Managementul meningitelor bacteriene acute: Strategii moderne de investigatie si interventionale

Dirctor proiect: Dr. Vasilica Ungureanu

Parteneri:
Institutul National de Boli Infectioase Prof. Dr. M. Bals
Spitalul Clinic de Boli Infectioase Dr. V. Babes

Meningita bacteriana acuta (MBA) o infectie invaziva a SNC, caracterizata prin inflamatia meningelui, este o
cauza majora de morbiditate si mortalitate, putand produce sechele permanente (epilepsie, retardare mentala sau
surzenie etc.). Acesta patologie reprezinta o serioasa problema de sanatate publica la nivel mondial. In ciuda
disponibilitatii celor mai noi si potente antibiotice cat si atentiei acordate diagnosticului si profilaxiei prin
antibioterapie si/sau vaccinare, rata mortalitatii ramane in continuare foarte inalta, in special in tarile in curs de
dezvoltare (15 40%). Meningita este o urgenta medicala ce justifica necesitatea diagnosticului rapid si instituirea
unei terapii agresive. Medici infectionisti si cercetatori din intreaga lume reclama nevoia supravegherii permanente a
meningitei bacteriane acute, stiind ca agentii patogeni responsabili pentru infectii ale SNC variaza cu timpul si aria
geografica, precum si cu varsta si functionalitatea mecanismelor de aparare a organismului.

Scopul proiectului este reprezentat de elaborarea unui algoritm modern de diagnostic si tratament al meningitelor
bacteriene acute in concordanta cu noile descoperiri si directii de cercetare in domeniu. Acesta va permite
identificarea rapida a agentilor etiologici specifici, orientarea diagnosticului si tratamentului, prin completarea
metodelor conventionale cu metode si tehnici moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare, capabile
sa evidentieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel tinte terapeutice alternative.

Principalele obiective ale proiectului sunt:
Studiul aspectelor de etiologie bacteriana a meningitei prin metode conventionale si moleculare
Punerea la punct a unui algoritm de diagnostic bacteriologic si molecular cost-eficient al meningitelor cauzate de
cei mai frecventi agenti patogeni
Studiul aspectelor de sensibilitate/rezistenta la antibiotice si realizarea antibiotipurilor de rezistenta
Caracterizarea prin metode moleculare a principalilor agenti etiologici de natura bacteriana, dar si virala pentru
realizarea diagnosticului diferential
Studiul implicarii mediatorilor solubili ai inflamatiei (citokine, chemokine etc.) in patogenie pentru diagnosticul
diferential cu alte meningite (virale, aseptice) din stadiile incipiente ale bolii
Studierea interactiei complexe agenti patogeni-sistem imun in relatie cu particularitatile localizarii meningeale, in
vederea elucidarii mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicatiilor neurologice consecutive

Rezultatele estimate ale proiectului:
- Definirea unui cadru epidemiologic adaptat la situatia actuala din Romania
- Optimizarea algoritmului de diagnostic microbiologic si diferential al meningitelor
- Actualizarea si reconsiderarea schemelor terapeutice
- Evidentierea implicarii unor componente ale imunitatii in mecanismele patogenice ce contribuie la severitatea
bolii si la aparitia complicatiilor ulterioare
- Conturarea unor noi strategii de prevenire si control a bolii

Etapa I (raportare 15 februarie 2009): Model conceptual de studiu al etapelor critice ale diagnosticului MBA

In aceasta etapa a fost realizat un studiu al datelor din literatura de specialitate pentru a identifica stadiul actual al
cunoasterii diagnosticului MBA pe plan international, precum si aspectele critice ale supravegherii si diagnosticului
MBA in Romania. Aceasta va permite elaborarea unui algoritm de diagnostic si tratament al meningitelor bacteriene
acute, putand realiza astfel identificarea rapida a agentilor etiologici si orientarea diagnosticului si tratamentului,
prin completarea metodelor conventionale cu metode si tehnici moderne din domeniul imunologiei si biologiei
moleculare, capabile sa evidentieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel tinte terapeutice
alternative.
De asemenea, a fost elaborata documentatia referitoare la particularitatile clinice si epidemiologice ale MBA
determinate de cei mai frecventi agenti bacterieni si s-au definit criteriile de selectie a pacientilor in studiu, precum
si fisa de urmarire clinica a pacientilor.
Criteriile de selectie a pacientilor in studiu:
1. Criterii clinice
Meningita bacteriana poate fi dificil de diagnosticat dupa semne si simptome, acestea fiind adesesa nespecifice (11).
Simptomele pot include : febra, cefalee, inapetenta, greturi, varsaturi, letargie, iritabilitate, fotofobie, alterarea starii
de constienta.
Semnele clinice cele mai frecvente la copii sunt : febra, varsaturi, bombarea fontanelelei, somnolenta, refuzul
suptului, apnee, convulsii si rash purpuric. La copiii mai mari semnele clasice - redoarea cefei, cefalea si fotofobia
sunt cele mai comune, iar semnele Kernig, Brudzinski, sunt adesea absente.
2. Criterii epidemiologice:
- Contact cu alte cazuri cunoscute
- Provenienta din colectivitate (casa copii, camin,, cresa, armata, etc)
- Calatorie recenta in zone endemice (Africa, Asia, etc)
- Contact cu animale (profesional, animale de casa)
3. Criterii de laborator
3.1. Criterii orientative:
Modificarile macroscopice, citologice si biochimice ale LCR sugestive pentru o meningita bacteriana sunt:
- LCR tulbure (zeama de varza) sau opalescent
- LCR hipertensiv
- Reactia Pandy pozitiva
- Pleiocitoza (peste 100 celule nucleate / mmc LCR) cu predominenta PMN
- Hiperalbuminorahie (peste 100 mg /dl LCR)
- Hipoglicorahie (sub 40 mg / dl LCR)
3.2. Criterii de confirmare:
Etiologia bacteriana a unei meningite acute bacteriane poate fi confirmata prin 3 metode:
- Identificarea pe frotiul colorat Gram a unei bacterii gram-pozitive sau negative.
- Identificarea unor antigene bacteriene solubile din LCR sau sange prin: latex-aglutinare,
imunoelectroforeza
- Izolarea in culturi a unei bacterii din LCR sau sange (hemocultura)
4. Criterii de excludere :
Pacienti ce nu consimt sa participe la studiu
Epidemie de meningita virala
- Semne sugestive de meningita tuberculoasa: - Debut insiduos
- Sindrom de impregnare bacilara
- Infectie TBC cunoscuta (pulmonar
sau alta localizare
- Infectie HIV (?)
Pentru a facilita comunicarea intre parteneri si a asigura un bun acces la rezultatele obtinute in cadrul proiectului a
fost elaborata o baza de date cu acces extern restrictionat (username si parola). Fiecare partener este automat
directionat catre partea ce ii revine din baza de date, pe baza username-ului propriu. Coordonatorul proiectului va
avea acces la toata baza de date.
Intrucat metodele si tehnicile moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare vor fi puse la punct si
aplicate pentru prima data in tara noastra, s-a impus elaborarea metodologiei de determinare a mediatorilor solubili
ai inflamatiei in LCR si ser si a metodologiei moderne de diagnostic adaptate pentru probele biologice utilizate.



Etapa II (raportare 01.12.2009): Studiul si analiza comparativa a metodelor moderne si conventionale de
diagnostic MBA.
Activitatile specifice si rezultatele estimate ale acestei etape sunt:
1. Metodologie de diagnostic microbiologic prin metode conventionale si de testare a sensibilitatii/ rezistentei la
antibiotice (optimizare metode)
2. Metodologie de diagnostic diferential prin metode conventionale (optimizare metode)
3. Metodologie de diagnostic si caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare; metodologie de
derminare a markerilor genetici ai rezistentei bacteriene (optimizare metode)
4. Metodologie de realizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in LCR/
ser

Rezumatul etapei II

1. In aceasta etapa sunt descrise etapele importante ale diagnosticului bacteriologic prin metodele conventionale
optimizate, experimentate la nivelul laboratoarelor partenerilor: recoltarea prelevatelor biologice (LCR,
hemocultura, exsudate faringiene si nazale etc), procesarea acestora, urmata de identificarea prin metode rapide de
diagnostic (ex. Latex aglutinare, microscopie) si identificarea prezumtiva a agentului cauzal. Inocularea
prelevatelor biologice pe medii de cultura este urmata de identificarea definitiva a agentului etiologic al MBA.
Ultima etapa a diagnosticului bacteriologic il constituie testarea susceptibilitatii la antibiotice (TSA), ceea ce ajuta la
determinarea antibiotipurilor de rezistenta, necesara pentru instituirea tratamentului empiric pana la obtinerea
rezultatelor de laborator, prezentand astfel importanta pentru adoptarea atitudinii terapeutice si/sau a politicii de
utilizare a antibioticelor la nivel local, regional si/sau national pe baza datelor obtinute.
2. In continuare sunt etalate metodele conventionale de diagnostic diferential. Diagnosticul diferential intre
meningita bacteriana si meningitele de alte etiologii este inca foarte dificil de facut, semnele si simptomele fiind
adesea nespecifice. Analiza LCR, coloratia Gram si cultura raman inca cele mai utilizate metode de diagnostic al
meningitei, dar la pacientii ale caror rezultate, privind coloratia Gram si cultura, sunt negative, se folosesc alte teste
pentru a diferentia meningita bacteriana de celelalte meningite (nivelul proteinelor, lactatului si glucozei, ca si
numarul leucocitelor in LCR ; CRP, procalcitoninele si glucoza in ser). Parametrii cei mai importanti pentru
diagnosticul diferential al meningitelor sunt sintetizati in Tabelul 2.
3. Unul dintre obiectivele specifice ale fazei de executie a fost elaborarea metodologiei de diagnostic si
caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare; metodologie de derminare a markerilor genetici ai
rezistentei bacteriene.Metodele de laborator convenionale, bazate pe cultivarea i identificarea agentului etiologic
prezent n produsul patologic, pot necesita cteva zile pentru obinerea unui rezultat cert. In plus, instituirea precoce
a tratatmentului cu antibiotice, naintea recoltrii probelor biologice, a diminuat mult numrul cazurilor clinice de
meningit confirmate prin metode de laborator tradiionale. Acest impas poate fi depit prin identificarea
microorganismului direct n produsul patologic, utiliznd n principal tehnica PCR. In aceast etap, ne-am propus
adaptarea la condiiile noastre de lucru a unei reacii PCR multiplex care permite detectarea simultan a celor trei
microorganisme care cauzeaz majoritatea meningitelor bacteriene: Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae si Haemophilus influenzae. Aceast metod intete trei gene specifice speciilor menionate :ctrA
codific o protein de membran implicat n transportul capsulei la N. Meningitidis ; ply codific pneumolizina
la S. pneumoniae ;bexA codific o protein implicat n exportul capsulei polizaharidice la H. Influenzae.
Studiile efectuate pe probe biologice n diferite laboratoare, au evideniat sporirea numrului de rezultate pozitive
nregistrate n diagnosticul etiologic al meningitelor acute bacteriene obinute prin utilizarea unei reacii PCR
multiplex i sunt unanim de acord asupra utilitii includerii unor reacii de acest tip n diagnosticul molecular de
rutin.
Identificarea serogrupului / serotipului reprezint primul pas n caracterizarea tulpinilor de meningococ i cel mai
important pentru managementul prompt al contacilor. Pentru acest motiv au fost dezvoltate metode PCR de
amplificare a acizilor nucleici, pentru identificarea serogrupului la nivel molecular (genogrup), care sunt sau
trebuie s devin o parte important a funciei laboratorului de referin.
In ceeea ce priveste determinarea molecular a sensibilitii la ageni antimicrobieni n absena unor culturi
bacteriene, s-a experimentat detectarea mutaiilor n secventa genelor implicate n rezistena principalilor agenti
cauzali ai MBA la substane antimicrobiene prin amplificare PCR urmat desecveniere.
4. Un alt obiectiv specific al fazei de executie II a fost elaborarea metodologiei de realizare a modelului
experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in fluide biologice (LCR si ser) recoltate de la
pacienti cu meningita acuta. Etapele importante in cadrul acestui model experimental au fost definite, dupa cum
urmeaza: selectarea pacientilor si recoltarea probelor biologice; selectarea parametrilor imunologici de determinat;
alegerea metodei de determinare si optimizarea protocolului de lucru. Determinarea unor astfel de pattern-uri
specifice de mediatori solubili ai inflamatiei atat la nivel sistemic (ser) cat si local (LCR) in relatie cu etiologia si
evolutia meningitelor infectioase ar putea constitui o modalitate moderna de diagnostic. In ceea ce priveste metoda
de testare, variantele cele mai potrivite au fost considerate metodele ELISA si xMAP (asa cum reiese si din
evaluarea metodologiei de lucru din etapa anterioara de raportare), ambele avand la baza reactia specifica antigen-
anticorp. Desi ELISA este o metoda robusta, cu sensibilitate si specificitate crescuta, are ca dezavantaj major
posibilitatea determinarii unui singur parametru in mediul de reactie, necesitand efectuarea de determinari separate
pentru fiecare parametru in parte. Acest fapt a dus la optiunea utilizarii tehnologiei xMAP (care permite determinari
multiple de parametri simultan in aceeasi proba) deoarece in etapa de optimizare a modelului experimental de
determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in fluide biologice a fost necesara determinarea unui panel larg de
parametri (citokine, chemokine, factori de crestere) pe un numar redus de probe biologice.
Tehnologia xMAP folosita de platforma Luminex permite o determinare multiparametrica bazandu-se pe un
ansamblu (array) de microsfere in suspensie capabil sa detecteze simultan pana la 100 de parametri intr-o singura
proba (necesarul fiind de maximum 100 L de proba biologica, in mod obisnuit 25 50 L). Aceasta tehnologie
ofera o solutie eficienta de investigare a sistemelor complexe de mediatori (cum ar fi citokinele secretate la nivel
sistemic in cursul inflamatiei, reteaua de hormoni etc.), avand o serie de avantaje cum ar fi rapiditatea achizitiei
datelor, specificitate si sensibilitate excelenta, protocol mai putin laborios (decat metode de referinta cum ar fi
ELISA), cost redus per parametru, cinetica de reactie mai rapida, flexibilitate in alegerea parametrilor. De asemenea
datorita analizei statistice a evenimentelor individuale (prin soft-ul dedicat, Star Station 2.3), rezultatele obtinute
sunt net superioare.

Etapa III (raportare 01.12.2010): Dezvoltarea experimentala a modelului de algoritm de diagnostic.
Activitatile specifice si rezultatele estimate ale acestei etape sunt:
Studiu comparativ al celor doua tipuri de metode, conventionale si moleculare, in raport cu indicatorii de fiabilitate
(sensibilitate, specificitate, cost)
Selectarea, diagnosticarea si monitorizarea pacientilor si fezabilitatea algoritmului de diagnostic
Set de parametri definitorii ai algoritmului de diagnostic si concluzii privind functionalitatea algoritmului de
diagnostic
Completarea algoritmului cu parametri imunologici
Solutii de caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare
Diseminarea rezultatelor partiale obtinute in aceasta etapa.

Rezumatul etapei III

Dezvoltarea experimentala a modelului de algoritm de diagnostic a consitituit obiectivul specific al etapei a III-
a, realizandu-se in acest scop analiza comparativa a metodologiei de diagnostic microbiologic prin metode moderne
moleculare in raport cu cele conventionale, stabilirea parametrilor definitorii ai algoritmului de diagnostic.si analiza
functionalitatii acestui algoritm pe cazuri de MBA inregistrate in studiu. De asemenea, s-a experimentat modelul de
determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in prelevatele de LCR si ser sanguin, recoltate de la pacientii cu
MBA inscrisi in proiect, acestia avand un rol deosebit de important in patogenia meningitelor, dar si a complicatiilor
acestora. Caracterizarea unor tulpini bacteriene prin metode moleculare, complementare metodelor fenotipice, a
constituit o alta activitate in cadrul acestei etape. Diseminarea rezultatelor partiale ale proiectului au fost , de
asemenea, in atentia activitatilor noastre.
Sunt descrise comparativ cele doua tipuri de metode, conventionale si moleculare, in raport cu indicatorii de
fiabilitate. Astfel, suspiciunea clinica de meningita bacteriana este confirmata pe baza detectarii / izolarii agentilor
bacterieni cauzali ai meningitei prin examenul microscopic si prin cultura din LCR, insa sensibilitatea acestor teste
este mai mica de 50% la pacientii care au fost deja tratati cu antibiotice. Exista unele teste de detectare rapida a
antigenului bacterian (polizaharidul capsular) in LCR (latex-aglutinarea-LA, imunoelectroforeza), dar acestea au o
specificitate si sensibilitate scazuta (50 80%). Istoric, agentii patogeni cauzali ai meningitei bacteriene au fost
caracterizati prin metode conventionale fenotipice: cultura, caractere morfologice si morfotinctoriale, caractere
biochimice, caractere antigenice (serogrupare, serotipare, subtipare) si susceptibilitatea la antibiotice.
In contrast cu metoda de cultivare a specimenelor clinice, care necesita ca bacteria sa fie in viata, si LA care nu
poate detecta agentii bacterieni necapsulati, s-au dezvoltat tehnici moleculare, precum polymerase chain reaction
(PCR), care ofera avantajul de a putea detecta rapid ADN-ul celulei bacteriene moarte, iar pe de alta parte
caracterizarea tulpinilor bacteriene, in special in cazul tulpinilor necapsulate. Pentru diagnosticul meningitei
bacteriene a fost pusa la punct tehnica PCR multiplex pentru detectarea simultana a mai multor germeni, in speta N..
meningitidis, H. influenzae si S. pneumoniae. Metodele moleculare sunt utilizate tot mai mult, in defavoarea
metodelor fenotipice, pentru caracterizarea tulpinilor bacteriene, esentiale pentru supravegherea epidemiologica a
bolilor infectioase, ceea ce constituie o baza solida pentru stabilirea masurilor eficiente de prevenire, modalitatea
cea mai eficienta ramanand vaccinarea. In etapa anterioara au fost optimizate doua reactii PCR multiplex : (i) o
reactie care tinteste gene specifice celor trei agenti etiologici majori ai meningitei bacteriene, N. meningitidis, S.
pneumonie si H. Influenzae; (ii) a doua reactie permite caracterizarea / identificarea si determinarea prin PCR a 5
serogrupuri (genogrupuri) de N. meningitidis izolate din meningitele meningococice.
In etapa prezenta s-au urmarit doua aspecte privind reactia PCR: (i) aprecierea sensibilitatii / limitei de detectie a
reactiei PCR multiplex care tinteste identificarea agentului etiologic. Limitele de detectie (exprimate in cantitate de
ADN) obtinute pentru fiecare specie, dupa cateva experimente, au fost: < 1 pg/ reactie , respectiv mai putin de 415
microorganisme pentru N. meningitidis (Fig. 1); < 0,9 pg/reactie, respectiv mai putin de 457 microorganisme
pentru H. influenzae si < 2,6 pg/reactie, respectiv mai putin de 1130 microorganisme pentru S.
pneumoniae. Rezultatele obtinute de noi, similare cu alte studii (Tzanakaki si colab), ne indreptatesc sa evidentiem
sensibilitatea buna a reactiei PCR multiplex pentru detectia agentilor bacterieni cauzali ai meningitei acute. Al
doilea aspect studiat a fost (ii) evaluarea reactiei PCR ca metoda de detectie direct din prelevatele clinice(LCR), care
s-a realizat prin testarea direct din prelevate clinice de la pacienti suspecti de meningita bacteriana. Rezultatele
obtinute prin PCR au fost in concordante cu alte teste fenotipice aplicate la nivelul laboratorului pentru identificarea
agentului etiologic (Tabel 1).
Desi costul unei investigatii moleculare poate fi ridicat, in comparatie cu metodele conventionale, prin instituirea
rapida a terapiei specifice, ca urmare a unui diagnostic etiologic si patogenic rapid, se pot reduce cheltuielile de
management al bolii si, implicit, de spitalizare si de monitorizare a complicatiilor, in aceste situatii raportul
beneficiu cost fiind pozitiv.
Un alt aspect studiat a fost functionalitatea algoritmului de diagnostic al MBA, care a fost testata pe cazuri noi de
MBA, selectate, validate si inregistrate in studiu conform criteriilor clinice, epidemiologice si de laborator, stabilite
in etapele anterioare. Metodele conventionale de diagnostic au fost realizate in cea mai mare parte la nivelul
laboratoarelor celor doi parteneri, iar la nivelul Institutului Cantacuzino s-au pus la punct si s-au realizat o serie de
metode moderne de diagnostic si de investigare a patogeniei meningitelor bacteriene, precum si pentru diagnosticul
diferential intre meningitele bacteriene si cele virale, in vederea completarii diagnosticului conventional cu unele
metode moderne moleculare si imunologice, pentru dezvoltarea experimentala a modelului de algoritm de
diagnostic.
Astfel, au fost inclusi in studiu de catre cei doi parteneri 54 bolnavi prezentand MBA. Acesti bolnavi au provenit
din judete din sudul tarii, cu varste cuprinse intre 1 luna si 75 ani, iar distributia pe sexe a fost aproximativ egala.
Metodele conventionale, foarte importante si sugestive pentru diagnosticul de meningita bacteriana, au fost realizate
la toti pacientii inclusi in studiu: (i) examenul LCR pentru orientarea diagnosticului(modificarile macroscopice,
citologice si biochimice); (ii) coloratia Gram a fost pozitiva intr-un procent de 77,8% din cazurile studiate;
(iii) Latex-aglutinarea cu LCR a fost pozitiva numai in 5 cazuri, in care cultura a fost negativa; desi specificitatea
acestei reactii este foarte buna, sensibilitatea este mai mica, depinzand de numarul de germeni din LCR; (iv) Cultura
LCR a fost pozitiva in 41 de cazuri (75,9%); (v) Serogruparea/serotiparea tulpinilor de N. meningitidis, S.
pneumoniae si H. influenzaea evidentiat predominenta serogrupului B la meningococi (o singura tulpina a apartinut
serogrupului C), la pneumococi au predominat serotipurile 6B, 19F si 1, iar hemofilii au apartinut serotipului b.;
(vi) Testarea sensibilitatii la antibiotice (TSA), realizata conform standardelor CLSI, a evidentiat la S pneumoniae o
rezistenta crescuta la tetraciclina (TE) si clindamicina (DA) 42,1% ; 36,1% din tulpini au fost rezistente la
eritromicina (E), iar rezistenta la penicilina si cefotaxim a fost inregistrata in 31,6% si, respectiv, 10,5% din cazuri.
Toate tulpinile au fost sensibile la ciprofloxacin (Grafic 3); la meningococi s-a observat rezistenta intr-un procent
foarte mare fata de sulfamide si aparitia rezistentei de nivel scazut la penicilina, insa beta-lactaminele,
carbapenemele, quinolonele, cloramfenicolul si rifampicina raman antibioticele majore curent utilizate in terapia si
profilaxia acestor infectii.
Adaugarea metodelor moleculare la algoritmul de diagnostic al MBA (in speta detectarea ADN-ului bacterian direct
in LCR prin tehnica PCR si caracterizarea moleculara a tulpinilor bacteriene) are o deosebita importanta in special in
situatiile in care pacientii au primit antibiotice inainte de realizarea punctiei lombare sau in cazul agentilor etiologici
fastidiosi, dar si pentru confirmarea cat mai rapida a diagnosticului de MBA.
Determinarea mediatorilor solubili ai inflamatiei prin metoda xMAP, atat la nivel sistemic (ser) cat si in LCR, in
relatie cu etiologia si evolutia meningitelor infectioase, constituie o modalitate moderna de diagnostic, de investigare
in detaliu a interactiei complexe agenti patogeni-sistem imun in relatie cu particularitatile localizarii meningeale, si
de elucidare a mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicatiilor neurologice consecutive. In aceasta
etapa, au fost analizate un numar de 18 probe de LCR si ser provenite de la pacienti cu meningita bacteriena
(ajungandu-se la un total de 35 de pacienti), 17 probe de LCR de la pacienti cu meningite enterovirale si 15 probe de
ser de la donatori sanatosi. Au fost evaluati parametrii imunologici stabiliti in etapa anterioara (IL-6, IL-8, IL-10,
TNF-, IFN-, VEGF, bFGF, MIP-1, MCP-1, ENA-78, IL-1). Rezultatele obtinute au relevat prezenta unui
status inflamator local mai puternic in cazul meningitelor bacteriene (caracterizate prin valori semnificativ mai mari
atat ale citokinelor si proinflamatorii cat si ale IL-10) in comparatie cu meningitele enterovirale (concentratii
detectabile doar pentru IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1, ), dar si diferente semnificative intre cazurile de meningite
bacteriene, in functie de agentul etiologic (coci gram negativi vs. coci gram pozitivi).
S-a stabilit astfel setul de parametri definitorii ai algoritmului de diagnostic (parametri clinici, epidemiologici,
parametri de laborator conventionali, moleculari si imunologici). Acest algoritm poate fi aplicat la nivelul
laboratoarelor spitalelor de boli infectioase, cu conditia sustinerii materiale si educatiei continue a personalului
medical. Aplicarea algoritmului modern de diagnostic al MBA se traduce prin optimizarea diagnosticului prin
introducerea metodelor moderne si rapide, cresterea capacitatii de diagnostic microbiologic, imbunatatirea
managementului meningitei bacteriene acute, ce au drept consecinta evolutia favorabila si reducerea complicatiilor
severe ale infectiilor meningeale ce pot lasa sechele pentru toata viata.
In concluzie, toate obiectivele etapei a III-a de executie a proiectului au fost indeplinite.


ETAPA IV I FINAL (15.11.2011)

In cadrul etapei a IV-a, am urmrit ndeplinirea obiectivului specific: Model de studiu cu privire la interacia
sistem imun-agent patogen n MBA. Verificarea funcionalitii algoritmului de diagnostic n clinic (aplicarea
metodelor moderne de diagnostic moleculare i imunologice la pacienii nscrii n studiu). Integrarea
cunotinelor acumulate i evaluarea strategiilor de transfer spre potenialii beneficiari, obiectiv care a cuprins
urmtoarele activiti specifice i rezultate estimate ale acestora:
- Elaborare model in vitro de studiu al efectelor bacteriilor / componentelor bacteriene asupra inflamaiei n
raport cu particularitile regiunii meningeale
- Realizare model in vitro de studiu al efectelor bacteriilor/ componentelor bacteriene asupra inflamaiei
(secreie mediatori, apoptoza etc.)
- Experimentarea funcionalitii algoritmului de diagnostic n clinic
- Realizarea sistemului integrat de cunotine acumulate, prin corelarea datelor experimentale cu datele clinice
- Proiectarea i elaborarea documentaiei de analiz tehnico-economic asupra posibilitii de transfer spre
beneficiari a produselor rezultate din proiect [Strategie de transfer al algoritmului de diagnostic n sistemul de
sntate public (aspecte tehnico-economice)]
- Diseminarea prin comunicarea i publicarea naional sau internaional a rezultatelor
Scopul proiectului, reprezentat de elaborarea unui algoritm modern de diagnostic al meningitelor
bacteriene acute, a fost realizat. Prin aceasta s-a intit:
1. identificarea agenilor etiologici, incidena i caracterizarea acestora cu importan n orientarea diagnosticului i n
strategiile de combatere i prevenire prin vaccinare. Metodele de izolare i identificare utilizate au fost cele
convenionale asociate cu metodele moderne moleculare. Cultura LCR a fost pozitiv n 71,6% din cazuri, pe
primul loc sitund-seStreptococcus pneumoniae izolat i 47,3% din cazuri, cu predominena serotipurilor 6B,
19F i 1, care se regsesc n componena vaccinului pneumococic 23-valent, ceea ce corespunde, pe de o parte
datelor din literatur conform crora serotipurile cuprinse n vaccinul 23-valent acoper aprox. 90% din
serotipurile implicate n infeciile invasive, iar pe de alt parte aceste date denot i faptul c introducerea
vaccinrii antipneumococice ar acoperi n mare parte tulpinile care cauzeaz infecii invasive, avnd un efect
favorabil n ceea ce privete prevenirea i scderea mbolnvirilor n special la grupele de vrst cu risc
crescut.Neisseria meningitidis a fost identificat i detectat n 13,5% din cazurile de meningit, serogruparea acestor
tulpini, att prin metode fenotipice ct i moleculare, a relevat predominena serogrupului B, serogrup ce
predomin n special n zona european. Haemophilus influenzae, se situeaz pe locul trei, fiind identificat i
detectat n 9,5% din cazuri i aparinnd n mod egal serotipurilor b i f. Urmrind distribuia agenilor etiologici
dup vrst, s-a observat c la grupa de vrst <5 ani s-au izolat i/sau detectat germeni din toate cele trei
specii, H. influenzae fiind izolat n 80% din cazuri de la copii < 5 ani, vaccinarea anti H. influenzae serotip b
avnd un rol important n prevenirea infeciilor invazive determinate de acest serotip, dar, aa cum este semnalat i
n literatur, s-a observat apariia unei nie ecologice alte serotipuri dect b i chiar i tulpini necapsulate de H.
Influenzae au fost identificate ca fiind cauza unor infecii severe.
2. completarea metodelor convenionale cu metode i tehnici moderne din domeniul:
- biologiei moleculare, care asigur rapiditatea diagnosticului prin detectarea ADN bacterian direct din
prelevatul clinic (LCR), precum i caracterizarea agenilor etiologici ai MBA. De asemenea, aplicarea metodelor
moleculare ( n principal PCR) de detectare a ADN bacterian n LCR a mrit procentul de identificare a celor trei
germeni, cei mai frecvent implicai n etiologia MBA. Astfel s-au detectat S. pneumoniae, H. influenzae, i N.
meningitidis la pacieni la care cultura LCR a fost pozitiv, dar i la pacieni tratai cu antibiotice anterior punciei
lombare i la care cultura a fost negativ (11 din cele 12 probe de LCR testate, pentru care cultura a fost negativ,
au fost PCR pozitive pentru unul sau mai muli din cei trei ageni cauzali mai importani ai MBA). Rezultatele
obinute prin PCR au fost concordante cu coloraia Gram / Latex-aglutinarea , cultura LCR i/sau semnele clinice
ale pacienilor al cror LCR a fost luat n experiment. Metoda PCR multiplex, cu primeri specifici pentru
detectarea simultan a unor secvene int specifice, constituind un instrument rapid ce poate pune diagnosticul
etiologic relativ repede, a fost adaptat i optimizat n acest proiect.
- imunologiei, capabile s evidenieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel inte terapeutice
alternative. Determinarea citokinelor [IL-6, IL-8, IL-10, TNF-a, IFN-g), chemokinelor (MCP-1, MIP-1a, ENA-78)
i factorilor de cretere (VEGF)] n serul i LCR pacienilor i al martorilor cu meningite de origine enteroviral, s-a
realizat prin aplicarea metodologiei stabilite n etapele anterioare ale proiectului, folosind tehnologia xMap, aplicat
pe platforma Luminex. Rezultatele obinute indic un status inflamator sistemic evident, caracterizat prin
concentraii semnificativ mai mari ale IL-6, IL-8 i mai mici pentru ENA-78 la pacienii cu meningite bacteriene.
Meningitele cauzate de Neisseria meningitidis i Streptococcus pneumoniae se difereniaz clar de meningitele
virale prin manifestrile inflamatorii la nivel sistemic (concentraii semnificativ mai mari de IL-6 i IL-8), dar toi
pacienii, indiferent de etiologia bolii, prezint concentraii sczute ale ENA-78 n comparaie cu donatorii sntoi.
Determinrile la nivel local indic un status inflamator mai puternic n cazul meningitelor bacteriene caracterizat
prin valori semnificativ mai mari ale IL-6, IL-8, TNF-, IFN-, VEGF, MIP-1, MCP-1, ENA-78 dar i IL-10 n
comparaie cu meningitele virale (concentraii detectabile doar pentru IL-6, IL-8, MCP-1 i MIP-1). Diferene
semnificative n funcie de agentul etiologic au fost identificate doar pentru IL-8, dar tendine spre concentraii mai
mari n LCR apar la pacienii cu meningit meningococic i n cazul IL-6, IL-10, TNF- , MIP-1 i MCP-1.

- prin componenta de cercetare fundamental (ipoteze, modele de studiu) proiectul poate clarifica unele aspecte
importante asupra mecanismelor patogenice ale bolii, prin dezvoltarea unui model experimental de investigare a
interaciei complexe ageni patogeni-sistem imun n relaie cu particularitile localizrii meningeale, n vederea
elucidrii mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicaiilor neurologice consecutive. De asemenea,
prin determinarea unor mediatori imuni (citokine, chemokine, factori de cretere) att la nivel local ct i
sistemic, au fost evideniate unele particulariti ale rspunsului imun n relaie cu agentul etiologic al bolii.

Un rezultat important al proiectului, tradus i printr-un plus de cunoatere tiinific n domeniu, s-
a concretizat prin elaborarea unei cri Algoritm de diagnostic n meningitele bacteriene acute, la editura
CERES, ncadrndu-se n cerinele strategiei de dezvoltare a cunoaterii tiinifice n spaiul european.
Prin ndeplinirea obiectivelor propuse, impactul proiectului este major n aria de cercetare medical
naional dar i internaional, domeniul abordat reprezentnd o prioritate tematic la nivel mondial. Acest proiect
vine n ntmpinarea unei lungi activiti pe plan european a proiectului EU-IBIS (European Union Invasive
Bacterial Infections Surveillance), avnd drept scop mbuntirea supravegherii bolilor invazive determinate
de Neisseria meningitidis i Haemophilus influenzae. Din 2007, n cadrul European Invasive Bacterial Diseases
Surveillance Network (EU-IBD), au fost incluse i infeciile invazive determinate de S. pneumoniae.
Aplicarea acestor rezultate la nivel naional vor avea i un impact social i economic direct:
mbuntirea strii de sntate, creterea calitii vieii i a speranei de via a pacienilor
reducerea incapacitii de munc i a consecinelor negative la nivelul familiei i societii
reducerea cheltuielilor de spitalizare i a costului extrem de ridicat ale tratamentului

Prin activitile de cercetare aplicativ i dezvoltare experimental desfurate n cadrul proiectului, se
evideniaz i un impact economico-social derivat legat de creterea competitivitii n cercetare, prin:
formarea tinerilor specialiti, prin dezvoltarea unor competene complementare i interdisciplinare (numr
tinerilor paticipani la proiect: 9, din care 3 asisteni de cercetare i 4 doctoranzi);
posibilitatea dezvoltrii profesionale pe termen lung a tinerilor cecettori (n timpul derulrii proiectului unul din
tinerii cercettori as. de cercetare, a devenit doctorand avnd ca tem implicarea H. influenzae n etiologia
infeciilor invazive i studiul aprofundat al factorilor de virulen ce intervin n mecanismele fiziopatologice din
cadrul acestor infecii, iar un alt tnr cercettor va continua i aprofunda studiile n vederea elucidrii
mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicaiilor neurologice, prin investigarea n detaliu a interaciei
complexe ageni patogeni-sistem imun n relaie cu particularitile localizrii meningeale)

Rezultatele obinute, att n cadrul proiectului ct i prin continuarea studiilor de ctre tinerii cercettori,
vor avea aplicabilitate clinic direct (Ministerul Sntii Publice, care n calitate de beneficiar, va putea
implementa algoritmul de diagnostic n sistemul de sntate public), dar vor contribui i ca spor de cunoatere
tiinific n spaiul european (European Added Value).

Prin introducerea la nivelul laboratoarelor, ce deservesc Spitalele de boli infecioase i Direciile de
Sntate Public din ar, a tehnicilor moderne de diagnostic adaptate la condiiile noastre i optimizate n
cadrul proiectului, putem afirma c rezultatele acestui proiect vor conduce la atingerea unuia dintre
obiectivele majore ale Planului Naional de Cercetare Dezvoltare i Inovare II, i anume eficientizarea
sistemului de sntate public, att prin obinerea ntr-un interval de timp mai scurt a rezultatelor scontate
n cazul bolii, ct i prin scderea incidenei acestor maladii datorit aplicrii tot mai eficiente a strategiilor
de prevenire prin vaccinare.

Lista de publicatii / comunicari stiintifice
Carte
Vasilica Ungureanu, Alexandru Rafila, Maria Nica. Algoritm de diagnostic in meningitele bacteriene acute.
Editura CERES, Bucuresti, 2011.
Articole
L. Lerescu, C. Tucureanu, Iuliana Caras, Ramona Pitica, Vasilica Ungureanu, Aurora Salageanu. Implicarea
mediatorilor solubili ai inflamatiei n interactia agent patogen sistem imun din cadrul meningitelor infectioase.
Bacteriol.Virusol. Parazitol.Epidemiol.- 2008, vol 53, nr 2, p 89-97.
M. Nica, T. Biolan, A. Dascalu, E. Mozes, A. Toderan, P. Calistru, E. Ceausu. Tulpini bacteriene izolate din
infectii sistemice ; evaluare si supravegherea rezistentei la antibiotice. Bacteriol.Virusol. Parazitol.Epidemiol.
2010, vol 55 nr 2, p 151-160.
Pana M, Ghita M, Nica M, Botea S, Dorobat OM, Rafila A, Papagheorghe R, Popescu N, Nistor I, Ungureanu V.
Study of Streptococcus pneumoniae strains resistant to antibiotics analyzed at Cantacuzino NIRDMI during
2006-2008. Bacteriol.Virusol.Parazitol.Epidemiol. 2010, vol 55 nr 2, p 77-82
Giuca Mihaela Cristina, Monica Straut, Maria Surdeanu, Alina Maria Holban, Cerasella Cristiana Dragomirescu,
Raluca Georgescu, Laura Grigore, Maria Nica, Amalia Dasclu, Alexandru Rafila, Vasilica Ungureanu.
Methodology optimization and diversification for the investigation of virulence potential in Haemophilus
influenzae clinical strains. Roum.Arch.Microbiol.Immunol. Vol. 70, nr 4/2011.
Comunicri naionale
Vasilica Ungureanu, A. Rafila, Maria Nica, Monica Straut. Algoritm de diagnostic al meningitelor bacteriene
acute. Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie,Brasov, 8-10 oct.2009.
Ungureanu Vasilica, Rafila Alexandru, Nica Maria, Straut Monica, Salageanu Aurora, Surdeanu Maria, Lerescu
Lucian, Pana Marina, Petrini Anca, Giuca Mihaela si toti membrii Consortiului Parteneriate 42-116.
Managementul meningitelor bacteriene acute: Strategii moderne de investigatie si interventionale. A 2-a
Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
Anca Petrini, Mihaela Giuca, Tuca Ceornea, Maria Nica, Alexandru Rafila, VasilicaUngureanu. Streptococi -
hemolitici implicati in etiopatogenia meningitei bacteriene acute (MBA). A 2-a Conferinta Nationala de
Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
Mihaela Cristina Giuca (Arama), Monica Straut, Marieta Surdeanu, Marina Pana, Anca Petrini, Vasilica
Ungureanu. Haemophilus spp.: Implicatii in patologia umana si diagnostic. A 2-a Conferinta Nationala de
Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
Marina Pana, Maria Ghita, Maria Nica, Smaranda Botea , Olga Dorobat, A.Rafila, Raluca Papagheorghe,
Nicoleta Popescu, Elena Duca ,Irina Nistor, Daniela Blana,Vasilica Ungureanu. Studiul tulpinilor
de Streptococcus pneumoniae, analizate la INCDMI Cantacuzino, in perioada 2005 2010. A 2-a Conferinta
Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
Comunicri internaionale
Vasilica Ungureanu, M. Pana, M.C.Giuca, M. Surdeanu, M. Nica, A. Rafila, O. Dorobat, A.O. Dascalu, all
partners of Parteneriate project 42-116 and M. Straut. Causal agents of acute bacterial meningitis: phenotipical
and genotipical characteristics. Microbiologia Balkanica, 7
th
Balkanic Congress of Microbiology, 25-29 oct
2011,Belgrad,Serbia.
Mihaela Cristina Giuc, M. Stru, M. Surdeanu, C. M. Chifiriuc, V. Ungureanu. Phenotypic and molecular
characterization of Haemophilus influenzae invasive and noninvasive strains. Microbiologia Balkanica,
7
th
Balkanic Congress of Microbiology, 25-29 oct 2011,Belgrad,Serbia.