
ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având pe geloză-chocolate aspectul unor picături de rouă. Necesită
prezenţa în mediul de cultură a factorilor de creştere (X şi V). Factorul V este sintetizat şi de stafilococul
auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni
mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus
aureus (fenomenul de satelitism). Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde,
convexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză.
Caractere biochimice:
Testul porfirinei este util pentru a demonstra necesităţile de factor X.
Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transformă triptofanul în indol).
Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. Pe baza unor teste biochimice (ex. indol, urează, ornitin
decarboxilază) specia a putut fi împărţită în opt biotipuri.
Utilizând galeriaAPI NH(manuală) putem identifica specii
de Neisseria, Haemophilus şi Branhamella catarrhalis,  în numai 4 ore.
Caractere antigenice:
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus influenzae, prin
tehnici imunologice, în funcţie de Ag K. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei,
imunofluorescenţă, aglutinare, latex-aglutinare şi coaglutinare.
Tiparea LOZ poate fi realizată prin Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în gel. Au fost
caracterizate 5 serotipuri de H. influenzae.
Prin aceleaşi tehnici (Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în gel), tipul b capsular poate
fi subtipat (11 subtipuri).
Tulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) sauprin
tipizarea antigenelor OMP (electroforeză în gel de poliacrilamidă; această metodă poate fi utilizată şi
pentru subtiparea tulpinilor cu capsulă de tip b).
Alte teste: există sonde nucleotidice şi amorse (pentru PCR) produse comercial pentru identificarea H.
influenzae (atât din cultură cât şi din produse patologice).
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Este recomandată
utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot utiliza şi truse automate
pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire şi interpretare după 18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire şi
interpretare după 4-5 ore incubare). Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară şi se realizează prin
metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 7).
Identificarea răspunsului imun faţă de Haemophilus influenzae
Identificarea prezenţei de anticorpi faţă de H. influenzae ar putea fi utilă pentru verificarea răspunsului
imun în urma vaccinării. În acest scop au fost utilizate RIA şi ELISA.
56. 2. 4. Tratament
Deoarece se estimează că mortalitatea datorită meningitei cu Haemophilus influenzae, în lipsa
tratamentului, poate fi de până la 90%, la copii, punerea diagnosticului şi instituirea tratamentului corect
reprezintă un deziderat major. Diagnosticul prompt şi tratamentul antimicrobian sunt esenţiale şi pentru
scăderea implicării ulterioare neurologice şi intelectuale. Multe din tulpini sunt încă sensibile la ampicilină
(circa 25% produc β lactamaze sub control plasmidic). Pentru infecţiile grave, până la obţinerea
rezultatelor antibiogramei se poate administra ceftriaxonă.
56. 2. 5. Epidemiologie. Prevenire. Control
Haemophilus influenzae tip b se transmite pe cale aeriană, interuman.
Deoarece vaccinurile polizaharidice care conţin şi polimeri aparţinând peretelui celular, sunt slab
imunogenice la copiii sub 2 ani, s-a realizat un vaccin la care polizaharidul este cuplat cu anatoxina
difterică. Acest vaccin conjugat se administrează la copiii în vârstă de peste 18 luni. La minimum 2 luni
după prima doză se poate administra a doua doză (între 18 şi 23 de luni).
Deoarece vaccinul nu împiedică portajul, în situaţii epidemiologice se pot administra antibiotice în scop
profilactic (ex. rifampicină 20 mg/kg-corp, timp de patru zile).
În România nu se raportează (s-au nu s-au raportat) infecţiile invazive meningeale, produse de H.
influenzae. Se raportează în schimb pneumoniile la care agentul etiologic este acest microorganism. Dacă
în 1998 au fost raportate 425 cazuri iar în 2003 au fost raportate 307 cazuri, cel mai mare număr de cazuri
s-a înregistrat în 2004 (969 cazuri, cu o incidenţă de 4,5 0/0000). În anul 2005 au fost înregistrate 263 cazuri
iar în anul 2006, 313 cazuri (incidenţa fiind 1,5 0/0000). Subiectul „diagnosticul de laborator în infecţii cu H.
influenzae” a fost de asemenea tratat în cursul de pregătire pe care dr. M. Popa l-a coordonat în 2004
(proiectul Phare, aprobat pentru România în anul 2000); din păcate, rezultatele nu sunt, încă, remarcate.
Chiar şi după introducerea recomandării vaccinării anti - H. influenzae la copii, în SUA au fost înregistrate
infecţii invazive cu acest microorganism. Incidenţa acestor manifestări a atins în 1996 cifra de 0,45 0/0000, cu
1.170 cazuri raportate, în 1998 s-au înregistrat 1.194 cazuri (incidenţă 0,44 0/0000) iar în 1999, 1.309 cazuri
(incidenţă 0,480/0000). În următorii ani, incidenţa s-a situat în jurul valorii de 0,70 0/0000 (0,7 în 2003; 0,72 în
2004 şi respectiv 0,78 în 2005, cu 2.304 cazuri raportate la nivel naţional). Autorităţile de sănătate publică
americane supraveghează în mod special meningitele cu H. influenzae la copiii cu vârsta mai mică de 5
ani, situaţie pentru care sunt raportate şi serotipurile mai frecvent identificate (serotipul b este identificat
într-un procent mai mic decât alte serotipuri; au existat şi tulpini „ne-tipabile”, în 2005).

56. 3. Haemophilus ducreyi

Haemophilus ducreyi  este agentul patogen al şancrului moale, maladie veneriană umană, identificată
pentru prima dată în anul 1889, de către Ducrey. A fost izolat în anul 1900. Cu toate că studiile genetice
arată că ar aparţine unui alt grup (1985-1991), deocamdată nu a fost propusă re-clasificarea acestei specii.
În SUA au fost raportate 386 de cazuri (incidenţă 0,15 0/0000) în 1996, respectiv 189 cazuri în 1998 (0,070/0000)
şi 143 cazuri în 1999 (0,060/0000). În următorii ani, numărul de cazuri raportate a fluctuat, dar nu a mai
depăşit niciodată o valoare mai mare de 80 cazuri / an (78 cazuri raportate în 2000, 38 în 2001, 67 în 2002,
54 în 2003, 30 în 2004 şi respectiv 17 cazuri raportate în anul 2005).
România nu a raportat cazuri de infecţie cu H. ducreyi (la nivel naţional); însă acest lucru nu înseamnă că
astfel de cazuri nu ar exista.
56. 3. 1. Habitat
Este strict patogen pentru specia umană; se poate izola uneori din leziunile bolnavului. Se dezvoltă intra-
şi extracelular (mai frecvent).
56. 3. 2. Caractere morfologice
Bacil scurt (sau cocobacil), dispus în perechi sau lanţuri paralele, Gram-negativ. Se colorează
bipolar. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20 secunde, pentru că
hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu bacterii Gram-pozitive, iar recolorarea nu se face cu
safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci cu fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 20-30 minute. Frotiul
colorat poate depista H. ducreyi în 40-70% dintre cazurile însoţite de secreţii şancroide [cocobacili, intra-
şi extraleucocitari, coloraţi bipolar, dispuşi în lanţuri scurte sau medii, aspect asemănat de unii autori cu
„lanţurile de bicicletă” ].
56. 3. 3. Caractere de cultură
Necesită pentru cultivare factorul X. Creşte optim dacă produsul patologic este recoltat de la baza
şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3 mg/ml la 33-35ºC şi atmosferă de 10% CO 2.
Coloniile sunt de dimensiuni mici şi apar după 3-7 zile de la cultivare.
56. 3. 4. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici.
Sensibil la acţiunea căldurii, uscăciunii şi dezinfectanţilor obişnuiţi. Sensibil la ampicilină, ceftriaxonă,
cloramfenicol, rifampicină, biseptol, eritromicină, azitromicină, claritromicină. Poate deveni rezistent.
56. 3. 5. Structură antigenică
Toate tulpinile sunt identice şi posedă un antigen cu capacitate sensibilizantă, precum şi antigenul O.
Prezintă receptori pentru hemoglobină.
56. 3. 6. Patogenitate
Caracterele de patogenitate includ: pilii, LOZ, toxina citotoxică, OMP care leagă hemoglobina, hemolizina,
Cu-Zn superoxid dismutaza şi o proteină filamentoasă asemănătoare hemaglutininei.
La om, după câteva zile (în medie 5-7 zile) de la contactul sexual infectant, în regiunea genitală apare
şancrul moale (iniţial se formează o papulă sensibilă, cu eritem în jur, urmată de apariţia unei pustule şi
apoi a unei eroziuni care ulcerează), dureros, cu eritem şi edem. Pot exista şancre multiple. Sângerează
uşor dacă este manipulat. Ganglionii regionali sunt măriţi, dureroşi şi pot supura. Nu sunt depăşite
limfaticele învecinate. Diagnosticul diferenţial trebuie făcut cu sifilisul, infecţia cu virusul Herpes simplex,
limfogranulomatoza veneriană.
56. 3. 7. Diagnostic de laborator
56. 3. 7. 1. Diagnosticul de laborator este în special microbiologic (bacteriologic, direct).
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile
produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreţii de la nivel genital (raclarea secreţiei de sub
marginea şancrului; puroi din abces).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv
Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în
perechi sau lanţuri paralele (în şiruri), frecvent în asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Cultivarea H.
ducreyi este dificilă. Necesită pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta dacă produsul patologic este
recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3 mg/ml la 33°C în
atmosferă de 7-10% CO2, timp de 3-7 zile.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în perechi sau
lanţuri paralele. Se pot colora bipolar.
Caractere de cultură: produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, după 3-7 zile de la cultivare. Pe geloză-
sânge pot produce hemoliză.
Caractere biochimice:
Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorului de creştere (X);
Haemophilus ducreyi este catalază-negativ.
-          Caractere antigenice:
-          Tiparea antigenelor OMP permit clasificarea în 7 subtipuri;
-          Pot fi utilizate în cadrul reacţiei de imunofluorescenţă indirectă.
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) este necesară şi poate realiza (cu dificultate) prin metode difuzimetrice.
56. 3. 7. 2. Diagnosticul de laborator imunologic
Şancrul moale este singura afecţiune produsă de microorganisme din genul Haemophilus în
care diagnosticul serologic ar putea fi util. Identificare prezenţei anticorpilor este utilă şi în scop
epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor IgG sau IgM care apar
faţă de H. ducreyi.
Este încă în discuţie utilitatea IDR cu Ag extrase din cultură de bacili Ducreyi.
56. 3. 8. Imunitate
Există răspuns imun umoral şi celular dar nu există imunitate faţă de reinfecţie.
56. 3. 9. Tratament
În şancrul moale se poate utiliza biseptol sau eritromicină pentru o perioadă de 2 săptămâni.

57. Genul Bordetella. Bordetella pertussis (MI Popa)

57. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram-negativi asemănători celor din genul Haemophilus, strict
aerobi. Specia tip este reprezentată de B. pertussis agentul etiologic al tusei convulsive izolată în 1906 de
Bordet şi Gengou; alte exemple sunt reprezentate de Bordetella parapertussis şi  Bordetella
bronchiseptica. În afară de aceste trei specii (foarte înrudite din punct de vedere genetic) mai sunt
cunoscute încă alte cinci.

57. 2. Caractere generale

57. 2. 1. Habitat
Bordetelele se pot localiza la nivelul cililor epiteliului respirator; nu au capacitatea de a invada. Reprezintă
microorganisme care infectează organismul uman, uneori şi animale cu sânge cald.
57. 2. 2. Caractere morfologice
Bordetella pertussis este un cocobacil Gram-negativ, cu dimensiunea de 0,5 μm / 0,5-2 μm, imobil. Atunci
când este recent izolat prezintă capsulă. În primele ore de cultivare prezintă pili ataşaţi de peretele
bacterian. După 24 ore, pilii se pot identifica în mediul de cultură. Prin treceri succesive microorganismul
devine polimorf, lipsit de capsulă şi pili. De regulă celulele bacteriene apar izolate sau în pereche, foarte
rar în lanţuri. Dacă se practică o colorare cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule
metacromatice situate bipolar.
57. 2. 3. Caractere de cultură
B. pertussis este unul din germenii care se cultivă şi se izolează dificil. Fiind inhibat de acizi graşi, peroxizi
organici etc, nu se dezvoltă pe mediile uzual folosite în diagnosticul bacteriologic. Necesită pentru
cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură optimă de 35-37ºC. Cel mai cunoscut mediu de
cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv
prin adăugare de penicilină sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi
permit dezvoltarea microorganismelor. După 3-6 zile de incubare la 37ºC se pot dezvolta colonii de tip S
mici, convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de
hemoliză (faza I). În lumina transmisă oblic par ca picăturile de mercur. La izolare este necesar mediul
Bordet-Gengou, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau pe geloză
simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea modificări
morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută.
Incubarea se realizează 3-7 zile la 35-37ºC în atmosferă umedă. Ar fi de menţionat că în această etapă de
izolare diagnosticul poate fi urgentat, realizându-se identificarea microorganismului prin
imunofluorescenţă.
Aspecte genetice
Referitor la modificările antigenice care apar în cursul cultivării, s-a descris la Bordetella pertussis variaţia
de fază.
Faza I se întâlneşte la tulpinile izolate din produse patologice cultivate pe medii îmbogăţite. Sunt tulpini în
formă de S, virulente, capsulate cu mare capacitate imunogenă. Vaccinurile se prepară folosind culturi în
faza I. Fazele II şi III sunt intermediare.
Faza IV se întâlneşte la tulpini care se pot multiplica pe medii obişnuite. Au aspectul caracteristic formelor
R. Sunt degradate antigenic, nu produc toxină şi nu prezintă nici alţi factori de patogenitate.
57. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt germeni strict aerobi, cu temperatură optimă de dezvoltare 35-37ºC, nu necesită prezenţa factorilor
X sau V, metabolizează oxidativ o serie de aminoacizi (ex. acidul glutamic) etc. Tulpinile virulente produc
hemoliză.
57. 2. 5. Acţiunea factorilor fizici, chimici
În afara organismului Bordetella pertussis are o rezistenţă scăzută. Rezistă maximum 2 ore la temperatura
camerei. Lumina solară o distruge în 60 de minute, iar la 55ºC este distrusă în 30 de minute.
57. 2. 6. Structură antigenică
Structura antigenică este foarte complexă, bacteria prezentând spre exemplu:
- 1 hemaglutinină fimbrială (de natură proteică, cu structură filamentoasă, FHA);
- aglutinogene de suprafaţă (K), de natură proteică. Există aglutinogene specifice de gen şi de specie.
Datorită implicaţiilor epidemiologice, ar fi de menţionat că microorganismul are capacitatea de a-şi
modifica serotipul in vitro;
- la nivelul peretelui celular există lipopolizaharidul (endotoxina), antigen comun germenilor Gram-
negativi.
În afară de aceste antigene mai există şi o serie de substanţe active cu rol important în patogenia bolii şi
care ar putea fi grupate astfel:
- toxina pertussis (TP), factor major de virulenţă, dar şi cel mai important antigen şi imunogen. Este o
exotoxină formată din 2 subunităţi (A şi B);
- adenilatciclaza;
- toxina letală (dermonecrotică);
- citotoxina traheală.
57. 2. 7. Răspuns imun
După infecţie apar titruri înalte de anticorpi anti-TP şi anti-FHA. Titrul anticorpilor anti-TP persistă timp
îndelungat (posibil pe tot parcursul vieţii), fiind corelaţi cu imunitatea faţă de o nouă îmbolnăvire.
57. 2 .8. Caractere de patogenitate
B. pertussis este patogenă în special prin localizare, multiplicare şi toxinogeneză.
În realizarea adeziunii la epiteliul ciliat respirator, un rol important îl au:
- fimbriile;
- aglutinogenele;
- hemaglutinina filamentoasă (FHA);
- pertactinele (PRNs);
- toxina pertussis.
Bacteria se multiplică rapid, interferă cu activitatea muco-ciliară normală, produce toxine care determină
apariţia manifestărilor clinice (toxinele au fost menţionate anterior).
Endotoxina (LOZ) are, probabil, un rol în patogenitate.

57. 3. Patogenie. Principalele afecţiuni produse

Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om. Transmiterea se realizează în special pe cale aeriană
(picături Pflügge) într-un acces de tuse. Contagiozitatea este maximă în primul stadiu de boală şi la
începutul stadiului al doilea (de tuse paroxistică).
Microorganismul aderă, se multiplică rapid, interferă cu activitatea mucociliară normală, apar primele
manifestări clinice care se agravează treptat.
Substanţele toxice elaborate (şi în special TP) au următoarele acţiuni:
- după legarea subunităţii B (a TP) pe suprafaţa celulelor gazdei, are loc penetrarea subunităţii A.
Subunitatea A se leagă de proteina Gi de la nivelul membranei celulare, o inhibă şi rezultă o stimulare a
adenilatciclazei şi respectiv o creştere a sintezei de AMPc. Dintre efectele negative care se datorează
sintezei de TP putem enumera hipoglicemia, sensibilizarea la histamină, reducerea activităţii macrofagelor,
diminuarea răspunsului imun umoral (sinteza de anticorpi);
- adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leucocitelor;
- toxina letală produce necroze locale;
- citotoxina traheală produce ciliostază şi distrugerea celulelor respiratorii ciliate (favorizând, probabil,
acumularea de mucus, tusea şi apariţia infecţiilor secundare).
Boala la om se numeşte tuse convulsivă („tuse măgărească”).
După o incubaţie de 7-10 zile, încep manifestările clinice care evoluează în două faze.
În prima fază (catarală), care durează aproximativ 10 zile, microorganismul colonizează căile respiratorii
superioare, determinând manifestări necaracteristice, asemănătoare unei infecţii respiratorii obişnuite:
tuse, strănut, temperatură. În această etapă, pacientul este foarte contagios, elimină prin tuse un număr
foarte mare de microorganisme. Diagnosticul de laborator bacteriologic este posibil prin prelevări cu
tampon steril de la nivelul faringelui sau prin metoda „plăcilor tuşite”. Gravitatea şi durata bolii pot fi
reduse dacă se face tratament antimicrobian corect. În caz contrar simptomele se agravează treptat.
Faza a doua (paroxistică) este stadiul toxemic, cu accese de tuse paroxistică, accese adeseori tipice, cu
sonoritatea caracteristică. În acces, după o inspiraţie prelungită, forţată, urmează 5-10 secuse expiratorii
spasmodice, datorită contracţiei musculaturii bronşice şi glotice (de unde şi denumirea de „tuse
măgărească” dată bolii în ţara noastră sau de „cocqueleuche” în limba franceză). Adesea accesul se
termină cu vomă şi cu aspirarea vomismentelor. Pot apărea cianoză, convulsii, anxietate.
La o parte dintre pacienţi nu apar accese paroxistice tipice. La cei la care apar, pot fi până la 30 accese pe
zi, mai frecvente în timpul nopţii. Pe parcursul stadiului toxemic apare şi limfocitoza periferică
caracteristică, precum şi hipoglicemia.
Datorită obstrucţiei bronhiolelor mici cu dopuri de secreţii mucoase, precum şi datorită tusei şi inspirului
amplu, pot apărea o serie de complicaţii pulmonare. Problema eliminării secreţiilor este mai importantă la
copii deoarece stagnarea secreţiilor contribuie la instalarea hipoxiei şi dificultăţilor de nutriţie. Uneori apar
complicaţii şi la nivelul sistemului nervos central, care pot fi foarte grave (encefalita pertussis).
Faza a doua durează 2-4 săptămâni şi este urmată de convalescenţă, care durează 2-3 săptămâni.

57. 4. Diagnosticul de laborator

Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic sau imunologic.
57. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Bordetella pertussis este bacteriologic,
direct.
Diagnosticul etiologic este foarte util în primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este foarte
contagios iar evoluţia bolii poate fi influenţată pozitiv prin administrarea de antibiotice). Diagnosticul
bacteriologic poate fi realizat în timpul fazei catarale şi în prima parte a fazei paroxistice (foarte rar se mai
pot obţine rezultate, la mai mult de 4 săptămâni de la debut, în special pentru că, se administrează
antibiotice şi chimioterapice). Detectarea adenilat ciclazei (prin activitatea enzimatică) şi a toxinei pertussis
(prin efectul citotoxic sau imunoteste), în produsul patologic, eventual după îmbogăţire, sunt
promiţătoare, dar nu au intrat în practică.
O valoare a numărului de leucocite de 16-50.000 / dL sânge, cu limfocitoză absolută, vine în sprijinul
diagnosticului de tuse convulsivă.
 Identificarea B. pertussis la persoanele asimptomatice (sau cu simptome nespecifice) şi respectiv la
contacţi ar permite aplicarea unor măsuri preventive.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât
mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din
punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile
produse de Bordetella pertussis se pot recolta secreţii de la nivelul tractului respirator superior (nazal,
faringian). Vom realiza recoltarea cu ajutorul tamponului din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60
de secunde pentru a favoriza adsorbţia B. pertussis (bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau
prin aspirarea secreţiilor traheobronşice. Este descrisă (istoric) şi metoda „plăcilor tuşite” (se expune o
placă Petri cu mediul Bordet-Gengou la care s-a adăugat antibiotic, deschisă, la aproximativ în faţa gurii
bolnavului în timpul accesului de tuse).
Este recomandată prelucrarea imediat a p.p., dacă este posibil la patul bolnavului (microorganismul este
foarte puţin rezistent în mediul extern). Nu există o metodă perfectă pentru recoltarea p.p. atunci când se
suspicionează o infecţie cu B. pertussis (toate metodele au diferite limite atât din punctul de vedere al
sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct de vedere practic).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul
patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Examinăm frotiurile la
microscopul optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi
prezenţa cocobacililor Gram-negativi, dispuşi separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte. Datorită
faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia ar putea fi necesară colorarea
frotiului de rezervă printr-o altă metodă (imunofluorescenţă directă) sau recolorarea prelungită cu fucsină
sau safranină.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Bordetella
pertussis este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite;
este inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc. Izolarea B. pertussis în culturi este dificilă, dar eforturile
sunt necesare pentru a putea fi evaluată variaţia genetică (de fază) şi respectiv pentru a putea
supraveghea fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice.
Bordetella pertussis necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură optimă de
35-37˚C, cu incubare timp de 3-7 zile, în aerobioză şi atmosferă umedă. Cel mai cunoscut mediu de
cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv
prin adăugare de penicilină / meticilină sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii
graşi şi permit dezvoltarea microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou
este reprezentat de timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7 zile).
Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca mediu de transport, care include geloză
nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu 10% sânge de cal. Acest mediu poate fi utilizat pe
parcursul a 1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.
În vederea izolării primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu cărbune activat, însă prin
treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe geloză simplă.
Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice
(pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale:
Sunt cocobacili Gram-negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 μm / 0,5-2 μm, imobili, dispuşi separat sau
în perechi, rareori în lanţuri scurte, cu tendinţa de a deveni pleomorfi în urma subcultivărilor (pot apărea şi
forme filamentoase).
Utilizând coloraţii speciale, în coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenţia structurile capsulare.
Dacă frotiul se colorează cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate
bipolar.
Imunofluorescenţa directă este utilă şi pentru identificarea microorganismului după cultivare.
Caractere de cultură:
Produc colonii de tip S sau M. După 3-7 zile de incubare la 37˚C pe mediul Bordet-Gengou se pot
dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente,
înconjurate de un halou de hemoliză (faza I).
În lumina transmisă oblic coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe mediul cu cărbune activat coloniile
apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu suprafaţa perlată.
Caractere biochimice:
Bordetella pertussis este hemolitică, oxidază-pozitivă, urează-negativă.
Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili Gram-negativi (BGN) (ex. API 20 E,
API 20 NE), fiind de regulă necesare şi teste adiţionale de identificare.
Caractere antigenice:
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis, prin reacţia
de aglutinare pe lamă.
Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă:
Se poate utiliza amplificarea genetică folosind diferite amorse (primeri); tehnica PCR are o bună
specificitate şi sensibilitate dezavantajul principal fiind reprezentat de costul ridicat.
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii
tratamentului) poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de rezistenţă la antibiotice
şi se realizează prin metode difuzimetrice.
57. 4. 2. Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic este de mică importanţă pentru pacientul cu tuse convulsivă, deoarece o creştere
semnificativă a anticorpilor aglutinanţi sau precipitanţi se realizează abia din a doua sau a treia săptămână
de boală. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC, reacţiile de aglutinare, hemaglutinare şi
hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA. Diagnosticul serologic poate fi realizat în cadrul unor
studii epidemiologice, în scop de cercetare; ar putea fi, eventual, util în diagnosticul diferenţial
(retrospectiv).

57. 5. Tratament
Administrarea eritromicinei în faza catarală duce la blocarea multiplicării microorganismului, reduce
gravitatea simptomelor şi are valoare profilactică diminuând perioada în care pacientul este contagios. Se
mai pot administra rifampicină, tetraciclină, cloramfenicol, gentamicină dar nu ampicilină.
Tratamentul cu antibiotice, instituit după debutul fazei paroxistice, rareori mai poate influenţa cursul boli.
În general are drept mic beneficiu limitarea contagiozităţii pacientului respectiv.
Deosebit de important sunt tratamentul simptomatic, oxigenoterapia şi respiraţia asistată, hidratarea,
eliminarea secreţiilor, măsurile generale nespecifice, în special la nou-născuţi şi copii mici la care tusea
convulsivă rămâne o importantă problemă medicală. Eficiente sunt şi administrarea de sedative şi
aspirarea secreţiilor.

57. 6. Epidemiologie
Boala este endemică în zonele dens populate din orice parte a lumii şi adesea pot apare epidemii, în
cicluri la 3-5 ani, prin acumularea indivizilor susceptibili în populaţie.
Sursa cea mai frecventă este reprezentată de pacientul în faza catarală, infecţia răspândindu-se de obicei
pe cale aeriană. Contagiozitatea este foarte mare, 30-90% din contacţi receptivi putând face boala. Multe
cazuri apar înaintea vârstei de 5 ani, însă majoritatea cazurilor grave apar înaintea vârstei de un an. Odată
cu limitarea numărului de cazuri la copiii mici, este evident că adulţii cu boală atipică, nediagnosticată,
reprezintă populaţia cu rol major în transmitere. Boala este mai puţin periculoasă la adulţi, dar la copii rata
mortalităţii este destul de mare. Frecvenţa bolii a scăzut mult după 1930, odată cu introducerea vaccinării;
totuşi evoluţia numărului de îmbolnăviri în diferite ţări în care programele de imunizări sunt, în general,
eficiente, pun întrebări cu privire la eficacitatea vaccinului pertussis şi solicită găsirea unor soluţii.
În România, cazurile de tuse convulsivă raportate în anul 1997 au fost în număr de 263, incidenţa bolii
ajungând la valoarea de 1,20/0000. Pentru anul 1998, incidenţa bolii a scăzut la 0,40/0000, numărul de cazuri
înregistrate fiind de 97, la fel ca şi în 1999. Cel mai mare număr de cazuri în ultimii 10 ani a fost înregistrat
în anul 2000 (493 cazuri, incidenţă 2,20/0000). În perioada 2001-2006 au fost înregistrate anual între 37
(2006) şi 233 (2004) cazuri, evoluţia fiind imprevizibilă şi fără o legătură / influenţă epidemiologică
demonstrată (sau studiată).
Cu toate că vaccinarea DTP se realizează pe scară naţională în SUA, în 1997 au fost raportate 6.564 cazuri
de tuse convulsivă (incidenţă 2,460/0000), iar în 1999, 7.288 de cazuri, corespunzând la o incidenţă de
2,670/0000. În anul 2001 incidenţa tusei convulsive a fost de 2,69 0/0000, cu 7.580 cazuri raportate. În perioada
2002-2004 numărul de cazuri şi respectiv incidenţa au înregistrat valori în continuă creştere, valoarea
maximă fiind raportată în 2004 (25.827 cazuri de tuse convulsivă). În anul 2005 au fost înregistrate 25.616
cazuri, incidenţa fiind de 8,720/0000. Această evoluţie ridică semne de întrebare cu privire la raportarea
cazurilor în ţara noastră şi certifică necesitatea întăririi sistemului de supraveghere, inclusiv prin metode de
laborator.

57. 7. Prevenire. Control

Vaccinul este o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, distruşi fie cu formol, mertiolat de
sodiu etc, fie prin căldură, fie prin acţiunea combinată a agentului fizic şi chimic. Vaccinul pertussis se
administrează în mod curent combinat cu anatoxina difterică şi tetanică sub forma trivaccinului diftero-
tetano-pertussis (DTP).
Dezavantajul acestui vaccin este faptul că, pe lângă componentele care duc la protecţie, conţine şi
anumite componente care induc la reacţii adverse, uneori necontrolabile. Însă, punându-se în balanţă
beneficiile vaccinării şi respectiv dezavantajele datorită reacţiilor adverse (care apar relativ rar), este
unanim recunoscută utilitatea vaccinării. Reacţiile adverse sunt de obicei reprezentate de reacţii locale şi
febră, probabil datorită conţinutului în lipopolizaharide.
Primovaccinarea se începe la 2 luni, administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru
menţinerea imunităţii se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se
practică la 36 de luni de viaţă a copilului respectiv.
Datorită reacţiilor adverse mai sus menţionate se recomandă eliminarea componentei pertussis la nou-
născuţii cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei care au avut o reacţie adversă
semnificativă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a
unui vaccin acelular în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată, evitându-se astfel reacţiile adverse
(vaccinul acelular este deja recomandat în cadrul programului de imunizare din SUA, Japonia şi o bună
parte din ţările din UE). Componenta principală a vaccinului acelular este reprezentată de anatoxina
pertussis inactivată genetic (modificarea a 2 aminoacizi). Cu toate acestea, în ultimii ani există o serie de
discuţii privind eficacitatea acestui vaccin. Ceea ce este cert este că există o recrudescenţă a tusei
convulsive în ţări în care acoperirea vaccinală este mare (USA, Australia, Canada, Olanda etc).
Imunizarea activă a adulţilor ar putea fi eficace în stăpânirea unei epidemii izbucnite într-o colectivitate
(ex. personalul unui spital). Utilizarea eritromicinei administrate imediat după contactul cu un bolnav are
valoare profilactică. Se recomandă şi în cazul copiilor vaccinaţi, cu vârsta mai mică de 4 ani, deoarece
vaccinarea nu are o eficacitate de 100%.

58. Genul Brucella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)

58. 1. Definiţie. Încadrare
Genul Brucella cuprinde mai multe specii care infectează animalele şi se pot transmite omului de
ex. Brucella melitensis (capre, oi; 3 serogrupuri), Brucella abortus (vaci; 9 serogrupuri), Brucella suis (porci; 5
serogrupuri), Brucella canis (câini), Brucella ovis (oi), Brucella neotomae (şobolan) şi Brucella
maris (mamifere marine).
Sunt cocobacili Gram-negativi, imobili, eventual prezentând capsulă, nesporulaţi, care parazitează în
special animalele, caracteristic localizaţi intracelular, relativ inactivi metabolic. Primele trei sunt principalele
specii implicate şi în patologia umană.
Primul microorganism al genului a fost izolat în 1887 de Bruce, din piese recoltate anatomopatologic
(splină de la patru soldaţi decedaţi în insula Malta) şi a fost numit Micrococcus melitensis. Denumirile
istorice ale bolii sunt: febra ondulantă, febră de Malta, febră mediteraneană etc (o boală în care febra avea
un caracter „ondulant”, a fost descrisă ca fiind prezentă în zona litoralului Mării Mediterane, încă de pe
vremea lui Hipocrate). Zece ani mai târziu, Wright pune la punct reacţia de aglutinare pentru evidenţierea
anticorpilor anti-M. melitensis. În onoarea şi amintirea lui Sir David Bruce, în anul 1920 se stabileşte
încadrarea în genul Brucella atât pentru germenul descoperit în 1887 cât şi pentru o a doua specie, care
producea avort la capre (descrisă de Alice Evans).

58. 2. Caractere generale

58. 2. 1. Habitat
Habitatul principal al brucelelor este reprezentat de organismul infectat (în sistemul reticuloendotelial, la
nivel genital), dar germenii pot supravieţui şi în mediul înconjurător. Animalele menţionate mai sus
reprezintă gazdele cele mai frecvente, dar infecţia se poate întâlni şi la alte animale. Există o serie de
mecanisme care le asigură persistenţa, dintre care se poate aminti posibilitatea transformării în condiţii
nefavorabile în forme L („persister”).
58. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
În culturi proaspete, brucelele sunt cocobacili Gram-negativi, imobili (se poate observa o capsulă fină
utilizând tehnici speciale de colorare), nesporulaţi, izolaţi sau mai rar prezenţi în grămezi neregulate. În
produsul patologic sunt găsiţi în special intracelular. În culturi mai vechi prezintă un important grad de
polimorfism.
58. 2. 3. Caractere de cultură
Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare, la prima izolare, medii
îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, factori de creştere
etc). Dacă produsul patologic este potenţial contaminat, se recomandă utilizarea mediilor selective (cu
bacitracină, cicloheximidă, acid nalidixic, nistatină, polimixină B şi vancomicină).
Microorganismele sunt aerobe, facultativ anaerobe. Dintre cele patru specii considerate importante şi
pentru om, numai Brucella abortus necesită la prima izolare o atmosferă cu 5-10% CO2.
Creşterea este lentă, mai ales la prima cultivare, iar coloniile (de tip S) devin vizibile după 2 sau mai multe
zile. Plăcile cultivate se vor menţine la incubator un timp suficient de lung (uneori câteva săptămâni).
Pentru hemoculturi este utilizat în mod curent mediul bifazic Castaneda (hemocultura trebuie
supravegheată minimum 3-4 săptămâni). Mediul lichid este tulburat uniform (dar pot apărea depozite sau
o peliculă la suprafaţă).
Tulpinile de Brucella spp. au fost implicate de multe ori în „accidente de laborator”, motiv pentru care
manipularea produselor şi culturilor trebuie să se realizeze cu precauţie.
58. 2. 4. Caractere biochimice
Activitatea metabolică este scăzută. Utilizează carbohidraţi, dar nu produc hidrogen sau gaz în cantităţi
suficiente pentru o eventuală utilitate în clasificare. Toate brucelele produc catalază şi descompun în mod
variabil ureea. Se pot folosi o serie de aminoacizi (ex. L-alanina, L-asparagina) şi o serie de carbohidraţi
(ex. L-arabinoza, D-galactoza) pentru evaluarea metabolismului oxidativ al tulpinilor de Brucella spp.
58. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici
Brucelele sunt destul de rezistente în mediu, mai ales dacă sunt înconjurate de un strat protector (în
ţesuturile fetale infectate eliminate pot rezista săptămâni de zile; B. melitensis poate rezista 6 zile în urină,
5-6 săptămâni în praf şi 9-10 săptămâni în apă sau sol). Sunt moderat sensibile la temperatură şi aciditate.
Pasteurizarea laptelui le distruge. Sunt sensibile la majoritatea substanţelor dezinfectante, respectând
protocolul de lucru (concentraţie, timp de expunere etc. stabilit).
58. 2. 6. Structură antigenică
Brucella spp. are o structură antigenică relativ complexă.
Antiserurile de la animale imunizate cu o tulpină de tip S aglutinează cu cele patru specii principale. Au
fost propuşi doi determinanţi antigenici diferiţi, A şi M (polizaharide de suprafaţă). Aceştia sunt prezenţi în
proporţii diferite la speciile studiate. Antigenul abortus (A) este determinantul major de suprafaţă
la Brucella abortus şi Brucella suis şi determinant minor (a) la Brucella melitensis. Antigenul M predomină
la Brucella melitensis şi este determinant minor (m) la celelalte două specii.
A fost descoperit un antigen de suprafaţă L asemănător cu antigenul Vi de la Salmonella.
Tulpinile capsulate prezintă un antigen de tip K.
La nivel parietal există lipopolizaharidul (Ag O, endotoxina), care diferă de Ag O al altor germeni Gram-
negativ prin compoziţia în acizi graşi şi faptul că este strâns legat de proteine, formând împreună un
complex, ceea ce îi determină o activitate biologică distinctă.
58. 2. 7. Răspuns imun
Bruceloza acută, la fel ca şi administrarea de vaccinuri cu tulpini vii atenuate, determină atât un răspuns
imun umoral cât şi un răspuns imun celular.
În principiu, o dată cu apariţia semnelor şi simptomelor se pot detecta anticorpi, dar prezenţa lor nu
previne bacteriemia şi nici reinfecţia (care este relativ frecventă).
Imunitatea celulară are un rol critic în rezistenţa faţă de o nouă îmbolnăvire. Răspunsul imun celular este
în mod cert necesar pentru eradicarea brucelelor situate intracelular.
58. 2. 8. Caractere de patogenitate
Caracterele de patogenitate se manifestă prin capacitatea germenilor de a se multiplica şi de a invada
organismul. Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau pentru om, capabile să
determine infecţii acute, cronice dar şi infecţii inaparente. Dintre animalele de laborator, cobaiul pare să
fie animalul cel mai constant sensibil. Cronicizarea depinde de capacitatea de multiplicare în celule
fagocitare. Cele mai patogene specii sunt Brucella melitensis, urmată de Brucella suis şi de Brucella
abortus.
Nu s-au detectat exotoxine; nu s-au pus în evidenţă constituenţi antifagocitari capsulari sau ai peretelui
celular. Brucelele prezintă, însă, un grad de rezistenţă faţă de distrugerea de către PMM explicabilă prin
faptul că nu are loc stimularea metabolismului oxidativ şi este inhibată degranularea neutrofilelor, precum
şi descărcarea enzimelor din granulaţii. Supravieţuirea intracelulară pare să fie favorizată de existenţa: Cu-
Zn superoxid-dismutazei, unor proteine de şoc termic (de „tip” Gro EL, HtrA etc).
Pare să existe şi un factor de patogenitate neprecizat, produs numai in vivo, care ajută supravieţuirea
intracelulară (de ex. tulpini de Brucella abortus virulente provenite din culturi de monocite sau din
placentă bovină infectată supravieţuiesc mai bine decât aceleaşi tulpini cultivate pe medii artificiale).
Endotoxina (antigenul O, LPZ) este implicată în patogenitate.

58. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele

afecţiuni produse
Incubaţia este în medie de 2-3 săptămâni, însă uneori pot trece câteva luni între momentul infectării şi
apariţia fenomenelor clinice.
Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii, febră moderată,
transpiraţii abundente.
În perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de greu de
recunoscut clinic. Febra „ondulantă” (care creşte în cursul după amiezii şi scade în timpul nopţii) însoţită
de frisoane are mai mult o valoare istorică. În realitate, curba febrilă are un aspect variabil (poate fi
ondulantă, neregulată, renitentă şi intermitentă). Transpiraţiile abundente nocturne, cu un miros
caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezintă alte elemente care pot fi comune în cursul bolii.
S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.
Durata bolii poate fi de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând în formele cronice
la ani de zile. În formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.
Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella melitensis, urmată de infecţia cu Brucella
suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella canis.

58. 4. Diagnostic de laborator

În principiu, în realizarea diagnosticului se porneşte de la aspecte clinice şi epidemiologice, însă
diagnosticul de laborator este esenţial, reprezentând unica metodă certă („golden standard”) de
diagnostic.
Diagnosticul de laborator în bruceloză poate fi bacteriologic (direct) sau imunologic.
58. 4. 1. Diagnosticul bacteriologic include următoarele etape.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute
(vezi anexa nr. 2), în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul
patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar s-ar putea recolta şi prin puncţie ganglionară,
puncţie medulară (rata de izolare creşte), puncţie hepatică sau splenică, sau ar putea fi reprezentat de LCR,
urină, bilă, lapte, materiale necroptice etc., în funcţie de simptomatologie şi stadiul bolii. În continuare
vom discuta situaţia în care se realizează o hemocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare
rapide, de tipul BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi şi anexa nr. 6 / A.6.8.).
Tehnica PCR, utilizând un fragment de 223 perechi de baze, ar putea fi utilizată atât în bruceloza acută, cât
şi în bruceloza cronică. Este de luat în considerare la pacienţii care au primit, deja, antibiotice sau
chimioterapice.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile diagnosticului, în
special dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imunofluorescentă care uneori duce la rezultate
pozitive.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Toate speciile
au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite cu substanţe nutritive
(aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc). Se recomandă efectuarea
hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura se incubează în atmosferă de 5-
10% CO2, la 37ºC pentru o perioadă de minim 2-3 zile; culturile negative trebuie urmărite până la 4
săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom însămânţa panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a
deschide flaconul.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativicu dimensiuni de 0,5-0,6 mm/ 0,6-1,5 mm,
dispuşi izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi necesară o prelungire a
timpului de recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.
Caractere de cultură:
Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3 zile colonii de tip S, cu un diametru
de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte astfel încât la 1 săptămână de incubare diametrul poate
fi de 6-7 mm; pot fi identificate (în special după incubare prelungită) colonii de tip R sau M;
Examinate folosind o sursă de lumină la 45º, coloniile apar transparente, galben-deschis, asemănător
„picăturilor de miere” în timp ce în lumina reflectată prezintă o transparenţă cenuşiu-albăstruie.
Caractere biochimice:
Brucella spp.  după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism oxidativ;
Microorganismele sunt catalază-pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei, ureazei şi producerii de
H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este posibilă şi utilizarea
galeriilor API (ex. API 20E);
Testăm necesitatea în CO2, pentru izolare;
Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la diferiţi coloranţi incluşi de
ex. în medii de cultură (ex. tionină sau fucsină bazică).
Caractere antigenice:
Utilizăm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacţii de aglutinare pe lamă (există reacţii încrucişate);
în cazul unei reacţii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referinţă se pot realiza reacţii de aglutinare pe
lamă cu seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R în cazul coloniilor de tip R).
Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau în scop de
cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; spre exemplu fagul Tbilisi lizează tulpinile de B.
abortus, poate liza la concentraţii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizează tulpinile de B. melitensis, B.
canis sau tulpinile în formă R.
Alte teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:
-          tehnici ale biologiei moleculare (există sonde nucleotidice specifice pentru diferite biotipuri izolate
mai frecvent, de ex. 1 şi 3 aparţinând B. melitensis; s-a pus la punct şi tehnica PCR, pornind de la cultura
bacteriană).
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) se realizează prin metoda
difuzimetrică standardizată, şi este utilă atât în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la
medicamentele antimicrobiene, cât şi pentru stabilirea tratamentului corespunzător în cazul unei maladii
infecţioase în general dificil de tratat.
58. 4. 2. Diagnosticul serologic
Este de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile obţinerii diagnosticului bacteriologic pozitiv. Utilizăm
antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa anticorpilor specifici în sângele pacientului,
valoarea titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia acestui titru în dinamică. Trebuie să menţionăm că
anticorpii de tip IgM cresc în infecţia acută (în câteva săptămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau
chiar şi după tratamentul antibiotic realizat corespunzător (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar
după circa 3 săptămâni de la debutul brucelozei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în
cazul unei infecţii cronice.
În special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor practice, aglutinarea
pe lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută şi utilizată tehnică de diagnostic
serologic este reacţia de aglutinare în tuburi (Wright) prin care putem determina atât titrul anticorpilor de
tip IgM cât şi cel al anticorpilor de tip IgG.
Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care blochează activitatea
aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, există dificultăţi şi în ceea ce priveşte
interpretarea rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic.
Pentru a simplifica, considerăm că un titru ≥ 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de 4 ori în dinamică
a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.
Există o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:
diluarea suplimentară a serurilor de cercetat;
testul de blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright este negativă câte 1 picătură de ser imun anti-
Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz nu apare aglutinarea, concluzionăm că în serul
de cercetat există anticorpi blocanţi);
testul Coombs;
utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM şi IgG care apar faţă de proteinele
membranei externe etc.
Un test Wright negativ nu exclude diagnosticul de bruceloză. Există studii în care s-a demonstrat că
există pacienţi la care reacţia de aglutinare a fost negativă, dar Brucella spp. a fost izolată prin
hemocultură.
58. 4. 3. Diagnosticul imunobiologic
Datorită faptului că în infecţia cu Brucella spp. este stimulat în special răspunsul imun mediat celular,
diferiţi autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în investigarea unui caz suspect de
bruceloză. IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei stări de hipersensibilitate de tip IV, faţă de
antigenul brucelos.

58. 5. Tratament
Brucelele pot fi sensibile la tetraciclină sau ampicilină. Se recomandă utilizarea tetraciclinei în combinaţie
cu gentamicina sau varianta recomandată de OMS (rifampicină + doxiciclină, timp de minim şase
săptămâni). Ameliorarea simptomatologiei se poate produce în câteva zile de la începerea tratamentului.
Totuşi, datorită localizării intracelulare a germenului, tratamentul trebuie să fie prelungit (mai multe
săptămâni).

58. 6. Epidemiologie
Sursa de microorganisme din genul Brucella este reprezentată de animalele bolnave. Transmiterea
infecţiei la om se realizează prin ingestia de lapte sau de produse contaminate provenite de la animalele
bolnave, prin contactul cu Brucella la nivelul leziunilor tegumentare, la nivelul conjunctivei sau prin
inhalarea microorganismului.
Bruceloza este în principal o boală profesională, apărând la lucrătorii din sectorul zootehnic, fermieri etc.
În România, în anul 1999 au fost raportate 3 cazuri iar în anul 2000, 5 cazuri de bruceloză (incidenţă
0,020/0000). Numărul de cazuri a fost mic şi în următorii ani (de ex. 2 cazuri în 2005 şi 1 caz în anul 2006).
Incidenţa brucelozei s-a menţinut relativ constantă în ultimii 20 de ani în SUA, cu o uşoară scădere; în
1998 şi 1999 valoarea a fost de 0,030/0000, cu 79 şi respectiv 82 de cazuri notificate. Având în vedere sursa
de infecţie, autorităţile de sănătate publică americane includ în raportul anual şi bruceloza la animale (în
2005, 3 cirezi de cornute şi 2 cirezi de porci au fost identificate cu bruceloză; 48 de state nu au raportat
cazuri de bruceloză la animale). Numărul de cazuri de bruceloză la om, în 2005, a fost 120 (incidenţă
0,040/0000).

58. 7. Profilaxie
Elementul esenţial pentru eliminarea brucelozei umane este eradicarea bolii la animale. Acest lucru s-ar
putea realiza folosind un vaccin viu atenuat, care determină imunitate. Animalele bolnave trebuie
sacrificate.
Între metode de prevenire a infecţiei cu Brucella se pot aminti şi pasteurizarea laptelui, evitarea
contactului cu produsele animale contaminate şi aplicarea măsurilor de protecţie a personalului aflat la
risc pentru contractarea bolii.

59. Genul Francisella (Gabriela Loredana Popa)

59. 1. Definiţie. Încadrare
Microorganismele din genul Francisella sunt cocobacili Gram-negativi, aerobi, facultativi anaerobi,
pleomorfi, imobili, care produc tularemia, o boală infecţioasă a unor specii de animale (mai ales
rozătoare), care poate fi transmisă incidental pe diferite căi la om. Tularemia este o zooantroponoză.
Specia Francisella tularensis reprezintă singura specie a genului importantă pentru patologia animală şi
umană.
Agentul etiologic al tularemiei a fost izolat pentru prima dată în anul 1912, într-o izbucnire epidemică
(„outbreak”) în care boala a fost asemănată cu ciuma, în districtul Tulare (California). Dacă preocuparea
pentru infecţiile cu F. tularensis a scăzut destul de mult în secolul 20, în momentul de faţă, datorită
faptului că microorganismul este considerat drept un agent potenţial utilizabil în acţiuni bioteroriste,
studiile în domeniu au înregistrat o evidentă creştere.

59. 2. Caractere generale

59. 2. 1. Habitat
Francisella tularensis infectează animalele sălbatice şi domestice (iepuri, şobolani, şoareci, popândăi,
hârciogi, bizami, veveriţe etc) precum şi păsările. Agentul patogen este prezent şi la unele căpuşe, muşte
de animale şi ţânţari. În focarele de infecţie căpuşele joacă un rol important (în ele microorganismul poate
persista 2-3 ani). În plus, ele pot transmite microorganismul transovarian.
59. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Francisella tularensis este un cocobacil Gram-negativ, foarte mic (0,2-0,3 μm /0,6-1 μm) coloraţia fiind
adesea bipolară şi relativ slabă. Prezintă o capsulă fină. Microscopul electronic a pus în evidenţă şi
elemente cocobacilare mai mici, de 0,1μm, sub posibilităţile de rezoluţie ale microscopului optic, care pot
trece prin filtrele uzuale pentru sterilizare bacteriologică. Microorganismul este imobil, necapsulat (la
microscopul optic), nesporulat.
59. 2. 3. Caractere de cultură
Coloniile cresc lent (2-10 zile) la prima inoculare. Se preferă folosirea unor medii speciale, cu gălbenuş de
ou coagulat (McCoy) sau cu cisteină-glucoză-sânge la temperatura de , în condiţii de aerobioză. Coloniile
sunt mici, transparente şi uşor de emulsionat (tip S).
59. 2. 4. Caractere biochimice
Francisella tularensis prezintă o activitate biochimică redusă. Poate fermenta unii carbohidraţi sau alcooli
fără producere de gaz. Este catalază-pozitivă şi oxidază-negativă. Testele biochimice nu prezintă
importanţă în diagnosticul curent.
59. 2. 5. Rezistenţa faţă de factorii fizici şi chimici
În mediul extern F. tularensis poate fi distrusă rapid de căldură. Este rezistentă la frig (de exemplu, carnea
de iepure îngheţată poate rămâne infecţioasă în anumite condiţii). Muştele pot purta agentul patogen
circa 14 zile, iar căpuşele 2-3 ani. Este distrusă de antisepticele şi dezinfectantele uzuale.
59. 2. 6. Structura antigenică
Tulpinile de Francisella tularensis sunt omogene antigenic, dar genul poate fi împărţit în două serotipuri.
Tipul A este întâlnit în special în America de Nord şi include două subspecii (tularensis şi nearctica). Tipul B
include două subspecii (holarctica şi mediasiatica).
Materialul extracelular (capsula) conţine lipopolizaharide şi carbohidraţi. Au fost extrase şi o serie de
antigene localizate la nivelul peretelui.
Există unul sau mai multe antigene proteice înrudite cu antigenele aglutinante ale
genului Brucella. Francisella tularensis prezintă de asemenea antigenul somatic O (endotoxina, LPZ).
59. 2. 7. Caractere de patogenitate
Factorii responsabili pentru patogenitatea F. tularensis  nu sunt foarte bine definiţi. Totuşi, componentele
de suprafaţă ale celulei (materialul extracelular, capsula) sunt implicate în patogenitate.
Endotoxina pare să aibă un rol în patogeneză similar cu cel al endotoxinei Salmonellei typhi.
F. tularensis subspecia tularensis include cele mai virulente tulpini. DL 50 este de 10 microorganisme. Rata
fatalităţii (în lipsa tratamentului) este de circa 10-20%. Circa 1-2% dintre persoanele tratate cu antibiotice
şi chimioterapice pot avea o evoluţie nefastă, spre deces.
59. 2. 8. Imunitate
Imunitatea după infecţie este durabilă (ţine toată viaţa), deşi au fost înregistrate câteva cazuri de reinfecţie
la persoane care lucrau în laborator. Anticorpii aglutinanţi apar de regulă după 7-10 zile de la debutul
bolii, cresc până la un nivel maxim care se menţine pe toată durata bolii şi scad în convalescenţă,
rămânând la aceste valori ani de zile. Nu au efect protector. Tendinţa bolii de a progresa precum şi desele
recăderi sau cronicizarea, care pot apărea în ciuda titrurilor ridicate de anticorpi serici sau a răspunsului
imun persistent, se datorează în mod cert capacităţii de supravieţuire intracelulară a microorganismului.
Imunitatea celulară reprezintă modalitatea principală de apărare faţă de infecţie.

59. 3. Patogenie
Francisella tularensis are o infecţiozitate foarte mare. Infecţia poate apărea după penetrarea tegumentelor
sau mucoaselor sau după inhalarea a numai 10-50 de microorganisme. Cel mai adesea contaminarea se
realizează printr-o soluţie de continuitate tegumentară. Microorganismele se multiplică şi la locul de
pătrundere, în 2-6 zile apare o inflamaţie, apoi o papulă care se transformă într-o ulceraţie. Infecţia se
propagă mai departe pe cale limfatică prinzând ganglionii limfatici regionali, care se măresc şi încep să
supureze. Microorganismele se pot multiplica intracelular, supravieţuind mult timp în monocite sau în alte
celule ale organismului.
Diseminarea limfatică este urmată de o bacteriemie tranzitorie, cu formarea de focare în diferite organe
parenchimatoase, în special plămâni, ficat şi splină. Leziunile caracteristice sunt reprezentate de noduli
granulomatoşi care se pot necroza sau cazeifica. Mai pot apărea frison, febră, cefalee, greaţă, vărsături,
afectarea stării generale. În lipsa tratamentului corespunzător se poate ajunge la delir şi comă.
Alte forme clinice sunt forma oculoganglionară, tularemia orofaringiană, pneumonia tularemică, forma
tifoidică etc.

59. 4. Diagnostic de laborator

De menţionat că diagnosticul pozitiv este sugerat de datele clinice, întărit de cele epidemiologice şi
confirmat de datele de laborator.
De subliniat faptul că un laborator în care se presupune că se lucrează cu F. tularensis  trebuie să asigure
condiţii stricte de biosecuritate şi biosiguranţă.
Diagnosticul de laborator bacteriologic, deşi relativ dificil poate fi realizat (în laboratoare de referinţă),
dar în principiu, datorită riscurilor de infectare a personalului de laborator mai ales prin formarea de nuclei
de picătură contaminanţi, majoritatea cazurilor se diagnostichează imunologic (în special serologic). Se
foloseşte tehnica micro-aglutinării.
În vederea diagnosticului serologic este de reţinut că, anticorpii aglutinanţi apar la 7-10 zile de la debutul
bolii, ating un nivel maxim la 4-8 săptămâni; titruri dozabile pot persista mai mulţi ani. Se preferă
recoltarea a două probe la interval de 2 săptămâni. O creştere a titrului de 4 ori la a doua recoltare pune
diagnosticul unei infecţii recente.

59. 5. Tratament
Antibioticul de elecţie a fost streptomicina (interesul pentru streptomicină a scăzut nu datorită apariţiei
unor tulpini rezistente ci datorită efectelor adverse ale medicamentului). Gentamicina şi ciprofloxacina par
a fi la fel de eficace. Pot apărea recăderi. Pot fi folosite şi tetraciclina şi cloramfenicolul, dar recăderile sunt
mai frecvente, mai ales dacă tratamentul este întrerupt prematur (este recomandată o cură de 2-4
săptămâni). Multiplicarea intracelulară a F. tularensis creează dificultăţi în vindecarea tularemiei şi explică
procentul de circa 5-10% recăderi.
59. 6. Epidemiologie
Tularemia a fost raportată în toată America de Nord, în multe părţi ale Europei (mai ales în Scandinavia), în
fosta URSS, Japonia. Pare să fie o boală care afectează mai ales emisfera nordică. Apare sporadic sau în
epidemii.
Transmiterea agentului patogen de la animalul bolnav la om se face printr-una din următoarele căi: a.
contactul direct cu animalele bolnave sau cu produsele lor, agentul pătrunzând uşor prin tegumente sau
mucoase (inclusiv intacte). De notat frecvenţa crescută a transmiterii a. după muşcătura de animal; b. pe
cale digestivă, prin ingestia de apă sau alimente contaminate; c. prin intermediul unor vectori (artropode
hematofage: căpuşe, muşte, ţânţari, ploşniţe); d. pe cale respiratorie, prin aerosoli (foarte rar).
Boala are şi un caracter profesional survenind la vânători, agricultori, crescători de animale. În unele ţări,
90% din cazurile de tularemie apar prin contact cu iepurii sălbatici infectaţi.
În perioada 2000-2005, în USA au fost raportate între 90 şi 154 cazuri de tularemie, pe an. Cel mai mare
număr de cazuri a fost raportat în anul 2005 (154 cazuri, incidenţă 0,05 0/0000).

59. 7. Prevenire şi control

Deoarece infecţia animalelor sălbatice nu poate fi controlată, cheia prevenirii infecţiei umane este
reprezentată de evitarea contaminării (evitarea prelucrării produselor animalelor sălbatice, mănuşi etc).
Pentru persoanele cu risc crescut de infecţie, în special pentru cele care lucrează în laborator, este posibilă
administrarea intradermică a unui vaccin viu atenuat (considerat, încă, experimental). Nu realizează o
protecţie completă, dar persoanele vaccinate fac o formă mai uşoară de boală (dacă se contaminează).

60. Genul Pasteurella (MI Popa)

60. 1. Definiţie. Încadrare
Microbii din genul Pasteurella sunt cocobacili sau bacili mici, Gram-negativi, pleomorfi, imobili, aerobi
facultativ anaerobi, oxidază-pozitivi (majoritatea) şi catalază-pozitivi, patogeni în special pentru animale.
Iniţial termenul de Pasteurellae includea şi Yersinia şi Francisella, care actualmente formează genuri
distincte. Genul Pasteurella face parte din familia Pasteurellaceae, alături de
genurile: Actinobacillus, Gallibacterium, Haemophilus, Lonepinella, Mannheimia şi Phocoenobacter. Specia
tip este reprezentată de P. multocida. Studiile secvenţelor ARNr 16S au demonstrat că speciile P.
pneumotropica, P. aerogenes, P. haemolytica şi  P. ureae sunt destul de diferite, în comparaţie cu specia tip
şi ar putea să aparţină altor genuri (subiect de discuţie şi adaptare în următoarele ediţii ale manualului).

60. 2. Caractere generale

60. 2. 1. Habitat
P. multocida poate fi izolată de la nivelul tractului respirator şi gastrointestinal al animalelor sălbatice şi
domestice (pisică, câine, porc, cornute mari etc).
60. 2. 2. Caractere morfofuncţionale
Germenul are formă cocoidă sau cocobacilară, este Gram-negativ, colorându-se adesea bipolar. Unele
tulpini sunt capsulate. Capsula se poate colora cu tuş de China. Pot prezenta un polimorfism accentuat,
astfel că, de ex. pe un frotiu efectuat din LCR-ul care provine de la un organism infectat, aspectul poate
sugera prezenţa concomitentă de microorganisme din genurile Haemophilus şi Neisseria.
60. 2. 3. Caractere de cultură
Sunt aerobi, facultativ anaerobi, cresc uşor pe medii de cultură obişnuite, la o temperatură optimă de
37ºC. Creşterea este stimulată dacă mediul conţine sânge sau ser. Pe geloză-chocolate coloniile sunt de
tip S, mici (0,5-), neuniforme, semitransparente, uneori, cu aspect mucoid. Pe geloză-sânge coloniile sunt
mici, cenuşii, nehemolitice. Multiplicarea pare să fie stimulată în prezenţa unei concentraţii de 5-7% CO 2.
Cultura poate avea un miros asemănător cu cel produs de culturile de E. coli  (probabil datorită producerii
de indol). Nu se dezvoltă pe mediile utilizate atunci când presupunem o infecţie cu enterobacterii (ex.
MacConkey).
60. 2. 4. Caractere biochimice
Ca şi celelalte pasteurelle, P. multocida este oxidază-pozitivă şi catalază-pozitivă, ornitin-decarboxilază-
pozitivă, indol-pozitivă şi urează-negativă. Fermentarea zaharurilor este corelată în general cu tipul
antigenic şi cu originea tulpinii.
În baza caracterelor biochimice, specia se subîmparte în subspecii (Pasteurella
multocida subspecia multocida, subspecia septica şi subspecia gallicida).
60. 2. 5. Structură antigenică
Pasteurella prezintă un antigen somatic O (LPZ). Tulpinile capsulate care produc îmbolnăviri la animale au
fost împărţite în 4 serogrupuri capsulare (A-E). La tipul A, capsula mucoidă este formată în special din acid
hialuronic. Acest tip capsular este cel mai frecvent izolat din infecţile umane. Serogrupurile pot fi împărţite
în serotipuri, pe baza structurii LPZ.
60. 2. 6. Caractere de patogenitate
P. multocida este patogenă în special prin multiplicare şi invazivitate. Capsula reprezintă cel mai important
factor protector, inhibând fagocitarea germenilor şi permiţând invadarea organismului gazdă. Endotoxina
este implicată în patogenia bolii.
Unele tulpini de P. multocida produc o toxină dermonecrotică (implicată mai ales în infecţiile localizate
respirator) şi enzime (ex. lipaze) care par a fi implicate patogenic.

60. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni

produse
Microorganismul are capacitatea de a se multiplica în celule atît intra, cât şi extracelular. Infecţiile umane
cu P. multocida se încadrează în trei grupe principale:
1. infecţii locale, celulite, abcese, uneori osteomielite etc. apărute după muşcături de animale (cel mai
adesea pisică sau câine);
2. infecţii ale tractului respirator (pneumonie, abces pulmonar etc);
3. infecţii sistemice (bacteriemie, meningită, septicemie).
Infecţiile la om au în majoritatea cazurilor un caracter sporadic, calea de contaminare fiind reprezentată de
un traumatism prin muşcătură (câine, pisică) sau înţepătură (zgârietură). Din punct de vedere clinic, cel
mai adesea după muşcătura unui animal, debutul este acut, cu înroşire, umflare şi durere, la câteva ore de
la traumatism. Adenopatia regională este variabilă, iar febra nu este foarte mare.

60. 4. Diagnostic de laborator

În diagnostic trebuie pornit de la aspectul epidemiologic (expunerea la muşcătura unui animal) şi apariţia
în mai puţin de 24 de ore a unei celulite dureroase. Laboratorul trebuie alertat în cazul suspicionării unei
infecţii cu P. multocida, deoarece microscopic germenul poate fi iniţial confundat cu H.
influenzae, Neisseria spp. etc.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic şi cuprinde etapele clasice ale diagnosticului direct,
recoltarea produsului patologic (puroi, serozitate recoltate din profunzimea zonei muşcate etc), examenul
frotiului din produs patologic, cultivarea (pe medii simple sau pe geloză-sânge / geloză-chocolate) şi
identificarea pe baza caracterelor morfologice, de cultură, biochimice şi antigenice. Apariţia unor colonii
cu bacili sau cocobacili Gram-negativi, oxidază-pozitivi, indol-pozitivi, care nu se dezvoltă pe mediul
MacConkey, la o persoană care a fost zgârâiată sau muşcată de o pisică, este foarte sugestivă pentru
infecţia cu P. multocida.
Microorganismul este sensibil la medicamentele β-lactamice (peniciline, cefalosporine), tetracicline şi
cloramfenicol. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice poate fi utilă pentru surprinderea
apariţiei unor tulpini rezistente (de ex. în 1991 a fost izolată o tulpină „atipică”, rezistentă la penicilină,
cefalotină, acid clavulanic, sulbactam, ticarcilină şi tetraciclină), în cercetare şi în scop epidemiologic.

60. 5. Tratament
Pe lângă tratamentul corect, local al plăgii, este necesară terapia cu antibiotice (ex. penicilină G, alte
antibiotice β-lactamice).

60. 6. Epidemiologie
Pasteurella multocida poate fi identificată în tractul respirator sau gastrointestinal al animalelor sau
păsărilor. Germenul determină pneumonii sporadice sau epidemice, precum şi septicemii la vaci, oi, porci
şi holera aviară la găini, curcani, raţe. Infecţia se răspândeşte cel mai frecvent după muşcături de animale.
La om se mai pot descoperi cazuri de purtători asimptomatici în rândul îngrijitorilor de animale şi al
studenţilor la medicină veterinară.

60. 7. Prevenire
Limitarea contactului cu animalele domestice sau sălbatice rămâne principalul mijloc de a împiedica
infecţiile cu Pasteurella. Tratamenul local al zonei muşcate este foarte important. Preventiv se poate
administra ampicilină. Nu este recomandată suturarea plăgilor muşcate (în special după muşcătura de
pisică), sutura acţionând ca un factor predispozant pentru infecţie.

61. Genul Candida

61. 1.  Generalităţi
Genul cuprinde peste 81 de specii, din care 7 sunt sigur implicate în patologia umană.
Fac parte din levuri. Candida albicans produce pseudomicelii atât în culturi, cât şi în
produse patologice sau la nivel tisular.
61. 2.  Caractere generale
61. 2. 1. Habitat
Speciile de Candida pot fi izolate de la omul sănătos, spre exemplu de la nivelul tractului
respirator superior, digestiv şi de la nivel vaginal. În aceste zone echilibrul între
microorganism şi gazdă poate fi modificat, situaţie în care pot apărea o serie de aspecte
patologice. Mai rar (de obicei la persoane a căror apărare antiinfecţioasă este deficitară)
pot rezulta diseminări hematologice (fungemie) şi diferite infecţii de tipul tromboflebitei,
endocarditei, infecţiilor oculare sau la nivelul altor organe.
61. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
În frotiurile realizate din produse patologice, Candida albicans apare ca o levură ovalară,
Gram-pozitivă, cu dimensiuni de 2-3/4-6 µm, cu posibilitatea apariţiei unor pseudohife.
61. 2. 3. Caractere de cultură
Pe mediul de cultură Sabouraud, incubate la temperatura camerei sau la 37ºC, apar
colonii de tip S, cu o consistenţă cremoasă şi cu un miros relativ caracteristic.
61. 2. 4. Caractere biochimice
Candida albicans fermentează glucoza şi maltoza cu producere de acid şi de gaz.
Produce acid din sucroză şi este lactoză-negativă. Fermentarea carbohidraţilor permite
diferenţierea C. albicans de alte specii de Candida.
61. 2. 5. Structură antigenică
În structura corpului celular al speciilor de Candida există antigene zaharidice care
permit împărţirea genului în două grupe (A şi B). Extrasele antigenice utilizate în testele
serologice şi respectiv imunobiologice constau de fapt din mai multe structuri
antigenice nediferenţiate. Anticorpii care apar faţă de aceste structuri antigenice pot fi
identificaţi prin reacţii de precipitare, imunodifuzie, contraimunoelectroforeză sau latex
aglutinare.
61. 2. 6. Răspuns imun
S-a reuşit experimental imunizarea unor animale de laborator care devin rezistente faţă
de o eventuală candidoză sistemică. În cazul omului, se poate afirma deocamdată doar
că mecanismul imun este complex şi în curs de elucidare.
61. 2. 7. Caractere de patogenitate
Factorii de patogenitate ai C. albicans sunt reprezentaţi de anumite enzime, spre
exemplu proteinaze, hidrolaze, esteraze, ribonucleaze şi de anumite substanţe care
inhibă răspunsul imun (spre exemplu mananul, care s-a dovedit că inhibă proliferarea
limfocitelor T).
61. 3.  Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse
Este necesar de subliniat că în apariţia unei infecţii diseminate cu Candida sunt implicaţi
în special anumiţi factori care ţin de gazda infectată, aceasta având anumite deficienţe în
apărarea antiinfecţioasă.
61. 3. 1. Factorii implicaţi în apariţia unei candidoze
Factorii care sunt implicaţi în apariţia unei candidoze ar putea fi împărţiţi în două
categorii: intrinseci şi extrinseci.
Factorii intrinseci mai importanţi sunt reprezentaţi de:
- vârstă (nou-născuţi, vârstnici);
- sarcină, începând din luna a IV-a;
- endocrinopatii (diabet zaharat, insuficienţă suprarenaliană, insuficienţă
tiroidiană);
- hemopatii maligne;
- anemii aplazice;
- agamaglobulinemie şi hipogamaglobulinemie;
- infecţia cu HIV şi SIDA;
- alte cauze de imunodepresie.
Factorii extrinseci mai importanţi sunt reprezentaţi de:
 - antibioterapia incorect administrată, care poate conduce la
dismicrobisme şi la un grad de inhibare a răspunsului imun;
- terapia antituberculoasă şi antiparazitară;
- terapia imunosupresivă;
- utilizarea (pe cale generală) a medicamentelor anticoncepţionale;
- efectuarea anumitor manopere medico-chirurgicale (cateterisme,
implante etc);
- utilizarea radiaţiilor ionizante.
Speciile de Candida implicate patogenic (de exemplu Candida albicans) aderă la epitelii
şi mucoase (au afinitate pentru componente ale peretelui celular), colonizează şi se
multiplică, trecând în starea de pseudofilamente. Ulterior pot traversa epiteliul şi pot
invada capilarele sanguine, ducând la fungemie şi eventual la septicemie fungică.
61. 3. 2. Forme clinice
Formele clinice mai frecvent întâlnite sunt:
a). bucale şi peribucale:
- stomatită (mucoasa bucală este eritematoasă, cu depozite albicioase);
- glosită (limba este netedă, depapilată sau prezintă depozite albicioase, cu aspect
„păros”, cu următoarele simptome: arsuri la deglutiţie, mâncărime, dureri);
- amigdalită;
- cheilită (buzele sunt crăpate, scuamoase, sângerânde, leziunile fiind localizate la nivelul
comisurii bucale).
b). genitale:
- vaginite;
- vulvite;
- balanoprostatite;
c). cutanate şi ale fanerelor:
- onixis şi perionixis (dureri şi tumefacţii periunghiale);
- intertrigo axilar, submamar, interfesier, interdigital, cu leziuni exsudative, eritematoase,
scuame şi uneori vezicule cu lichid clar sau purulent (în cazul unor suprainfecţii
bacteriene).
d). generalizate:
- viscerale (bronhopneumonie, endocardită, meningită, infecţii digestive, infecţii urinare);
- septicemii.
61. 4.  Diagnosticul de laborator  în infecţiile produse de Candida albicans
Diagnosticul infecţiilor fungice nu este un diagnostic facil, dar este foarte important şi ar
trebui realizat de rutină, pentru că trebuie să avem în vedere că aceste afecţiuni sunt
mult mai frecvente decât sunt raportate, în ţara noastră.
Oricare laborator clinic ar trebui să poată realiza cel puţin examinarea microscopică în
vederea evidenţierii levurilor sau structurilor miceliene sau pseudo-miceliene precum şi
testul filamentării. Dintre infecţiile fungice vom discuta în continuare doar despre
infecţiile produse de levuri şi dintre acestea numai despre infecţiile produse de levurile
din genul Candida, mai precis de specia Candida albicans.
În ceea ce priveşte diagnosticul unei infecţii cu Candida spp. (respectiv C. albicans) există
anumite particularităţi de care trebuie ţinut cont atunci când se diagnostichează o
candidoză localizată la nivel muco-cutanat în comparaţie cu o candidoză localizată
profund. Diagnosticul poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect).
61. 4. 1. Diagnosticul micologic
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o
serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit
antibiotice antifungice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate,
respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În cazul
candidozelor superficiale, după antiseptizarea suprafeţei leziunii raclăm spre ex.
tegumentul şi colectăm scuamele rezultate într-un recipient. Mai putem recolta fire de
păr, fragmente de unghie etc. În principiu putem introduce p.p. recoltat în pachet de
hârtie, introdus la rândul lui într-o cutie Petri. Transportul trebuie să dureze maxim 48 de
ore. În cazul candidozelor profunde ca şi în cazul candidozelor localizate la
nivelul mucoaselor trebuie să evităm uscarea p.p. pe parcursul transportului. Vom utiliza
recipiente care se pot închide ermetic şi dacă estimăm că transportul va dura mai mult
de 1-2 ore introducem în recipient un tampon de vată sau tifon umezit cu soluţie salină
fiziologică. Pentru a preveni multiplicarea bacteriană putem adăuga p.p. antibiotice (ex.
penicilină, streptomicină, cloramfenicol). Este bine ca volumul de p.p. recoltat să fie cât
mai mare. În cazul candidozelor profunde preferăm ca recoltarea să fie
urmată imediat de realizarea preparatelor microscopice şi însămânţare pe medii de
cultură (la patul bolnavului).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic se realizează diferit, în funcţie de p.p.
prelucrat, dar face parte din orice examen micologic.
În cazul în care examinăm o secreţie sau un produs obţinut prin raclare de la nivel
tegumentar sau fragmente de unghie vom realiza un preparat proaspăt (umed),
montat în soluţie de 10-30% KOH-glicerol. Putem utiliza pentru colorare
calcofluor alb, un fluorocrom care permite evidenţierea levurilor datorită faptului
că au în compoziţie chitină (la nivelul peretelui celular). Elementele fungice
(levuri ovoide, cu dimensiunea de 4/6 m, pseudomicelii şi micelii) apar galben-
verzui sau alb-albăstrui în funcţie de lungimea de undă a radiaţiei de excitaţie.
Punerea în evidenţă a formaţiunilor menţionate mai sus permite suspicionarea
prezenţei Candida spp., dar pentru confirmarea prezenţei C. albicans este
necesară obţinerea culturilor pure şi identificarea acestora.
În cazul în care examinăm secreţii de la nivelul mucoaselor vom pregăti atât
preparate umede cât şi frotiuri pe care le vom colora (Gram, AM sau Giemsa).
Pentru creşterea sensibilităţii examinării preparatelor umede, acestea vor fi
colorate cu calcofluor alb sau cu lactofenol albastru cotton. Indiferent de metoda
 utilizată, punerea în evidenţă a levurilor şi pseudomiceliilor ridică o suspiciune,
însă datorită prezenţei Candida spp., în flora microbiană normală (ex. bucală,
vaginală etc) doar punerea în evidenţă a miceliilor alături de prezenţa
formelor levurice (Gram pozitive la coloraţia Gram) poate permite confirmarea
infecţiei. Este necesară obţinerea culturilor pure şi identificarea acestora. Pe de
altă parte, dorim să menţionăm că o cultură pozitivă în absenţa unui examen
microscopic pozitiv ridică semne de întrebare privind diagnosticul infecţie cu C.
albicans.
În cazul candidozelor profunde, interpretarea se va face diferenţiat. Atunci când
p.p. este normal steril (recoltat prin puncţie lombară, lavaj bronho-alveolar,
puncţie bioptică etc), identificarea structurilor fungice (levuri, micelii) este foarte
importantă pentru diagnostic. Dacă p.p. este reprezentat de urină, materii fecale,
spută sau alt produs potenţial contaminat de flora microbiană normală,
interpretarea este mai dificilă în ceea ce priveşte semnificaţia structurilor fungice
observate. Pentru examinarea p.p. recoltate de la pacienţi care prezintă candidoze
profunde vom realiza atât preparate umede cât şi frotiuri fixate, colorate prin
metodele amintite. Este posibil ca elementele fungice să apară deformate
datorită fixării precipitatelor de colorant, pe frotiul colorat Gram. În cazul
biopsiilor tisulare am putea utiliza coloraţiile histochimice.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. Există
mai multe medii de cultură care pot fi utilizate. Cel mai cunoscut este
mediul Sabouraud (agar, glucoză sau maltoză, polipeptonă) produs şi de INCDMI
„Cantacuzino”. În cazul p.p. contaminate vom folosi şi medii selective, de ex. mediul
Sabouraud cu antibiotice (cloramfenicol, gentamicină şi/sau tetraciclină) şi/sau mediul
Sabouraud cu cicloheximidă. Dorim să menţionăm că în cazul p.p. necontaminate
realizăm cultivarea numai pe mediul Sabouraud neselectiv în timp ce în cazul p.p.
contaminate vom realiza cultivarea atât pe mediul neselectiv cât şi pe mediile selective.
Putem incuba plăcile la 22-30º C, dar mai frecvent incubarea se realizează la 28º C (sau
la temperatura camerei) şi la 35-37º C, timp de 24-96 ore în cazul candidozelor
superficiale şi până la maxim 3 săptămâni în cazul candidozelor profunde.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale: Examenul microscopic al culturilor de levuri se
realizează asemănător cu ceea ce am discutat în cazul identificării bacteriilor.
Există însă şi anumite particularităţi.
Vom realiza atât preparate proaspete, colorate de ex. cu lactofenol
cât şi frotiuri fixate şi colorate. Vom putea remarca prezenţa levurilor
(blastoconidii), rotunde, ovoide sau puţin mai alungite, gram
 pozitive, putând prezenta muguri şi pseudomicelii. Prin examenul
microscopic dovedim şi puritatea coloniei.
După repicarea pe agar cu făină de porumb sau agar cu extract de
cartof (medii sărace din punct de vedere nutritiv), examinarea
microscopică a preparatului proaspăt va demonstra producerea
de chlamidoconidii (chlamidospori) care apar la extremitatea
pseudomiceliilor. Testul este negativ în numai 3-4% dintre cazuri.
Caractere de cultură:
Produc colonii de tip S, rotunde, bombate, netede, asemănătoare cu
unele colonii bacteriene dar cu dimensiuni mai mari.  Coloniile apar
în 1-4 zile, au o culoare albă sau alb-gălbuie şi consistenţă
cremoasă. În timp suprafaţa coloniilor capătă un aspect „zbârcit”.
Caractere biochimice:
Auxanograma: Levurile prezintă un anumit echipament enzimatic cu
ajutorul căruia pot să utilizeze un anumit carbohidrat ca unică sursă
de carbon. Dezvoltarea pe un mediu în care este inclus un singur
carbohidrat demonstrează utilizarea acestuia ca unică sursă de
carbon. În mod asemănător se poate testa capacitatea asimilării
unor substanţe azotate. C. albicans asimilează glucoză, maltoză,
trehaloză, galactoză etc.
Zimograma: Testarea fermentării unor carbohidraţi
Utilizarea unor teste produse comercial precum API 20C, API 32C,
Vitek etc
Relativ recent au fost puse la punct medii cromogene (ex. CHROM-
agar) care testează producerea anumitor enzime şi sunt utile în
identificarea C. albicans, C. krusei  şi C. tropicalis.
Caractere antigenice:
Se pot utiliza reacţia de aglutinare pe lamă, reacţia de latex-
aglutinare sau ELISA folosind antiseruri cunoscute. Ultimele două
tehnici sunt folosite şi în scopul identificării prezenţei Ag
de Candida spp. în diferite p.p.
Caractere de patogenitate:
Pornind de la o cultură de 24 de ore în mediul Sabouraud
lichid separăm sedimentul şi realizăm o suspensie 0,2% a
acestuia în soluţie salină fiziologică sterilă; inoculăm în venele
cozii la un lot de şoareci (câte 0,2-0,8 ml pentru fiecare
animal) suspensia obţinută şi urmărim evoluţia animalelor
timp de 4-10 zile; dacă este vorba de o tulpină de C.
albicans patogenă, animalele vor muri după circa 1
 săptămână (anatomopatologic vom putea evidenţia abcese
miliare renale, splenice, hepatice) etc.
Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor:
Testul filamentării (testul producerii de tubi germinativi):
Verificăm capacitatea blastoconidiilor de a produce, în
anumite condiţii, tubi germinativi. Repicăm tulpina de studiat
pe medii care conţin ser de iepure sau de berbec. La intervale
de 60 de minute realizăm preparate proaspete (între lamă şi
lamelă),  examinăm microscopic pentru a identifica apariţia
tubilor germinativi. C. albicans  produce în maxim 4 ore
pseudofilamente (tubi germinativi) relativ scurte, fără
stricturi, cu acelaşi calibru.
Detectarea unor metaboliţi prin gaz-lichid cromatografie
(GLC)
Teste de biologie moleculară (sonde nucleotidice, PCR).
5. Antifungigrama (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea
stabilirii tratamentului) a fost pusă la punct relativ recent. Eforturile depuse în vederea
standardizării acestei tehnici au avut la bază creşterea interesului faţă de infecţiile
fungice precum şi apariţia fenomenului de rezistenţă la medicamentele antifungice a
tulpinilor izolate. Metoda recomandată de NCCLS este cea a diluţiilor în bulion.
61. 4. 2. Diagnosticul imunologic poate fi serologic şi imunobiologic
Diagnosticul serologic
Cu toate că o serie de autori consideră drept nerelevant acest tip de diagnostic, diferite
studii arată că identificarea şi titrarea Ac anti-C. albicans poate fi utilă în diagnosticul
candidozelor profunde. Iniţial au fost utilizate tehnici de aglutinare pentru detectarea
prezenţei Ac anti-manan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea
prezenţei Ac faţă de Ag localizate în citoplasma C. albicans. Au fost utilizate
imunodifuzia în gel, contraimunoelectroforeza, ELISA şi tehnica de latex-aglutinare.
Diagnosticul imunobiologic
Intradermoreacţia cu candidină este pozitivă la practic toate persoanele adulte, fiind
astfel utilă nu în diagnosticarea unei infecţii cu Candida, ci în aprecierea RIC. Se mai
poate utiliza testul transformării blastice a limfocitelor în prezenţa unor Ag de C.
albicans.
Trebuie să menţionăm că există o serie de probleme privind standardizarea şi
interpretarea tehnicilor diagnosticului imunologic. Cu toate că prin aceste modalităţi
utilizate izolat nu putem pune diagnosticul de candidoză, interpretarea ansamblului
rezultatelor de laborator obţinute poate fi de folos în elucidarea implicării patogenice a
tulpinilor de Candida albicans.
61. 5.  Tratament
Nistatina nu se absoarbe intestinal, astfel încât nu este eficace în infecţiile candidozice
sistemice. Pot fi utile ketoconazolul sau amfotericina B. În infecţiile localizate este de
preferat folosirea unor medicamente antifungice topice locale. Trebuie reţinut: cel mai
bun tratament este reprezentat de eliminarea cauzei care a predispus la infecţie în cazul
gazdei respective.
61. 6.  Profilaxie
Numărul de cazuri de candidoză înregistrate şi raportate la nivel naţional, în perioada
1998-2006, a variat între 25.714 (1999) şi 40.990 (2002, incidenţă 188,1 0/0000). Care este
motivaţia unui număr semnificativ mai mare de cazuri în anul 2002 nu a explicat nimeni,
până în prezent. În ultimii 5 ani au fost raportate peste 30.000 de cazuri anual (peste
32.000/an în ultimii 3 ani). În anul 2006 au fost înregistrate 32.520 cazuri, cu o incidenţă
de 150,70/0000.
Cea mai importantă metodă de prevenire este evitarea interferenţei (negative) cu
mecanismele normale de apărare a gazdei, spre exemplu evitarea distrugerii florei
normale prin utilizarea judicioasă a antibioticelor şi în special a antibioticelor cu spectru
larg.